一種從黃芪中提取、分離和純化黃芪甲苷的方法
2023-06-24 06:37:11 3
專利名稱：一種從黃芪中提取、分離和純化黃芪甲苷的方法
技術領域：
本發明涉及從植物中提取、分離和純化功能性有效成分的一種方法，具體是從常
用中藥材黃芪中提取、分離和純化黃芪甲苷的方法。
背景技術：
黃芪素以"補氣諸藥之最"著稱，是一種名貴的中藥材，首載於我國古代第一部本 草著作《神農本草經》，為豆科多年生草本植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus (Fisch.) B皿ge var. mongholicus (B皿ge) Hsiao或膜英黃甚Astragalus membranaceus (Fisch.) Bimge的乾燥根。蒙古黃芪分布於東北和華北部分省區；膜莢黃芪分布於華北、西北、東北 及西南部分省區。黃芪在我國主要分布在溫帶和暖溫帶地區，為深根性植物。在北方地區， 普遍生長於東北的東部山區(長白山、小興安嶺、完達山脈和遼寧東部山區)及大興安嶺， 在部分平原地區亦可見到。此外河北、山西、山東、內蒙古、陝西、甘肅、寧夏、青海、新疆等省 區均有。朝鮮、蒙古、蘇聯也有分布。黃芪喜涼爽氣候，有較強的抗旱、耐寒能力，不耐熱，不 耐澇。氣溫過高，常抑制植株生長，土壤溼度過大，常引起根部腐爛。宜在土層深厚、肥沃、疏 松、排水良好的砂質土壤生長，在粘土上則根多，生長緩慢。多生於林緣、灌叢、林間或乾旱 向陽山坡草地、疏林下及草甸等處。雖然我國黃芪藥材資源豐富，但是其藥用部分是根，一 旦根部被刨取，整個植株不再存活，黃芪的野生資源在大量採挖的情況下日漸稀少。因此， 合理開發利用黃芪資源已經成為亟待解決的重大問題，符合時代發展的步伐。
黃芪是名貴中藥材，根據藥典記載有黃芪味甘，性微溫，具有增強機體非特異性、 改善心功能、擴張冠狀動脈、利尿消腫、益衛固表、託瘡生肌、抗菌、抗病毒、抗疲勞、抗衰老、 促進造血功能、保護肝臟等功效。常用於氣虛乏力、食少便溏、中氣下陷、久洩脫肛、便血崩 漏、表虛自汗、氣虛水腫、久潰不斂、慢性腎炎、蛋白尿、糖尿病等症。由於黃芪療效顯著，應 用廣泛，近年來黃芪年消耗量十分龐大，而且相關研究報導也很多，目前已經從中分離出皂 苷、異黃酮、多糖、蛋白質、維生素P、胺基酸、微量元素、酚性化合物等物質，這些活性成分 均與其藥效相關。其中，黃芪皂苷為黃芪的主要天然活性物質，並以黃芪甲苷為主，是目前
評價黃芪質量和黃芪製劑質量的重要指標成分。但黃芪甲苷在黃芪中的含量很低，約為 0. 04%，且提取分離十分困難(張宇，呂哲，李鑫昶等，黃芪總皂甙水解為黃芪甲苷的工藝 研究)。隨著研究的不斷深入，有關黃芪甲苷的研究和開發將成為倍受人們關注的新熱點。
中國專利申請號200510020977.0公開了一種黃芪甲苷純品的製備方法，是以中
藥黃芪為原料，包括提取、富集、除去雜質、鹼水解轉化、溶劑萃取和純化精製。但此方法步
驟較多，製備方法麻煩，黃芪甲苷純度不高。中國專利申請號200610012687. 6公開了一種
黃芪甲苷的製備方法，採用提取，乙醇脫色、鹼水解等步驟得到黃芪甲苷，簡化了中間步驟，
但是得率不高。中國專利申請號200710043678. 8公開了黃芪甲苷的製備方法，是以中藥黃
芪為原料，包括水提取、鹼處理、大孔吸附樹脂吸附、水洗、稀醇液洗、較高濃度醇液洗脫黃
芪甲苷、濃縮及結晶。但此步驟黃芪甲苷回收率低，所得黃芪甲苷純度不高。 綜上所述，傳統的製備黃芪甲苷的工藝不能達到高效利用黃芪資源和獲得高得
4率、高純度黃芪甲苷的目的。因此，有必要對黃芪中有效成分黃芪甲苷進行進一步提取、分 離和純化的工藝研究，尋找一種簡便、安全、經濟、高效的提取、分離和純化黃芪甲苷的方 法，為促進我國黃芪資源的深度開發和利用提供科學依據，以及為開發新藥提供有利條件。 本發明旨在建立一種通過生物誘導、水解轉化等高效提取技術與分離、純化技術相結合的 方法，實現簡單快速、高得率的提取、高純度分離純化黃芪甲苷的方法。
發明內容
針對黃芪甲苷在植物中的含量很低(約為0. 04% )、分離純化相當困難的問題，本
發明的目的是提供一種以中藥黃芪為原料，通過獨創性的勻漿萃取_混合酶誘導生物轉化
技術、負壓空化混旋提取技術、皂苷衍生物水解轉化技術、液液萃取技術、大孔吸附樹脂富
集技術、正相矽膠中壓柱層析技術以及低溫析晶和重結晶技術等一系列具有自主智慧財產權
的高效提取、分離和純化技術手段，從而簡單、快速獲得高得率、高純度黃芪甲苷的方法。為
了達到本發明的目的，所採用的技術方案如下中藥黃芪用蒸餾水浸泡，經過勻漿萃取體系
誘導和混合酶溶液生物誘導轉化，提高黃芪甲苷的含量。然後經過70 80%乙醇負壓空化
混旋提取和皂苷衍生物水解轉化，經過正丁醇液液萃取、大孔吸附樹脂富集和一次正相矽
膠中壓柱層析後得到黃芪甲苷的產品，純度大於90%，經過低溫析晶和重結晶得到黃芪甲
苷晶體，其得率大於0. 08%，純度大於95%。 具體方案如下 (1)勻漿破碎酶解將中藥黃芪和配製好的酶溶液按固液比1 : 10 20(g : mL) 混合，連續勻漿萃取1 3次，每次0. 5 2min。 (2)恆溫酶解將勻槳液放入恆溫搖床中，在25 4(TC酶解12 24h，轉速120 150rpm。 (3)負壓空化提取將酶解液抽濾，濾渣加入70 80%乙醇溶液，壓力為0. 04
0. 06Mpa，固液比為1 : 10 20 (g : mL)，室溫提取1 3次，每次30 90min。 (4)皂苷衍生物水解轉化將抽濾後的酶解液和提取液合併，減壓濃縮至幹後用
蒸餾水溶解，用氨水調節pH值為8 9，水解轉化12 24h。在鹼性條件下，可以使其它類
型的黃芪皂苷發生脫乙醯化反應轉化為黃芪甲苷，從而大大提高黃芪甲苷的含量。 (5)溶劑抽提除雜將得到的水解液，以體積比1 : 1 1 : 3的正丁醇為萃取溶
劑，萃取3 5次，減壓濃縮至幹得到固形物。 (6)大孔吸附樹脂富集精製合併正丁醇萃取液，濃縮至幹，得到精製的富含皂苷 類活性成分的黃芪提取物。大孔吸附樹脂採用溼法裝柱，保留液面，將液液萃取所得到的固 形物用蒸餾水溶解後，通過大孔吸附樹脂柱進行吸附，上樣量為0. 5 1BV，流速為0. 5 lBV/h。吸附後用10 40X乙醇3 5BV洗雜質，然後用50 60%乙醇10 15BV解吸。 收集解吸液，濃縮至幹，所得固形物為粗目標產物。 (7)正相矽膠中壓柱層析技術所用樣品為樹脂富集後所得粗目標產物，所用 矽膠為300 400目。預先稱取質量為樣品量的5 IO倍的矽膠，採用溼法裝柱，所用 溶劑包括三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇。將樣品用少量有機溶劑溶解，加入與浸膏質量比為 1 : 1.2(w/w)的層析矽膠拌勻，甲醇溶解後在水浴鍋上炒樣至幹，裝入預先裝好的矽膠柱 中。先後以10 20BV乙酸乙酯(三氯甲烷)、乙酸乙酯(三氯甲烷)甲醇、甲醇連續中壓洗脫，收集洗脫液，每份1/40 1/20BV。用矽膠薄層l，用10%硫酸染色後烤板。
(8)低溫析晶和重結晶得到黃芪甲苷溶液，低溫析晶得到產品，重結晶後得到純 度大於95%的黃芪甲苷。 上述的黃芪中黃芪甲苷的提取純化方法所用的大孔吸附樹脂分別為DlOl、 AB-8、 AL-1、 AL-2、 ADS-5、 ADS_8、 ADS_17、 ADS_31、 D3520、 HPDIOO、 HPD500、 HPD826、 SA_1、 SA-2和 SA-3型等。 上述的重結晶所用的溶劑為乙酸乙酉旨、二氯甲烷、三氯甲烷和甲醇，重結晶所用溶
劑比例為乙酸乙酯(二氯甲烷、三氯甲烷)甲醇=20 : i i : 1，低溫析晶溫度為-10
25°C。 傳統的提取方法如煎煮法、浸漬法、滲漉法、回流提取、超聲提取和索式提取過程
都是在完整植物細胞的情況下，通過浸潤與滲透、使溶劑進入組織細胞、溶解細胞內物質並 使其擴散至溶劑主體，這使溶劑提取細胞內生物活性成分成為可能。但由於細胞壁的屏障 作用，決定了中藥材有效成分的提取效率有一定限度，所以傳統提取方法存在提取溫度過 高，提取率低，成本高，不安全等問題。 酶誘導是在提取的基礎上，利用混合酶(如纖維素酶、果膠酶、l3-葡萄糖苷酶等)
將細胞壁的成分水解或降解，破壞細胞壁結構，使有效成分充分暴露出來，溶解、混懸或膠 溶於提取溶劑中，加速有效成分的釋放，從而提高提取效率。 所謂空化(cavitation)，一般是指液體內部局部壓力降低時，液體內部或液固交 界面上蒸汽或氣體的空穴(空泡)的形成、發展和潰滅的過程。當潰滅發生在固體表面附 近時，由於空泡瞬間(微秒級)潰滅產生極高的瞬時壓強，極高壓強的反覆作用，從而破壞 固體表面。因此，負壓空化提取技術是利用負壓空化氣泡產生強烈的空化效應和機械振動， 造成樣品顆粒細胞壁快速破裂，加速了胞內物質向介質釋放、擴散和溶解，從而促進提取。
本發明的優點 1.本發明對黃芪資源進行高效合理的利用，產品的附加值高。 2.本發明採用勻漿萃取_混合酶誘導生物轉化技術、負壓空化混旋提取技術、皂 苷衍生物水解轉化技術、液液萃取技術、大孔吸附樹脂富集技術、正相矽膠中壓柱層析技術 以及低溫析晶和重結晶技術等一系列具有自主智慧財產權的高效提取、分離和純化技術手 段，所得產品得率高、純度高。 3.與傳統提取方法相比，該方法簡單易行，操作條件溫和，提取溫度低，提取率高， 周期短，耗能低，降低了生產成本，可實現黃芪甲苷大規模的產業化生產。
圖l為黃芪甲苷的結構
圖2為黃芪甲苷的二級質譜圖
圖3為黃芪甲苷的LC-MS/MS色譜圖
(A)黃芪甲苷標準品LC-MS/MS色譜圖；
(B)黃芪甲苷樣品LC-MS/MS色譜圖
6具體實施方案
實施例1 精密稱取中藥黃芪1000g，取0.2X固形物重量的混合酶(纖維素酶、果膠酶、 P-葡萄糖苷酶)溶解於10倍體積溫水中，連續勻漿萃取3次，每次lmin。將勻漿液放入 3(TC恆溫搖床中恆溫酶解12h，酶誘導液抽濾後，濾渣加入70%乙醇負壓空化提取，壓力為 0.05Mpa，固液比為l : 10(g : mL)，室溫提取3次，每次45min，將抽濾後的酶解液和提取液 合併，減壓濃縮至幹後用水溶解，用氨水調節PH值為8，水解轉化12h，所得的水解液以等體 積的正丁醇為溶劑，萃取3次，減壓濃縮至幹得到固形物。固形物用水溶解後，通過AB-8大 孔吸附樹脂柱進行吸附，上樣量為0. 5BV，流速為lBV/h。吸附後用10 %和30%乙醇各3BV 洗雜質，然後用50%乙醇IOBV解吸。收集解吸液，濃縮至幹後用少量甲醇溶解，加入與浸膏 質量比為l : 1.2(w/w)的目數為300 400的層析矽膠炒樣。預先稱取質量為樣品量的 5 10倍的矽膠，用乙酸乙酯溼法裝柱，將拌好樣品的矽膠裝入中壓柱內，然後以TLC監測 收集洗脫液，濃縮得到黃芪甲苷，低溫析晶得到產品，重結晶後得到化合物，經MS確定為黃 芪甲苷，質量為0. 863mg，得率為0. 0863% ，純度為95% 。
實施例2 精密稱取中藥黃芪1000g，取0.5X固形物重量的混合酶(纖維素酶、果膠酶、 P-葡萄糖苷酶)溶解於15倍體積溫水中，連續勻漿萃取3次，每次2min。將勻漿液放入 3(TC恆溫搖床中恆溫酶解24h，酶誘導液抽濾後，濾渣加入80%乙醇負壓空化提取，壓力為 0.06Mpa，固液比為l : 15(g : mL)，室溫提取3次，每次60min，將抽濾後的酶解液和提取液 合併，減壓濃縮至幹後用水溶解，用氨水調節PH值為9，水解轉化24h，所得的水解液以等體 積的正丁醇為溶劑，萃取4次，減壓濃縮至幹得到固形物。固形物用水溶解後，通過AL-2大 孔吸附樹脂柱進行吸附，上樣量為1BV，流速為0. 5BV/h。吸附後用10 %和30%乙醇各5BV 洗雜質，然後用50%乙醇15BV解吸。收集解吸液，濃縮至幹後用少量甲醇溶解，加入與浸膏 質量比為l : 1.2(w/w)的目數為300 400的層析矽膠炒樣。預先稱取質量為樣品量的 5 10倍的矽膠，用乙酸乙酯溼法裝柱，將拌好樣品的矽膠裝入中壓柱內，然後以TLC監測 收集洗脫液，濃縮得到黃芪甲苷，低溫析晶得到產品，重結晶後得到化合物，經MS確定為黃 芪甲苷，質量為0. 935mg，得率為0. 0935% ，純度為95% 。
權利要求
一種從黃芪中提取、分離和純化黃芪甲苷的方法，其主要特徵在於中藥黃芪勻漿萃取後經混合酶生物轉化以增加目標化合物黃芪甲苷的含量，固形物使用70～80％乙醇負壓空化提取1～3次，酶解液和提取液合併減壓濃縮至幹後，加入蒸餾水溶解，用氨水調節pH值為8～9，水解轉化12～24h，所得水解液經正丁醇液液萃取後，採用大孔吸附樹脂富集和一次正相矽膠中壓柱層析得到黃芪甲苷的產品，經過低溫析晶和重結晶得到純度大於95％的純品。
2. 按照權利要求1所述的勻漿萃取_混合酶誘導生物轉化技術，其特徵在於勻漿萃 取所用的溶劑為配製好的酶溶液，按固液比1 : 10 20(g : mL)混合，連續萃取1 3 次，每次0. 5 2min。將勻漿液放入恆溫搖床中，在25 40。C酶解12 24h，轉速120 150rpm。勻漿過程產生的強大剪切力，兼具打破細胞壁、使植物組織細胞與酶充分接觸以及 瞬時剌激誘發內源性酶活性的作用，使目標化合物從細胞內向溶劑中充分釋放，增加目標 成分的含量。經過勻漿破碎酶解的勻漿液，在恆溫條件下繼續進行生物轉化，利用酶反應的 高效性、專一性等特性，將細胞壁的主要成分纖維素和果膠水解或降解，使有效成分黃芪甲 苷充分的暴露出來，溶解、混懸或膠溶於提取液中，從而使細胞內有效成分含量顯著提高， 所用的混合酶為纖維素酶、果膠酶、P-葡萄糖苷酶、蛋白酶、漆酶、澱粉酶、木聚糖酶等。在 勻漿機械脅迫萃取和混合酶的生物轉化的雙重作用下可提高黃芪甲苷的含量。
3. 按照權利要求l所述的負壓空化混旋提取技術，其特徵在於固形物加入70 80% 乙醇溶液，壓力為O. 04 0. 06Mpa，固液比為1 : 10 20(g : mL)，室溫提取1 3次，每 次30 90min。負壓空化混旋提取方法是以負壓為動力，利用氣泡產生的空化效應、湍流效 應而產生的高速傳質液固提取工藝。
4. 按照權利要求1所述的皂苷衍生物水解轉化技術，其特徵在於將抽濾後的酶解液 和提取液合併，減壓濃縮至幹後用水溶解，用氨水調節pH值為8 9，水解轉化12 24h。 在鹼性條件下，可以使其它類型的黃芪皂苷發生脫乙醯化反應轉化為黃芪甲苷，從而大大 提高黃芪甲苷的含量。
5. 按照權利要求1所述的正丁醇液液萃取技術，其特徵在於將得到的水解液，以體積 比l : 1 1 : 3的正丁醇為萃取溶劑，萃取3 5次，減壓濃縮至幹得到固形物。
6. 按照權利要求1所述的大孔吸附樹脂富集技術，其特徵在於所用樹脂包括DIOI、 AB-8 、 AL-1 、 AL-2 、 ADS-5 、 ADS-8 、 ADS-17 、 ADS-31 、 D3520 、 HPD100 、 HPD500和HPD826等廣譜 性大孔吸附樹脂和SA-1、 SA-2和SA-3皂苷類大孔吸附樹脂。該方法中大孔吸附樹脂採用 溼法裝柱，保留液面，將液液萃取所得到的固形物用蒸餾水溶解後，通過大孔吸附樹脂柱進 行吸附，上樣量為0. 5 1BV，流速為0. 5 lBV/h。吸附後用10 40X乙醇3 5BV洗雜 質，然後用50 60%乙醇10 15BV解吸。收集解吸液，濃縮至幹，所得固形物為粗目標產 物。
7. 按照權利要求1所述的正相矽膠中壓柱層析技術，其特徵在於所用樣品為樹脂富 集後所得粗目標產物，所用矽膠為300 400目。預先稱取質量為樣品量的5 10倍的 矽膠，採用溼法裝柱，所用溶劑包括三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇。將樣品用少量有機溶劑溶 解，加入與浸膏質量比為l : 1.2(w/w)的層析矽膠拌勻，甲醇溶解後在水浴鍋上炒樣至幹， 裝入預先裝好的矽膠柱中。先後以10 20BV乙酸乙酯(三氯甲烷)、乙酸乙酯(三氯甲 烷)甲醇、甲醇連續中壓洗脫，收集洗脫液，每份1/40 1/20BV。用矽膠薄層層析檢測洗脫液成分，合併相同部分，展開劑為乙酸乙酯(三氯甲烷)甲醇=20 : i i : i，用 10%硫酸染色後烤板。正相矽膠中壓柱流動相包括乙酸乙酯(三氯甲烷)甲醇的不同比 例梯度。
8.按照權利要求i所述的低溫析晶和重結晶技術，其特徵在於重結晶所用的溶劑為 乙酸乙酉旨、二氯甲烷、三氯甲烷和甲醇，重結晶所用溶劑比例為乙酸乙酯(二氯甲烷、三氯 甲烷)甲醇=20 : i i : i，低溫析晶溫度為-io 25°c。
全文摘要
本發明涉及一種從常用中藥黃芪中提取、分離和純化功能性有效成分黃芪甲苷的方法，目的是提供一種簡便、安全、經濟、有效地從黃芪中提取、分離和純化高純度黃芪甲苷的方法，所採取的技術方案是以中藥黃芪為原料，採用獨創性的勻漿萃取-混合酶誘導生物轉化技術、負壓空化混旋提取技術、皂苷衍生物水解轉化技術、液液萃取技術、大孔吸附樹脂富集技術、正相矽膠中壓柱層析技術以及低溫析晶和重結晶技術等一系列高效提取、分離和純化技術手段，得到高得率、高純度的黃芪甲苷，其得率可達0.08％以上，純度可達95％以上。本發明所用原料為我國常用中藥黃芪，資源豐富，黃芪甲苷的生產工藝簡單易行，目標化合物得率高、純度高。適合工業化生產和應用，產品附加值高，具有良好的市場應用前景。
文檔編號C07J53/00GK101775056SQ20101010193
公開日2010年7月14日 申請日期2010年1月28日 優先權日2010年1月28日
發明者付玉傑, 劉威, 李慶勇, 祖元剛, 羅猛, 閆明明, 陳彩雲 申請人:東北林業大學;付玉傑