一種檢測小菜蛾對阿維菌素類農藥抗藥性的方法

2023-05-29 12:34:06 3

專利名稱：一種檢測小菜蛾對阿維菌素類農藥抗藥性的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種檢測小菜蛾對阿維菌素類農藥抗藥性的方法。
背景技術：
目前小菜蛾對阿維菌素類農藥的抗性檢測主要是通過傳統的生測法一葉片藥膜法進行取新鮮無汙染的甘藍葉片浸在系列濃度的阿維菌素類藥液中10秒，以蒸餾水(含 0. 01% Triton-XlOO)作對照，室內晾乾後接大小一致的3齡幼蟲10至20頭，每個濃度3 次重複。48小時後檢查結果。然後用POLO或SAS軟體處理數據，計算LC50值，根據LC50 值的比較來判斷小菜蛾的抗性水平。但是，上述傳統監測小菜蛾對阿維菌素類農藥抗性方法存在明顯的不足(1)需要大批量人工飼養試蟲。傳統的生物測定法要求被測試蟲的齡期和大小一致，這就需要在田間採回活的試蟲後在室內進行人工飼養，得到足量的標準試蟲。(2)需要較長的測試時間。傳統的生物測試時間需要兩天以上；(3)傳統的生測結果只是對被測昆蟲群體耐藥性的一個總體評判，並不能反應昆蟲抗性個體出現的頻率。為此，急需發明一種新型、快速的檢測方法。

發明內容
為了實現上述發明目的，本發明採用的技術方案如下一種檢測小菜蛾對阿維菌素類農藥抗藥性的方法，包括步驟如下第一步，對小菜蛾樣本進行單頭基因組DNA的提取，步驟包括，(1)將所述小菜蛾樣本置於預冷的勻漿器中，加入TE緩衝液勻漿，(2)加入細胞裂解液，混勻，轉入離心管中，再加入蛋白酶K，放置，期間搖勻若干次，直到樣品為半透明粘稠液體，(3)加入氯仿，輕輕混勻，(4)加入沉澱液，室溫放置，然後離心處理，(5)吸掉上清液，立即加入氯化鈉溶液，輕輕振蕩致沉澱完全溶解，加入RNA酶A， 混勻，放置，(6)加入預冷的無水乙醇，放置，然後離心處理，吸走乙醇，用乙醇洗一次，倒置於乾淨濾紙上，室溫乾燥，用TE緩衝液溶解DNA，得到DNA模板，低溫保存備用；第二步，對所述第一步中提取的DNA模板進行特定基因片段的PCR擴增，步驟包括，(1)在PCR管中建立PCR反應體系PCR緩衝液，脫氧核糖核苷酸，上遊引物，下遊引物，DNA模板，DNA聚合酶，去離子水，(2)將上述反應體系進行PCR反應，反應條件為預變性後，變性，退火，延伸，多次循環，最後延伸，然後低溫保存樣品；
第三步，對所述PCR擴增後的產物進行回收，步驟包括，(1)取所述PCR擴增後的產物用瓊脂糖凝膠進行電泳，(2)紫外燈下迅速從所述瓊脂糖凝膠上割下目的條帶100 300毫克，置於微離心管中，紫外燈下操作不要超過30秒，(3)往離心管中加入的結合緩衝液約100-300 μ L，55 60°C加熱5 10分鐘使膠完全溶化，每隔2-3分鐘混勻一次，(4)將所述第三步(3)中獲得的混勻物轉到回收柱中，於室溫離心處理，除掉上清液，(5)再向所述回收柱中加結合緩衝液洗所述回收柱，於室溫離心處理，除掉上清液，(6)加SWP緩衝液於所述回收柱中，離心處理，除掉上清液，(7)重複所述第三步中(5)、(6) 一次，(8)離心處理後除淨上清液，加入DNA溶解液，離心處理，(9)瓊脂糖電泳檢測回收結果；第四步，將所述回收得到的DNA低溫貯存然後進行測序，或將所述回收得到的DNA 立即進行測序；第五步，根據所述測序結果，檢查所述回收得到的DNA的N-端是否出現突變位點， 即第78位的亮氨酸變成纈氨酸或者第82位的賴氨酸變成亮氨酸；第六步，根據第五步中的測序結果，對所述小菜蛾樣本對阿維菌素類農藥的抗性進行判別，如果出現所述第78位的亮氨酸變成纈氨酸或者第82位的賴氨酸變成亮氨酸之中的任一突變位點，就說明所述小菜蛾樣本對阿維菌素出現了抗性。還包括第七步，步驟包括，多次重複第一步至第六步，根據檢測的所述小菜蛾樣本的個數和其中出現了所述突變位點的樣本的個數，計算出所述小菜蛾樣本種群的抗性頻率。還包括第八步，檢測是否需要更換藥劑種類對所述小菜蛾樣本種群進行防治，步驟包括，根據計算出的所述小菜蛾樣本種群的抗性頻率，如果一個所述小菜蛾樣本種群的抗性頻率大於5 %，就應該更換藥劑種類進行防治。所述小菜蛾樣本是從田間採回的小菜蛾活蟲，或者所述小菜蛾樣本是從田間採回的小菜蛾經過酒精浸泡的標本。所述小菜蛾樣本是小菜蛾幼蟲。所述第三步中，對所述PCR擴增後的產物進行回收採用的是快速回收試劑盒；所述第四步中，將所述回收得到的DNA貯存於-20°C冰箱中然後進行測序或立即進行測序。所述第一步，步驟包括，(1)將所述小菜蛾樣本置於_4°C預冷的勻漿器中，加入200μ L TE緩衝液勻漿，(2)加入200yL細胞裂解液，混勻，轉入1.5mL離心管中，再加入3yL蛋白酶K， 55°C放置10分鐘，期間搖勻3次，直到樣品為半透明粘稠液體，(3)加入300 μ L氯仿，輕輕混勻，(4)加入250 μ L沉澱液，室溫放置2分鐘，IOOOOrpm離心處理2分鐘，(5)吸掉上清液，立即加入50μ L 1.2摩爾每升的氯化鈉溶液，輕輕振蕩致沉澱完全溶解，加入1 μ L RNA酶A，混勻，55°C放置10分鐘，(6)加入150 μ L預冷的無水乙醇，-20°C放置1小時，IOOOOrpm離心處理10分鐘，
吸走乙醇，用75 %的乙醇洗一次，倒置於乾淨濾紙上，室溫乾燥10分鐘，用25 μ L TE緩衝液溶解DNA，得到DNA模板，於_20°C保存備用；所述第二步，步驟包括，(1)在0. 25mL PCR管中建立總體積為25 μ L的PCR反應體系2. 5μ L 10 X PCR緩衝液，2 μ L的10毫摩爾每升濃度脫氧核糖核苷酸，1 μ L上遊引物，1 μ L下遊引物，1 μ L DNA 模板，0. 5yL DNA聚合酶，17. OyL去離子水，(2)將上述反應體系進行PCR反應，反應條件為94°C預變性5分鐘後，94°C變性 45秒，52°C退火45秒，72°C延伸1分鐘，共反應35個循環，最後72°C延伸10分鐘，然後於 4°C保存樣品。所述第三步，步驟包括，(1)取5 μ L所述PCR擴增後的產物用1. 0%瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳條件80毫伏恆壓，電泳40分鐘，(2)紫外燈下迅速從所述瓊脂糖凝膠上割下目的條帶100 300毫克，置於1. 5mL 微離心管中，紫外燈下操作不要超過30秒，(3)往離心管中加入的結合緩衝液約100-300 μ L，55 60°C加熱5 10分鐘使膠完全溶化，每隔2-3分鐘混勻一次，(4)將所述第三步(3)中獲得的混勻物轉到2mL的回收柱中，於室溫10，OOOrpm離心處理1分鐘，除掉上清液，(5)再向所述回收柱中加300 μ L結合緩衝液洗所述回收柱，於室溫10，OOOrpm離心處理1分鐘，除掉上清液，(6)加700 μ L SffP緩衝液於所述回收柱中，10，OOOrpm離心處理1分鐘，除掉上清液，(7)重複所述第三步中的(5)、(6) 一次，(8)離心處理後除淨上清液，加入10 μ L DNA溶解液，10，OOOrpm離心處理1分鐘，(9) 瓊脂糖電泳檢測回收結果，PCR擴增產物大小應為131bp。在所述第三步(8)之後，重複所述第三步( 至少一次後，再進行所述第三步(9)。本發明中所謂的TE緩衝液，是指10毫摩爾的三羥甲基氨基甲烷鹽酸溶液+1毫摩爾的乙二胺四乙酸溶液。本發明中所謂的上遊引物，是指10微摩爾濃度，脫氧核糖核苷酸序列為 TAAGGCCGAACTATGGAG ；所謂的下遊引物，是指10微摩爾濃度，脫氧核糖核苷酸序列為 GGGGATCTGTCCAAAACT ；所謂的DNA聚合酶，是指5單位/ μ L。本發明中所謂的第78位的亮氨酸，核酸序列為TGT ；所謂的纈氨酸，核酸序列為 TCT ；所謂的第82位的賴氨酸，核酸序列為AAA ；所謂的亮氨酸，核酸序列為TCA。本發明所述的檢測小菜蛾對阿維菌素類農藥抗藥性的方法，首先提取單頭小菜蛾基因組DNA，用設計的引物進行特定基因片段的PCR擴增，PCR產物經過純化回收後，進行 DNA直接測序。如果N-端出現任何一個突變位點第78位的亮氨酸(核酸序列為TGT)變成纈氨酸(核酸序列為TCT)或者第82位的賴氨酸(核酸序列為AAA)變成亮氨酸(核酸序列為TCA)，就說明該小菜蛾對阿維菌素出現了抗性，再根據抗性個體在所檢測蟲量的百分率，判斷小菜蛾種群抗性的大小。如一次檢測小菜蛾30頭，其中有3頭出現了突變位點，則這個小菜蛾種群的抗性頻率為10% (3/30*100%)。如果一個種群的抗性頻率大於5%，就應該考慮更換藥劑種類進行防治。本發明中，在所述第三步(8)之後，重複所述第三步( 一次或多次後，再進行所述第三步(9)，可提高回收效率。本發明的有益效果如下1，本發明不需要大批量人工飼養試蟲，節省勞動力和資源。2，本發明從田間採樣直接測試，減少中間過程，可以是酒精浸泡標本，方便郵寄和儲存。3，本發明所得抗性結果準確，且能反應昆蟲抗性個體出現的頻率。
具體實施例方式下面詳細說明本發明優選的技術方案。一種檢測小菜蛾對阿維菌素類農藥抗藥性的方法，包括步驟如下第一步，首先從田間採回小菜蛾後(可以是酒精浸泡標本或活蟲)，進行單頭基因組DNA的提取，步驟包括，(1)將所述小菜蛾樣本置於_4°C預冷的勻漿器中，加入200μ L TE緩衝液勻漿，(2)加入200 μ L細胞裂解液，混勻，轉入1.5mL離心管中，再加入3yL蛋白酶K， 55°C放置10分鐘，期間搖勻3次，直到樣品為半透明粘稠液體，(3)加入300 μ L氯仿，輕輕混勻，(4)加入250 μ L沉澱液，室溫放置2分鐘，IOOOOrpm離心處理2分鐘，(5)吸掉上清液，立即加入50 μ L 1.2摩爾每升的氯化鈉溶液，輕輕振蕩致沉澱完全溶解，加入1 μ L RNA酶Α，混勻，55°C放置10分鐘，(6)加入150 μ L預冷的無水乙醇，_20°C放置1小時，IOOOOrpm離心處理10分鐘，
吸走乙醇，用75 %的乙醇洗一次，倒置於乾淨濾紙上，室溫乾燥10分鐘，用25 μ L TE緩衝液溶解DNA，得到DNA模板，於_20°C保存備用；第二步，對所述第一步中提取的DNA模板進行特定基因片段的PCR擴增，步驟包括，(1)在0. 25mL PCR管中建立總體積為25μ L的PCR反應體系2. 5μ L 10XPCR緩衝液，2 μ L的10毫摩爾每升濃度脫氧核糖核苷酸，1 μ L上遊引物，1 μ L下遊引物，1 μ L DNA 模板，0. 5yL DNA聚合酶，17. OyL去離子水，(2)將上述反應體系進行PCR反應，反應條件為94°C預變性5分鐘後，94°C變性 45秒，52°C退火45秒，72°C延伸1分鐘，共反應35個循環，最後72°C延伸10分鐘，然後於 4°C保存樣品；第三步，採用快速回收試劑盒對所述PCR擴增後的產物進行回收，步驟包括，(1)取5 μ L所述PCR擴增後的產物用1. 0%瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳條件80毫伏恆壓，電泳40分鐘，
(2)紫外燈下迅速從所述瓊脂糖凝膠上割下目的條帶100 300毫克，置於1. 5mL 微離心管中，紫外燈下操作不要超過30秒，(3)往離心管中加入的結合緩衝液約100-300 μ L，55 60°C加熱5 10分鐘使膠完全溶化，每隔2-3分鐘混勻一次，(4)將所述第三步(3)中獲得的混勻物轉到2mL的回收柱中，於室溫10，OOOrpm離心處理1分鐘，除掉上清液，(5)再向所述回收柱中加300 μ L結合緩衝液洗所述回收柱，於室溫10，OOOrpm離心處理1分鐘，除掉上清液(6)加700 μ L SffP緩衝液於所述回收柱中，10，OOOrpm離心處理1分鐘，除掉上清液，(7)重複所述第三步中(5)、(6) 一次，(8)離心處理後除淨上清液，加入10 μ L DNA溶解液，10, OOOrpm離心處理1分鐘，(9)重複所述第三步( 一次，可提高回收效率，(10) 瓊脂糖電泳檢測回收結果，PCR擴增產物大小應為131bp ；第四步，將所述回收得到的DNA立即進行測序；第五步，根據所述測序結果，檢查所述回收得到的DNA的N-端是否出現突變位點， 即第78位的亮氨酸變成纈氨酸或者第82位的賴氨酸變成亮氨酸；第六步，根據第五步中的測序結果，對所述小菜蛾樣本對阿維菌素類農藥的抗性進行判別，如果出現所述第78位的亮氨酸變成纈氨酸或者第82位的賴氨酸變成亮氨酸之中的任一突變位點，就說明所述小菜蛾樣本對阿維菌素出現了抗性；第七步，多次重複第一步至第六步，根據檢測的所述小菜蛾樣本的個數和其中出現了所述突變位點的樣本的個數，計算出所述小菜蛾樣本種群的抗性頻率；第八步，檢測是否需要更換藥劑種類對所述小菜蛾樣本種群進行防治，根據計算出的所述小菜蛾樣本種群的抗性頻率，如果一個所述小菜蛾樣本種群的抗性頻率大於5%， 就應該更換藥劑種類進行防治。如一次檢測小菜蛾30頭，其中有3頭出現了突變位點，則這個小菜蛾種群的抗性頻率為10% (3/30*100%)。如果一個種群的抗性頻率大於5%，就應該考慮更換藥劑種類進行防治。以上通過具體的和優選的實施例詳細的描述了本發明，但本領域技術人員應該明白，本發明並不局限於以上所述實施例，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、 等同替換等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
權利要求
1.一種檢測小菜蛾對阿維菌素類農藥抗藥性的方法，其特徵在於，包括步驟如下第一步，對小菜蛾樣本進行單頭基因組DNA的提取，步驟包括，(1)將所述小菜蛾樣本置於預冷的勻漿器中，加入TE緩衝液勻漿，(2)加入細胞裂解液，混勻，轉入離心管中，再加入蛋白酶K，放置，期間搖勻若干次，直到樣品為半透明粘稠液體，(3)加入氯仿，輕輕混勻，(4)加入沉澱液，室溫放置，然後離心處理，(5)吸掉上清液，立即加入氯化鈉溶液，輕輕振蕩致沉澱完全溶解，加入RNA酶A，混勻， 放置，(6)加入預冷的無水乙醇，放置，然後離心處理，吸走乙醇，用乙醇洗一次，倒置於乾淨濾紙上，室溫乾燥，用TE緩衝液溶解DNA，得到DNA模板，低溫保存備用；第二步，對所述第一步中提取的DNA模板進行特定基因片段的PCR擴增，步驟包括，(1)在PCR管中建立PCR反應體系PCR緩衝液，脫氧核糖核苷酸，上遊引物，下遊引物， DNA模板，DNA聚合酶，去離子水，(2)將上述反應體系進行PCR反應，反應條件為預變性後，變性，退火，延伸，多次循環，最後延伸，然後低溫保存樣品；第三步，對所述PCR擴增後的產物進行回收，步驟包括，(1)取所述PCR擴增後的產物用瓊脂糖凝膠進行電泳，(2)紫外燈下迅速從所述瓊脂糖凝膠上割下目的條帶100 300毫克，置於微離心管中，紫外燈下操作不要超過30秒，(3)往離心管中加入的結合緩衝液約100-300μ L，55 60°C加熱5 10分鐘使膠完全溶化，每隔2-3分鐘混勻一次，(4)將所述第三步(3)中獲得的混勻物轉到回收柱中，於室溫離心處理，除掉上清液，(5)再向所述回收柱中加結合緩衝液洗所述回收柱，於室溫離心處理，除掉上清液，(6)加SWP緩衝液於所述回收柱中，離心處理，除掉上清液，(7)重複所述第三步中(5)、(6)一次，(8)離心處理後除淨上清液，加入DNA溶解液，離心處理，(9)瓊脂糖電泳檢測回收結果；第四步，將所述回收得到的DNA低溫貯存然後進行測序，或將所述回收得到的DNA立即進行測序；第五步，根據所述測序結果，檢查所述回收得到的DNA的N-端是否出現突變位點，即第 78位的亮氨酸變成纈氨酸或者第82位的賴氨酸變成亮氨酸；第六步，根據第五步中的測序結果，對所述小菜蛾樣本對阿維菌素類農藥的抗性進行判別，如果出現所述第78位的亮氨酸變成纈氨酸或者第82位的賴氨酸變成亮氨酸之中的任一突變位點，就說明所述小菜蛾樣本對阿維菌素出現了抗性。
2.根據權利要求1所述的檢測小菜蛾對阿維菌素類農藥抗藥性的方法，其特徵在於， 還包括第七步，步驟包括，多次重複第一步至第六步，根據檢測的所述小菜蛾樣本的個數和其中出現了所述突變位點的樣本的個數，計算出所述小菜蛾樣本種群的抗性頻率。
3.根據權利要求2所述的檢測小菜蛾對阿維菌素類農藥抗藥性的方法，其特徵在於， 還包括第八步，檢測是否需要更換藥劑種類對所述小菜蛾樣本種群進行防治，步驟包括，根據計算出的所述小菜蛾樣本種群的抗性頻率，如果一個所述小菜蛾樣本種群的抗性頻率大於5 %，就應該更換藥劑種類進行防治。
4.根據權利要求1或2或3所述的檢測小菜蛾對阿維菌素類農藥抗藥性的方法，其特徵在於所述小菜蛾樣本是從田間採回的小菜蛾活蟲，或者所述小菜蛾樣本是從田間採回的小菜蛾經過酒精浸泡的標本。
5.根據權利要求1或2或3所述的檢測小菜蛾對阿維菌素類農藥抗藥性的方法，其特徵在於所述小菜蛾樣本是小菜蛾幼蟲。
6.根據權利要求1或2或3所述的檢測小菜蛾對阿維菌素類農藥抗藥性的方法，其特徵在於，所述第三步中，對所述PCR擴增後的產物進行回收採用的是快速回收試劑盒；所述第四步中，將所述回收得到的DNA貯存於-20°C冰箱中然後進行測序或立即進行測序。
7.根據權利要求1或2或3所述的檢測小菜蛾對阿維菌素類農藥抗藥性的方法，其特徵在於，所述第一步，步驟包括，(1)將所述小菜蛾樣本置於_4°C預冷的勻漿器中，加入200yLTE緩衝液勻漿，(2)加入200μ L細胞裂解液，混勻，轉入1. 5mL離心管中，再加入3 μ L蛋白酶K，55°C 放置10分鐘，期間搖勻3次，直到樣品為半透明粘稠液體，(3)加入300μ L氯仿，輕輕混勻，(4)加入250μ L沉澱液，室溫放置2分鐘，IOOOOrpm離心處理2分鐘，(5)吸掉上清液，立即加入50μ L 1.2摩爾每升的氯化鈉溶液，輕輕振蕩致沉澱完全溶解，加入1 μ L RNA酶Α，混勻，55°C放置10分鐘，(6)加入150μ L預冷的無水乙醇，-20°C放置1小時，IOOOOrpm離心處理10分鐘，吸走乙醇，用75%的乙醇洗一次，倒置於乾淨濾紙上，室溫乾燥10分鐘，用25 μ L TE緩衝液溶解 DNA,得到DNA模板，於_20°C保存備用。
8.根據權利要求1或2或3所述的檢測小菜蛾對阿維菌素類農藥抗藥性的方法，其特徵在於，所述第二步，步驟包括，(1)在0.25mL PCR管中建立總體積為25 μ L的PCR反應體系2. 5 μ L 10XPCR緩衝液，2 μ L的10毫摩爾每升濃度脫氧核糖核苷酸，1 μ L上遊引物，1 μ L下遊引物，IyL DNA 模板，0. 5yL DNA聚合酶，17. OyL去離子水，(2)將上述反應體系進行PCR反應，反應條件為94°C預變性5分鐘後，94°C變性45秒， 52°C退火45秒，72 °C延伸1分鐘，共反應35個循環，最後72°C延伸10分鐘，然後於4°C保存樣品。
9.根據權利要求1或2或3所述的檢測小菜蛾對阿維菌素類農藥抗藥性的方法，其特徵在於，所述第三步，步驟包括，(1)取5μL所述PCR擴增後的產物用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳條件80毫伏恆壓，電泳40分鐘，(2)紫外燈下迅速從所述瓊脂糖凝膠上割下目的條帶100 300毫克，置於1.5mL微離心管中，紫外燈下操作不要超過30秒，(3)往離心管中加入的結合緩衝液約100-300μ L，55 60°C加熱5 10分鐘使膠完全溶化，每隔2-3分鐘混勻一次，(4)將所述第三步(3)中獲得的混勻物轉到2mL的回收柱中，於室溫10，OOOrpm離心處理1分鐘，除掉上清液，(5)再向所述回收柱中加300μ L結合緩衝液洗所述回收柱，於室溫10，OOOrpm離心處理1分鐘，除掉上清液，(6)加700μ L SffP緩衝液於所述回收柱中，10，OOOrpm離心處理1分鐘，除掉上清液，(7)重複所述第三步中的(5)、(6)—次，(8)離心處理後除淨上清液，加入10μ L DNA溶解液，10，OOOrpm離心處理1分鐘，(9)瓊脂糖電泳檢測回收結果，PCR擴增產物大小應為131bp。
10.根據權利要求1或2或3所述的檢測小菜蛾對阿維菌素類農藥抗藥性的方法，其特徵在於在所述第三步(8)之後，重複所述第三步( 至少一次後，再進行所述第三步(9)。
全文摘要
一種檢測小菜蛾對阿維菌素類農藥抗藥性的方法，包括步驟對小菜蛾樣本進行單頭基因組DNA的提取；對所述第一步中提取的DNA模板進行特定基因片段的PCR擴增；對所述PCR擴增後的產物進行回收；根據所述測序結果，檢查所述回收得到的DNA的N-端是否出現突變位點，根據測序結果，對所述小菜蛾樣本對阿維菌素類農藥的抗性進行判別。本發明不需要大批量人工飼養試蟲，節省勞動力和資源，所得抗性結果準確，且能反應昆蟲抗性個體出現的頻率。
文檔編號C12Q1/68GK102382876SQ201010266309
公開日2012年3月21日 申請日期2010年8月30日 優先權日2010年8月30日
發明者史雪巖, 宋敦倫, 尚慶利, 梁沛, 高希武 申請人:宋敦倫, 梁沛, 高希武