新的抗衰老試劑及其鑑別方法

2023-06-22 08:16:36 3

專利名稱：新的抗衰老試劑及其鑑別方法
技術領域：
本發明是關於新的抗衰老試劑、新的篩選鑑別和檢測抗衰老試劑的方法、和這些試劑在老年性疾病或老年症上的應用。本發明也報導了一個新的方法用於測量生物樣品中的抗衰老試劑的活性濃度。本發明還介紹了低劑量的雷帕黴素和它的衍生物以及其他TOR 途徑的抑制劑，作為熱量限制模仿物，在防治老年性疾病或老年症上的用途。
背景技術：
研究人類的衰老過程是非常有意義的，部分原因是很多疾病在老年人中橫行，例如癌症，老年痴呆症，帕金森氏病，腦卒中，心肌梗塞，心血管疾病，等等，許多老年性疾病缺乏預防和治療的方法。因此，通過研究動物衰老過程來尋找有效預防和治療老年性疾病的方法，在近十年裡被科學界所重視。儘管有許多有關衰老的文獻報導，完全了解衰老過程對人類在科學上仍舊是一個巨大的挑戰。目前世界上老年人口增加的很快，相應的健康醫療的負擔和花費也大大增加了，因此，研究衰老、發現用於老年性疾病的抗衰老試劑也變得很急切了。本發明披露這樣一個系統方法，有效的發現可以開發成預防和/或治療與老年性疾病或老年症的抗衰老劑。在有關衰老過程的眾多理論中，以及由此派生的用於防治老年性疾病的方法，有三個是主要的營養信號途徑(熱量限制)，線粒體途徑(活性氧，R0S)和端粒缺陷理論。營養信號途徑(熱量限制)與衰老熱量限制(Caloric Restriction, CR)或限食是已被公認為最可行的延緩衰老的方法，從酵母到哺乳動物皆可。CR被顯示可以降低老年性疾病的發病率或延緩發病時間，如靈長類動物的帕金森氏模型(Maswood N, et al. Proc Natl Acad Sci USA 101 18171-6,2004)、老年痴呆症(Qin ff, et al. J Alzheimers Dis. 10 :417-22,2006 ；ffang J, et al. Faseb J. 19 :659-61, 2005) Dahl-SS 大鼠的高血壓和心臟病(Seymour EM, et al. J Mol Cell Cardiol. 41 :661-8,2006)、纖維化(Castello L, et al. Faseb J. 19 :1863-15, 2005)和腎臟疾病(Yu BP, et al. J Gerontol, 37 =130-41,1982), CR 也抑制多種自發性腫瘤的，包括在P53基因敲除小鼠的產生腫瘤、小鼠模型的自發性前列腺癌(Berrigan D，et al.Carcinogenesis 23 :817_22，2002 ;Huffman DM, et al. Cancer Res. 67 :417-24,2007 ； Pollard M，et al. Comp Med. 56 :461_67，2006)、人類的乳腺癌、結腸癌和前列腺癌的發病率(Platz EA, J Nutr. 132 3471S-81S,2002 ；Demark-Wahnefried W，et al. Curr Opin Urol. 17 :168-74,2007 ；Torti DC，et al. Spots Med. 34 :363-69,2004 ；Steinbach G，et al.Cancer Res. 54 :1194_7，1994 ;Michels KB,et al. Jama，291 :1226—30，2004)
進化上高度保守TOR (target of rapamycin)整合由營養、生長因子、能源和壓カ 產生的信號，調節代謝與合成過程(Fingar DC, et al. Oncogene, 23 :3151-71,2004) 在最佳生長因子和營養條件下，哺乳動物的TOR(mTOR)刺激細胞的合成上調(如核糖體合成和蛋白質翻譯功能)，導致細胞體積數量增加和加速的增埴(Kim E, et al. Hum Gene Ther. 14:1415-28,2003)。反之，通過生長因子撤出、CR或壓カ而抑制mTOR，導致的對高耗能的過程下調和抑制細胞増殖。很多研究提出，TOR途徑在由CR誘導芽殖酵母，線蟲和果蠅的壽命延長起了很重要的作用(Kaeberlein M, et al. Science 310 :1193-6, 2005 ;Powers Rff, et al. Genes Dev. 20 :174-84,2006 ；Vellai T, et al. Nature,426 :620,2003 ;Kapahi P, et al. Curr Biol. 14 :885-90,2004 ；Jia K，et al. Developmental :3897-906, 2004)。因為 TOR 途徑非常保守，它在衰老上的作用也有可能適用於人類。線粒體/活性氧與衰老線粒體是細胞器通過氧化磷酸化的過程消耗代謝燃料(如葡萄糖和脂肪酸)，生產可用的能源ATP。線粒體還參與了其他重要的細胞功能，例如鈣穩態，細胞內信號轉導和細胞凋亡的調控。為生產ATP的線粒體氧化磷酸化過程，是活性氧(ROS)在細胞內的主要來源(約 90% 的細胞總 R0S) (Balaban RS, et al. Cell, 120 :483-95, 2005)。在正常氧化磷酸化過程中，ROS 洩漏估計佔氧消耗的 1-5% (Chance B，et al. Physiol Rev. 59 :527-605,1979) 由於線粒體對線粒體DNA(mtDNA)有限的修復能力和與ROS的近距離，線粒體特別容易積累ROS損傷，其產生的mtDNA突變可後導致線粒體氧化磷酸化功能受損，從而増加了 ROS的洩露和隨後更多的突變積累。由於ROS是高活性氧分子，可以對細胞產生各種損害，ROS洩露-基因突變這ー惡性循環，被認為推動了隨著時間而呈現指數增長的氧化損傷，而導致各種功能逐漸衰退，符合衰老過程的特徵。很多證據支持這樣的觀點，ROS參與了許多與老年性疾病的發展，包括糖尿病、心血管病、癌症和帕金森氏症的疾病(Kovacic P，et al. Curr Med Chem. 8 :773-96，2001 ; Aviram M. , et al. Am J Clin Nutr. 71 1062-76,2000 ；Maassen JA, et al.J Endocrinol Invest. 25 =477-84,2002);真核生物具有的抗氧化防禦系統也支持了產生內源性活性氧的重要作用(Mates JM, Toxicologyl53 =83-104,2000);而超氧化物歧化酶和過氧化氫酶大量表達確實可以延長果蠅壽命(Orr WC，et al. Science 263:1128-30,1994)。ー些研究還表明，線粒體功能完整隨年齡而下降，例如，線粒體膜電位，線粒體量和 ATP產生/O2 消費也一直隨衰老而下降(Hagen TM, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 3064-69，1997 ；Greco M. et al. Faseb J. 17 :1706-8，2003)。線粒體功能的突變可以造成很多人類遺傳病，它們在臨床表現上包括失明、耳聾、運動失調、痴呆、心血管疾病、肌肉無力、 腎功能不全如糖尿病和內分泌失調。最近也有報導表明，老鼠攜帶ー個由於在線粒體DNA 聚合酶PoIgA的校對缺陷突變，表現出線粒體DNA突變的大幅度提高和顯著的壽命縮短，同時表現出衰老的表型(Trifunovic A, et al. Nature 429:417-23,2004)。在酵母中由於 TORl去除導致的壽命延長(chronological life span)和在線蟲中由於限制葡萄糖導致的壽命延長是通過線粒體呼吸(Bonawiz, N. D.，et al.，Cell Metab.，5 :233-235(2007)； Schulz, T. J. ,et al. ,Cell Motab.，6 :280-293 (2007))。這些結果表明線粒體功能在哺乳動物的老化和老年性疾病的的重要作用。但是也有證據反對這個推測，例如，CR導致的酵母壽命延長不需要線粒體功能(Kaeberlei, M. , et al. , PloS Genet. , I, e69 (2005)) 所以， 線粒體在衰老過程的作用仍舊不清楚。染色體端粒，衰老，和癌症染色體端粒(telomeres)是染色體上的最末兩端,其中一條DNA鏈由含豐富的鳥嘌呤脫氧核苷酸(G)的重複DNA序列組成。(染色體)端粒與端粒蛋白結合，從而防止細胞錯認端粒為普通的雙鏈DNA斷裂(DSBs)。端粒功能障礙可以是因為端粒在細胞分裂中一點兒點兒縮短了，這是由於DNA 複製酶的內在缺陷以及大多數的人體細胞缺乏端粒酶活性，最後，嚴重縮短端粒不能結合端粒蛋白質，因此暴露這個自然雙鏈斷口，激活DNA損傷反應和誘導以RB和p53依賴的細胞周期阻滯，這一過程被稱為replicative senescence,或翻譯為細胞分裂靜止。這種分裂靜止狀態也可以由癌基因活化引起的DNA損傷信號所導致，從而抑制癌症的發展 (Di Micro, R. , et al. , Nature,444 :638-642(2006) ；Bartkova, J. , et al. , Nature,444 633-637(2006))。此外，引起DNA損傷的試劑也被報導引起這種靜止狀態。端粒功能障礙也可以是因為端粒蛋白功能不良而引起的。例如一個TRF2(TTAGGG 結合)的顯性負突變體的表達，或者POTl敲除，導致端粒功能障礙和DNA損傷信號 (Karlseder J, et al.Science 283:1321-5, (1999) ；Denchi EL, et al. Nature 448 1068-71,2007 ；Guo X，et al. Embo J. 26 :4709-19, (2007)).長的端粒與人類長壽有關，而短的端粒與癌症、特發性肺纖維化以及很多不同的分裂組織的病變有關。例如，端粒酶突變引起先天性角化不良症，患者通常過早死於骨髓衰竭。有證據表示分裂靜止狀是一個防止腫瘤發展的屏障，因為癌細胞需要無限制的細胞分裂。確實，分裂靜止狀的指標被發現出現在老鼠和人的癌前病變組織中，但不在晚期癌症組織中(Braig, M.，et al.，Nature, 436 :660-665 (2005) ；Collado, M.，et al.，Nature, 436 :642(2005) ；Michalogou, C.，et al.，Nature,436 :720-724(2005));所有的癌細胞都能穩定端粒長度，通過活化端粒酶，或者端粒重組(ALT)，從而繞過細胞分裂靜止狀態(Shay Jff, et al. Exp Cell Res. 209 :45-52,1993 ；Shay Jff, et al. Eur J Cancer 33:787-91， 1997 ；Kim NW, et al. Science 266:2011-5,1994 ；Bryan TM ；et al. Nat. Med. 3 :271-4, 1997);早期前列腺瘤的惡性進展可以被分裂靜止狀態所阻擋(Chen Z，et al. Nature 436 725-30，2005);此外，由p53介導的分裂靜止狀抑制了端粒酶缺陷Terc-/-小鼠的原發性腫瘤(Cosme-Blanco W，et al. EMBO Rep. 8 =497-503,2007) 分裂靜止狀態可能阻止細胞分裂周期，以利於修復，並阻斷早期病變的進一步發展。同時，分裂靜止狀態也被認為是衰老的重要貢獻者(Campisi，J，Nat. Rev. Cancer. 3 :339-49 ；Faragher, RG, Biochem. Soc. Trans, 28 :221-6,2000)。例如，在哺乳動物組織中，分裂靜止狀態的細胞隨年齡而增加(Campisi J，Celll20 =1-10,2005);分裂靜止細胞被發現的地方恰好有老年性病症，如骨關節炎，動脈粥樣硬化(Price JS, et al, Aging Cell, I :57-65, 2002 ；VasiIe E，et al, FASEB J，15 :458-66, 2001 ;Matthews C，et al, Cir Res, 99 :156-64,2006);此外，在小鼠，長期活躍表達p53基因既促進細胞的分裂靜止狀態， 加速衰老症狀(Maier B, et al. Genes Dev. 18 :306-19, 2004 ；Tyner et al. Nature 415 45-53,2002);有報導也表明，分裂靜止狀態的細胞分泌ー些蛋白質，促進腫瘤發展和炎症反應(Coppe JP, et al, PlosBiology,6 =2853-68,2008) 有人建議，分裂靜止程序導致與老年性疾病，限制了人的壽命(Blagosklonny MV, Cell Cycle, 5 =2087-102,2006) 因此， 從染色體端粒的角度的抗衰研究目前著重於防止分裂靜止狀態。儘管已有許多的研究，端粒在衰老過程的作用還是不清楚。例如，目前解釋不了為什麼老鼠有比人類長的端粒，但壽命比人類短；端粒在不分裂細胞中(如神經細胞和心臟細胞)怎樣與衰老相關也不清楚。除上述提到的三個衰老的理論，還有許多其他的理論，例如，損傷蛋白積累的理論，DNA突變積累的理論，幹細胞衰竭理論等。上面哪個理論代表的老化過程的真實本質， 以及他們是否和/或如何相互關聯的目前仍不清楚。因此，至少在一定程度上，人類衰老的進程仍然是ー個謎。老年性疾病，如癌症、心血管疾病、神經退化疾病等，是人類死亡的主要原因，目前針對這些疾病的藥物的發現和研發都根據我們目前對特定疾病的認識，因為對衰老過程的有限認識。因此，迄今為止，對這些疾病的研究相互獨立，與老化過程也沒有關聯。因此，有必要制定一個基於衰老過程的系統方法，去發現新型抗衰老試劑用於預防和治療老年性疾病或老年症。

發明內容
本發明提供了一個衰老過程的新機理，井根據新機制創建了ー個識別或檢測抗衰老劑，用於預防和治療老年性疾病或老年症，這個新方法可以用已被充分認知的酵母突變體模型來快速進行高通量篩選抗衰老劑。本發明披露篩選出來的一系列候選藥物，尤其是低劑量的雷帕黴素或它的衍生物，在防治老年性疾病或老年症的用法和用途。本發明的ー個方面提供了ー個篩選鑑別、檢測防治老年性疾病或老年症藥物的方法，此法包括用分裂靜止狀模型去篩選ー種或多種化合物或組合物，並測量它們的抗衰老活性。另ー方面，本發明提供了ー個篩選鑑別、檢測防治老年性疾病或老年症藥物的方法，此法篩選ー種或多種化合物或組合物，並用T0R/AMPK/線粒體/分裂靜止途徑的最少一個成分測量它們的活性。另ー方面，本發明提供了ー個篩選鑑別、檢測防治老年性疾病或老年症藥物的方法，此法篩選ー種或多種化合物或組合物，並用線粒體生物合成途徑的最少ー個成分測量它們的活性。另ー方面，本發明提供了ー個篩選鑑別、檢測防治老年性疾病或老年症藥物的方法，此法篩選ー種或多種化合物或組合物，並用AMPK途徑的最少ー個成分測量它們的活性。另ー方面，本發明提供了ー個篩選鑑別、檢測防治老年性疾病或老年症藥物的方法，此法篩選ー種或多種化合物或組合物，並用分裂靜止途徑的最少ー個成分測量它們的活性，此化合物在不分裂細胞中維持分裂靜止或細胞周期阻滯狀態、防止分裂靜止狀退化以及隨後的線粒體衰退或細胞死亡。另ー方面，本發明提供了防治老年性疾病或老年症的方法，這個方法給需要的個體一個組合物包括用本發明描述的方法篩選出來的試劑，或它的藥學上可接受的鹽、溶劑化物，或藥物前體(prodrug)等等。另一方面，本發明提供了防治老年性疾病或老年症的方法，這些老年性疾病與染色體端粒功能受損和/或線粒體功能受損有關；這個方法是給需要的個體一個組合物包括 AMPK活化劑，或它的藥學上可接受的鹽、溶劑化物，或藥物前體等，AMPK活化劑直接或間接活化AMPK,增加線粒體生物合成,在個體的分裂靜止細胞或不分裂細胞中維持細胞分裂靜止狀。另一方面，本發明提供了防治老年性疾病或老年症的方法，這個方法是給需要的個體一個組合物包括TOR抑制劑，或它的藥學上可接受的鹽、溶劑化物，或藥物前體 (prodrug)等等,低劑量TOR抑制劑可以(a)增加細胞分裂次數，(b)在分裂靜止細胞或不分裂細胞中維持細胞分裂靜止狀，(c)防治分裂靜止狀態退化消失後線粒體損壞或細胞死亡。在這裡，TOR抑制劑是指低劑量的雷帕黴素或它的衍生物。另一方面，本發明提供了一個用酵母分裂靜止模型來測量生物樣品中的抗衰老劑的方法。另一方面，本發明提供了測量生物樣品中抗衰化試劑的生物濃度的方法，此法用酵母分裂靜止模型，並對比與事先設立抗衰老試劑的標準濃度。另一方面，本發明披露，線粒體功能在維持染色體端粒功能障礙引起的分裂靜止狀態起了重要作用，熱量限制(CR)通過T0R/AMPK/線粒體/分裂靜止途徑維持分裂靜止狀。這個機理從酵母到人的染色體端粒功能障礙模型中都是進化上保守的。這個保守機理使得這些酵母和人的染色體端粒功能障礙模型可以用於篩選藥物，針對提高線粒體活性、 防止、治療分裂靜止狀退化。因為許多老年性疾病與線粒體和/或端粒功能障礙有關，用這些模型得到的試劑可以用於此防治類老年性疾病。目前抗衰老研究的主流是禁止分裂靜止狀態的發生，這是基於分裂靜止狀態是衰老的主要的促進者這樣的概念；本發明報導了一個創新的防治老年性疾病或老年症的策略，即維持分裂靜止狀態。本發明的其他方面在下面的說明和權利要求中有詳細的描述。


圖I顯示限制營養信號抑制cdcl3-lp滅活引起的細胞死亡。(A)葡萄糖限制和2-脫氧葡萄糖抑制cdcl3-lp滅活引起的細胞死亡，細胞死亡用菌落形成法測量。為了使染色體端粒功能失活，cdcl3-l細胞的新鮮過夜培養液用YEH)培養基稀釋，葡萄糖濃度和2-脫氧葡萄糖濃度如圖所示，37°C培養24小時以滅活cdcl3-lp。菌落形成法如下，cdcl3-lp滅活的細胞用水作一系列10-倍稀釋，取5iil點在普通YEH)培養板上，培養板在24°C培養，讓存活的細胞形成菌落。起始用的活細胞數也用此法測量。(B)氮限制抑制cdcl3-lp滅活引起的細胞死亡(菌落形成法測量)。細胞培養在合成培養基(SC)、 或SC-N(SC去胺基酸和(NH)2SO4)中，37°C培養24小時，存活細胞數如圖IA用菌落形成法測量。(C-D)低劑量(低於抑制細胞生長的濃度)雷帕黴素抑制T0R(標示為Rapa)抑制 cdcl3-lp滅活引起的細胞死亡。cdcl3-l細胞在含如圖所示的雷帕黴素的濃度YEH)培養基中37°C培養24小時，存活細胞數如圖IA用菌落形成法測量。為得到生長曲線，用含如圖所示的雷帕黴素的濃度YEH)培養基在24°C培養cdcl3-l細胞，在圖所示的時間測量的細胞密度(OD595)相對時間作圖。(E)細胞周期阻滯的cdcl3-l的丟失可以被雷帕黴素(InM) 和葡萄糖限制(0.5%葡萄糖)推遲，存活細胞數用菌落形成法測量。數據代表3次實驗的平均數。圖2顯示營養信號不影響滅活cdcl3-lp引起的在G2/M的細胞周期阻滯，但維持這個G2/M周期阻滯狀態，並防止細胞死亡。(A)培養在YEro、YEH)+lnM雷帕黴素、或0. 5% 葡萄糖YEH)的cdcl3-l細胞用37°C滅活cdcl3-lp，在所示的時間點，取一部分細胞用50% こ醇在-20°C固定4小時，用0. 2mg/ml RNaseA(Tris pH7. 6)在37°C消化過夜，細胞用50mM Tris pH7. 6洗過後，再用蛋白酶K在55°C處理2小時，然後清洗；細胞用100 y g/ml碘化丙啶染色在黑暗中染色20分、FACS分析(B)細胞存活實驗表示，cdcl3-lp滅活引起的的在 G2/M分裂停止2小時後，雷帕黴素或葡萄糖限制仍然可以抑制細胞死亡。cdcl3-l細胞先在37°C孵化2小吋，然後轉入在37°C的YEH)、YEPD+雷帕黴素、或0. 5%葡萄糖YPED。細胞在37°C培養22小時，存活細胞數用菌落形成法測量。圖3顯示雷帕黴素(InM)和葡萄糖限制(0. 5 % )降低cdcl3-lp滅活而產生的 R0S(R0S用脫氫羅丹明123 (Invitrogen)染色，然後FACS分析)(A)，並降低細胞凋亡(用 annexin V-FITC和FACS測量凋亡標記磷脂醯絲氨酸(PS)翻轉(B)。A.細胞培養如同在圖IA和IC所示，然後用5 u g/ml脫氫羅丹明123在YETO中染色I小時再FACS分析測量 ROS0每個樣本分析10，000細胞。B.測量細胞凋亡-處理好的細胞,懸浮於含I. IM山梨醇和2mg/ml zymolyase的PBS緩衝液中，37°C孵育20分，細胞用annexin V-FITC和碘化丙唳染色(在含I. IM山梨醇的PBS中)(BD Biosciences Pharmingen)。姆個樣本分析了 10，000細胞。在此條件下，碘化丙啶-陰性群體表示完整細胞，碘化丙啶-陰性+FITC陽性代表凋亡細胞，碘化丙啶-陽性+FITC陽性代表晩期凋亡細胞或壞死細胞。圖4顯示雷帕黴素和葡萄糖限制通過AMPK防止cdcl3-lp滅活引起的細胞死亡。 (A)去除AMPK調節亞基蛋白Sip2p取消了葡萄糖限制的作用。(B)去除AMPK的催化亞基蛋白Snflp或調節亞基Snf4p顯著的降低了雷帕黴素(InM)的作用。cdcl3_lsip2: :Kan, cdcl3-lsnfl: :kan和cdcl3_lsnf4: :Kan雙突變細胞是這樣得到的雜交從單個基因敲除庫(Invitrogene, Carlsbad, CA)中來的單個基因敲除突變體與cdcl3_l,培養單倍體的孢子並分離，篩選高溫敏感和G418(200ug/ml)抗性的孢子。細胞培養如同在圖IA和IC所示， 存活細胞用菌落形成法來測量。圖5顯示線粒體在熱量限制預防cdcl3-l死亡起的重要作用。(A)線粒體缺陷顯著抑制雷帕黴素和葡萄糖限制的作用。cdcl3-l培養在含溴こ啶的YC培養基來得到線粒體缺陷突變體 P°(Qi,H.，et al，J. Biol. Chem. ，278 :15136-15-41 (2003))。細胞培養如同圖IA和1C。存活細胞用菌落形成法來測量。(B-C)葡萄糖限制和雷帕黴素提高線粒體量。新鮮的過夜培養液用以下培養基稀釋YEH)，或YEPD+雷帕黴素(B)，YEH)，0.5%葡萄糖YEH) (C)，細胞在24°C培養4小時或到對數生長階段，細胞被60%こ醇固定，MitoTracker Green FM染色，FACS分析，測量線粒體量。圖6顯示營養信號通過T0R、AMPK、和線粒體來維持分裂靜止狀、在酵母cdcl3_l模型中防止端粒功能障礙引起的細胞死亡的機理。圖7顯示ー些試劑抑制分裂靜止的WI-38細胞的損失，這些試劑包括50pM雷帕黴素，250 u M AICAR，20 u g/ml兒茶素(EGCG)，I. 6 y g/ml葡萄籽提取物(GSE)，減少葡萄糖(從0. 4%減到0. 2% ),20u g/ml覆盆子提取物(BE) ,IuM異硫氰酸烯丙酯(AITC)，和
12.5uM 2-脫氧葡萄糖。AICAR和0.2%葡萄糖的用法是2天有/8天無的周期，其他的試劑是用3天有/7天無的周期。實驗始於第29細胞傳代(passage 29)。培養基每3天換一次，第31傳代進入分裂靜止狀態。進入靜止狀態56天後，細胞用2%甲醛/0. 2%戊二醛很快固定一下，用X-gal染色(溶液含lmg/ml X_gal, 40mM朽1檬酸/磷酸鹽,pH6. 0, 5mM亞鐵氰化鉀，5mM鐵氰化鉀，150mM NaCl, ImM MgCl2)，37°C，18小時，測量細胞的@ _半乳糖苷酶活性(彩照中為藍色，黑白照中衛深灰色)。存活的靜止狀態細胞用顯微鏡觀察。圖8顯示低劑量雷帕黴素在人成纖維細胞中提高線粒體量，促進線粒體膜潛能， 並降低ROS水平。(A)測量線粒體量在傳代24的WI-38細胞中加入不同濃度雷帕黴素培養 2 天。細胞 _20°C用 60% 乙醇固定，用 MitoTracker Green FM(Invitrogene)染色 30 分然後FACS分析。(B)測量線粒體膜潛能在人淋巴細胞L40中加入不同濃度雷帕黴素培養 2天，用5ug/ml JC-I (Invitrogene)在黑暗中染色15分。細胞用PBS緩衝液洗一次，然後 FACS分析。用FLl測量單體JC-I的綠色螢光(Aem = 525nm),FL2測量聚合體JC-1的紅色螢光(Aem = 590nm)。FL2/FL1或紅色/綠色的比例表示線粒體的膜潛能。只有正常細胞的數據被採用，正常細胞選定是根據不加試劑的樣本中的細胞正向和側向散射。(C)測量 ROS0加藥培養的L40細胞用2ug/ml的dehydrorhodamine 123染色30分,然後FAC分析。 在以上的每一個實驗中，至少10，000細胞被分析，數據代表兩次實驗的平均。圖9顯示只有低劑量雷帕黴素(低於生長抑制劑量)可以防止分裂靜止細胞 WI-38損失。(A)傳代29的WI-38細胞被加入圖7表示的雷帕黴素的濃度，細胞在傳代31 的時候進入分裂靜止狀態，進入靜止狀態以後的第65天，存活細胞用MTT染色方法來測量。 微孔皿酶標儀可在570納米處讀出紫色的深淺度，它由線粒體還原酶催化MTT產生的。這個數據代表三個獨立的雙實驗。(B)雷帕黴素對WI-38細胞生長的作用。細胞培養如圖7 所示，箭頭表示雷帕黴素在此時加入。25pM雷帕黴素對生長几乎沒有抑制作用，但增加細胞分裂的次數(PD)從5. 18到6. 82。細胞分裂次數用以下公式來計算PD = log(Nf/N0)/ log2，Nf為最終總細胞數，Ntl為起始總細胞數。數據代表兩次獨立的雙實驗。(C)低劑量的雷帕黴素增加以下蛋白的含量p53，p21，和pRB。WI-38細胞在分裂靜止狀態第20天時， 加雷帕黴素培養18小時。裂解細胞，用免疫印記(Western blotting),通過抗體特異性反應，分析p53，p21和pRB的蛋白含量。圖10顯示通過以下方法處理2天，人的淋巴細胞L40中增加線粒體量，⑷10 ii M LY294002 (PI3K抑制劑)，2 y M 二烯丙基三硫(DATS)，I U M苄基異硫氰酸酯(BITC)， I PM苯基異硫氰酸酯(PITC), 2 u g/ml白藜蘆醇(RSV)，0.03 ii M番茄紅素(Iycopene)， (B) 6. 7 ii M異硫氰酸苯(PEITC)，5mM水飛薊賓(silibinin)，I. 25mM亞硒酸鈉，2. 5mM染料木素(genistein)，250ii g/ml GSE,50u g/ml EGCG, 3mg/ml BE，I y M AITC，50pM雷帕黴素， 250 u M AICAR，或葡萄糖減少(從0. 4%到0. 2% )。測量線粒體量-細胞用60%乙醇固定後，用 MitoTracker Green FM 染色，再 FACS 分析。圖11顯示一些防癌劑或有抗衰老活性的試劑抑制cdcl3-lp滅活引起的細胞死亡。6. 7 ii M PEITC, 5mM水飛薊賓，I. 25mM亞硒酸鈉，2. 5mM染料木素，250 u g/ml GSE, 50 u g/ ml EGCG，或3mg/ml BE與細胞共培養30小時。細胞存活用24°C菌落形成法測量。圖12顯示低劑量雷帕黴素和AICAR扭轉TPA降低的線粒體量。NIH3T3細胞用DMEM培養基培養，DMEM含有10%小牛血清，100單位/毫升盤尼西林，100 u g/ml鏈黴素，2mM穀氨醯胺，DMSO對照、IOii M TPA、InM雷帕黴素、IOii M TPA+lnM雷帕黴素，40 y M AICAR、或 IOuM TPA+40UMAICAR加入培養基培養細胞(37°C、5% CO2) 2天。細胞用胰酶收穫、60%こ 醇固定、MitoTracker Green FM在黑暗中染色30min,然後FACS分析。顯示的數據是3次試驗的平均結果。圖13顯示低劑量雷帕黴素和AICAR防止TPA誘導的NIH3T3細胞的癌轉化。(A) NIH3T3細胞培養在含IOiiM TPA的0. 39%軟瓊脂中，對照DMSO、InM雷帕黴素、或250nM AICAR被加入培養基中，培養7天，在顯微鏡下癌細胞克隆。(B)數據顯示4次試驗的平均。圖14顯示低劑量雷帕黴素，0. 2和2pM培養的延長小腦神經元細胞(CGN)細胞的壽命(A)並降低ROS水平(B)CGN細胞從7-天大的新生大鼠提取。簡單的說，把小腦從大腦分離出來，切成小塊，胰酶消化37°C 15分，用40-iim孔膜過濾，細胞離心沉澱，再用含 25mM KCl 的 B27 神經細胞懸浮液(supplemented neurobasal medium)懸浮。(A)細胞壽命試驗，細胞種在24-孔培養皿中(I皿/1小腦)加入神經元培養液(含B27，20mM KCl, 0. 5mM穀氨酸，100單位/毫升的盤尼西林，100 u g/ml鏈黴素)。培養7天後，加入雷帕黴素，31天後存活的細胞用MTT測量。(B)ROS水平。懸浮在培養液中的CGN細胞分裝在試管 (12x75mm)中(I百萬/ml/試管)，加入雷帕黴素培養20小吋，細胞用2 u g/ml的脫氫羅丹明123染色30分，然後FACS分析。圖15顯示低劑量的雷帕黴素在大鼠腦卒中模型中減少大腦梗死體積。(A) 10 u g/ kg雷帕黴素減少大腦損傷。以大腦中動脈梗塞(MCA)造成局灶性腦缺血。SHP-SP大鼠隨機分成2組、每組8隻對照組和雷帕黴素組，給藥10分後造摸。MCA24小時後取大腦切片(2mm 厚)，切片用 2% 的 TTC(2, 3, 5-triphenyltetrazolium chloride)染色，梗死細胞不能被染色，正常細胞染為紅色。每片切片的梗死面積和正常面積用ー個圖像分析軟體 (Microsystems Type DM LB2,Leica,德國)來定量。大腦水腫對分析的幹擾也被校正(在同一切片內，通過從對側大腦半球減去無缺血的同側大腦半球)。梗死面積表達為佔對側大腦半球比例。(B) —些低劑量的雷帕黴素減少大腦梗死造成的腦損傷。SHP-SP大鼠隨機分組、每組8隻。雷帕黴素0,0. 3,1,3,IOu g/kg給藥20天，然後造模MCA。圖16顯示低劑量雷帕黴素降低在WI-38細胞中MPP+引起的ROS水平。 MPP+(200 PM)和不同濃度的雷帕黴素加入細胞並培養3天。細胞用脫氫羅丹明123在黑暗中染色30分，然後進行FACS分析。圖17顯示低劑量雷帕黴素在IOii g/kg，而非IOOii g/kg，減少大鼠心肌梗死體積 (MI)。SD雄性白化大鼠Sprague-Dawley在200-250g被隨機分組，每組(n) 10-12隻，用0， 10，或100 u g/kg的雷帕黴素給藥3天，然後麻醉老鼠，剝露心臟，結紮左前降動脈(在肺動脈流出道和左心房之間)，心臟放回去，縫合胸腔，去除空氣，大鼠回籠。5個小時後，解剖老鼠，左心室被分出，垂直心臟長軸切成4-5片，然後用硝基四氮唑藍磷酸鹽緩衝液染色。正常組織呈藍色，梗死組織不能被染色。染色和不被染色的組織被分別分離出來並稱重。心肌梗死體積(MI)表達為不染色組織佔左心室的比例。圖18顯示葡萄糖或TOR調節衰老過程的模型，在多種組織中是通過AMPK/R0S/線粒體途徑,導致老年性疾病。圖19圖示了一個高通量篩選抗衰老試劑的方法，用酵母的存活來測量。
圖20圖示了一個高通量篩選抗衰老候選物的方法，用酵母的ROS水平來測量圖21顯示用cdcl7-l或cdcl7-2來篩選抗衰老試劑的的例子。突變細胞用含雷帕黴素0，1，3nM的YEH)培養基、或0. 5%葡萄糖的YETO，37°C培養22hrs。細胞被10-倍系列稀釋，點在YEH)培養板上，24°C培養，存活細胞將形成菌落。
具體實施例方式本發明描述一個創新的方法，篩選鑑別、檢測和提純抗衰老試劑，以及這些試劑在防治老年性疾病或老年症的用途。本發明基於，尤其是，以下的發現(I)抑制營養信號在酵母中延長端粒功能障礙引起的分裂靜止狀態，通過AMPK下遊的線粒體途徑；(2)低劑量雷帕黴素、葡萄糖限制和AMPK激活劑在人成纖維細胞中刺激線粒體活性，延長端粒功能障礙引起的分裂靜止狀；(3) —些具某些抗衰老或防癌功能的試劑也能刺激線粒體功能，防止分裂靜止的酵母和人細胞死亡；(4)許多老年性疾病或老年症與線粒體或端粒功能障礙有關，以及(5)低劑量雷帕黴素防止急性缺血性心肌損傷(心肌梗死)和缺血性大腦損傷 (腦卒中)，降低MPP+引發的ROS升高，延長培養的神經元細胞的壽命，並防止細胞的癌轉化。第一部分，本發明提供了一個方法，篩選鑑別和檢測化合物，用以防治老年性疾病或老年症，此方法包括用分裂靜止狀模型篩選一個或多個化合物或組合物，跟蹤它或它們的抗衰老活性。在第一部分的一個實施例，本發明提供了一個方法，篩選鑑別或檢測化合物，用以防治老年性疾病或老年症，此方法中的抗衰老活性是指在分裂靜止狀或不分裂細胞中可以防止分裂靜止狀態退化喪失。在第一部分的另一個實施例，本發明提供了一個方法，篩選鑑別或檢測化合物，用以防治老年性疾病或老年症，此方法中的抗衰老活性是可以指刺激、增進或維持線粒體功倉泛。在第一部分的另一個實施例，本發明提供了一個方法，篩選鑑別或檢測化合物，用以防治老年性疾病或老年症，此方法中的抗衰老活性是指可以防治與線粒體或端粒功能障礙有關的老年性疾病。在第一部分的另一個實施例，本發明提供了一個方法，篩選鑑別或檢測化合物，用以防治老年性疾病或老年症，此方法中的抗衰老活性是指可以可以防止端粒功能障礙引起的ROS升高或由端粒功能障礙引起的細胞凋亡增加。在第一部分的另一個實施例，本發明提供了一個方法，篩選鑑別或檢測化合物，用以防治老年性疾病或老年症，此方法中的分裂靜止模型指酵母突變體的模型，含端粒功能障礙。在第一部分的另一個實施例，本發明提供了一個方法，篩選鑑別或檢測化合物，用以防治老年性疾病或老年症，此方法中的分裂靜止模型指元代人體細胞系的模型，缺乏或不足端粒酶活性。在第一部分的另一個實施例，本發明提供了一個方法，篩選鑑別或檢測化合物，用以防治老年性疾病或老年症，此方法中的分裂靜止模型指人體細胞系的模型，含端粒蛋白或端粒酶變異缺陷引起的端粒功能障礙或喪失。
在第一部分的另ー個實施例，本發明提供了ー個方法，篩選鑑別或檢測化合物，用以防治老年性疾病或老年症，此方法中的端粒功能障礙模型是由化學試劑引起的。在第一部分的另ー個實施例，本發明提供了ー個方法，篩選鑑別和檢測化合物，用以防治老年性疾病或老年症，此方法中的分裂靜止模型是由癌基因活化和/或DNA損失反應引起的。在第一部分的另ー個實施例，本發明提供了ー個方法，篩選鑑別或檢測化合物，用以防治老年性疾病或老年症，此方法中的分裂靜止模型指小鼠、大鼠或s. Pombe細胞株，含端粒功能功能缺陷。在第一部分的另ー個實施例，本發明提供了ー個方法，篩選鑑別或檢測化合物，用以防止老年性疾病或老年症，此方法包括以下的步驟(i)由端粒功能障礙或DNA損傷引起的分裂靜止狀的態酵母細胞與ー個化合物或組合物一起孵化一段時間後；(ii)用細胞凋亡實驗測量死亡酵母細胞數量，或者，(iii)去除引起細胞分裂靜止的條件，測量存活細胞數；以及(iv)與對照實驗比較步驟ii的細胞死亡數或步驟iii的細胞存活數，所述對照實驗除了沒有化合物或組合物外，其他條件均與步驟i相同，其中，如果相對於對照實驗，步驟ii得到減少的死亡細胞數，或者步驟iii得到增加的存活細胞數，則表明此化合物或組合物是ー個候選的抗衰老劑。在第一部分的另ー個實施例，本發明提供了ー個方法，篩選鑑別或檢測化合物，用以防治老年性疾病或老年症，此方法也可以包括以下的步驟(i)將鑑別出的化合物或組合物與分裂靜止狀哺乳動物細胞一起孵化一段時間後;(ii)測量存活的分裂靜止狀細胞數；和(iii)與對照實驗比較存活的分裂靜止細胞數數量其中，相對於對照實驗，如果步驟ii中存活的分裂靜止細胞數量増加，則確認此化合物或組合物是ー個候選的抗衰老劑。在第一部分的另ー個實施例，本發明提供了ー個方法，篩選鑑別或檢測化合物，用以防治老年性疾病或老年症，此方法也可以包括以下的步驟(i)將鑑別出的化合物或組合物與正常生長的人體細胞株一同孵育一段時間；(ii)通過測量線粒體量、線粒體DNA含量、或線粒體轉錄因子的表達來測定人體細胞的線粒體生物合成，和(iii)與對照實驗比較得到結果，其中，相對於對照實驗，如果步驟ii得到增強的線粒體生物合成，則進ー步確認鑑別出的化合物或組合物為候選的抗衰老劑。在第一部分的另ー個實施例，本發明提供了ー個方法，篩選鑑別或檢測化合物，用以防治老年性疾病或老年症，此方法也可以是以上3個實施例的的步驟任意組合。在第一部分的另ー個實施例，本發明提供了ー個方法，篩選鑑別或檢測化合物，用以防治老年性疾病或老年症，此方法中的分裂靜止狀模型是含端粒功能障礙或喪失的變異酵母，包括 cdcl3_l, cdcl3_2, stnl-1, cdcl7_l, cdcl7_2, hdfl, hdf2, estl, est2,和 est3.
在第一部分的另一個實施例，本發明提供了一個方法，篩選鑑別或檢測化合物，用以防治老年性疾病或老年症，此方法中的分裂靜止狀模型是缺乏或不足端粒酶的元代人體細胞系，最少包括成纖維細胞，內皮細胞，外皮細胞中的一種。在第一部分的另一個實施例，本發明提供了一個方法，篩選鑑別或檢測化合物，用以防治老年性疾病或老年症，此方法中的分裂靜止狀模型是人體變異細胞引起的端粒功能障礙，包括變異在TRF2，POTl，TERT, TERC，或WRN等基因。在第一部分的另一個實施例，本發明提供了一個方法，篩選鑑別或檢測化合物，用以防治老年性疾病或老年症，此方法中的分裂靜止狀模型是化合物引起的端粒功能障礙， 包括博萊黴素，阿得瑞黴素(adiramycin),和G4結構配體。在第一部分的另一個實施例，本發明提供了一個方法，篩選鑑別或檢測化合物，用以防治老年性疾病或老年症，此方法中的老年性疾病是指非正常細胞增生疾病，退化性疾病，和功能減弱症。在第一部分的另一個實施例，本發明提供了一個方法，篩選鑑別或檢測化合物，用以防治老年性疾病或老年症，此方法中的化合物或組合物可以屬於一個化合物庫。所以，本發明優選是實施例包括高通量篩選的方法。第二部分，本發明提供了一個實施例，篩選鑑別或檢測防防治老年性疾病或老年症的化合物，此方法包括用篩選一個或多個化合物或組合物，並測量它或它們對T0R/AMPK/ 線粒體/分裂靜止狀途徑中的至少一個組成成分的作用，在這裡，此化合物或組合物(a)增加細胞分裂次數，(b)在不分裂細胞中維持分裂靜止狀態或細胞周期阻滯狀態，(C)或防止線粒體功能退化或由於分裂靜止狀態/細胞周期阻滯狀態的退化引起的細胞死亡。本發明的這一部分與第一部分相關，即抗衰老活性與T0R/AMPK/線粒體/分裂靜止狀途徑有關，並維持分裂靜止狀態。在第二部分的一個實施例，本發明提供了一個方法，篩選鑑別或檢測防防治老年性疾病或老年症的化合物，所述的老年性疾病或老年症，與分裂靜止細胞和不分裂細胞的分裂靜止狀態退化、和接下來的細胞死亡有關，以及與線粒體退化的加速、ROS的增加和端粒功能障礙相關。在第二部分的另一個實施例，本發明提供了一個方法，篩選鑑別或檢測防防治老年性疾病或老年症的化合物，此方法中所說的T0R/AMPK/線粒體/分裂靜止狀途徑中的組成成分包括胰島素/IGF，胰島素/IGF 受體，PI3K，PDKl, PTEN, TSCl, TSC2，AKT，Rheb, raptor, G^L, S6K, TOR, AMPK, STRAD, M025, LKBI,葡萄糖吸收，胺基酸吸收，CaMKK^， PGC-I a，PGC-I3，NRF-I，NRF-2，TFAM, TFB1M，TFB2M, ERRs(如 EER a，EERb a , ERR y), PPARs (如 PPARa，PPAR 8，PPAR y ), SIRTl，RIP140, PRC, POLRMT, ATM, p53, p21, pl9嫌， WAFI, pl6INK4a, pRB, PTEN, E2F, p27KIP1。在第二部分的另一個實施例，本發明提供了一個方法，篩選鑑別或檢測防防治老年性疾病或老年症的化合物，此方法中的老年性疾病或老年症是指細胞非正常細胞增殖疾病，退化性疾病，和功能減弱症。在第二部分的另一個實施例，本發明提供了一個方法，篩選鑑別或檢測防防治老年性疾病或老年症的化合物，此方法中的一個或多個化合物或組合物，每個可屬於一個化合物庫。
第三部分，本發明提供了一個實施例，篩選鑑別或檢測防治老年性疾病或老年症的化合物，此方法包括用篩選ー個或多個化合物或組合物，並測量它或它們對線粒體生物合成途徑中的至少ー個組成成分的作用，在這裡，此化合物或組合物(a)增加細胞分裂次數，(b)在不分裂細胞中維持分裂靜止狀態或細胞周期阻滯狀態，或(C)防止線粒體功能退化或由於分裂靜止狀態退化引起的細胞死亡。本發明的這一部分與第一部分相關，即抗衰老活性與線粒體生物合成途徑有夫，它在維持分裂靜止狀起作用。在第三部分的一個實施例，本發明提供了ー個方法，篩選鑑別或檢測防治老年性疾病或老年症的化合物，此方法中的老年性疾病或老年症是指與在分裂靜止細胞中或不分裂細胞中由分裂靜止狀態退化引起的細胞死亡有關的疾病、與加速的線粒體功能退化、增大的氧化壓力、或端粒功能障礙有關的疾病。在第三部分的另ー個實施例，本發明提供了ー個方法，篩選鑑別或檢測防治老年性疾病或老年症的化合物，此方法中所說的線粒體生物合成途徑中的組成成分包括AMPK， STRAD, M025, LKBl，葡萄糖吸收，胺基酸吸收，CaMKK ^，PGC-I a，PGC-I ^，NRF-I, NRF-2， TFAM, TFB1M, TFB2M, ERRs (如 EER a，EERb a , ERR y ), PPARs (如 PPAR a，PPAR 8，PPAR y )， SIRTl, RIP140, PRC, POLRMTo在第三部分的另ー個實施例，本發明提供了ー個方法，篩選鑑別或檢測防治老年性疾病或老年症的化合物，此方法中的老年性疾病或老年症是指非正常細胞増殖疾病，退化性疾病，和功能減弱症。在第三部分的另ー個實施例，本發明提供了ー個方法，篩選鑑別或檢測防治老年性疾病或老年症的化合物，此方法中的ー個或多個化合物或組合物，每個可屬於ー個化合物或組合物庫。第四部分，本發明提供了一個實施例，篩選鑑別或檢測防治老年性疾病或老年症的化合物，此方法包括用篩選ー個或多個化合物或組合物，並測量它或它們對AMPK途徑中的至少ー個組成成分的作用，在這裡，此化合物或組合物(a)增加細胞分裂次數，(b)在不分裂細胞中維持分裂靜止狀態或細胞周期阻滯狀態，或(c)防止線粒體功能退化或由於分裂靜止狀態退化引起的細胞死亡。本發明的這一部分與第一部分相關，即抗衰老活性與 AMPK途徑有夫，它在維持分裂靜止狀起作用。在第四部分的一個實施例，本發明提供了ー個方法，篩選鑑別或檢測防治老年性疾病或老年症的化合物，此方法中所說的老年性疾病或老年症與分裂靜止狀態退化、衰老引起的細胞喪失、腫瘤形成或癌症發展惡化有夫。在第四部分的另ー個實施例，本發明提供了ー個方法，篩選鑑別或檢測防治老年性疾病或老年症的化合物，此方法中所說的AMPK途徑中的組成成分包括AMPK，STRAD, M025, LKBlJP CaMKK^。在第四部分的另ー個實施例，本發明提供了ー個方法，篩選鑑別或檢測防治老年性疾病或老年症的化合物，此方法中的老年性疾病或老年症是指非正常細胞増殖疾病，退化性疾病，和功能減弱症。在第四部分的另ー個實施例，本發明提供了ー個方法，篩選鑑別或檢測防治老年性疾病或老年症的化合物，此方法中的ー個或多個化合物或組合物，每個可屬於ー個化合物或組合物庫。
第五部分，本發明提供了一個實施例，篩選鑑別或檢測防治老年性疾病或老年症的化合物，此方法包括用篩選一個或多個化合物或組合物，並測量它或它們對分裂靜止狀途徑中的至少一個組成成分的作用，在這裡，此化合物或組合物在不分裂細胞中維持分裂靜止狀態或細胞周期阻滯狀態，或防止線粒體功能退化或由於分裂靜止狀態退化引起的細胞死亡。本發明的這一部分與第一部分相關，即抗衰老活性與分裂靜止狀途徑有關，它維持分裂靜止狀。在第五部分的一個實施例，本發明提供了一個方法，篩選鑑別或檢測防治老年性疾病或老年症的化合物，此方法中所說的老年性疾病或老年症與分裂靜止狀態退化、在分裂靜止細胞中或不分裂細胞中由分裂靜止狀態退化引起的細胞死亡、與加速的線粒體功能退化、增大的氧化壓力、或端粒功能障礙有關。在第五部分的另一個實施例，本發明提供了一個方法，篩選鑑別或檢測防治老年性疾病或老年症的化合物，此方法中所說的分裂靜止狀途徑中的組成成分包括ATM，p53， p21, pl9AEF, WAFl，pl6INK4a, pRB, E2F, PTEN, p27KIP1。在第五部分的另一個實施例，本發明提供了一個方法，篩選鑑別或檢測防治老年性疾病或老年症的化合物，此方法中的老年性疾病或老年症是指非正常細胞增殖疾病，退化性疾病，和功能減弱症。在第五部分的另一個實施例，本發明提供了一個方法，篩選鑑別或檢測防治老年性疾病或老年症的化合物，此方法中的一個或多個化合物或組合物，每個可屬於一個化合物或組合物庫。第六部分，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此法包括給需要的個體一種組合物，其含有一個根據以上描述的第一到第五方面實施例篩選出的化合物， 或它的藥學上可接受的鹽、溶劑化物、或藥物前體。這個方面包含用以上所述方法篩選的化合物來配成或成藥用於防治老年性疾病。在第六部分的一個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法， 此法中所說的老年性疾病或老年症與在分裂靜止細胞中或不分裂細胞中的分裂靜止狀態退化、線粒體功能退化、或端粒功能障礙相關。在第六部分的另一個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法中所說的化合物可以是無機分子、有機分子、天然化合物、多肽、蛋白、DNAs、 RNAs、或代謝中間體等。在第六部分的另一個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法中所說的化合物可以是AICAR，低劑量雷帕黴素或它的衍生物，EGCG，葡萄籽提取物，覆盆子提取物，亞硒酸鈉，染料木素，二烯丙基三硫，苯基異硫氰酸酯，苄基異硫氰酸酯， 異硫氰酸苯乙酯，白藜蘆醇，番茄紅素，異硫氰酸烯丙酯。在第六部分的一個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法， 本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法中所說的組合物中可以含第二種化合物，包括抗氧化、防高血壓的、降低血脂的、防治中風的、防癌的、或另一個抗衰老試劑。在第六部分的另一個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法中所說的組合物中的、第二種化合物中的抗氧化劑，可以是維他命C、維他命E、胡蘿蔔素、其他類胡蘿蔔素、亞硒酸鈉，硫辛酸、番茄紅素、葉黃素、玉米黃質、輔酶Q10、 穀胱甘肽、N-こ醯半胱氨酸、褪黑色素、染料木素、雌ニ醇、茶提取物、葡萄籽提取物等。在第六部分的另ー個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法中所說的組合物中也包括一個藥學上可接受的載體。在第六部分的另ー個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法中所說的組合物可以是ロ服劑，針劑，外敷劑，皮膚滲透劑，栓劑，或噴霧劑。在第六部分的另ー個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法中的老年性疾病或老年症是指非正常細胞増殖疾病，退化性疾病，和功能減弱症。在第六部分的另ー個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法中的老年性疾病或老年症可以是腫瘤形成和癌症的發展惡化，神經退化性疾病， 心肌梗死，心臟衰竭，血管硬化，高血壓，骨性關節炎，骨質疏鬆，肌肉萎縮，骨髄衰竭，白內障，多發性硬化，乾燥症候群，類風溼關節炎，免疫功能退化，糖尿病，特發性肺纖維化，老年性黃斑變性，小腦梗死，中風，老年痴呆症，帕金森病，亨廷頓氏症，以及由睪丸激素、雌性激素、生長激素、IGF-I或能量生產的退化引起的功能障礙。在第六部分的另ー個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法中的所示說的需要的個體是指ー種哺乳動物。在第六部分的另ー個方面，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法， 此方法中的所述的需要的個體是指人。第七部分，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此法包括給需要的個體ー種組合物，其含AMPK激活劑，或它的藥學上可接受的鹽、溶劑化物、或藥物前體， 其直接或間接活化AMPK，增加線粒體生物合成，在不分裂細胞中和分裂靜止細胞中維持分裂靜止狀態。本發明的這一部分是用ー個AMPK激活劑來製備或生產ー個藥劑，用以防治老年性疾病或老年症。本發明的這一部分與第六部分相關，即篩選出的化合物為ー個AMPK激活劑。在第七部分的一個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法， 此法中所說的老年性疾病或老年症與線粒體功能退化或喪失、端粒功能障礙、在分裂靜止細胞中或不分裂細胞中的分裂靜止狀態退化、或衰老細胞的死亡相關。在第七部分的另ー個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此法中所說的AMPK激活劑可以選擇於AICAR，ニ甲雙胍，2-脫氧葡萄糖，3-0-甲基葡萄糖，LY294002，黃連素，苯こ雙胍，A769662，噻唑烷ニ酮，地塞米松，他汀類藥物，瘦素，脂聯素，西洛他唑，EGCG，亞硒酸鈉，異硫氰酸烯丙酷，異硫氰酸苯こ酷。在第七部分的另ー個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法中所說的組合物中可以含第二種化合物，可以從抗氧化劑、防高血壓的、降低血脂的、防治中風的、防癌的、或另ー個抗衰老試劑中選擇。在第七部分的另ー個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法中所說的組合物中也可以包括一個藥學上可接受的載體。在第七部分的另ー個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法中的老年性疾病或老年症是指非正常細胞増殖疾病，退化性疾病，和功能減弱症。在第七部分的另一個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法中的老年性疾病或老年症可以是腫瘤形成和癌症的發展惡化，神經退化性疾病， 心肌梗死，心臟衰竭，血管硬化，高血壓，骨性關節炎，骨質疏鬆，肌肉萎縮，骨髓衰竭，白內障，多發性硬化，乾燥症候群，類風溼關節炎，免疫功能退化，糖尿病，特發性肺纖維化，老年性黃斑變性，小腦梗死，中風，老年痴呆症，帕金森病，亨廷頓氏症，以及由睪丸激素、雌性激素、生長激素、IGF-I或能量生產的退化引起的功能障礙。在第七部分的另一個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法中的所示說的需要的個體是指一種哺乳動物。在第七部分的另一個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法中的所示說的需要的個體是指人。第八部分，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法包括給需要的個體一種組合物，其含有低劑量TOR抑制劑，或它的藥學上可接受的鹽、溶劑化物、或藥物前體，它能(a)增加細胞分裂次數，(b)在不分裂細胞中維持分裂靜止狀態或細胞周期阻滯狀態，或(C)防止由於線粒體功能退化或分裂靜止狀態退化引起的細胞死亡。本發明的這一部分是用一個低劑量TOR抑制劑、它的藥學上可接受的鹽、溶劑化物、或藥物前體來製備或生產一個藥方，用以防治老年性疾病或老年症。本發明的這一部分與第六部分相關， 即篩選出的化合物為一個TOR抑制劑。在第八部分的一個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法， 此方法中所說的老年性疾病或老年症與線粒體功能退化或喪失、端粒功能障礙、在分裂靜止細胞中或不分裂細胞中的分裂靜止狀態退化、或衰老細胞的死亡相關。在第八部分的另一個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法中所說的低劑量mTOR抑制劑是雷帕黴素或一個它的類似物。在第八部分的另一個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法中所說的低劑量TOR抑制劑是雷帕黴素或它的一個類似物，後者可以選擇於DeforOIimus，AP-23675，AP-23841，Zotarolimus, CCI779/Temsirolimus, RAD-001/ Everolimus, 7-epi-雷帕黴素，7-硫代甲基-雷帕黴素，7-印i_三甲基-雷帕黴素，2-脫甲基-雷帕黴素，42-0- (2-羥基)乙基-雷帕黴素，或一個藥學上可接受的鹽、溶劑化物、或藥物前體。在第八部分的另一個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法中所說的TOR抑制劑是低劑量雷帕黴素、它的一個藥學上可接受的鹽、有機物、 或藥前體。在第八部分的另一個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法中所說的TOR抑制劑雷帕黴素的低劑量，在血清、培養基中為0. I到lOOOOpM，在動物中為0. I到10000ng/kg/天。令人驚奇的是，不同於細胞生長的抑制功能，雷帕黴素在低劑量時展現全新的作用，儘管在目前的臨床劑量下(lmg/天到5mg/天)，雷帕黴素是一個免疫抑制劑，可以在Gl細胞周期抑制細胞生長，也有可能作用在其他的靶點蛋白。結果，臨床劑量的雷帕黴素有很多副作用，例如升高血液中的膽固醇、三脂甘油，腎臟功能受損，貧血，傷口癒合受損，腹瀉，乏力、高血壓，疼痛，惡性瘤發展，肝臟腫瘤惡化，腹水，生長發育不良，精神狀態改變，脾梗塞，和結腸炎，等等。在本發明中，用低劑量的雷帕黴素可以避免這些副作用。雷帕黴素或它的類似物的有效劑量也許取決於這個特定的化合物、給藥方式、特定的疾病、以及被治療個體的身體條件等。當雷帕黴素在O. 01到50 μ g/天的口服給藥劑量是，可能得到最佳效果。這個劑量是目前臨床劑量(lmg/天到5mg/天)的O. 001%到5%; 同時與本發明的方法相匹配，給藥的安排將為連續給藥2-4天，然後連續2-5天不給藥，這樣的安排可以進一步降低雷帕黴素的副作用。在第八部分的另一個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法中所述的低劑量雷帕黴素或它的類似物為低於10%，8%，6%，4%，2%，1%， O. 1%，0. 01%，或O. 001%左右的目前的臨床用藥劑量。在第八部分的另一個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法中所述的雷帕黴素或它的類似物給藥劑量是目前的臨床用藥劑量8%到10%。在第八部分的另一個方面實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法中所述的雷帕黴素或它的類似物給藥劑量是目前的臨床用藥劑量6%到8%。在第八部分的另一個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法中所述的雷帕黴素或它的類似物給藥劑量是目前的臨床用藥劑量4%到6%。在第八部分的另一個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法中所述的雷帕黴素或它的類似物給藥劑量是目前的臨床用藥劑量2%到4%。在第八部分的另一個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法中所述的雷帕黴素或它的類似物給藥劑量是目前的臨床用藥劑量1%到2%。在第八部分的另一個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法中所述的雷帕黴素或它的類似物給藥劑量是目前的臨床用藥劑量O. 1%到1%。在第八部分的另一個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法中所述的雷帕黴素或它的類似物給藥劑量是目前的臨床用藥劑量O. 01%到 O. 1%。在第八部分的另一個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法中所述的雷帕黴素或它的類似物給藥劑量是目前的臨床用藥劑量O. 001%到 O. 01%。在第八部分的另一個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法中所述的雷帕黴素或它的類似物給藥劑量是目前的臨床用藥劑量O. 0001%到 O. 001%。在第八部分的另一個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法中所述的低劑量雷帕黴素是以純化的化合物來給藥。在第八部分的另一個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法中所說的低劑量雷帕黴素是以粗提純物來給藥，其含雷帕黴素。在第八部分的另一個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法中所說的低劑量雷帕黴素是以非純化的發酵液給藥，其含雷帕黴素。在第八部分的另一個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法中所說的低劑量雷帕黴素是以非純化的產生雷帕黴素的菌絲體吸水鏈黴菌(Streptomyces hygroscopicus)為主體，其含雷帕黴素。在第八部分的另一個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法中所說的組合物中可以含第二種化合物，可以從抗氧化劑、防高血壓的、降低血脂的、防治中風的、防癌的、和另一個抗衰老試劑中選擇。在第八部分的另一個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法中所說的組合物中可以進一步含有抗氧化劑，用以控制細胞內和線粒體內的活性氧水平。在第八部分的另一個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法中所說的組合物中的、第二種化合物中的抗氧化劑，可以是維他命C、維他命E、
胡蘿蔔素、其他類胡蘿蔔素、亞硒酸鈉，硫辛酸、番茄紅素、葉黃素、玉米黃素、輔酶Q10、 穀胱甘肽、N-乙醯半胱氨酸、褪黑色素、染料木素、雌二醇、茶提取物、葡萄籽提取物等。在第八部分的另一個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法中所說的組合物可以是口服劑，針劑，外敷劑，皮膚滲透劑，栓劑，或噴霧劑。在第八部分的另一個實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法中的老年性疾病是指非正常細胞增殖疾病，退化性疾病，或功能減弱症。在第八部分的另一個優選實施例，本發明提供了一個防治老年性疾病或老年症的方法，此方法中的老年性疾病可以是腫瘤形成和癌症的發展惡化，神經退化性疾病，心肌梗死，心臟衰竭，血管硬化，高血壓，骨性關節炎，骨質疏鬆，肌肉萎縮，造血功能喪失，白內障， 多發性硬化，乾燥綜合症，類風溼關節炎，免疫功能退化，糖尿病，特發性肺纖維化，老年性黃斑變異，小腦梗死，中風，老年痴呆症，帕金森病，亨廷頓氏症，以及由睪丸激素、雌性激素、生長激素、IGF-I或能量生產的退化引起的功能障礙。第八部分的另一個優選實施例，即本發明提供了一個防治老年性疾病的方法，其中所述的化合物是低劑量雷帕黴素或它的衍生物，其中所述的老年性疾病或老年症是腫瘤形成或癌症惡性發展、帕金森氏症、中風、小腦梗死、或心肌梗死。第八部分的另一個優選實施例，即本發明提供了用低劑量雷帕黴素維持延長細胞的分裂靜止狀態，此狀態可以由衰老的染色體端粒的功能缺陷喪失、癌基因活化、或DNA損傷劑(如R0S，抗癌藥物，UV或放射性輻射)引起，因為同樣的分裂靜止狀態的機理參與了這些過程，即通過DNA損傷反應。本發明的方法可以用以治療各種良性腫瘤、防止腫瘤惡化。此方法可以用以得癌症的高危險人群，如老年人，與致癌劑經常接觸的人群，或經常暴露在UV或放射性輻射的人群；此方法也可以用於正在服用某藥物，其可以增加患癌機率， 如在用激素替代療法的婦女。此方法也可以用於正在進行某種化療的癌症病人，其化療可能引起二級癌症。第八部分的另一個優選實施例，即本發明提供了用低劑量雷帕黴素防止腦中風引起的大腦損傷。低劑量的雷帕黴素可以被用於腦中風急救藥，適用於缺血性和出血性的腦中風。為了得到最佳效果，低劑量雷帕黴素可以與急救藥一起治療缺血性腦中風，比如 t-PA, 一種血塊溶解藥。第八部分的另一個優選實施例，即本發明提供了用低劑量雷帕黴素防止腦中風和腦中風復發。為了得到最佳效果，此方法的另一個方面是，低劑量的雷帕黴素與某個不同機理的防治腦中風的藥一起用以減少中風機會，後者可以是，但不限於是抗血小板凝集藥(如氯批格雷(clopidogrel), agrrenox)、抗凝血劑(如華法林(warfarin),肝素),降血脂藥(如他汀類藥物(statins))、高血壓藥物(如ACE-抑制劑，ARBs、β -阻滯劑、利尿劑、鈣離子通道阻滯劑)。第八部分的另一個優選實施例，即本發明提供了用低劑量雷帕黴素防治神經退化疾病，包括但不限於老年痴呆症、帕金森氏症、亨廷頓氏症。第八部分的另一個優選實施例，即本發明提供了用低劑量雷帕黴素防治心肌梗死引起的心臟損傷。本發明提供了低劑量雷帕黴素在預防心肌梗死或心臟病發作的用途。為了得到最佳效果，低劑量的雷帕黴素與某個不同機理的藥一起用來防治心臟病，後者可以是，但不限於是抗血小板凝集藥(如氯批格雷(clopidogrel), agrrenox)、抗凝血劑(如華法林(warfarin),肝素)，降血脂藥(如他汀類藥物(statins))、高血壓藥物(如ACE-抑制劑，ARBs、β -阻滯劑、利尿劑、鈣離子通道阻滯劑)、血糖控制藥物(如二甲雙胍，吡格列酮)。本領域的技術人員可以理解雷帕黴素在不同的組織、細胞中的分布是不均勻的， 而用此抗衰老法篩選出的每一個化合物在不同的組織、細胞中，也可能有特定的分布式樣。 因此，此方法的一個方面是用低劑量雷帕黴素，與最少另一個抗衰老劑一起用，以得到最佳效果。所述另一個抗衰老劑不限於是AICAR，2-脫氧葡萄糖，LY294002, 二甲雙胍，EGCG,葡萄籽提取物，亞硒酸鈉，染料木素，水飛薊賓，覆盆子提取物，二烯丙基三硫，苄基異硫氰酸酯，異硫氰酸苯乙酯，白藜蘆醇，番茄紅素，異硫氰酸烯丙酯。第八部分的另一個實施例，低劑量雷帕黴素可以以任何一種有用的方式給藥，包括口服，缺少via implants，注射(如靜脈、皮下、腹腔)，皮上敷用、直腸、鼻腔、陰道，吸入給藥，或氣霧劑、皮膚滲透等。皮膚滲透是指所有穿過身體表面和身體內的膜包括上皮和黏膜組織。此種給藥方式可以由於雷帕黴素、它的藥學可接受的鹽或有機製劑製成的乳液， 膏，泡沫，貼劑，懸浮液，液體，栓劑(直腸和陰道)。第八部分的另一個實施例，本發明提供了低劑量雷帕黴素的另一個用途，即可作為固體食物、飲料、或液體食物的一個成分，其中飲料和液體食物包括含酒精與不含酒精的，例如水，酒，果汁等。在第九部分，本發明提供了一個方法，用以在生物樣本中檢測抗衰老劑，此方法包括下面的步驟⑴生物樣本用溶劑適當稀釋；(ii)在引起端粒異常或DNA損傷進而造成細胞周期阻滯的條件下，把稀釋的樣本與變異酵母細胞一同孵化；(iii)去掉引起細胞周期阻滯的孵化條件，測定存活酵母細胞數；並(iv)比較步驟iii得到的存活細胞數和對照試驗的細胞存活數，對照試驗除不含所述的生物樣本外，其它條件均與步驟ii相同，其中，相比於對照試驗，如果存活細胞數增加，表明所述生物樣本包含抗衰老劑。在第十部分，本發明提供了一個方法，用以在生物樣本中計算抗衰老劑的生物活性濃度(即抗衰老活性濃度)，此方法包括步驟⑴生物樣本用溶劑適當稀釋；(ii)在引起端粒異常或DNA損傷進而造成細胞周期阻滯的條件下，把稀釋的樣本與變異酵母細胞一同孵化；(iii)去掉引起細胞周期阻滯的孵化條件，並且測定存活酵母細胞數；(iv)比較步驟iii得到的存活細胞數和與對照試驗的存活細胞數，對照試驗除不含所述的生物樣本外，其它條件均與步驟ii相同，(V)通過將存活酵母細胞數目代入預先制定的抗衰老劑的濃度對存活酵母細胞數目的標準公式或曲線，來計算所述抗衰老劑的生物學濃度。在第十部分的一個方面，本發明提供了一個用標準公式或曲線來計算在生物樣本中的抗衰老劑的生物活性濃度。標準公式或曲線通過以下的步驟得到(vi)製備一系列含有不同濃度且濃度已知的經提純的抗衰老劑的標準溶液，該標準溶液採用培養所述生物樣本個體時所用的溶劑；(vii)在引起端粒異常或DNA損傷進而造成細胞周期阻滯的條件下，將標準溶液與突變酵母細胞一起孵化；(viii)去掉引起細胞周期阻滯的條件並測定每份所培養的標準溶液中存活酵母細胞數目；並(ix)以步驟viii中獲得的存活細胞數對與其對應的抗衰老劑濃度作圖，從而獲得標準曲線和/或得到標準公式。本發明的這一部分與第九部分相關，即都有定量分析抗衰老物質的生物活性濃度，是用以上所述的標準濃度或曲線來計算的。因此本發明包含的方法，可以是在以上兩個部分所述步驟的任何組合。在第十部分的一個實施例，本發明提供了一個用標準公式或曲線來計算在生物樣本中的抗衰老劑的生物活性濃度，在此所述抗衰老劑是指以上所述任何一個部分的任何一個方面中得到的、或用到的一個化合物或組合物。第十部分的另一個實施例，方法中所述變異酵母可以從cdcl3_l, cdcl3-2, stnl-1, cdcl7_l, cdcl7_2, hdfI, hdf2, estl, est2, est3 中選擇。本發明的其他部分或重要方面可以包括以上所述任何實施例的合適組合。在這裡，其他部分或實施例也可以被展現在這裡所述的其他部分。定義本文中所使用的術語，除非文章特別指出，一般「a」，「an」，「the』，指單數，也指複數。本文中所使用的術語「optional」或「optionally」指接下來所述的事件或情況有可能發生，或者所述包括事件或情況發生例子和不發生的例子。本文中所使用的術語「老年症」或「老年性疾病」定義為衰老是此症或疾病一個主要危險因素。老年性疾病或老年症可以分為3個主要類型(I)非正常細胞增殖性疾病，如癌症；(2)退化性疾病，如神經退化疾病(老年痴呆症，帕金森氏症，腦中風等)，心肌梗死， 心臟衰竭，血管硬化，高血壓，骨性關節炎，骨質疏鬆，肌肉萎縮，骨髓衰竭，類風溼性關節炎，免疫功能退化，糖尿病，特發性肺纖維化，衰老性的黃斑變性，和(3)功能下降性疾病或障礙，如激素降低(雌激素、睪丸激素、生長激素，IGF-I等)，能量生產減少等。根據細胞類型，老年性疾病或老年症可以分為2類，(I)在不分裂細胞中，神經退化疾病(如老年痴呆症，帕金森氏症，腦中風等)，肌肉萎縮，心血管疾病(如心肌梗死，心臟衰竭等)，⑵在分裂細胞中，骨髓衰竭，免疫功能退化，糖尿病，特發性肺纖維化，衰老性黃斑變性，類風溼性關節炎，骨性關節炎，骨質疏鬆，血管硬化，高血壓。更進一步,老年性疾病或老年症與線粒體和/或端粒功能退化喪失有關，包括並不限制於癌症，骨性關節炎，老年性黃斑疾病，多發性肺纖維化，帕金森氏症，老年痴呆症， 亨廷頓氏症，皮膚老化，白內障，多發性硬化症，乾燥症候群，類風溼性關節炎，血管硬化，心肌梗死,心臟衰竭,高血壓，中風,糖尿病,骨質疏鬆,肥胖症，白髮脫髮,聽力退化等等，以上所述的疾病都被此發明所包括。在本文中一些優選實施例中，使用的術語「老年性疾病」或「老年症」是指以下的疾病腫瘤形成和癌症惡化發展，心肌梗死、心臟衰竭，腦梗死，中風，帕金森氏症，心衰竭，血管硬化，高血壓，白內障，老年性黃斑變性，肌肉萎縮，骨性關節炎，骨質疏鬆，骨髓衰竭，多發性硬化症，乾燥症候群，類風溼性關節炎，免疫功能退化，糖尿病，特發性肺纖維化，神經退化，帕金森氏症，阿爾茨海默氏病，亨廷頓氏病，由於睪丸激素、雌激素、生長激素、IGF-I 等減少或能量減少引起的功能障礙或疾病。本文中使用的術語「抗衰老作用」是指，包括增加線粒體生物合成和功能，降低活性氧的水平，延長分裂靜止細胞和不分裂細胞的壽命，例如神經細胞，預防老年學疾病，如腫瘤的形成、癌症的惡性發展、腦梗死和心肌梗死等。本文中使用的術語「防治老年性疾病」是指，減少發病率，推遲發病時間，或扭轉治癒老年性疾病。本文中使用的術語「分裂靜止狀態」是指停止細胞周期、細胞不繼續進行有絲分裂，可由端粒功能異常、DNA損傷、或癌基因激活等引起。在出芽酵母中，由端粒功能受損引起的分裂靜止狀是細胞周期停止在G2/M期上。在哺乳動物細胞中，由端粒功能受損引起的分裂靜止狀是細胞周期停止在GO期上，GO細胞逃出了細胞分裂周期。在人的成纖維細胞 WI-38中，分裂靜止狀是指在顯微鏡的觀察下，細胞數傳代10天以後都不再增加，並且顯示 β-乳糖苷酶陽性染色。本文中使用的術語「不分裂細胞(post-mitotic cell) 」是指那些停止在GO期的細胞，GO期在細胞分裂周期以外，不再分裂複製，但細胞在生物個體的生命中具有應有的功能。不分裂細胞包括有神經細胞，心肌細胞，肌肉細胞等。有的細胞在成熟個體中，非永久性性地進入GO期，不分裂了，只有在特別的情況下，才能被誘導再次進入細胞周期進行分裂， 如肝臟和腎的實質細胞。這些細胞在GO期時，也被認為是不分裂細胞。本文中使用的術語「cdcl3-l」是指在⑶C13基因上有一個點變異的酵母細胞，也指這個點變異，「cdcl3-lp」指有由此基因變異的基因轉錄的蛋白，Cdc3p指野生型的⑶C13 基因轉錄的蛋白。本文中使用的術語「CdC13-2」，「stnl-r』，「CdC17-r』，「CdC17-2」，是指酵母細胞含有相應的基因變異，也指此變異的基因。術語「6#1」，「6^2」，「6#3」，「11(^1」，和「11(^2」 是指酵母細胞分別含有相應的基因敲除，即EST1，EST2，EST3，HDFl和HDF2基因敲除，也指此敲除的基因。本文中使用的術語「TOR抑制劑」是指一組免疫抑制化合物，含有基本的雷帕黴素核心結構，包括雷帕黴素和它的化學、生物學修飾後的衍生物等，並具有維持細胞靜止狀態的活性。相應的，TOR抑制劑可以是以雷帕黴素的酯、醚、腙、胲、或肟的形式存在。此術語也包括在雷帕黴素核心結構上功能基團上的修飾，例如，通過氧化或還原反應。因此，TOR 抑制劑包括但不限於雷帕黴素和類似物，如AP-23573 (Deforolimus)，AP-23675，AP-23841， ABT-578 (Zotarolimus), CCI-779 (Temsirolimus), RAD-001 (Everolimus), 7-epi-雷帕黴素，7-硫代甲基-雷帕黴素，7-epi-三甲基-雷帕黴素，7-epi-硫代甲基-雷帕黴素和7-去甲氧基-雷帕黴素,32-去甲氧基-雷帕黴素，2脫甲基-雷帕黴素和42-0(2-羥基)乙基-雷帕黴素。本文中使用的術語「雷帕黴素的臨床劑量」是指從Img/天到5mg/天的劑量範圍， 此範圍也可延伸從0. Img/天到15mg/天,但不能多於40mg/天。在這些劑量範圍下,雷帕黴素抑制蛋白合成，在Gl期停止細胞周期，並也引起細胞自噬。在動物和體外細胞培養中， 臨床劑量在鼠類模型中大於0. lmg/kg/天，在人細胞中大於10ng/ml，在鼠類細胞中大於 100ng/ml。此領域的普通技術人員都知道，具體的臨床劑量隨不同的細胞株和特定的動物而變化。本文中使用的術語「低劑量雷帕黴素」是指低於雷帕黴素的臨床劑量，例如，低劑量可以是0. I到IOOOpM當用於細胞培養時，0. 01到IOOii g/kg/天當用於鼠類模型中，0. 01 到IOOiig/天當用於人體。具體的濃度是根據特定的細胞類型、或特定的疾病或特定的給藥方式而定。低劑量雷帕黴素大約為臨床劑量的0.001%到10%。本文中所用的術語化合物或組合物的「抗衰老生物活性濃度」是指化合物或組合物中具有抗衰老的活性成分的濃度，相對於化合物或組合物的濃度。此抗衰老生物活性濃度可以用延長酵母cdcl3-l細胞的分裂靜止狀的實驗來測量。本文中所用的術語「癌症」是指患病狀態，其中一個正常細胞變成非正常，始於如 DNA損傷，癌基因激活，或端粒功能障礙的初始異常的細胞病變，然後侵入到鄰近組織，區域淋巴結和遙遠的地點。癌症可以是與衰老有關的癌症，誘變劑引起的癌症，抗癌藥物化療引起的二級癌症，針對其他疾病的治療方法引起的，如激素替代，由環境引起的，如紫外線、發射性輻射、或吸菸。本文中所使用的術語「防止腫瘤的形成」，是指抑制一個正常細胞變為一個異常細胞，或抑制正常細胞到良性腫瘤的形成轉化。本文中所使用的術語「防止惡性進展」是指以抑制良性腫瘤發展為惡性腫瘤或癌症。本文中所使用的術語「防治癌症」和「癌症防治」是指以防止腫瘤的形成和/或防止惡性進展。本文中所使用的術語「防癌化合物試劑」是指天然的或實驗室合成的物質，可用以抑制腫瘤生長。術語「藥學上可接受的載體」是指一種在此領域中被接受的載體基質，通常用於把生物活性劑載入動物中，尤其是哺乳動物，包括佐劑，賦形劑或媒介物，例如稀釋劑，保鮮劑，填料，流動調節劑，崩解劑，潤溼劑，乳化劑，懸浮劑，增甜劑，調味劑，香料，抗生素，抗真菌劑，潤滑劑，配藥劑，選擇取決於給藥模式和劑量形式。藥學上可接受的載體包括水性和非水性的液體基質，以及各種固體和半固體的基質。如此的載體可以含除了活性物質外的有許多不同的成分和添加劑，它們因為各種原因被放在配方中，如穩定活性成分，粘合等， 這些都是此領域的普通技術人員所熟知的。本文所用術語「藥學上可接受的鹽」，是指一個化合物的鹽或兩性離子的狀態，是水溶或油溶的、或可分散的，在可靠的醫學判斷的範圍內，適合用於病人的組織而沒有過多的毒性、刺激性、過敏性、或其他的問題或併發症，並且益處/風險比合理，可以達到預定的有效性。代表性的成鹽的酸包括醋酸，己二酸，褐藻膠，檸檬酸，天門冬氨酸，苯甲酸，苯磺酸，硫酸氫鈉，丁酸，樟腦磺酸，脲硫酸鹽，庚酸，己酸，甲酸，富馬酸，鹽酸，氫溴酸，碘酸，乳酸，馬來酸，均三甲苯磺酸鈉，甲磺酸，萘磺酸，煙酸，2-萘磺酸，草酸，雙萘水楊酸，果膠酸， 過硫酸銨，特戊酸，丙酸，琥珀酸，酒石酸，三氯乙酸，三氟乙酸，磷酸，穀氨酸鈉，碳酸氫鹽， 對甲苯磺酸。可用於形成藥學上可接受的鹽的其它酸的例子包括鹽酸，氫溴酸，硫酸和磷酸等無機酸，和有機酸，如草酸，馬來，琥珀酸，檸檬酸。藥學上可接受的鹽的陽離子包括鋰，鈉，鉀，鈣，鎂，鋁，以及無毒的季銨鹽陽離子， 如銨，四甲銨，四乙銨，四丁基胺，甲胺，二甲胺，三甲胺，三乙胺，二乙胺，乙胺，三丁胺，吡啶，N，N-二甲基苯胺，N-甲基苯胺，N-甲基哌啶，甲基二環己胺。其他代表性的可形成鹽的有機胺包括乙二胺，乙醇胺，二乙醇胺，哌啶和哌嗪。本文所用術語「溶劑化物」是指一個或多個、最好是一至三個溶劑分子，有機或無機的，物理結合。這個結合包括氫鍵結合。在某些情況下溶劑化物可以被隔離，例如，當一個或多個、最好是一至三個溶劑分子結晶在固體晶格中。在溶液中溶劑化分子可能會是有序的排列和/或是非有序排列。溶劑化物可能會包括溶劑分子的化學當量或非化學當量。 「溶劑化物」包括可溶的相和不可溶溶劑。範例溶劑化物包括、但不僅限於水合物、乙醇合物，甲醇合物，異丙醇合物。溶劑化的方法在此領域中是公知的。此外，本發明涉及的化合物可能有藥物前體形式。在本發明的範圍內，任何可在體內轉化為有生物活性的化合物都是藥物前體。在各種形式的藥物前體在領域內是眾所周知的。對於這類藥物前體以及衍生物的例子，請參閱Design of Prodrugs, edited by
H.Bundgaard(Elsevier,1985) ；Methods in Enzymology,Vol. 112,at pp. 309-396,edited by K. Widder et al. (Academic Press,1985) ；and A Textbook of Drug Design and Development, edited by Krosgaard-Larsen and H. Bundgaard, Chapter 5, 「Design and Application of Prodrugs,，，by H. Bundgaard, at pp. 113-191 (1991)。作為一個例證，含有羥基基團的化合物，如雷帕黴素及其類似物，可以形成可水解的酯類，碳酸鹽，或氨基甲酸酯類，作為藥物前體可在體內水解產生的有活性的化合物。因此，本發明包括使用雷帕黴素類似物及其相應的酯、碳酸、或氨基甲酸酯衍生物作為抗老化劑。這些前體藥物可以被領域內一般的人用傳統的合成方法合成。例如，酯類包括但不限於那些用普通醯化劑醯化羥基的衍生物，如，醋酸，醋酐，乙醯氯酸，丙醯氯，苯甲醯氯，丁醯氯，琥珀酸酐等等。碳酸鹽包括、但不僅限於，用含有一個X-C(O)OR結構的化合物與羥基的反應而來的衍生物，其中X是一個滷化物和R可以是任何基團含一個碳連在氧原子上，例如，燒基，芳基，芳燒基等；氣基甲酸酷也可以以類似的方式合成。此外，雷帕黴素的藥物前體，也可以是其他形式，如美國專利4650803和美國專利 5151413所述的，或在任何出版或要公布的。此處所描述的大多數藥物前體，最好口服，因為在許多情況下，藥物前體主要由消化酶水解。注射給藥也可，當前體藥物本身是有活性的， 或可在血液中的發生水解。本發明的配方，可在用任何合適的途徑給藥，例如，通過口服，外用，注射(包括皮下，肌肉，靜脈注射和皮內)，和肺部給藥。在一些實施例中，配方是用單位表示劑量，可用何任方法配製。通常，藥方是均勻製備的與活性成分密切關聯的(例如，雷帕黴素或及其類似物)，使用液態載體或極細的的固態載體，或兩者。包含本發明所述的活性化合物的口服劑可是任何常規的口服劑包括片劑，膠囊劑，片劑，頰形式，錠劑和口服液，混懸劑，或溶液的形式，或作為粉末或顆粒，在水或非水性的溶液或懸浮液，水包油型乳狀或油包水型乳狀。膠囊可是含有活性化合物、惰性填料和/ 或稀釋劑的混合物。片劑配方可由傳統的壓縮，溼法或幹法造粒的方法，並用藥學上可接受的稀釋劑，結合劑，崩解劑，潤滑劑，表面改性劑(包括表面活性劑)，或懸浮劑或穩定劑。口服製劑也可利用標準的延緩或控釋劑，來改變活性化合物的吸收。在某些情況下，可以以氣霧劑的形式直接向呼吸系統，耳朵，皮膚，或咽喉給藥。低劑量雷帕黴素在也可外用。外用的形式包括、但不僅限於，霜劑，軟膏，乳劑，凝膠，乳液，和噴霧劑。本發明的外用製劑一個實施例是，外用配方是惰性材料(如油)，還有一實施例是基礎保溼霜成分，防腐劑也可用於增加保質期。此領域的技術人員知道如何添加額外的活性成分或惰性材料來修改外用配方。本發明的外用製劑可用於防止皮膚老化和治療癌症等疾病的早期階段。在一些實施例中，片劑包括至少一個活性成分和選擇性的一個或多個藥學上可接受的載體，後者由壓縮或成型劑組成。在優選實施例中，壓縮片劑由合適的機器壓縮活性成分，其在自由流動的狀態，含如粉末或顆粒，也可混合於粘結劑(如碘伏，明膠，羥丙基甲基纖維素)，潤滑劑，惰性稀釋劑混合，壓縮崩解劑，防腐劑，崩解劑(例如，鈉乙醇酸澱粉，交聯聚維酮，交聯羧甲基纖維素鈉)，表面活性劑或分散劑。本發明的化合物或組合物，可單獨或聯合給藥，可結合一個或多個，最好是一到三個，額外的治療藥物。「聯合給藥」或「綜合療法」是指本發明中和一個或以上，最好一至三個額外的治療藥物，對接受治療的哺乳動物同時給藥。聯合給藥時，每個組成部分可以以任何順序給藥，在同一時間或在不同的時間點。因此，每個組成可單獨給藥，但相近的時間，以提供理想的治療效果。範圍這裡可表示為從「大約」一個特定的值，和/或到「大約」另一個特定值。當範圍這樣表示時，一方面包括從一個特定的值到另一特定值。同樣，當值以前綴』 「大約」表示為近似值，它會被理解為此特別值形式的另一個方面；這將被進一步理解為每個範圍的端點與其他端點顯著的有關並獨立；它也被理解為有系列的值被披露者，此處披露每個值除了此特定的值本身也含「大約」的值。例如，如果值「10」披露，則「大約10」也披露。同時也被理解為在此申請中數據有許多不同的格式，這些數據代表終點的出發點、範圍是數據點的任意組合。例如，如果一個特定的數據「2% 」和一個特定的數據「4% 」被披露，被理解為大於、大於或等於、小於、小於或等於、等於2%和4%、以及2%和4%之間被披露了。也被理解為在兩個特別單位之間的每個單位被透露了。當「大約(about)」出現在表示劑量數字前，這意味著至少±30%可變性，較好在±20%以內，最好的±10%以內；當這個詞出現在表示溫度的數字前，這意味著值可以有所不同，至少±2°C，最好土1°C，表示時間時，這意味著該值可以有所不同，至少在15%在10%以內，最好在5%以內。鑑別、檢測和純化抗衰老試劑方法本發明是基於下面討論的各種發現。A.抑制營養信號通過AMPK和隨後的線粒體塗徑延長端粒功能障礙誘導的酵母細胞周期阻滯狀傑。
A-1、抑制營養信號維持端粒功能障礙引起細胞周期阻滯狀態，從而防止隨後的細胞死亡。基於各種原因，芽殖酵母cdcl3-l是端粒功能障礙的重要模型。第一，滅活 cdcl3-lp引起的端粒功能障礙和端粒酶的失活激活同樣的下遊途徑MEC1 (與ATM和ATR 同源)依賴的G2/M細胞周期停止，以及隨後大量的細胞死亡，並伴有細胞體積增大，ROS大幅增加，細胞凋亡標記，和在單倍體細胞中多倍體(> 2N)的DNA含量。TOR抑制劑雷帕黴素防止cdcl3-lp或端粒酶的失活引起的細胞的死亡。有趣的是，雷帕黴素不影響因滅活 cdcl3-lp引起的G2/M細胞周期停止，但維持、延長G2/M的周期阻滯狀態，從而防止多倍體 (> 2N)DNA含量的出現,這是分裂靜止狀態的退化和細胞死亡的一個指標(Qi, H. , Chen, Y. et al. , PLoS 0ΝΕ，3，e3520，2008)。第二，端粒的結構和功能從酵母到人類都是保守的。 在人類細胞中，端粒功能障礙也導致ATM-/ATR-依賴的細胞周期阻滯，伴隨著增大的細胞體積，細胞凋亡標記和多倍體(Denchi EL, et al, Nature 448 :1068-71, 2007 ；Shay JW, et al, Carcinogenesis 26 :867-74. 2005)，與 cdcl3_l 類似。因此，cdcl3_l 可以用來研究端粒功能障礙引起的下遊事件。本發明揭示，類似於低劑量雷帕黴素，葡萄糖限制-即減少酵母培養基中的葡萄糖或加200 μ M 2-脫氧葡萄糖(葡萄糖的類似物)，以及氮限制，也阻止滅活cdcl3-lp引起的細胞死亡，其用菌落形成實驗來監測。如圖IA所示，cdcl3-l細胞(單倍體)在YEH) 培養基中(蛋白腖I %，2%酵母提取物，2%葡萄糖)、非允許溫度(37°C)孵化22小時後經菌落形成測試可知導致細胞的大量細胞死亡。然而，減少YEH)培養基中的葡萄糖(從 2%至1%、0.5%或0% )以及加入200 μ M 2-脫氧葡萄糖的2%葡萄糖的ΥΕΗ)，有效地阻止細胞死亡糖越少，存活細胞越多。此外，限制氮的培養基SC-N(O. 67%酵母氮源(yeast nitrogen base)不含胺基酸和(MM)2SO4, 2%葡萄糖，組氨酸，亮氨酸，色氨酸和尿嘧啶各 100mg/L)也阻止細胞死亡(圖1B)。此外，雷帕黴素預防cdcl3-l細胞死亡與劑量相關， 濃度在0. 3至InM(圖1C)之間。0. 5和InM的雷帕黴素沒有阻止細胞生長、相反微有促進 (圖1D)，表明低劑量雷帕黴素的新功能。圖IE顯示，低劑量雷帕黴素和葡萄糖限制延遲 cdcl3-l細胞死亡。相比於在37°C 20小時後大量的細胞死亡，雷帕黴素和葡萄糖限制減慢了細胞死亡，在37°C培養60小時後，與未經處理的細胞相比，細胞的存活至少提高了 100倍以上。實驗結果進一步證明，葡萄糖限制，與雷帕黴素治療相似，維持滅活cdcl3-lp引起的G2/M周期阻滯狀態，並防止隨後的細胞死亡。如圖2A所示，在非允許溫度(37°C)培養2小時後，超過95%的cdcl3-l細胞進入G2/M期，葡萄糖限制(0.5%葡萄糖)和雷帕黴素(InM)與對照實驗同樣。葡萄糖在YEH)培養基中從2%減少至0.5%與雷帕黴素(InM) 相同，抑制多倍體(>2N)DNA含量的增加，表明維持細胞周期阻滯狀態。如圖2B所示， cdcl3-l在37°C預培養2小時，使大於95%的細胞進入G2/M期，並不會影響葡萄糖限制和雷帕黴素對細胞死亡的預防作用。因此，營養限制，與TOR抑制劑雷帕黴素相似，保持端粒功能障礙引起的細胞周期阻滯狀態，從而防止分裂靜止狀態的退化，以及隨後的細胞死亡。A-2、葡萄糖限制，類似於低劑量TOR抑制劑雷帕黴素，防止cdcl3-l細胞死亡時的 ROS的增加並抑制凋亡標記的出現。圖3A顯示cdcl3_l細胞的死亡時伴有急劇增加的R0S。雷帕黴素(InM)以及葡萄糖從2%至0.5%的減少(0.5% GLC)，有效地降低ROS的增加，至同一溫度下的野生型(WT) 的水平。圖3B顯示，滅活cdcl3-lP誘導的細胞死亡也伴有細胞凋亡的增加，其以磷脂醯絲氨酸(PS)翻轉來測量，葡萄糖減少(0.5% Glc)或雷帕黴素(InM)有效地抑制細胞凋亡。A_3、AMPK和線粒體功能，在雷帕黴素和葡萄糖限制預防cdcl3_l細胞死亡中發揮
重要作用。本發明還公開了 AMPK在預防cdcl3-l細胞死亡的重要作用。圖4A顯示，刪除 Sip2p，酵母AMPK的調節亞基P，能顯著減弱葡萄糖限制的預防效果。此外，刪除Snflp及 Snf4p，分別是AMPK的催化亞基a和調節亞基Y，大大降低雷帕黴素的預防效果(圖4B)。本發明進一步揭露，線粒體，其功能可以通過激活AMPK和下遊的線粒體生物合成而改進提高，在預防cdcl3-l細胞死亡中發揮了重要作用。cdcl3-l線粒體缺陷的細胞是通過培養在含溴乙錠的培養基得到的((Qi,H. J. Biol. Chem.，278，15136-15141，2003)。圖5A 顯示，線粒體功能缺乏顯著減弱了葡萄糖限制和雷帕黴素(I和5nM的)的預防效果。通過測量線粒體量的增加，葡萄糖限制(0.5%葡萄糖)和雷帕黴素(InM)也被證明了可以上調線粒體生物合成(圖5B及5C)。圖6總結了上述的結果。線粒體在維持端粒功能障礙引起的分裂靜止狀態發揮了重要作用，雷帕黴素和葡萄糖限制通過激活AMPK刺激線粒體功能，從而防止分裂靜止狀態退化和隨後的細胞死亡。B.低劑暈雷帕黴素、葡萄糖限制、和AMPK活化劑，都相似的刺激線粒體的功能，並延長元代人成纖維細胞分裂靜止狀態。本發明揭示了，在人細胞中，CR或雷帕黴素也延長端粒功能障礙引起的分裂靜止狀態，並防止細胞死亡。實驗採用元代人胚肺成纖維細胞WI-38。此細胞缺乏端粒酶活性， 在通常的常規培養條件下，在第31次傳代(paSSage31)時達到最大複製的潛力，表現出端粒功能障礙，並進入分裂靜止狀態。在第29傳代時加入50pM的雷帕黴素。療程是10天一個周期，其中3天給藥、7天無藥(也稱為3-day-on/7-day_off周期)。不論有無雷帕黴素，細胞在第31傳代停止分裂(在顯微鏡下檢查)，並展現出分裂靜止狀態，通過測量細胞質@ -半乳糖苷酶的活性，即用5-溴-4-氯-3- 口引哚基0 -D-半乳糖苷(X-Gal) (lmg/ml X-gal，40mM的檸檬酸/磷酸鈉，pH值6. 0，5mM亞鐵氰化鉀，5mM氰化鉀，150mM氯化鈉，2mM 氯化鎂)染色。由於分裂靜止細胞增加細胞質中的￠-半乳糖苷酶的活性而被染成藍色的顏色(黑白畫面中呈暗灰色)。圖7顯示，在分裂靜止後的第56天，在對照中可見大量的細胞損失，50pM雷帕黴素強力抑制細胞損失。雷帕黴素並沒有轉化細胞，因為分裂靜止狀態的標記仍然存在，並且也沒有觀察到細胞的分裂。此外，在培養液中葡萄糖減少(從0.4%到
0.2% )或2-脫氧葡萄糖(12. 5 u M)也阻止分裂靜止細胞的消失(圖7)。同酵母相似，AMPK在雷帕黴素或葡萄糖限制預防人類細胞中的端粒紊亂引起的細胞死亡也起著重要作用。如圖7所示，AMPK的特異性激活劑5-氨基咪唑 (Aminoimidazole)-4-甲酸胺-I-P-D-呋喃核糖苷(ribofuranoside) (AICAR, 250uM)(給藥方式為10天一個周期，其中2天給藥、8天無藥，以避免毒性)防止靜止的WI-38細胞的損失。此外，用免疫印跡來檢測AMPK在Thr 172 (數據未顯示)的磷酸化表示，雷帕黴素 (50pM)可以激活AMPK。此外，雷帕黴素、2-脫氧葡萄糖、葡萄糖限制和AICAR，增加人體中線粒體量和提高線粒體的功能(圖8和圖10)。低劑量雷帕黴素在人成纖維細胞(圖8A)以及淋巴L40細胞(數據未顯示)都可以增加線粒體的質量。低劑量雷帕黴素在成纖維細胞和L40細胞也增加了線粒體膜電位並減少ROS的水平(圖8B，8C和數據未顯示)。令人驚訝的是，只有低劑量雷帕黴素(從10到IOOpM)可防止靜止的WI-38細胞的損失，如圖9A所示，相反，在濃度超過500pM時促進細胞的損失。例如，25pM雷帕黴素阻止細胞的損失(圖9A)，但不抑制細胞生長(圖9B)，相反，它增加了細胞複製的次數，從5. 12 至6.8 ;此外，在低劑量雷帕黴素(50和IOOpM)增加的分裂靜止關鍵蛋白質p53，p21和pRb 的水平，但高劑量(2000pM)不能(圖9C)。此外，低劑量雷帕黴素增加人類細胞中線粒體量和膜電位，並降低ROS水平，而大於IOnM的雷帕黴素似乎失去了這個效果(圖8)。因此，低劑量雷帕黴素的功能與臨床治療劑量不同，它刺激線粒體功能和防止分裂靜止狀態退化， 而不是阻止蛋白質的翻譯和在Gl期抑制細胞生長。綜上所述，I)分裂靜止細胞的細胞周期阻滯狀態的維持從酵母到人類是保守的， 2) CR，葡萄糖限制或低劑量雷帕黴素通過AMPK的刺激線粒體的功能，延長分裂靜止狀態， 從而抑制了隨後的細胞死亡，3)只有低劑量雷帕黴素，模仿CR，維持人體細胞的分裂靜止狀態。C. 一些抗衰老或癌症的化學預防劑刺激線粒體功能，並抑制酵母和人類的分裂靜止細胞的死亡。本發明公開，被報導兩種試劑-可以預防一些與老年性疾病綠茶提取物(GTE)中的兒茶素EGCG的和葡萄籽提取物(GSE)，均可增加線粒體量並延長分裂靜止狀態。綠茶提取物被報導可以防止多種癌症(美國專利7192612和7384655，和美國專利申請20040142048 和 20040047921, Shimizu M, et al. , Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 17 :3020-25, 2008 ；Nakachi K, et al.，Jpn J Cancer Res. 89 :254-61,1998)。兒茶素(EGCG)是GTE的最有效成分。EGCG被報導可延長線蟲的壽命(Abbas S and Wink Μ, Planta. Med. 75 =216-21,2009)。它也被報導調節澱粉狀(amyloid)前體蛋白裂解和減少阿爾茨海默氏症的轉基因小鼠的腦澱粉樣變性病(amyloidosis) ((Rezai-Zadeh K,et al. ,J Neurosci. 25(38) :8807_14，2005)，防止大鼠急性大腦中動脈閉塞後的腦損傷(Choi YB，et al, Brain Res. 1019 :47_54，2003)，在大鼠離體心臟中，通過線粒體K(ATP)通道的激活保護心肌細胞由缺血/再灌注引起的細胞凋亡，並減少梗死面積(Townsend PA, et al. ,FASEB J. 18 1621-3, 2004 ；Song, DK, et al, J Korean Med Sci. 2010 Mar ；25(3) :380-6)。此外， 它也被證明在分離出胰島中防止細胞凋亡(Hara Y, et al, J Hepatobiliary Pancreat Surg. 14 :493-7,2007)，防止低劑量鏈脲菌素誘導的小鼠自身免疫性糖尿病((Song EK, et al，Arch Pharm Res. 26 =559-63,2003)減少了人類乾燥症候群小鼠模型的自身免疫性症狀 (Hsu, S. D. , et al. , Autoimmunity, 40 :138-47, 2007)，並防止硒引起的大鼠白內障(Gupta SK, et al. ,Ophthalmic Res. 34 :258_63，2002)。有趣的是，EGCG還能激活 AMPK(Huang CH, et al, Mol Nutr Food Res. 53(9) :1156-65，2009)。GSE也被證明有預防癌症的活性(美國專利申請20040047921和20050013880)。 例如，五倍子酸，一個GSE的主要組成部分，在TRAMP小鼠前列腺癌模型中防止向中晚期的進展(Raina K，et al. ,Cancer Res. 67 :5976_82，2007)，GSE 也可以防止致癌劑NNK誘發人類乳腺上皮細胞 MCF10A 癌變((Siriwardhana N, et al. , Breast Cancer Res Treat. 109 427-41,2008)。此外，GSE已被證明在雌激素耗盡(estrogen depleted)的動物模型中減少動脈壓和鹽敏感的高血壓(see review by Carlson S, et al. , Gend Med. 5Suppl A, S76-90，2008)，它在一個三維的人體表皮組織培養模型中有效地防止紫外線引起的皮膚損傷(Tomaino A，et al. ,Toxicol In Vitro. 20 :1395-402，2006)，在阿爾茨海默氏病的小鼠模型中防止A3的集聚和認知功能減退(Wang J, et al, J Neurosci. 28 :6388-92, 2008), 在小鼠和倉鼠中防止高脂肪飲食誘導的肥胖症((Park SH, et al, Nutr Res Pract. 2 227-33,2008 ；DecordeK, et al, Mol Nutr Food Res. 53 :659_66，2009)，在一個大鼠模型中抑制衰老引起的氧化損傷的DNA在脊髓和大腦的積累(Balu, M. , et al. , Brain Res Bull. 68 :469-473，2006)，並保持在衰老過程中紅細胞膜的完整性(Sangeetha P，et al.， Exp Gerontol. 40 :820-828, 2005)。如圖10所示，250 u g/ml的GSE和50 u g/mL的GTE中EGCG增加在人的細胞中的線粒體量，例如，在淋巴L40細胞中，也阻止酵母和人原代成纖維細胞WI-38的端粒功能障礙引起的細胞死亡(圖11和7)圖10顯示了許多腫瘤化學預防劑在人類淋巴母細胞中增加線粒體量，例如，IOuM LY294002 (PI3K抑制劑),2uM 二烯丙基三硫化物(DATS) ,IuM苄基異硫氰酸酯(BITC)， Iii M苯基異硫氰酸酯(PITC)，2ii g/mL的白藜蘆醇(RSV)和0. 03 y M的番茄紅素，6. 7 y M 苯乙基異硫氰酸酯(PEITC) ,IuM烯丙基異硫氰酸酯(AITC)，水飛薊賓5mM，I. 25mM亞硒酸鈉，2. 5mM染料木素，3mg/ml的越橘提取物。圖7和11顯示許多腫瘤化學預防劑，包括異硫氰酸苯乙酯，水飛薊賓，亞硒酸鈉，染料木素，越橘提取物，對酵母和/或人端粒功能障礙引起的細胞死亡展示出不同程度的的保護作用。D.許多老年性疾病或老年症與線粒體功能異常和/或端粒功能障礙有關，低劑量雷帕黴素在動物或組織培養模型防止多種老年性疾病或老年症。癌症。幾乎所有的腫瘤細胞表現出線粒體的功能障礙，這種現象被稱為Warburg 效果，即在腫瘤細胞中高達60%的ATP是通過糖酵解生產的，儘管有氧存在，而在正常細胞中，大部分的ATP通過線粒體氧化磷酸化生成的。癌轉化已被證明導致抑制氧化磷酸化並且增加糖酵解，相反，腫瘤抑制蛋白P53的上調氧化磷酸化並抑制糖酵解。不過，目前尚不清楚線粒體功能障礙是癌症原因還是結果。由於逐步縮短的端粒，端粒功能障礙是年齡依賴性的，維持端粒功能障礙引起的分裂靜止狀態是預防與年齡有關的癌症的一個關鍵機制。由於由癌基因的激活和誘變劑引起的分裂靜止狀態也是通過DNA損傷反應，與端粒功能障礙的相同，分裂靜止狀態的維持應是防止各種癌症的一個內在機制。本發明公開了線粒體的功能在維護分裂靜止狀態中起著關鍵作用。因此，線粒體的功能通過維持分裂靜止狀態在癌症預防起重要作用，線粒體功能障礙是分裂靜止狀態退化和癌症發展的早期步驟。因此，端粒功能障礙模型可以用來篩選候選藥物，用以刺激線粒體功能、延長分裂靜止狀態、和預防癌症。事實上，本發明披露，許多已知的癌症化學預防劑，可以延長衰老分裂靜止狀態，增加線粒體量(圖7，10和11)。此外，可以延長分裂靜止狀態的低劑量雷帕黴素和AICAR，如圖7所示，在NIH3T3細胞中扭轉了誘變劑TPA (12_0_醯佛波醇(Tetradecanoylphorbol)-13-醋酸酯)引起的線粒體量的降低和防止腫瘤形成(圖 12和13)(見實施例15)。神經行性疾病。儘管有大量的研究，神經退行性疾病的機制尚不清楚。線粒體功能障礙可能在疾病中起作用，因為Pakin (與帕金森氏病有關)，Huntintin (與亨廷頓氏病有關)和￠-澱粉樣蛋白(Amyloid-P)(導致阿爾茨海默氏症的老年斑)都參與線粒體功能。最近的研究也建議自體吞噬(一種蛋白質的降解)在這些疾病中也起一些的作用。本發明公開了低劑量雷帕黴素、而非高劑量的雷帕黴素，降低培養的大鼠小腦顆粒神經元(CGN)的ROS水平、增加細胞的壽命(圖14A和圖14B)，在大鼠中風模型中防止由於小腦梗死引起的腦損傷(圖15A及15B)(見實施例16-18)，低劑量雷帕黴素也減少了 200 u M MPP+誘導的ROS水平的增加，MPP+是多巴胺神經毒，可誘發鼠類帕金森症(圖16)。 此外，曾被報導可防治神經退行性疾病的EGCG，這裡被顯示可延長分裂靜止狀態(圖7和圖 11)。因此，低劑量雷帕黴素和EGCG可以延長不分裂細胞和分裂靜止細胞的壽命，這表明維持不分裂神經細胞的GO階段與維持分裂靜止細胞中的GO階段有著類似的機制。因此，本發明的一個方面，是基於這樣的發現，即分裂靜止態模型可以用來篩選和檢測候選藥物，用於防止神經退行性疾病或症狀，包括但不限於中風、現帕金森症、阿爾茨海默氏症、和亨廷頓氏病。心臟衰竭，動脈粥樣硬化和心肌梗死。端粒功能障礙已被顯示在慢性心力衰竭中起重要作用。在培養的心肌細胞中幹擾TRF2的功能可引發端粒侵蝕和細胞凋亡。相反，外源性TRF2可保護免於氧化壓力，表明在不分裂細胞中，通過端粒功能障礙引起的細胞死亡 (0h，H，et al. ,Proc Natl Acad Sci USA. 100 :5378-5383, 2003)。在第五代 TERC 基因缺陷小鼠(G5TERC K0)( 一個由於缺乏端粒酶RNA基因TERC的端粒酶突變模型)表現出，心肌細胞中端粒明顯縮短，心肌心室擴張，心肌變薄，心功能障礙，突然死亡。G5TERC-K0小鼠的心臟切片揭示，與野生型小鼠相比，DNA損傷反應蛋白p53的表達增加，細胞凋亡也增加了，並且左心室心肌細胞的數量減少了 50% (Leri，A，et al. ,EMBO J. 22 :131-139, 2003)。動脈粥樣硬化通常指動脈硬化或動脈管壁的垢，它是因為動脈內多個斑塊的形成。因動脈粥樣化的刺激引發血管內皮細胞(ECs)功能障礙，對動脈粥樣硬化的發病機制非常重要。加速端粒縮短和提前進入靜止狀態已被發現於人的動脈粥樣硬化病變組織 (Ogami M, et al. , Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 :546-550,2004 ； (Minamino T, et al.，Circulation. 105 :1541_1544，2002)，建議由年齡依賴性的端粒縮短而引起的ECs的功能障礙或死亡可能是斑塊形成的早期步驟。冠狀動脈粥樣硬化導致的冠脈循環阻塞，引起心肌梗塞(MI，俗稱心臟病發作)。 MI導致的不分裂的心肌細胞的死亡，重塑適應不良，心臟收縮功能障礙，並最終充血性心力衰竭。本發明公開了低劑量雷帕黴素在IOii g/kg，而不是高於IOOii g/kg，在大鼠模型中顯著降低缺血性心肌梗死(圖17和例19)。此外，據報導，AMPK激活劑二甲雙胍也可以在鼠類模型中減少心肌梗死和防止線粒體介導的心肌細胞死亡(Calvert, Jff, Diabetes, 57 :696-705,2008)。這些結果表明，T0R/AMPK的/線粒體途徑對維持的不分裂心肌細胞的重要性，類似與對分裂靜止細胞。因此，端粒功能障礙所致分裂靜止模型可以用來選擇預防或治療心肌梗死的的候選藥物。老年性黃斑退化。年齡相關性黃斑變性(AMD)是老年人(> 50歲)失明的主要原因。它是開始於視網膜色素上皮(RPE)細胞退化，結果於視野中心(黃斑區)的視力的喪失。據報導端粒侵蝕、線粒體功能的喪失和細胞丟失與此病相關(Matsunaga H, InvestOphthalmol Vis Sci. 40 :197-202，1999 ；Liang FQ, et al.，Exp Eye Res. 76 :397-403, 2003)。因此，改善線粒體功能，防止細胞端粒侵蝕引起的細胞死亡，可以防止或穩定疾病的早期階段。有趣的是，50pM低劑量雷帕黴素治療本病的(美國專利號7083802)已有專利申請。因此，端粒功能障礙所致分裂靜止模型可以用來選擇預防或治療AMD的的候選藥物。骨性關節炎。骨性關節炎(OA)-關節軟骨逐漸喪失，是老年人中最常見的慢性關節病，顯著導致疼痛和殘疾。軟骨細胞的功能對維持適當的軟骨基質必不可少。有報導顯示，軟骨細胞的端粒功能障礙、線粒體突變和凋亡與OA相關((Martin，JA, et al. J Bone Joint Surg Am. 85-A Suppl 2 :106-110,2003 ;Ruiz-Romero C, et al. , Mol Cell Proteomics. 8 172-189,2009.Dave M. ,et al. ,Arthritis Rheum. ,58 :2786-2797,2008), 表明端粒功能障礙引起的軟骨細胞的死亡是一個潛在的疾病啟動機制。因此，改善線粒體功能，防止細胞端粒功能障礙所致的細胞丟失，可以防止或穩定疾病的早期階段。所以，粒功能障礙所致分裂靜止以用來選擇預防或治療OA的候選藥物。特發性肺纖維化(IPF)。這是一種慢性的，漸進的間質性肺疾病，特點是在肺間質的纖維組織異常和過度沉積。它通常發生在50歲以後。有證據顯示，端粒酶基因突變可導致成人的肺間質纖維化(Tsakiri KD, et al. ,Proc Natl Acad Sci USA. 104:7552-7557， 2007)，並且短的端粒與 IPF 相關(Alder JK, et al.，Proc Natl Acad Sci U S A 105 13051-13056,2008 ；Armanios MY, et al.，N Engl J Med. 356 :1317-1326，2007)。肺上皮細胞中的線粒體和凋亡也被證明參與IPF((Kuwano P, Intern Med. 47 :345-353, 2008)。這些結果表明，端粒功能障礙引起的肺上皮細胞的損失可能是老年性IPF的初始機制。因此， 改善線粒體功能，防止肺上皮細胞中的端粒侵蝕引起的細胞損失可能會阻止或穩定疾病的早期階段。因此，端粒功能障礙所致分裂靜止模型可以用來篩選防治IPF的的候選藥物。皮膚老化。成纖維細胞在皮膚老化中起著重要作用，如皺紋等。逐步縮短的端粒、 DNA損傷的積累、活性氧或紫外線都導致成纖維細胞老化，其中包括成纖維細胞的分裂靜止狀態和隨後的細胞丟失。成纖維細胞老化導致功能喪失，包括增細胞殖潛能的喪失，細胞形態和代謝的變化，細胞外基質蛋白的生產的下降，如I型和III型膠原(Varani J，et al. ,Am J Pathol. 168 :1861_1868，2006)，分解細胞外基質的蛋白酶的高表達(West MD，et al. ,Exp Cell Res. 184 :138_147，1989)。在這些體外變化都或多或少參與在體內皮膚老化的變化。保持的線粒體功能不僅減慢端粒的縮短(圖9B)，也可防止仍由功能的靜止的成纖維細胞的丟失(圖7和圖9A)，因此，延遲皮膚老化並防止皮膚癌。類風溼關節炎(RA)。端粒功能異常和線粒體基因突變是在RA的潛在致病因子。 RA患者的造血前體細胞(HPCS)和骨髓間質幹細胞(MSCs)顯示過早的端粒縮短和增殖潛力的減少(ColmeRna I, et al. , Arthritis Rheum. 58 :990-1000, 2008 Kastrinaki MC, et al, Ann Rheum Dis. 67 :741-749, 2008)。此外，HLA_DRB1*04 等位基因，本病的主要易感基因，已被證明調節端粒的縮短過程(Schonland S.O., et al. , Proc Natl Acad Sci U S A^lOO : 13471-13476，2003)。一些研究還表明，RA中發炎滑膜的組成和結構的一些特徵性的改變，與滑膜細胞凋亡反應的改變有關(Korb A』et al. ,Apoptosis. 14 =447-454,2009)。 此外，從RA滑膜細胞得到的線粒體DNA的突變與對照組相比大大增加(Pa Sylva TR, et al. ,Arthritis Res Ther. 7 R844-851, 2005)。因此,可改善線粒體功能和防止端粒縮短誘導的細胞死亡的候選藥物，可以被研發來防治此疾病。
糖尿病。糖尿病是指一組疾病，導致高血糖，原因是胰島素的減少(I型)或對胰島素不敏感(2型和妊娠期)。胰島￠-細胞由於端粒功能障礙或線粒體功能障礙而過早喪失功能可能是糖尿病的起始步驟。線粒體DNA的缺陷是糖尿病的病因一個常見的因素而且線粒體 DNA 的重排(Ballinger Sff, et al.，Nat. Genet. 7 :458-459, 2004 ；Ballinger SW, et al. , Nat. Genet. I :11-15,1992)和 tRNA 基因突變(van den Ouweland JM, et al.， Diabetes 43 :746-751,1994)與糖尿病是相關的。此外，在小鼠胰腺的P _細胞，滅活線粒體轉錄因子TFAM，一個線粒體生物合成的關鍵的蛋白質，導致細胞凋亡引起的P細胞數量的逐漸下降，結果血清胰島素的嚴重減少，並且血糖和空腹血糖大大增加(Koster JC, et al. , Cell 100 :645-654,2000 ；ffallace DC, Am. J. Med. Genet, 106 :71-93, 2001) 也有證據顯示人體胰島￠-細胞在體外有端粒侵蝕和其誘導的分裂靜止狀態(Halvorsen TL，.T Endocrinol. 166 :103-109，2000)。因此，改善線粒體功能、防止端粒侵蝕引起的細胞喪失的候選藥物可能預防這種疾病。上面提到的老年性疾病或老年症的幾個例子，都與線粒體退化和/或端粒功能障礙相關。有許多其他疾病，都屬於這一類，包括，但不僅限於，肥胖症，骨質疏鬆，高血壓，老年性肌肉萎縮，白內障，多發性硬化症，乾燥症候群，年齡相關性聽力損失，白髮，與年齡有關的免疫失調，以及睪酮，雌激素，生長激素，IGF-I或能源生產下降造成的障礙等等。因此， 本發明還包括將發現的任何與線粒體、端粒的相關的老年性疾病或老年症。綜上所述，本發明披露，在分裂靜止細胞和不分裂細胞中如神經元和心肌細胞，線粒體對維持分裂靜止狀態起重要的作用、並與許多老年病相關聯。此外，線粒體功能障礙和端粒功能障礙也被認為與老年性疾病相連。這些原則是使用的分裂靜止模型來搜尋老年性疾病的候選藥物的基礎上。圖18總結了老年性疾病的機制，並說明抑制營養/TOR途徑怎樣防止與老年性疾病。簡單地說，在各種的細胞和組織中，線粒體在老年性疾病中都發揮了重要的作用。在不分裂細胞中，如神經細胞、肌肉細胞和心肌細胞，線粒體可以維持的不分裂狀態，從而防止細胞重新進入細胞周期和隨後的發生細胞死亡。在增殖組織，改善線粒體功能，可以減少氧化壓力，提高細胞的增殖潛力。進入靜止狀態後，線粒體也保持靜止狀態，防止細胞喪失，如同在不分裂細胞中。細胞喪失可能引發修復反應，如在RA和IPF中的炎症反應。細胞喪失也可導致組織的功能喪失和退化性疾病，如骨髓造血功能衰竭，神經元退化和心臟衰竭。在另一種情況下，分裂靜止狀態的消失可能導致腫瘤的發生和癌症的發展。熱量限制，包括葡萄糖限制和低劑量雷帕黴素，刺激線粒體功能，並防止各種與老年性疾病或功能障礙。總結，本發明披露包括(一)，線粒體功能可維持分裂靜止狀態；(二)維持不分裂狀態是類似維持分裂靜止狀態；(三)CR通過提高線粒體功能維分裂靜止和不分裂的細胞，因而分裂靜止模型可以用來鑑別篩選候選藥物，用以刺激線粒體功能和預防各種老年症；(四)許多癌症的化學預防劑，葡萄糖的攝入抑制劑和AMPK的活化劑都能延長分裂靜止狀態，從而可以研發為老年性疾病的候選藥物；和(V)低劑量雷帕黴素，作為CR模仿物， 能維持分裂靜止的和不分裂狀態的細胞，防止癌症，中風引起的腦損傷，心肌梗死的和其他老年性疾病或老年症。最近，在前申請要求相應權益的優先權後，一些研究報告說，臨床劑量的雷帕黴素可通過抑制蛋白質的翻譯和刺激自嗤而對裳老和老年性疾病有一定的效果。例如，在小鼠模型中，高劑量雷帕黴素(7. 5mg/kg)，通過抑制蛋白質翻譯，特別是RTP801/REDD1/Ddit4， 而對帕金森氏病有效，此蛋白在受影響的神經元中表達高並導致神經元死亡(Malagelada C et al.，J Neurosci. 30(3) :1166-1175,2010 Jan 20);高劑量雷帕黴素(2. 24mg/kg)， 在阿爾茨海默病的小鼠模型中，通過增加自體吞噬，能改進的認知障礙，並能夠改善A β和 tau蛋白病理(Caccamo A, et al. , J Biol Chem. 2010 Feb 23);此外，高劑量雷帕黴素能稍稍延長小鼠和果蠅的壽命( 10% ) (Harrison DE, et al. ,Nature. 460(7253) :392-395, 2009 Jul 16)，但與CR(約30-40% )相比效果小多了。有趣的是，高劑量雷帕黴素這樣的延長果蠅壽命的機制不是通過AMPK/線粒體途徑，但通過抑制蛋白質的翻譯和/或刺激自體吞噬(Bejdov I, et al.，Cell Metab. 11(1) :35-46. 2010 Jan 06)。這些結果表明，高劑量或臨床劑量雷帕黴素，通過抑制蛋白質翻譯以及生長、或增加細胞自噬，可能對某些特定的老年性疾病和壽命有一定作用。然而，由於各種副作用，臨床劑量雷帕黴素不適合長期使用，來防止老年性疾病或老年症。另一方面，本發明披露低劑量雷帕黴素，作為模仿CR者(事實上，由於非常小的副作用，比CR更好)，可用於防止衰老和老年性疾病，通過AMPK的/線粒體途徑，相比於使用臨床高劑量雷帕黴素，低劑量雷帕黴素有各種明顯的優勢，如上面所討論的，比如更高的有效性和更小的副作用。實施例A.用端粒功能障礙模型來高通暈篩選鑑別和檢測抗衰老的候選物，以預防或治療老年性疾病或老年症。在本發明的的一個方面，是用酵母端粒功能障礙模型cdcl3-l進行高通量篩選， 發現有用的抗老化劑，來預防或治療與老年性疾病或老年症。cdcl3-l模型已經被很好的研究過，一旦cdcl3-lp被滅活後，立即進入在G2/M細胞周期阻滯，以及隨後的細胞死亡。採用此模型，本發明提供了一種快速的方法來篩選候選物，防止端粒功能障礙誘導的細胞死亡。 其他的有端粒功能障礙、並表現出快速的細胞周期阻滯和隨後的細胞死亡的模型也可用， 例如，stnl-1, cdcl7-l和cdcl7_2,分別是Stnlp (酵母的端粒封蓋蛋白)和Cdcl7p (酵母 DNA聚合酶的催化亞基中的α-引物酶)溫度敏感突變體。此外，其他酵母細胞表現出端粒功能障礙和細胞凋亡，也可以使用，其中包括、但不僅限於estl, est2, est3, hdfl, hdf2,或 cdcl3-2突變體。人類的元代成纖維細胞WI-38，是人類的端粒功能障礙模型，可用以確認或檢測的候選藥物。以下(實施例1-6)使用cdcl3-l模型。實施例I用細胞存活實驗篩選鑑別試劑來防止在cdcl3-l模型中的細胞死亡(如圖所示 19)為高通量篩選在cdcl3-l模型中可改善線粒體功能、延長細胞周期阻滯狀態、並防止細胞死亡的化合物或化學成分，_80°C保存cdcl3-l細胞先被激活，即放在新鮮YEH)或酵母完全培養基(YC)培養板上，然後在允許細胞生長的溫度培養為3 5天(約24°C )， 直至形成單菌落。幾個酵母菌落被培養在液體培養基中過夜(24°C )，然後用新鮮培養基稀釋，從I : 2到I : 20(對cdcl3-l菌株I : 10稀釋最合適)。酵母細胞液分裝到96-孔板或任何合適培養板。要測試的化合物或化學成分，如藥物、化合物、肽庫或其他的庫，用水、DMSO (二甲基亞碸)或其他有機溶劑連續稀釋，然後加入細胞培養液，加入的體積小於5%的總體積；加入相應的溶劑作為陰性對照、InM的雷帕黴素作為陽性對照。然後酵母細胞被培養在一個非允許溫度中(約37°C)兩天，或直至陰性對照組無存活細胞。取少量(如5 ill)的細胞轉移到含YEH)瓊脂的另一個96-孔或任何其他培養板上(細胞還可以稀釋後再轉移)，然後在允許生長的溫度(約24°C)孵育至少3天，或直至陽性對照有菌落形成。促進菌落形成的化合物將被視為初級候選藥物。另外，少量(如 5 U I)的細胞也可被轉移到含YEH)液體的另一個96-孔或任何其他適用培養板中，然後在 24°C培養，並在595nm定期讀取光密度OD595值，比如每天一次。相對於陰性對照，能增加細胞密度是初級候選藥物。這種方法圖示於圖19。初級候選藥物將由細胞凋亡和ROS測量的實驗來確認，如實施例2和3所的分別描述的。初級候選藥物可以進一步被測試是否抑制細胞生長於Gl期，通過監測在允許生長的溫度下的生長曲線如同圖ID和通過使用流式細胞儀分析DNA含量的分布如圖2A。為了消除初級候選藥物刺激細胞突變、從而在不允許生長溫度中形成菌落的可能性，候選藥物與cdcl3-l細胞一起孵化在37°C去形成菌落。另一個重要方面是候選藥物將被測試是否能改善線粒體功能、和抑制靜止狀態的哺乳動物細胞如WI38的損失。它們是否可有效地預防某老年性疾病將被用特定的疾病模型來測試，例如，它們是否可以抑制腫瘤的發生、和/或在動物模型中減少腦梗塞。適合高通量篩選的其他類型的培養板包括但不限於384-孔板。此外，這種方法可以用其他類型培養板來檢測和確認的候選藥物，如6-孔、12-孔板等。實施例2用細胞凋亡實驗篩選鑑別防止cdcl3-l細胞死亡的試劑cdcl3-l的細胞死亡展現凋亡標記，這個特點可以用於高通量篩選，因它比實施例 I的細胞存活實驗所需時間少。它也可用於確認從實施例I的高通量篩選出陽性候選藥物。 另外，此實驗也可以用以篩選抑制細胞凋亡的試劑。化合物與cdcl3_l在非允許溫度(約37°C )中孵化一天(約18_24小時)後，細胞用FITC-Z-VAD-FMK (只結合到激活的caspase的自殺底物)在黑暗中20分鐘染色，或其他合適的細胞凋亡檢測劑。細胞與磷酸鹽緩衝液(PBS)洗一次，用螢光酶標儀讀取螢光值。 由於細胞死亡，陰性對照組(篩選的無化合物或組合物)會有很高的FITC信號，減少FITC 的化合物或組合物，被認為是陽性的候選藥物。它們可以用實施例I的細胞存活實驗來確認，並被進一步測試能否減少活ROS和改善線粒體功能。這些活性也將用人的端粒功能障礙模型如WI-38分裂靜止細胞進行測試。它們在預防癌症和其他與老年性疾病或老年症活性，也將進一步在適當的模型進行測試。作為凋亡標記，測量磷脂醯翻轉的膜聯蛋白V結合法已在圖3B中描述，它也可用於高通量篩選。實施例3用ROS測量法來篩選鑑別防止cdcl3_l細胞死亡試劑(圖20所示)cdcl3-l細胞死亡展現顯著升高的ROS水平，這種特性可以用於篩選抑制cdcl3-l 細胞死亡的試劑。ROS測量法比實施例I的細胞存活實驗所需時間少，可以用於高通量篩選。它也可用於確認從實施例I和實施例2的高通量篩選出陽性候選藥物。此外，這也可以被用來檢測篩選抗氧化劑。
圖20說明的實驗過程。細胞與化合物在非允許溫度(37°C )中孵化一天後，用脫氫羅丹明-123染色(或其他合適的ROS檢測劑)黑暗中一小時，用螢光酶標儀讀取螢光值。 陰性對照(篩選的無化合物或組合物)在細胞死亡過程中釋放的高水平R0S。能減少ROS 的化合物或組合物是陽性的候選藥物，他們對細胞死亡的預防和線粒體功能的改善將在酵母和人體模型中進一步測試。它們在預防癌症、神經退行性病變和其他老年性疾病或老年症的作用也將在適當的模型被測試。實施例4測量線粒體量來篩選鑑別防止端粒功能障礙模型的分裂靜止細胞退化的試劑cdcl3-l的細胞死亡伴隨著線粒體量(mito mass)的急劇增加。這種特性可以用來尋找抑制cdcl3_l細胞死亡的分子。線粒體量檢測比實施例I中所描述的細尚存活實驗花費較少的時間，可用於高通量篩選，以及確認從實施例1，2和3中所述的高通量篩選出的陽性的候選藥物。化合物與cdcl3-l細胞在非允許溫度(約37°C )孵化一天後，用MitoTracker Green FM(或任何合適的線粒體量染色劑)在黑暗中染色20分鐘，螢光酶標儀讀取螢光值。 由於死細胞中含有更多惡化並失去了膜電位的線粒體，它們會展現急劇增加的線粒體量染色。改善線粒體功能防止細胞死亡的化合物或化學成分，能降低線粒體的惡化、減少線粒體量信號，被認為是陽性候選物，它們將被進一步測試是否可以延長酵母和人細胞的分裂靜止狀態。實施例5從DNA或核酸庫中篩選鑑別防止分裂靜止細胞死亡的生物分子這裡以Li-PEG轉染法作為例子，其他的轉染方法也可使用。對數期快速生長的新鮮酵母細胞(cdcl3-l)用蒸餾水洗淨，然後和DNA庫或核酸庫一起孵化在轉染緩衝液中 (2mM TRIS pH7. 5, IOOmM LiAC, O. 5mM MgAC2,0. ImM CaAC2,15%甘油，40% PEG-4000，24 μ g/ ml ssDNA)，24°C 1-4小時。混合物然後在約42°C熱休克15分鐘，再加入3倍體積的豐富的培養基YEH)，並在室溫(約24°C )孵育一個小時。離心去除液體後，細胞重新懸浮於蒸餾水H2O,然後根據特定的核酸庫的要求塗在選擇培養基平板上。在允許的溫度24°C培養至少4天後，收穫轉染菌落並在允許溫度(約24°C)培養在液體選擇培養基中。對數生長期的細胞被轉移到一個非允許溫度(約37°C)培養2天，讓滅活cdcl3-lp誘導的細胞進入死亡。細胞然後被適當稀釋，塗在YEH)培養基，在約24°C培養4天以上，或直到存活細胞形成菌落。每個菌落被單獨挑出，DNA被分離並用PCR(DNA聚合酶鏈反應)擴增和測序來確定DNA序列。可防止cdcl3-l死亡的DNA將被確認，通過把純化的DNA再引入cdc3_l細胞中。陽性DNA將被進一步測試是否預防分裂靜止的人成纖維細胞的惡化和調節線粒體和氧化應激的功能。實施例6從基因破壞或基因刪除庫中篩選鑑別促進細胞死亡的蛋白質要篩選鑑別可促進由端粒功能障礙引起的細胞死亡的功能的蛋白質，基因幹擾的庫(例如酵母轉座子插入庫)可以引入cdcl3-l細胞。另外，cdcl3-l基因也可以引入酵母的基因刪除菌株庫，其中每一株都有一個特定的基因刪除，可以防止滅活cdcl3-lp引起的細胞死亡的缺失的蛋白的或功能喪失的蛋白，被認為是陽性候選物。
實施例7在哺乳動物細胞中篩選鑑別刺激線粒體生物合成的試劑這個實驗可直接用人體細胞。細胞株的選擇是根據某一老年性疾病或老年症。細胞與化合物一起孵化在96-孔板大約一天，用乙醇(最後的60%左右)固定以消除線粒體膜電位的影響，然後用MitoTracker染料(Invitrogen)染色、突光酶標儀讀取突光信號。與對照比，大於20%螢光信號的增加為陽性，陽性化合物將在cdcl3-l和WI-38模型中被測試是否防止端粒功能障礙引起的細胞損失，以及對線粒體膜潛能和ROS水平影響。篩選鑑別刺激線粒體生物合成的候選物另一種方法，是使用實時定量反向轉錄聚合酶鏈反應(即real time quantitative RT-PCR or qRT-PCR),以測試線粒體生物合成的轉錄因子的mRNA是否被上調。線粒體生物合成的轉錄因子，包括TFAM， NRF-I，NRF-2, PGC-I a，PGC-I 旦，TFB1M, TFB2M, ERRS (ERR a , ERR ^ , ERR y ) , PRC, POLRMT, PPAPs (PPAP a，PPAP y，PPAP S )，和 RIP140。在這裡，以 TFAM 作為一個例子， 優選用元代人體細胞。WI-38細胞接種於96-孔板(或其他格式)，與化合物一起培養一定的時間(如，大約18小時)。細胞用PBS洗漆和用TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit (Applied Biosystems)溶解於孔板中，如此可去除DNA,使細胞裂解物可進行RT-PCR。細胞裂解液用Qiagene的onestep qRT-PCR試劑盒和QuantiFast多重RT-PCR試劑盒的試劑稀釋在一個新96孔板，TFAM的引物組5』 -ACAGCTAACTCCAAGTC AGATTATGTC-3』 和 5』 -GTAGACACTTGAGACTAACAACCGT-3 』，肌動蛋白(對照組)的引物組 5』 -CAAAGACCTGTACGCCAACACAGT-3』 和 5』 -TTGCTGATCCACATCTGCTGGAAG5-3』 已被成功地用於檢測由50pM雷帕黴素和其他試劑對TFAM mRNA的提高(數據未顯示，見Fu X，et al, PLoS ONE, 3 (4) :e2009，2008)。能增加TFAM表達> 2倍左右的化合物或組合物，將視為陽性，被進一步在cdcl3-l或WI-38端粒功能障礙模型的維持分裂靜止的測試。實施例8在WI-38成纖維細胞中測試化合物或組合物的防止分裂靜止狀態喪失的活性會有這樣情況，如化合物或組合物是已知的藥物、天然物或天然提取物、已知的肽、蛋白，或從酵母分裂靜止模型篩選獲得的候選物，它們需要在人體細胞中被測試它是否具有抗衰老的作用。這些實驗可以如圖7所示，用人的WI-38成纖維細胞完成。實施例9用cdcl3-l酵母細胞測定雷帕黴素及其類似物的抗衰老的生物活性濃度有時會需要確定雷帕黴素的抗衰老的生物活性的濃度或含量，例如，不同批純化的雷帕黴素，樣品在純化過程中的粗提取物，給藥後血液、組織中雷帕黴素、或雷帕黴素衍生物的化學衍生物等。為確定從各種來源的雷帕黴素的抗衰老生物活性，含雷帕黴素材料將被適當的溶劑進行所需的連續稀釋(如3倍或10倍的系列稀釋)。大約或小於5%培養總體積的稀釋物將被加入到被YEH)培養基10倍稀釋新鮮cdcl3-l細胞中。在非允許溫度 (約37°C )孵化約24至36小時來誘導細胞死亡的後，存活細胞的數量用圖I所述的菌落形成實驗測量。為了得到活性雷帕黴素的標準濃度，純化雷帕黴素是用DMSO稀釋到I PM。 過夜培養的cdcl3-l用YEH)稀釋10倍。I ii M雷帕黴素用含細胞培養基的連續稀釋3倍或2倍至10pM，然後將混合物在約37°C孵育約24-36小時以滅活cdcl3-lp誘導細胞死亡。 不同濃度的標準雷帕黴素得到的存活細胞數用菌落形成來測量，並相對相應的濃度繪製標準曲線。用各種雷帕黴素來源而得到的存活細胞數比較的標準曲線，從而確定雷帕黴素的抗衰老活性濃度。對於一種雷帕黴素的衍生物，標準曲線將先被相同的衍生物創造出。為測量雷帕黴素衍生物的活性濃度，純化的衍設立生物將被用於標準曲線。除了菌落形成， cdcl3-l細胞死亡引起的細胞凋亡檢測和釋放ROS也可以被用來確定雷帕黴素的抗衰老的生物濃度。這種方法也可以用來確定其他抗衰老試劑或化學成分的抗衰老活性的生物濃度， 如EGCG。此外，這種方法可用於檢測生物樣品的抗衰老活性。實施例10用cdcl7-l和cdcl7_2酵母突變體檢測抗衰老劑雷帕黴素(I和3nM)和葡萄糖限制用來作為抗衰老藥物的例子。從_80°C的儲藏 cdcl7-l和cdcl7-2酵母細胞被培養在新鮮YEH)板上以被活化，然後在允許溫度(約24°C) 孵育5天，直到單菌落形成。挑取幾個酵母菌落放在YEH)液體培養基中24°C培養過夜。培養液(10倍稀釋)用新鮮YEH)含有雷帕黴素0，I和3nM，或0. 5%葡萄糖YETO的培養基稀釋，然後在一個非允許高溫(約37°C )培養22小時，以滅活的DNA聚合酶-a、引起生長停滯和隨後的細胞死亡。用菌落形成實驗測定存活細胞數目。簡短的說，處理過得細胞被連續稀釋(10倍)，然後放少量的細胞(5 ii L)在YEH)培養板上，再在允許的溫度(約24°C ) 孵育至少4天,讓存活細胞形成菌落。如圖21A所示,雷帕黴素防治在cdcl7-l和cdcl7-2 變異酵母中滅活DNA聚合酶-a誘導的細胞死亡。實施例11用estl-ts酵母突變體檢測抗衰老劑在此模型中用雷帕黴素作為抗衰老藥物的例子。雷帕黴素可以防止端粒酶失活 68七1」3酵母細胞(estl-ts rad52: :URA3)中ROS上升和類似凋亡細的胞死亡，如文章所述 (Qi H et al, PlosOne, 2008) 0此實驗是用含雷帕黴素的培養板做的，此法也可改為在液體培養基中培養細胞，以適應高通量篩選。簡單的說，estl-ts細胞被從_80°C儲存中激活， 即把菌劃在新鮮YEH)培養板後在允許的溫度(約24°C )培養5天，直到單菌落形成。挑幾個酵母菌落在YEH)液體培養基中，在一個允許溫度約24°C培養過夜。細胞用新鮮YEH) 稀釋約100-300倍到，加入0或InM雷帕黴素，在非允許溫度約37°C孵育混合物兩天左右。 細胞再次用含0或InM的雷帕黴素的YEH)或對照溶劑稀釋100-300倍，然後在不允許溫度 37°C培養兩天左右。不允許溫度中滅活端粒酶導致逐步縮短的端粒和最終端粒功能障礙， 從而引起ROS上升和類似凋亡的細胞死亡。用細胞凋亡檢測或ROS的檢測來測量細胞死亡。 ROS測量用脫氫羅丹明123(約5 y g/ml在PBS緩衝液中)黑暗中染色並用流式細胞儀分析。細胞的凋亡也可用如例2的caspase活性來測定.B.針對營養信號/T0R/AMPK/線粒體/分裂靜止途徑來防治老年性疾病或老年症實施例12在哺乳動物模型系統測量分裂靜止途徑的組成部分。此例使用免疫印跡在哺乳動物細胞中確定抗老化劑誘導的的分裂靜止途徑關鍵蛋白質的增加。雷帕黴素作為一個例子。最後傳代20天後的WI-38細胞後(分裂靜止態) 用圖示的雷帕黴素劑量處理18小時，細胞裂解液用免疫印跡分析。低劑量雷帕黴素(50和 IOOpM)，但不是高劑量(2000pM)，增加分裂靜止途徑的關鍵蛋白P53，P21和pRb (圖9C)。
實施例13具有防止老年性疾病或癌症化學預防活性的試劑刺激線粒體的功能並延長分裂靜止狀態實施例如圖7、10和11所述。在圖10顯示，50pM雷帕黴素、250 μ M AICAR、20yg/ ml EGCGU. 6 μ g/ml GSE、葡萄糖限制(從 O. 4%到 O. 2% )、20 μ g/ml 的越橘提取物(BE)、 I μ M AITC和12. 5 μ M 2-脫氧葡萄糖增加線粒體量(一個線粒體生物合成的指標)，也可阻止分裂靜止細胞WI-38的損失(圖7)。此外，苯異硫氰酸鹽、水飛薊賓、亞硒酸鈉和染料木素可以增加線粒體量，也在酵母細胞中表現出不同程度的對端粒死亡的保護作用(圖10 和 11)。實施例14AMPK的活化劑抑制TPA誘導ΝΙΗ3Τ3細胞的癌轉化。此實驗如實施例19所述。簡單的說，1500個ΝΙΗ3Τ3細胞分別與50 μ L的O. 4% 瓊脂培養基(10%的牛胎血清基礎培養基)混合，鋪在在96孔板中，其孔中已經鋪了一層 50 μ I的O. 8%瓊脂培養基，加入100 μ I的含藥物的液體培養基，使終濃度如圖所示，DMS0， 10 μ M TPA, 40 μ M AICAR，或 10 μ M ΤΡΑ+40 μ M AICARA5%C02 3 7°C培養大於 7 天，每 5 天加50 μ I新鮮培養基，細胞克隆數在顯微鏡下計數。如圖12所示，TPA急劇減少NIH 3Τ3 細胞中的線粒體量，AMPK的活化劑AICAR扭轉這種下降(圖12)。此外，AICAR也減少(圖 13Α及13Β)ΤΡΑ誘導的NIH 3Τ3細胞的癌轉化形成的克隆。C.用低劑暈TOR抑制劑模仿的CR以預防和治療與老年性疾病或老年症TOR抑制劑和雷帕黴素。TOR特異抑制劑雷帕黴素(西羅莫司)是一類的大環三烯分子的原始成員，包括CCI779 (temsirolimus)，RAD-001 (everoIimus)， AP-23573(Deforolimus), AP-23675， AP-23841， ABT-578(zotarolimus),7-epi-雷帕黴素，7硫代甲基-雷帕黴素，7-epi-三甲氧苯基-雷帕黴素，7-epi-硫代甲基-雷帕黴素,7-去甲氧基-雷帕黴素，32-去甲氧基-雷帕黴素，2-去甲基-雷帕黴素，以及 42-0-(2-輕基)乙基-雷帕黴素。雷帕黴素最早被發現具有抗真菌活性(C. Vezina et al., J. Antibiot. 28, 721,1975 ；S. N. Sehgal et al. , J. Antibiot. 28, 727,1975 ；H. A. Baker et al.，J. Antibiot. 31, 539,1978 ；U. S. Patent 3, 929, 992 ；and U. S. Patent 3, 993, 749)。雷帕黴素是用來作為免疫抑制劑(Santos E and Nebreda AR, Santos, FASEB 3 2151-63，1989):預防或治療系統性紅斑狼瘡(美國專利5，078，999)、肺部炎症(美國專利 5，080，899)、在器官移植時的排斥反應性、關節炎(Carlson et al, J Pharmacol Exp Ther 266 :1125-38,1993 ；Foroncewi. cz et al, Transpl Int 18 :366_8，2005)、眼內炎症(美國專利5，387，589)、和心臟炎症性(美國專利5，496，832);用於防止血管損傷後平滑肌細胞增殖和內膜增厚(美國專利號5，288，711，和5，516，781)，也用於預防再狹窄(美國專利第 6585764號)；也被專利用於治療眼疾(美國專利號7083802)。包括老年性黃斑變性(AMD) (美國專利申請公布號 2006/0182771, 2006/0247265, 2006/0263409,及 2007/0105761， 2006年獲得專利/0264453)，脈絡膜新生血管(CNV)和溼性AMD(美國專利申請公布號 2005/0187241)。雷帕黴素已被證明有抗增殖和抗腫瘤活性。雷帕黴素單獨或與其他藥物合用，已顯示出對成人T細胞白血病/淋巴瘤的抗腫瘤活性，(美國專利號4，885，171和4，401，653 ;歐洲專利申請525960A1)以及對惡性癌(美國專利號為5，206，018)和貧血 (美國專利號為5，561，138)的作用。它可用於治療轉移性乳腺癌(美國專利申請公布號2007/0104721)，腫瘤(美國專利申請公布號2004/0176339和2006/0035904)，和早期的B細胞產生的急性淋巴細胞白血病(美國專利7026330)。也被專利用於治療結節性硬化症(美國專利申請公布號2005/0070567)，抑制哺乳動物的異常細胞的生長(美國專利申請公布號2006/0035907)，降低增殖和促進腫瘤細胞的凋亡(美國專利專利申請公布號 2006/0094674)，和治療增生及炎症性疾病(美國專利申請公布號2006/0135549)和慢性病毒感染(美國專利申請公布號2007/0099844)。使用雷帕黴素/mTOR抑制劑或與其他藥物的組合也被用於治療其他各種疾病或症狀，如糖尿病(美國專利號為5，321，009)，皮膚病(美國專利號為5，286，730)的報告，腸道疾病(美國專利號5，286，731)，神經系統疾病，神經退行性疾病(美國專利號 6，187，756)，骨質流失(美國專利申請公布號2006/0173033)，抗血管生成的緩釋人工晶體植入(美國專利申請公布號2007/0059336)，和自體吞噬誘導而抑制蛋白質的構象紊亂(美國專利申請公布號2007/0155771)。雷帕黴素被發現與TOR和FKBP12形成複合物，抑制TOR與它正常的底物蛋白形成複合物如TOR-Raptor(TORCl)，抑制TORCl形成導致蛋白翻譯和核糖體生物合成被抑制，因此細胞周期抑制在Gl期。TORCl抑制也導致為營養而增加蛋白質和細胞內器官的自體吞噬。目前雷帕黴素對各種疾病的治療用途主要是基於這個TORCl幹擾和隨後的在Gl細胞周期的抑制和自體吞噬。與此對比，低劑量的雷帕黴素及其類似物，模仿CR，通過AMPK/線粒體/分裂靜止途徑來預防或治療老年性疾病。實施例15低劑量雷帕黴素抑制TPA誘導NIH3T3細胞癌轉化NIH3T3細胞的癌轉化是以很好的腫瘤的形成在體外模型，以在軟瓊脂中形成克隆來測定(稱為錨碇獨立增長(anchorage-independent))。誘變劑 TPA(12-0-TetradecanoyIphorbo 1-13醋酸醯佛波醇-13-乙酯)是眾所周知的蛋白激酶 C(PKC)激活劑，在小鼠胚胎成纖維細胞NIH3T3中激活原癌基因和癌轉化。腫瘤形成的檢測，採用TPA誘導NIH3T3細胞錨地獨立增長。有趣的是，IOuM TPA急劇減少NIH 3T3細胞中線粒體量，InM雷帕黴素扭轉這種下降如圖12所示。此外，InM雷帕黴素防止10 y M TPA 誘導的NIH 3T3細胞的轉化(圖13)。1500個NIH3T3細胞分別與50mL的0. 4%瓊脂培養基(10%的牛胎血清培養基)，鋪在在96孔板中，其孔中已經鋪了一層50ii L的0. 8%瓊脂培養基，加入IOOml的含藥物的液體培養基，使終濃度如圖所示，DMSO，IOii M TPA，lnM雷帕黴素，或IOii M TPA+lnM雷帕黴素。在5% CO2 37°C培養超過7天，每5天加50 y L新鮮培養基，細胞克隆數在顯微鏡下計數。如圖13A及13B所示，InM雷帕黴素完全阻止癌轉化。 雷帕黴素為InM略放慢了 NIH3T3的增長速度，為等待生長慢的克隆，繼續培養21天後再計數，結果與培養7天的相同。因此，InM雷帕黴素放慢生長，不是阻止克隆形成的原因，卻支持線粒體功能通過維持分裂靜止而防止錨碇獨立增長或腫瘤形成。相反，臨床劑量雷帕黴素被報導促進腫瘤的發生，從而增加淋巴瘤、人類皮膚癌和其他癌症的風險。最近發現的臨床劑量的雷帕黴素抗增殖活性是限制已形成的腫瘤的生長，可能是通過其抑制Gl期和蛋白合成的作用。
此外，AICAR (40 μ Μ)，能激活AMPK並延長分裂靜止狀的人成纖維細胞的壽命(圖 7)，也能扭轉TPA引發的線粒體量下降(圖12)，以及抑制錨碇獨立增長(圖13Α和13Β)。 這些數據進一步支持線粒體功能在防止錨碇獨立增長或腫瘤形成的作用。結論，低劑量雷帕黴素和AICAR防止腫瘤形成，起碼是TPA誘導的腫瘤形成的情況下。實施例16低劑量雷帕黴素降低ROS和延長培養的GCN神經細胞的壽命小腦顆粒神經元(CGN)從7日齡幼鼠得到。簡短地說，從大腦剝離的小腦被放置在一個含BMEM與20mM HEPES緩衝液(BMEM-HEPES)的Petri培養皿中。小腦的腦膜和血管被丟棄，以確保最小的血管內皮細胞的汙染，用解剖刀切成小碎塊，用胰酶消化37°C 15 分鐘，再加入Iml含O. 025%大豆胰蛋白酶抑制劑和O. 05% DNA酶的BME胰來抑制胰酶，組織碎片通過火拋光過的巴斯德吸管被小心磨碎，直到它被分散成均勻的懸浮液。懸浮液通過乙醇消毒過得40微米的濾膜過濾，再離心沉澱。小腦顆粒神經元被懸浮在B27補充神經基質(neurobasal)培養基中含有25mM氯化鉀(Invitrogen, Carlsbad, CA)。細胞然後接種到24孔板(I板/小腦)，並在含B27，20mM的氯化鉀，O. 5mM的穀氨醯胺，100單位/ml青黴素，100 μ g/ml鏈黴素的神經基質(Neurobasal)培養基(Invitrogen)中培養。培養7天後加雷帕黴素。培養31天後，用MTT法測量神經細胞的存活。如圖所示14A，大多數CGN細胞培養31天後已經死亡丟失了。然而，低劑量雷帕黴素防止這種丟失，延長CGN細胞的壽命，但高劑量的雷帕黴素沒有此效應。為分析R0S，剛分離的CGN細胞液懸浮在Neurobal完全培養基中，以I百萬細胞/ 毫升/管的密度，接種於12X75毫米試管中，細胞經雷帕黴素處理20小時後，用2 μ g/ml的脫氫羅丹明123染色30分鐘，流式細胞儀分析。圖14B顯示，雷帕黴素降低了懸浮的CGN 細胞的ROS水平。實施例17低劑量雷帕黴素在大鼠中風模型中減少小腦梗死面積此例用缺血性中風的大腦中動脈(MCA)閉塞模型。自發性高血壓易中風的大鼠 (SHR-SP)被隨機分為兩組(η=每組8隻)對照組DMSO和雷帕黴素組。大鼠被15%水合氯醛(300毫克/公斤，腹膜內(I. P.))的麻醉。用改進後的田村和McGill的方法造成電凝MCA 末端引起的永久局灶性腦缺血(Tamura A, et al.，J Cerebral Blood Flow Metab. 1981 ；
I:53-60. McGill JK, et al. ,Stroke. 36 :135-141,2005) 簡短地說，右 MCA 在嗅束和下腦靜脈之間的一段被電凝固。凝固的動脈用微型剪刀以確保血液供應完全停止。MCA閉塞10分鐘後，雷帕黴素和對照組DMSO給藥，24小時後收穫MCA閉塞腦樣品， 2毫米厚的冠狀切片立即用2% 2，3，5_三苯基氯化四氮唑(TTC)染色，梗死區域為白色，正常為紅色。梗死面積和大腦半球每個切片(雙面)的面積被用圖像分析來描繪和量化分析 (Microsystems Type DM LB2, Leica, Germany)。腦水腫可能會干擾在評估梗死體積,此點可用標準方法來糾正，即從對側大腦半球體積減去非缺血同側半球體積。梗死體積表達為佔對側半球體積的百分比。梗死組織和半球的重量以類似的方式測定。如圖15A所示，雷帕黴素低劑量在10μ g/kg明顯減少MCA閉塞引起的梗死體積，而臨床劑量lmg/kg的雷帕黴素沒有這種效果(Sharkey，JJ and Butcher SP, Nature, 371 :336-339,1994) 此外，MCA 閉塞20天前給藥雷帕黴素，劑量為0，0.3，1，3和10μ g/kg，也可阻止腦梗死(圖15B)。
實施例18低劑量雷帕黴素降低MPP+誘導的ROSMPP+是線粒體呼吸鏈複合物I (NADH CoQl還原酶)的抑制劑，也是多巴胺神經毒素。它通常用於在鼠類中誘發帕金森氏病。人原代成纖維細胞WI-38細胞與200iiM MPP+ 孵化3天，圖14表示的不同濃度的雷帕黴素也與細胞一起孵化3天，然後用脫氫羅丹明123 在黑暗中染色30分鐘，再用流式細胞儀分析。脫氫羅丹明123可被氧化成羅丹明(顯示螢光)，與ROS水平成正比。如圖16所示，MPP+大大增加了 ROS水平，低劑量雷帕黴素在pM範圍明顯減少此增加。實施例19低劑量雷帕黴素在大鼠模型中減少心肌梗死面積心肌梗死(MI)實驗選用200至250克的雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠(每組n = 10-12隻)。雷帕黴素以0，10，或100 y g/kg/天的劑量，給藥3天，然後進行心肌梗死實驗。 大鼠在乙醚麻醉時被左側開胸暴露心臟，在肺動脈流出道和左心房之間的左前降支動脈用 6-0聚丙烯縫線結紮，然後跳動的心臟被迅速放到其正常的位置，關閉胸部，排除空氣。大鼠被送回具有以前提過的條件的籠子裡。冠狀動脈結紮後5個小時，用過量苯巴比妥處死大鼠。左心室被分離並沿心臟長軸垂直切成4 5片，切片在37°C用0. I %的硝基藍四氮唑磷酸鹽緩衝液染色30分鐘,和MI的大小的測量用所述方法(Lin LI, et al, J Cardiovasc Pharmaco, 50 :327-332, 2007)。正常組織被染成藍色,而壞死組織仍然不染色。分離染色和未染色的組織並分別稱重。MI的大小表達為佔總左室重量比例。如圖所示。如圖16所示， 在IOii g/kg/天的低劑量雷帕黴素顯著減少心肌梗死面積,但高劑量IOOii g/kg/天不行。本文所引用的所有專利和非專利出版物被納入本文作為參考，與每一個專利、出版物被單獨納入本文作為參考具有相同的效果。本申請中引用或鑑定的任何文件，並非承認這些文件構成本發明的現有技術。應理解上述詳細的說明文本和所附的例子是為了說明、而非限制該發明的範圍。 本領域的技術人員一旦看過本發明文本後，基於本發明的多種變體都是顯而易見的。本發明的全部範圍應該由權利要求及其等同物、說明書及其變體來確定。
權利要求
1.一種鑑別或測定用於預防或治療老年性疾病或症狀的試劑的方法，包括用分裂靜止模型篩選ー個或多個化合物或組合物，並監測它們的抗衰老活性。
2.如權利要求I所述的方法，其中所述的抗衰老活性選自(a)防止分裂靜止細胞或不分裂細胞的細胞周期阻滯狀態的退化；(b)刺激、改善、或維持線粒體功能；(C)防止與線粒體或端粒功能喪失有關的老年性疾病或症狀；和(d)防止由酵母的染色體端粒功能異常而引起的活性氧(ROS)的增高或細胞凋亡。
3.如權利要求I或2所述的方法，其中所述的分裂靜止模型選自(a)ー種包含功能異常的染色體端粒的變異酵母；(b)一種表現出端粒酶活性不足的原代人體細胞株；(C) 一種表現出由端粒結合蛋白或端粒酶的變異或缺陷導致的端粒功能異常的人體細胞株；(d)ー種由化學試劑導致的端粒功能異常模型；(e)一種由癌基因活化和/或DNA損傷反應的活化而創建的模型；和(f)一種表現出端粒功能異常的小鼠、大鼠或粟酒裂殖酵母(S. Pombe)細胞株。
4.如權利要求1-3的任一項所述的方法，包含如下步驟(i)在細胞周期由於端粒功能異常或DNA損傷而被阻滯的條件下，將ー種化合物或組合物與酵母細胞一同孵育；(ii)用細胞凋亡實驗測量死亡細胞數量，或者，作為替代的，(iii)去除造成細胞周期阻滯的條件，並且測量存活細胞數；以及(iv)與對照實驗比較步驟ii的細胞死亡數或步驟iii的細胞存活數，所述對照實驗除了沒有化合物或組合物外，其他條件均與步驟i相同，其中，如果相對於對照實驗，步驟ii得到減少的死亡細胞數，或者步驟iii得到増加的存活細胞數，則表明所孵育的化合物或組合物是ー個候選的抗衰老劑。
5.如權利要求4所述的方法，進ー步包含如下步驟(v)將鑑別出的化合物或組合物與哺乳動物分裂靜止細胞一同孵育一段時間；(vi)測量存活的分裂靜止細胞數量；和(Vii)與對照實驗比較存活的分裂靜止細胞數數量(步驟Vi)其中，相對於對照實驗，如果存活的分裂靜止細胞數量増加，則確認孵育的化合物或組合物是ー個候選的抗衰老劑。
6.如權利要求4或5所述的方法，進ー步包含如下步驟(viii)將鑑別出的化合物或組合物與正常生長的人體細胞株一同孵育一段時間；(ix)通過測量線粒體量、線粒體DNA含量、或線粒體轉錄因子的表達來測定人體細胞的線粒體生物合成，；和(x)與對照實驗比較步驟ix得到的結果，其中，相對於對照實驗，如果步驟ix得到增強的線粒體生物合成，則進ー步確認鑑別出的化合物或組合物為候選的抗衰老劑。
7.如權利要求3-6的任一項所述的方法，其中，所述包含功能異常的端粒的變異酵母選自 cdcl3_l、cdcl3_2、stnl-1、cdcl7_l,、cdcl7_2、hdfl、hdf2> estl、est2 以及 est3。
8.如權利要求3-6的任一項所述的方法，其中，所述表現出端粒酶活性不足的原代人體細胞株包含成纖維細胞、內皮細胞或上皮細胞中的至少一種。
9.如權利要求3-6的任一項所述的方法，其中，所述表現出端粒酶活性不足的人體細胞株包含在TRF2、POTI、TERT、TERC或WRN基因上的變異。
10.如權利要求3-6的任一項所述的方法，其中，所述的化學試劑是博來黴素、阿黴素、 或G-四鏈體(G-quadruplex)配體。
11.如權利要求1-10的任一項所述的方法，其中，所述的老年性疾病或症狀是非正常細胞增生性疾病、退行性疾病或功能減弱症。
12.如權利要求1-11的任一項所述的方法，其中，所述的一個或多個化合物或組合物屬於一個化合物庫和/或組合物庫。
13.一種鑑別或檢測用於預防或治療老年性疾病或症狀的試劑的方法，所述老年性疾病或症狀與分裂靜止狀態退化、分裂靜止細胞和不分裂細胞的細胞周期阻滯狀態退化所造成的細胞死亡、加速的線粒體退化、增強的氧化壓力或端粒功能異常有關，所述方法包括篩選一個或多個化合物或組合物，並用T0R/AMPK/線粒體/分裂靜止狀態途徑中的至少一個組成成員來測定它們的活性，其中，所述試劑(a)提升複製潛能(b)維持不分裂細胞的分裂靜止狀態或細胞周期阻滯狀態，或(c)防止線粒體退化或分裂靜止狀態退化引起的的細胞死亡。
14.如權利要求13所述的方法，其中，所述的T0R/AMPK/線粒體/分裂靜止狀態途徑的組成成員包括胰島素/IGF、胰島素/IGF受體、PI3K、PDKU PTEN、TSCU TSC2、AKT、 詘613、以 丨01'、601、361(、1'( 、葡萄糖攝取、胺基酸攝取、41^1(、31狀0、1 )25、0 1、？6(-1 a、 PGC-I 3，NRF-I、NRF-2、TFAM、TFB1M、TFB2M、ERRs (ERR a、ERR 3、ERR Y )、PPARs (PPAR a、 PPAR 8、PPAR y )、SIRTl、RIP140、PRC、POLRMT、ATM、CaMKK ^、p53、p21、pl9撕、wafl、P6INK4\ pRB、E2F、PTEN、以及 p27KIP1。
15.如權利要求13或14的方法，其中，所述的老年性疾病或症狀是非正常細胞增生性疾病、退行性疾病或功能減弱症。
16.如權利要求13-15的任一項所述的方法，其中，所述的一個或多個化合物或組合物屬於一個化合物庫和/或組合物庫。
17.一種鑑別或檢測用於預防或治療老年性疾病或症狀的試劑的方法，所述老年性疾病或症狀與分裂靜止細胞和不分裂細胞的細胞周期阻滯狀態退化所造成的細胞死亡、加速的線粒體退化、增強的氧化壓力或端粒功能異常有關，所述方法包括篩選一個或多個化合物或組合物，並用營養信號途徑中的至少一個組成成員來測定它們的活性，其中，所述試劑 (a)提升複製潛能(b)維持不分裂細胞的分裂靜止狀態或細胞周期阻滯狀態，或(c)防止線粒體退化或分裂靜止狀態退化引起的細胞死亡。
18.如權利要求17所述的方法，其中，所述的營養信號途徑的組成成員包括胰島素/ IGF、胰島素 /IGF 受體、PI3K、PDK1、PTEN、TSCl、TSC2、AKT、Rheb, raptor, G S6K、TOR、 AMPK, STRAD、M025、LKB1、葡萄糖攝取、胺基酸攝取，以及CaMKK^。
19.如權利要求17或18的方法，其中，所述的老年性疾病或症狀是非正常細胞增生性疾病、退行性疾病或功能減弱症。
20.如權利要求17-19的方法，其中，所述的一個或多個化合物或組合物屬於一個化合物庫和/或組合物庫。
21.一種鑑別或檢測用於預防或治療老年性疾病或症狀的試劑的方法，所述老年性疾病或症狀與分裂靜止細胞和不分裂細胞的細胞周期阻滯狀態退化所造成的細胞死亡、分裂靜止狀態退化、加速的線粒體退化、增強的氧化壓力或端粒功能異常有關，所述方法包括篩選ー個或多個化合物或組合物，並用線粒體生物合成途徑中的至少ー個組成成員來測定它們的活性，其中，所述試劑(a)提升複製潛能(b)維持不分裂細胞的分裂靜止狀態或細胞周期阻滯狀態，或(C)防止線粒體退化或分裂靜止狀態退化引起的細胞死亡。
22.如權利要求21所述的方法，其中，所述的線粒體生物合成途徑的組成成員包括 AMPK、STRAD、M025、LKB1、PGC-1a、PGC-1 P，NRF_l、NRF_2、TFAM、TFBlM、TFB2M、ERRs(ERR a、 ERR 3、ERRy)、PPARs (PPAR a、PPAR 8、PPAR y ), SIRTl、RIP140、PRC、POLRMT, ATM、以及 CaMKK 3。
23.如權利要求21或22的方法，其中所述的老年性疾病或症狀是非正常細胞增生性疾病、退行性疾病或功能減弱症。
24.如權利要求21-23的任一項所述的方法，其中所述的ー個或多個化合物或組合物可以屬於ー個化合物庫和/或組合物庫。
25.一種鑑別或測定預防或治療老年性疾病或症狀的試劑的方法，其中老年性疾病或症狀與分裂靜止狀態退化、年齡相關的細胞消亡或者腫瘤發生和癌症的惡性進展有關，所述方法含有篩選ー個或多個化合物或組合物，並用AMPK途徑中的最少一個組成成員來測定它們的活性，其中，所述試劑(a)提升複製潛能(b)維持不分裂細胞的分裂靜止狀態或細胞周期阻滯狀態，或(c)防止線粒體退化或分裂靜止狀態退化引起的細胞死亡。
26.如權利要求25所述的方法，其中，所述的AMPK途徑的組成成員包括AMPK、ATM、 LKBl、STRAD、M025、以及 CaMKK^。
27.如權利要求25或26的方法，其中，所述的老年性疾病或症狀是非正常細胞增生性疾病、退行性疾病或功能減弱症。
28.如權利要求25-27的任一項所述的方法，其中，所述的ー個或多個化合物或組合物屬於ー個化合物庫和/或組合物庫。
29.一種鑑別或檢測用於預防或治療老年性疾病或症狀的試劑的方法，所述老年性疾病或症狀與分裂靜止狀態退化、分裂靜止細胞和不分裂細胞的細胞周期阻滯狀態退化所造成的細胞死亡、加速的線粒體退化、增強的氧化壓力或端粒功能異常有關，並用分裂靜止狀途徑中的至少ー個組成成員來測定它們的活性，其中，所述試劑維持不分裂細胞的分裂靜止狀態或細胞周期阻滯狀態，或者防止線粒體退化或分裂靜止狀態退化所造成的細胞死亡。
30.如權利要求29所述的方法，其中，所述的分裂靜止狀途徑的組成成員包括ATM、 p53、p21、pl9AKF、WAF1、pl6INK4a、pRB、E2F、PTEN、以及 p27KIP1。
31.如權利要求29或30的方法，其中，所述的老年性疾病或症狀是非正常細胞增生性疾病、退行性疾病或功能減弱症。
32.如權利要求29-31的任一項所述的方法，其中，所述的ー個或多個化合物或組合物屬於ー個化合物庫和/或組合物庫。
33.一種預防或治療老年性疾病或症狀的方法，包括給予需要的個體ー種組合物，該組合物包含權利要求1-32的任一項所述的方法鑑別出的試劑，或它的藥學上可接受的鹽、溶劑化物或藥物前體。
34.如權利要求33的方法，其中所述的老年性疾病或症狀與分裂靜止細胞或不分裂細胞的細胞周期阻滯狀態退化、線粒體功能異常或端粒功能異常相關。
35.如權利要求33或34的方法，其中，所述的試劑選自有機分子、無機分子、天然產物、 多肽、蛋白、DNA、RNA以及代謝中間體。
36.如權利要求33-35的任一項所述的方法，其中，所述的試劑選自AICAR、低劑量雷帕黴素或它的類似物、EGCG、葡萄籽提取物、覆盆子提取物、亞硒酸鈉、染料木素、二烯丙基三硫、苯基異硫氰酸酯、苄基異硫氰酸酯、異硫氰酸苯乙酯、白藜蘆醇、番茄紅素以及異硫氰酸烯丙酯。
37.如權利要求33-36的任一項所述的方法，其中，所述的組合物進一步包含第二種試劑，該第二試劑選自抗氧化劑、抗高血壓試劑、降血脂試劑、抗中風試劑、防癌劑或另一種抗衰老劑。
38.如權利要求37的方法，其中，所述的抗氧化劑選自維他命C、維他命E、￠-胡蘿蔔素、其他類胡蘿蔔素、亞硒酸鈉，硫辛酸、番茄紅素、葉黃素、玉米黃質、輔酶Q10、穀胱甘肽、 N-乙醯半胱氨酸、褪黑色素、染料木素、雌二醇、茶提取物以及葡萄籽提取物。
39.如權利要求33-38的任一項所述的方法，其中，所述的組合物進一步包含藥學上可接受的載體。
40.如權利要求33-38的任一項所述的方法，其中，所述的組合物配方通過口服、腸道外、局部、皮膚滲透、栓劑或氣霧劑方式給藥。
41.如權利要求33-40的任一項所述的方法，其中，所述的老年性疾病或症狀是非正常細胞增生性疾病、退行性疾病或功能減弱症。
42.如權利要求33-40的任一項所述的方法，其中，所述的老年性疾病或症狀選自腫瘤發生和癌症的惡行進展、神經退化性疾病、心肌梗死、心臟衰竭、血管硬化、骨性關節炎、 骨質疏鬆、肌肉萎縮、造血功能喪失、白內障、多發性硬化、乾燥綜合症、類風溼關節炎、免疫功能退化、糖尿病、特發性肺纖維化、老年性黃斑變異、小腦梗死、中風、老年痴呆症、帕金森病、亨廷頓氏症、睪丸激素、雌性激素雌性激素、生長激素、IGF-I或能量生產的退化引起的功能紊亂。
43.如權利要求33-42的任一項所述的方法，其中，所述的個體是哺乳動物。
44.如權利要求33-42的任一項所述的方法，其中，所述的個體是人。
45.一種預防或治療老年性疾病或症狀的方法，包括給予需要的個體一種組合物，該組合物包含一種AMPK激活劑，它的藥學上可接受的鹽、溶劑化物或藥物前體，該AMPK激活劑可以直接或間接的活化AMPK,增加線粒體生物合成,維持所述個體的分裂靜止細胞或不分裂細胞的細胞周期阻滯狀態。
46.如權利要求45的方法，其中，所述的老年性疾病或症狀與線粒體功能損失、端粒功能異常、分裂靜止狀態退化以及年齡相關的細胞死亡、或不分裂細胞的線粒體退化或細胞周期阻滯退化有關。
47.如權利要求45或46的方法，其中，所述的AMPK激活劑選自AICAR、二甲雙胍、2-脫氧葡萄糖、3-0-甲基葡萄糖、LY29400、黃連素、苯乙雙胍、A769662、噻唑烷二酮、地塞米松、他汀類藥物、瘦素、脂聯素、西洛他唑、EGCG、亞硒酸鈉、染料木素，異硫氰酸烯丙酷、異硫氰酸苯こ酷。
48.如權利要求45-47的任一項所述的方法，其中，所述的組合物進ー步包含第二種試劑，選自抗氧化劑、抗高血壓試劑、降血脂試劑、抗中風試劑、防癌劑或另一種抗衰老劑。
49.如權利要求45-48的任一項所述的方法，其中，所述的組合物進ー步包含藥學上可接受的載體。
50.如權利要求45-49的任一項所述的方法，其中，所述的組合物通過ロ服、腸道外、局部、皮膚滲透、栓劑或氣霧劑方式給藥。
51.如權利要求45-50的任一項所述的方法，其中，所述的老年性疾病或症狀是非正常細胞增生性疾病、退行性疾病或功能減弱症。
52.如權利要求45-50的任一項所述的方法，其中，所述的老年性疾病或症狀選自腫瘤發生和癌症的惡行進展、神經退化性疾病、心肌梗塞(心臟病發作)、心カ衰竭、動脈硬化、高血壓、骨關節炎、骨質疏鬆、肌肉萎縮、骨髓損失、白內障、多發性硬化、舍格林綜合症 (Sjogren)、類風溼性關節炎、免疫功能退化、糖尿病、特發性肺纖維化、老年性黃斑變性、小腦梗死、中風、老年痴呆症、帕金森病、亨廷頓氏症，以及由睪酮、雌性激素、生長激素、IGF-I 或能量生產衰減而導致的症狀。
53.如權利要求45-52的任一項所述的方法，其中，所述的個體是哺乳動物。
54.如權利要求45-52的任一項所述的方法，其中，所述的個體是人。
55.一種預防或治療老年性疾病或症狀的方法，包括給予需要的個體ー種組合物，該組合物包含TOR抑制劑，它的藥學上可接受的鹽、溶劑化物或藥物前體，該TOR抑制劑(a)提升複製潛能(b)維持不分裂細胞的分裂靜止狀或細胞周期阻滯狀態，或(c)防止線粒體退化或分裂靜止狀退化引起的細胞死亡。
56.如權利要求55的方法，其中，所述的老年性疾病或症狀與線粒體功能損失、端粒功能異常、分裂靜止狀態退化以及年齡相關的細胞死亡、或不分裂細胞的線粒體退化或細胞周期阻滯退化有夫。
57.如權利要求55或56的方法，其中，所述的TOR抑制劑是低劑量雷帕黴素或其類似物，選自 Deforolimus, AP-23675、AP-23841、佐他莫司、CCI-779、RAD-00U7-印i-雷帕黴素、7-硫代甲基-雷帕黴素、7-epi-三甲氧基-雷帕黴素、7-去甲氧基-雷帕黴素、2脫甲基-雷帕黴素以及42-0(2-羥基)こ基-雷帕黴素。
58.如權利要求57的方法，其中，所述的低劑量雷帕黴素是指低於臨床批准劑量的 10%,8%,6%,4%,2%,1%>0. 1%、0. 01%或 0. 001%。
59.如權利要求57或58的方法，其中，所述的低劑量雷帕黴素可以是純化合物、粗提物或未經提純的含雷帕黴素的微生物。
60.如權利要求59的方法，其中，所述的含雷帕黴素的微生物是吸水鏈黴菌 (Streptomyces hygroscopicus)。
61.如權利要求55-60的任一項所述的方法，其中，所述的組合物進ー步包含第二種試劑，選自抗氧化劑、抗高血壓試劑、降血脂試劑、抗中風試劑、防癌劑或另一種抗衰老劑。
62.如權利要求61的方法，其中，所述的抗氧化劑選自維他命C、維他命E、￠-胡蘿蔔素、其他類胡蘿蔔素、亞硒酸鈉，硫辛酸、番茄紅素、葉黃素、玉米黃質、輔酶Q10、穀胱甘肽、N-乙醯半胱氨酸、褪黑色素、染料木素、雌二醇、茶提取物以及葡萄籽提取物。
63.如權利要求55-62的任一項所述的方法，其中，所述的組合物進一步包含藥學上可接受的載體。
64.如權利要求55-63的任一項所述的方法，其中，所述的組合物通過口服、腸道外、局部、皮膚滲透、栓劑或氣霧劑方式給藥。
65.如權利要求55-64的任一項所述的方法，其中，所述的老年性疾病或症狀是非正常細胞增生性疾病、退行性疾病或功能減弱症。
66.如權利要求55-64的任一項所述的方法，其中所述的老年性疾病或症狀選自腫瘤發生和癌症的惡性進展、神經退化性疾病、心肌梗塞(心臟病發作)、心力衰竭、動脈硬化、高血壓、骨關節炎、骨質疏鬆、肌肉萎縮、骨髓損失、白內障、多發性硬化、舍格林綜合症 (Sjogren)、類風溼性關節炎、免疫功能退化、糖尿病、特發性肺纖維化、老年性黃斑變性、小腦梗死、中風、老年痴呆症、帕金森病、亨廷頓氏症，以及由睪酮、雌性激素、生長激素、IGF-I 或能量生產衰減而導致的症狀。
67.如權利要求57-64的任一項所述的方法，其中，所述的老年性疾病或症狀選自腫瘤發生和癌症的惡性進展、帕金森病、中風、小腦梗死或心肌梗死。
68.一種用於檢測生物樣本中抗衰老劑的方法，包括以下步驟(i)生物樣本用溶劑適當稀釋；(ii)在引起端粒異常或DNA損傷進而造成細胞周期阻滯的條件下，把稀釋的樣本與變異酵母細胞一同孵育；(iii)去掉引起細胞周期阻滯的孵育條件，測定存活酵母細胞數；並(iv)比較步驟iii得到的存活細胞數和對照試驗的細胞存活數，對照試驗除不含所述的生物樣本外，其它條件均與步驟ii相同，其中，相比於對照試驗，如果存活細胞數增加，表明所述生物樣本包含抗衰老劑。
69.一種用於判定生物樣本中抗衰老劑的生物活性濃度的方法，包括以下步驟(i)生物樣本用溶劑適當稀釋；(ii)在引起端粒異常或DNA損傷進而造成細胞周期阻滯的條件下，把稀釋的樣本與變異酵母細胞一同孵育；(iii)去掉引起細胞周期阻滯的孵育條件，並且測定存活酵母細胞數；(iv)比較步驟iii得到的存活細胞數和與對照試驗的存活細胞數，對照試驗除不含所述的生物樣本外，其它條件均與步驟ii相同，(v)通過將存活酵母細胞數目代入預先制定的抗衰老劑的濃度對存活酵母細胞數目的標準公式或曲線，來計算所述抗衰老劑的生物學濃度。
70.如權利要求69的方法，其中，所述的標準公式或曲線通過以下的步驟得到(vi)製備一系列含有不同濃度且濃度已知的經提純的抗衰老劑的標準溶液，該標準溶液採用孵育所述生物樣本時所用的溶劑配製；(vii)在引起端粒異常或DNA損傷進而造成細胞周期阻滯的條件下，將標準溶液與突變酵母細胞一起孵育；(viii)去掉引起細胞周期阻滯的條件並測定每份所培養的標準溶液中存活酵母細胞數目；並(ix)以步驟viii中獲得的存活細胞數對與其對應的抗衰老劑濃度作圖，從而獲得標準曲線和/或得到標準公式。
71.如權利要求69或70的方法，其中，所述的抗衰老劑是權利要求1-32的任一項所鑑別出的試劑。
72.如權利要求69-71的任一項所述的方法，其中，所述的抗衰老劑是指雷帕黴素或其類似物。
73.如權利要求69-72的任一項所述的方法，其中，所述的變異酵母選自dcl3-l、 cdcl3_2、stnl-1、cdcl7_l、cdcl7_2、hdfl、hdf2> estl、est2 以及 est3。
全文摘要
本發明發現了衰老過程的新機制，並建立了一種高通量篩選方法來篩選鑑別，檢測和提純的試劑，用於改善線粒體功能的使用，在不分裂細胞和分裂靜止細胞中維維持不分裂狀態，預防或治療與的線粒體功能加速喪失、染色體端粒功能異常和不分裂細胞死亡有關的老年性疾病。本發明也披露了用此方法篩選出來的一系列化合物或組合物構成。本發明進一步提供了低劑量雷帕黴素或它的衍生物作為熱量限制模仿物在防治老年性疾病上的用途。
文檔編號C12Q1/00GK102612564SQ201080026210
公開日2012年7月25日 申請日期2010年4月12日 優先權日2009年4月10日
發明者齊海燕 申請人:無錫鶴谷藥業有限公司