生產纖維寡糖的方法

2023-06-09 15:13:01

專利名稱：生產纖維寡糖的方法
技術領域：
本發明涉及一種通過酶分解纖維素類物質獲得纖維寡糖的方法。本發明特別涉及將平均聚合度、平均粒徑、膠態纖維素成分含量和可溶於二乙醚的物質的含量均被控制在一定範圍內的水不溶性天然纖維素類物質用作基質，並使用β-葡糖苷酶活性與結晶性纖維素分解活性的活性比(β-葡糖苷酶活性/結晶性纖維素分解活性)被控制在一定範圍的纖維素酶進行酶分解，由此在短時間內提高纖維素的分解率，從而高收率地選擇性地生產纖維寡糖的方法。
背景技術：
纖維寡糖是纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖、纖維五糖和纖維六糖的通稱，是1至6個吡喃型葡萄糖單元通過β-1，4鍵連接在一起的一種寡糖。
近年來，對纖維寡糖的生理學功能與其它寡糖一樣正在進行闡明。因此，纖維寡糖有望成為保健食品的新型原料(非專利文獻1)。
纖維寡糖通過使用酶水解其聚合物、纖維素而獲得。但是，天然存在的纖維素極難溶於水並且高度結晶，因此難以通過纖維素酶進行酶分解。所以這存在問題。
在纖維素的酶分解反應中，作為分解產物獲得的纖維寡糖會被纖維素酶中的β-葡糖苷酶成分進一步分解成葡萄糖單體，從而導致纖維寡糖收率降低。因此，這存在另一個問題(非專利文獻2)。
鑑於上述問題，為提高酶分解纖維素時纖維寡糖的收率，到目前為止已經進行了很多嘗試。
使用特定纖維素生產纖維寡糖的方法包括專利文獻1描述了一種生產纖維寡糖的方法，其中使用含有大量非結晶性纖維素的纖維素原料，在木質素的存在下使用纖維素酶進行水解反應，同時，隨時從反應溶液中至少收集由水解反應生成的纖維寡糖中的纖維二糖。
專利文獻2描述了一種生產纖維寡糖的方法，在該方法中使用纖維素酶部分水解溼紙漿，以至少收集生成的纖維寡糖中的纖維二糖，其中所述溼紙漿是通過將含有天然木質纖維素的原料煮過之後不進行乾燥而獲得的。在這些生產方法中，纖維素酶中所包含的纖維寡糖分解酶β-葡糖苷酶被吸附在木質素中，並抑制了β-葡糖苷酶的作用，從而抑制了纖維寡糖分解成葡萄糖，從而提高了纖維寡糖的反應選擇性。然而，在這些生產方法中，所得糖化液體中包含大量木質素，結果降低了纖維寡糖的收率。此外，由於為獲得高純度的纖維寡糖需要將木質素從糖化液體中除去的處理，因此複雜的提純步驟一直都是個問題。
專利文獻3描述了一種通過將含有1質量％～20質量％的木質素的木質纖維素與纖維素酶和諸如白腐菌等木質素分解菌反應的生產纖維二糖(一種纖維寡糖)的方法。該方法可以提高纖維素酶對基質的作用，而無需用於除去纖維素中的木質素的處理。然而，其分解產物不僅包含纖維二糖，還包含木質素分解產物，因此會像上述方法一樣，導致纖維寡糖收率降低。此外，由於為獲得高純度的纖維二糖需要除去木質素分解產物的步驟，因此複雜的提純步驟一直都是個問題。
專利文獻4描述了一種生產纖維寡糖的方法，在該方法中，在將纖維素酶加入通過將纖維素溶解在諸如氧化胺、氯化鋰/N，N-二甲基乙醯胺、銅銨和粘膠纖維等溶劑中而獲得的纖維素溶液中後，從所得溶液中獲得含有纖維素酶的再生纖維素，然後在緩衝劑的存在下通過再生纖維素中所包含的纖維素酶進行酶反應，以生產纖維寡糖。該方法不需要諸如對纖維素酶進行提純等專門的預處理，並且能夠提高纖維寡糖的收率。然而，由於該方法需要溶解和再生纖維素的步驟，因此複雜的步驟一直都是個問題。在纖維素溶解中所用的化學物質，如氧化胺、氯化鋰/N，N-二甲基乙醯胺、銅銨和粘膠纖維，對於纖維素酶均具有較大的作用。結果，在纖維素的分解反應受到這些化學物質的影響方面存在問題。
專利文獻5描述了一種生產纖維二糖的方法，該方法使用保水性為230％～280％、濾水度為550ml～640ml的漂白粥漿作為原料。此處所用粥漿是煮/漂白處理後未乾燥的紙漿。雖然使用粥漿作為原料確實可以提高纖維二糖的生產量，但是由於未乾燥的粥漿具有很高的保水性，所以在酶分解時其基質濃度受到限制。因此，較低的纖維寡糖生產率一直都是個問題。
專利文獻6描述了一種方法，在該方法中使用超臨界水或亞臨界水由含有纖維素的物質將纖維素成分溶液化後，向所得處理液中補充纖維素酶製劑，用纖維素酶製劑將纖維素和具有高聚合度的纖維寡糖(纖維素部分分解產物)水解，從而獲得葡萄糖和/或纖維寡糖。該方法能夠同時改善纖維寡糖，如纖維二糖和纖維三糖的生產量和收率。然而，該方法在關於纖維素預處理的安全性方面存在問題，例如在超臨界或亞臨界水處理所需的耐壓、耐酸設備的設備安全性和加壓和加熱的安全性方面存在問題。
專利文獻7描述了一種生產纖維寡糖的方法，該方法使用下述紙漿作為纖維素酶的反應基質，所述紙漿具有通過X射線衍射測定的10％～80％的纖維素I結晶度、200％～1000％的保水性，其中將所述紙漿進行了選自原纖維化處理、機械化學處理和化學處理中的任意一種或多種處理。該方法能夠提高纖維二糖的生產量和纖維素分解率。然而，由於使用具有高保水性的纖維漿作為纖維素，該方法存在在諸如預處理(例如原纖維化處理、機械化學處理和化學處理)和隨後的酶分解以及寡糖提純等每一生產步驟中，發生阻塞或基質濃度受到限制等纖維寡糖生產率較低的問題。該方法與本發明的方法具有本質上的區別在本發明的方法中，平均聚合度、平均粒徑、膠態成分含量等被控制在較高水平，並且在包括酶分解在內的每一步驟中的處理性質均得到了提高。
通過使用特定纖維素酶來酶分解纖維素，從而提高纖維寡糖收率的方法包括以下專利文獻8至11專利文獻8描述了一種在纖維素酶的作用下，在水性反應溶液中由纖維素類物質生產纖維寡糖的方法，所述纖維素酶由屬於纖維弧菌屬的微生物生產，在該方法中組合使用了超濾反應器，以便消除生成物阻害，從而生產並積累纖維寡糖。根據該方法，僅由纖維二糖和纖維三糖構成的纖維寡糖可以作為酶分解纖維素類物質的分解產物而獲得。然而，由於通過纖維弧菌屬微生物生產的酶不容易對結晶性纖維素起作用，因此需要非結晶性纖維素作為基質來縮短反應時間和提高收率。這樣，複雜的步驟一直成為問題。
專利文獻9描述了一種通過使用纖維素酶分解纖維素來生產纖維寡糖的方法，其中纖維素酶預先與pH被平衡為3.5～5.0的弱酸性陽離子交換樹脂接觸，從而選擇性地除去纖維素酶中的β-葡糖苷酶，然後使已除去β-葡糖苷酶的纖維素酶與纖維素接觸。按照該方法，通過酶分解纖維素減少葡萄糖，因此能夠獲得具有大於或等於60％的纖維寡糖的分解產物。然而，上述方法需要除去纖維素酶中的β-葡糖苷酶的步驟。這樣就存在生產纖維寡糖的步驟很複雜的問題。此外，因為該提純纖維素酶的步驟需要的陽離子交換樹脂的量要比未反應的纖維素酶的量大75倍～1000倍，所以被處理的纖維素酶的量受到限制，並且纖維寡糖的生產率不足。因此，存在纖維素酶提純成本和陽離子交換樹脂的分離/提純劑成本很高的問題。
專利文獻10描述了一種纖維素酶提純方法，其中在將纖維素酶與纖維素酯和/或纖維素醚酯一起溶解並溫育固定的一段時間後，改變pH並將不溶的固體部分從溶液中分離出去，從而選擇性地除去纖維素酶中的β-葡糖苷酶；專利文獻10還描述了一種纖維二糖的生產方法，其中將纖維素與已除去β-葡糖苷酶的纖維素酶一起加入水性介質中，以製造一種懸浮液，進而將該懸浮液溫育固定的一段時間，以在該懸浮液中生產纖維二糖，然後收集所述纖維二糖。
專利文獻11描述了一種纖維素酶提純方法，其中在將殼聚糖和纖維素酶溶解到pH被調節為能使殼聚糖溶解的pH的水性介質中並溫育固定的一段時間後，改變pH並將不溶的固體部分從溶液中分離出去，從而選擇性地除去纖維素酶中的β-葡糖苷酶；專利文獻11還描述了一種纖維二糖的生產方法，其中將纖維素與已除去β-葡糖苷酶的纖維素酶一起加入水性介質中，以製造一種懸浮液，進而將該懸浮液溫育固定的一段時間，以在該懸浮液中生產纖維二糖，然後收集所述纖維二糖。這些方法通過使用纖維素衍生物或殼聚糖對纖維素酶進行吸附/分離處理，並使纖維素與仍吸附在纖維素衍生物或殼聚糖中的纖維素酶接觸，提高了纖維二糖的收率。然而，這些方法需要提純纖維素酶的處理，因此生產步驟複雜。由於纖維素酶提純中使用的纖維素衍生物和殼聚糖很昂貴，因此存在需要很高成本的問題。此外，由於在酶分解纖維素中纖維素酶與纖維素衍生物和殼聚糖一起使用，因此還存在這樣的問題，即需要將它們從分解反應溶液中除去的步驟。
迄今為止，尚未有下述方法問世將平均聚合度、平均粒徑、膠態纖維素成分含量和可溶於二乙醚的物質的含量通過預處理被控制在一定範圍內的水不溶性天然纖維素類物質用作基質，並使用β-葡糖苷酶活性與結晶性纖維素分解活性的活性比(β-纖維素酶活性/結晶性纖維素分解活性)被控制在一定範圍的纖維素酶進行酶分解，因此在短時間內提高纖維素的分解率，從而高收率地選擇性地生產纖維寡糖。
Cellulose Communications，5，No 2，91-97(1998)[非專利文獻2]《Cellulase》Kodansha Scientific出版，97-104(1987)[專利文獻1]特開平5-317073號公報[專利文獻2]特開平7-184678號公報[專利文獻3]特開平8-89274號公報[專利文獻4]特開平8-308589號公報[專利文獻5]特開平9-107087號公報[專利文獻6]特開2001-95594號公報[專利文獻7]特開2005-68140號公報[專利文獻8]特開平01-256394號公報[專利文獻9]特開平05-115293號公報[專利文獻10]特開平05-227957號公報[專利文獻11]特開平05-227958號公報

發明內容
本發明的一個目標是通過在特定纖維素酶的存在下，酶分解用作原料的水不溶性天然纖維類物質來高收率地選擇性地生產纖維寡糖，從而在短時間內提高纖維素的分解率。
本發明人通過以下發現完成了本發明為解決上述問題，將平均聚合度、平均粒徑、膠態纖維素成分含量和可溶於二乙醚的物質的含量均被控制在一定範圍內的水不溶性天然纖維素類物質用作原料，並使用具有特定活性的纖維素酶對其進行酶分解，從而在短時間內提高纖維素的分解率，從而以高收率選擇性地得到纖維寡糖。
因此，本發明為如下(1)一種生產纖維寡糖的方法，所述方法包括在纖維素酶的存在下酶分解水不溶性天然纖維素類物質，所述水不溶性天然纖維素類物質具有小於或等於700的平均聚合度、小於或等於100μm的平均粒徑並且可溶於二乙醚的物質的含量小於1質量％；(2)一種生產纖維寡糖的方法，所述方法包括在纖維素酶的存在下酶分解水不溶性天然纖維素類物質，所述水不溶性天然纖維素類物質具有小於或等於700的平均聚合度，含有大於或等於10質量％的膠態纖維素成分，並且可溶於二乙醚的物質的含量小於1質量％；(3)如(1)或(2)所述的生產纖維寡糖的方法，其中所述水不溶性天然纖維素類物質的平均粒徑小於或等於100μm，並包含大於或等於10質量％的膠態纖維素成分；(4)如(1)至(3)任一項所述的生產纖維寡糖的方法，其中所述水不溶性天然纖維素類物質的平均聚合度小於或等於500，並且平均粒徑小於或等於50μm；(5)如(1)至(4)任一項所述的生產纖維寡糖的方法，其中所述水不溶性天然纖維素類物質的平均聚合度小於或等於400，並且平均粒徑小於或等於30μm；(6)如(1)至(5)任一項所述的生產纖維寡糖的方法，其中所述水不溶性天然纖維素類物質包含大於或等於15重量％的膠態纖維素成分；(7)如(1)至(6)任一項所述的生產纖維寡糖的方法，其中所述纖維素酶的活性比(溫度為55℃時的β-葡糖苷酶活性/結晶性纖維素分解活性)小於或等於0.7；(8)如(7)所述的生產纖維寡糖的方法，其中所述纖維素酶的活性比小於或等於0.5；(9)如(8)所述的生產纖維寡糖的方法，其中所述纖維素酶的活性比小於或等於0.35；(10)如(1)至(9)任一項所述的生產纖維寡糖的方法，其中所述可溶於二乙醚的物質為木質素；(11)如(1)至(10)任一項所述的生產纖維寡糖的方法，其中所述水不溶性天然纖維素類物質包含纖維素I型晶體；(12)如(1)至11任一項所述的纖維素酶的生產方法，其中，在通過培養生產纖維素酶的微生物而獲得的培養液中，β-葡糖苷酶活性與結晶性纖維素分解活性的活性比(溫度為40℃時的β-葡糖苷酶活性/結晶性纖維素分解活性)小於或等於0.5；(13)如(12)所述的纖維素酶的生產方法，其中β-葡糖苷酶活性與結晶性纖維素分解活性的活性比小於或等於0.35；(14)如(12)或(13)任一項所述的纖維素酶的生產方法，其中所述生產纖維素酶的微生物是作為生產β-葡糖苷酶少的菌株而選擇得到的菌株；(15)如(12)至(14)任一項所述的纖維素酶的生產方法，其中在培養所述生產纖維素酶的微生物時，將培養期間的pH控制為小於3.5；(16)如(12)至(15)任一項所述的纖維素酶的生產方法，其中所述生產纖維素酶的微生物是屬於木黴菌屬的菌株；(17)一種纖維寡糖，其特徵在於，所述纖維寡糖可溶於二乙醚的物質的含量小於或等於2000ppm；(18)通過如(1)至(11)任一項所述的方法獲得的纖維寡糖，其特徵在於可溶於二乙醚的物質的含量小於或等於2000ppm；
(19)如(18)所述的纖維寡糖，其中所述可溶於二乙醚的物質的含量小於或等於1000ppm；(20)一種食品、化妝品或藥用製劑，其特徵在於包含通過如(1)至(11)任一項所述的方法獲得的纖維寡糖；和(21)一種食品、化妝品或藥用製劑，其特徵在於包含如(17)或(18)所述的纖維寡糖。
根據本發明的通過酶分解水不溶性天然纖維素類物質來生產纖維寡糖的方法，可以在短時間內提高纖維的分解率，並且以高收率選擇性地生產纖維寡糖。


圖1是顯示在實施例13和14以及比較例6中的培養期間內pH隨時間變化的圖；圖2是顯示在實施例15中的培養期間內pH隨時間變化的圖；和圖3是顯示在實施例16和比較例7中結晶性纖維素分解產物的濃度變化的圖。在該圖中，反應溶液中分解產物累積量(％)由反應溶液中葡萄糖和纖維寡糖的總濃度表示，而纖維二糖純度由纖維寡糖與反應溶液中累積的分解產物的量之比(百分比)表示。通過使用突變株和減小培養溶液中的pH，可以提高相對於分解產物累積量的纖維二糖的純度。
具體實施例方式
下面將詳細描述本發明，特別是其優選方面。
本發明中使用的天然纖維素類物質是含有纖維素的天然存在的水不溶性纖維物質。天然纖維素類物質可以來自於植物或動物。可以生產天然纖維素類物質的動物和植物的實例包括樹木、竹子、麥稈、稻草、棉花、薴麻、甘蔗渣、洋麻、甜菜、海鞘和細菌纖維素。可以單獨使用這些天然纖維素類物質中的一種作為原料，也可以混合使用它們中的兩種或兩種以上作為原料。
本發明中使用的纖維素類物質需要是天然纖維素類物質。天然纖維素和再生纖維素可以通過其晶形而區分。本發明的天然纖維素類物質需要包含纖維素I晶體，並且其含量需大於或等於1％。纖維素I晶體含量更優選大於或等於50％。此處所用的纖維素I晶形可以通過使用廣角粉末X射線衍射儀(理學電機(株)製造，商品名Rotaflex RU300)獲得的X射線衍射圖案來辨別。其含量由纖維素I晶體的峰面積佔通過X射線衍射獲得的衍射圖像的總峰面積的百分比來表示。可以使用本領域中已知的方法，將要進行廣角粉末X射線衍射測量的乾燥狀態的纖維素類物質粉末化，然後用於測量，而溼潤狀態的纖維素類物質，可以使用本領域中已知的方法將其乾燥，然後粉末化，並用於測量。優選較高的纖維素I晶體含量，因為這樣接近於天然纖維素的纖維素類物質會用在酶分解中，從而使人工化學處理步驟，如纖維素再生處理得到簡化。纖維素I晶體的最高含量不受特別限制，然而，考慮到目前已知的天然纖維素組成，其最高含量小於99％。
本發明中使用的天然纖維素類物質是水不溶性的。此處所用的「水不溶性」是指天然纖維素類物質中含有大於或等於90質量％的水不溶性成分。該水不溶性成分通過下述方法獲得在25℃下將纖維素類物質分散在純水中，並通過超濾(截流分子量10000)除去水溶性成分，然後定量分析水不溶性殘餘物。
本發明中的水不溶性天然纖維素類物質具有小於或等於700的平均聚合度。此處所用的平均聚合度可以通過使用如「the JapanesePharmacopoeia(日本藥典)，第14版」(廣川書店出版)中的結晶性纖維素確認試驗(3)所規定的銅乙二胺溶液的還原比粘度法測量。由於平均聚合度小於或等於700的纖維素類物質更容易進行諸如攪拌、粉碎和研磨等物理處理，因此可以容易地控制其膠態成分的量。當水不溶性天然纖維素類物質的平均聚合度被控制在上述範圍內時，可以為纖維素類物質中的纖維賦予多孔性。因此，酶-基質接觸的可能性增大，當酶分解纖維素類物質時纖維素的分解速率會提高。平均聚合度優選小於或等於500，更優選小於或等於400。較小的平均聚合度可以更容易地控制膠態成分的量和分解速率。因此，最小平均聚合度不受特別限制，然而，考慮到通過簡便步驟所獲得的平均聚合度的範圍，優選最小平均聚合度大於10。
本發明中使用的水不溶性天然纖維素類物質具有小於或等於100μm的平均粒徑。此處所用的平均粒徑是指通過下述方法獲得的體積頻度粒徑分布中的50％累積粒徑將纖維素類物質製成濃度為0.2質量％的水性乳液，使用高剪切均化器(日本精機(株)製造，商品名Excel AutoHomogenizer ED-7，處理條件以5000rpm的速度處理3分鐘)將其分散，將分散液的pH調整為7.5～8.5以後，進行離心分離(久保田商事(株)製造，商品名6930 Centrifuge，處理條件以2000G的離心力處理5分鐘)，然後分離出分散液的上清液成分和沉澱成分，並測量各成分的重量比。各成分的體積頻度粒徑分布是使用水作為介質，通過雷射衍射儀(堀場製作所(株)製造，商品名LA-910，超聲波處理1分鐘)獲得的，並且乘以上清液成分和沉澱成分的重量比以獲得體積頻度粒徑分布中的50％累積粒徑。優選平均粒徑小於或等於100μm，因為這樣在酶分解纖維素時，纖維素與纖維素酶的接觸面積(可及度，accessibility)會增大，使得可以改善纖維寡糖的生產速率和收率。平均粒徑更優選小於或等於50μm，特別優選小於或等於30μm，進一步更優選小於或等於10μm。較小的平均粒徑可以更好地改善纖維寡糖的生產速率、生產選擇性和收率。因此，最小平均粒徑不受特別限制，然而，考慮到通過簡便步驟所獲得的平均粒徑的範圍，優選最小平均粒徑大於或等於0.01μm。
本發明中使用的水不溶性天然纖維素類物質需要包含大於或等於10質量％的膠態纖維素成分。此處所用的膠態纖維素成分由離心分離後留在上清液中的纖維素固體含量的百分比表示，所述上清液如下獲得通過使用高剪切均化器(日本精機(株)製造，商品名Excel AutoHomogenizer ED-7，處理條件以5000rpm的速度處理3分鐘)分散天然纖維素類物質濃度為0.2質量％的水懸浮液，並將pH調整為7.5～8.5，然後離心分離(久保田商事(株)製造，商品名Centrifuge Model 6930，處理條件以2000G的離心力處理5分鐘)。膠態纖維素成分含量大於或等於10質量％使得可以改善纖維寡糖的生產速率、生產選擇性和收率。膠態纖維素成分含量更優選大於或等於15質量％，特別優選大於或等於40質量％。該膠態纖維素成分的量是影響與纖維素類物質的平均粒徑無關的酶分解性的一個因素。儘管膠態纖維素成分的量對於改善纖維寡糖的生產速率、選擇性和收率的機理尚不清楚，但可能的機理在於，膠態纖維素成分量的增加允許穩定的纖維素懸浮液作為基質，並且允許酶與基質均勻接觸，從而改善上述酶分解性。較高的膠態纖維素成分含量可以更好地改善酶分解性。因此，膠態纖維素成分的最高含量不受特別限制，然而，考慮到通過簡便預處理所達到的範圍，最高含量小於或等於99.9質量％。
本發明中使用的水不溶性天然纖維素類物質具有小於1質量％的可溶於二乙醚的物質。此處所用的可溶於二乙醚的物質是指纖維素類物質中可溶於二乙醚的雜質，例如木質素和木質素分解產物，並且所述可溶於二乙醚的物質的含量可以通過如「the Japanese Pharmacopoeia(日本藥典)，第14版」(廣川書店出版)中的結晶性纖維素純度試驗(2)中所規定的可溶於二乙醚的物質的定量分析方法測量。使用木質素含量小於1質量％的高純度纖維素可以更好地改善通過酶分解獲得的纖維寡糖的純度。纖維寡糖純度的提高導致生產收率的提高，從而有助於酶分解後纖維寡糖的提純和纖維素酶的收集。可溶於二乙醚的物質的含量更優選小於或等於0.5質量％，進一步更優選小於或等於0.3質量％。較低的可溶於二乙醚的物質的含量可以更好地改善上述纖維寡糖的純度。因此，可溶於二乙醚的物質的最低含量不受特別限制，然而，考慮到通過簡便預處理所實現的木質素的含量範圍，最低含量大於或等於0.0005質量％。
能夠使天然纖維素類物質的平均聚合度、平均粒徑、膠態纖維素成分含量和可溶於二乙醚的物質的含量滿足本發明範圍的優選處理方法包括以下方法對於控制平均聚合度和可溶於二乙醚的物質的含量的方法不加特別限制，只要是本領域中已知的方法即可。其一個實例包括水解處理。優選該水解處理是因為這樣可以除去纖維素纖維內的非結晶性纖維素和半纖維素以及雜質(例如木質素)，從而為纖維內部賦予多孔性，因此酶分解時纖維素酶更易於滲透到纖維內部，從而改善纖維素的分解速率和纖維寡糖的收率。
此外，優選水解還因為當使用本領域內已知的方法進一步處理水解的纖維素類物質時，纖維素類物質因具有多孔的纖維內部而更易於進行機械處理，並且可以更容易地控制纖維素類物質的平均粒徑和膠態成分含量。
水解的方法不受特別限制，然而可以例舉出加酸水解、鹼氧化分解、熱水分解、蒸汽噴發和微波分解。可以單獨使用這些方法中的任意一種方法，也可以組合使用它們中的兩種或兩種以上的方法。當進行上述方法中的加酸水解時，通過向保持分散在水性介質中的纖維素類物質中加入適量質子酸、羧酸、路易斯酸、雜多酸等，並在攪拌下加熱所得混合物，可以容易地控制平均聚合度。在此情況下，諸如溫度、壓力和時間等反應條件根據纖維素的種類和濃度，以及酸的種類和濃度而有所不同，但是，應該適當調整這些反應條件，以達到理想的平均聚合度。例如，對於上述加酸水解，優選的反應條件是在大於或等於100℃並加壓的條件下使用小於或等於1質量％的礦物酸溶液處理纖維素10分鐘以上。這是因為諸如酸等催化成分會滲透到纖維素纖維的內部，從而促進水解，因此可以減少催化成分的用量。
控制平均粒徑和膠態纖維素成分含量的方法不受特別限制，只要該方法為本領域中已知的方法即可。其實例包括研磨、粉碎、篩分、氣旋分離和使用離心分離機的離心分離。這些方法可以單獨使用，也可以組合使用它們中的兩種或兩種以上的方法。這些方法都可以作為溼法和幹法來進行。通過溼法單獨獲得的纖維素類物質可以在酶分解前混合在一起，而通過幹法單獨獲得的纖維素類物質也可以在酶分解前混合在一起。另外，也可以將通過溼法獲得的纖維素類物質與通過幹法獲得纖維素類物質混合在一起。
例如，當通過溼法處理纖維素時，通過對含有1％～99％的纖維素類物質和介質的纖維素分散液進行研磨、粉碎等本領域內已知的處理，可以容易地調整纖維素類物質的平均粒徑或膠態纖維素成分含量。在該情況下，所使用的介質不受特別限制，可以包括水、諸如甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、丁醇、2-甲基丁醇和苯甲醇等醇類、諸如戊烷、己烷、庚烷和環己烷等烴類，以及諸如丙酮和乙基甲基酮等酮類。特別是，優選的有機溶劑為在藥品、食品和其添加劑的生產步驟中所用的任意溶劑，並且包括在《醫藥品添加物事典》(Dictionary of Pharmaceutical Additives)(藥事日報社出版)、《日本藥典》和《食品添加物公定書》(Official Methodfor Food Additives)(廣川書店出版)中分類為溶劑的那些溶劑。可以單獨使用水和有機溶劑，也可以組合使用它們中的兩種或兩種以上溶劑。可選地是，在將一種介質用在分散液中然後將其除去後，可以將纖維素類物質再次分散到不同介質中。
研磨方法包括使用諸如單向旋轉式攪拌槳葉、多軸旋轉式攪拌槳葉、往復反轉式攪拌槳葉、上下運動式攪拌槳葉、旋轉並上下運動式攪拌槳葉和管路式攪拌槳葉等攪拌槳葉的研磨方法，例如可攜式混合器、固體混合器和側面混合器；噴射式攪拌研磨方法，如管線混合器；使用高剪切均化器、高壓均化器、超聲波均化器等的方法；使用捏合機的旋轉擠出式研磨方法；以及壓密與剪切相結合的研磨方法，例如輥磨機、球磨機、振動球磨機和珠磨機，上述任何方法都可以單獨使用或組合使用。
粉碎方法包括篩網式粉碎方法，例如篩磨機和錘磨機；槳葉旋轉剪切篩網式粉碎法，例如速磨機(flash mill)；噴氣式粉碎法，例如噴射磨；壓密與剪切相結合的粉碎法，例如輥磨機、球磨機、振動球磨機和珠磨機；以及攪拌槳葉式粉碎法，上述任何方法都可以單獨使用或組合使用。
本發明的纖維素酶是纖維素分解酶的通稱。具有分解纖維素活性的任何纖維素酶均包含在根據本發明的纖維素酶中。纖維素酶的酶源的實例包括生產纖維素酶的活微生物本身或其培養上清液、從生產纖維素酶的活微生物生產的酶中提純的酶，或者由提純的酶與諸如賦形劑、穩定劑等添加劑一起製備的製劑。當將纖維素酶製劑用在酶分解中時，向該製劑中加入的添加劑不受特別限制。其劑型可以是粉末、顆粒、液體等任意形式。
纖維素酶的來源不受特別限制，可以包括由本領域中已知的生產纖維素酶的微生物生產的纖維素酶，所述生產纖維素酶的微生物包括如《Cellulase(纖維素酶)》(Kodansha Scientific出版(1987))和《Dictionaryof Cellulose(纖維素辭典)》(朝倉書店出版(2000))中所述的木黴素屬、枝頂孢屬、麴黴屬、桿菌屬、假單胞菌屬、青黴菌屬、氣單孢菌屬、耙齒菌屬(Irpex)、側孢黴屬和腐殖菌屬微生物。然而，本發明的纖維素酶不僅限於本領域中已知的來源於上述微生物的酶，它還包括能夠分解纖維素的任意酶，其中包括來源於新發現的微生物的酶。
優選地是，本發明中使用的纖維素酶的β-葡糖苷酶活性與結晶性纖維素分解活性之比(溫度為55℃時的β-葡糖苷酶活性/結晶性纖維素分解活性)小於或等於0.7。此處所用的活性比通過纖維寡糖的分解能力(β-葡糖苷酶活性)與纖維素酶分解纖維素的能力(結晶性纖維素分解活性)之比來獲得。優選較小的活性比，因為這樣可以獲得較高的分解纖維素的能力和較低的分解寡糖的能力，從而提高寡糖的生產率。活性比更優選小於或等於0.5，進一步優選小於或等於0.4，特別優選小於或等於0.35，最優選小於或等於0.30。由於較小的活性比可以更好地改善纖維寡糖的收率，因此最小活性比不受特別限制，但是，考慮到容易實現的活性比的範圍，最小活性比大於或等於0.01。
此處所用的β-葡糖苷酶活性是指在將纖維二糖(一種纖維寡糖)用作基質從而使纖維素酶可以在水性介質中對其發揮作用時，由纖維二糖生產葡萄糖的酶活性。該活性通過在1mL反應溶液中1分鐘內產生的葡萄糖的摩爾數(μmol/mL*min)來測量，並由單位U(單位)/mL表示。該β-葡糖苷酶活性可以通過以下方法測量將2質量％的纖維二糖(Aldrich製造，特級)和纖維素酶溶解在pH為4.5的50mM的乙酸/乙酸鈉緩衝液中，在密封條件下將其在55℃的水浴中反應1小時後，定量測量反應溶液中葡萄糖的濃度。
此處所用的結晶性纖維素分解活性是指在將結晶性纖維素用作基質，從而使纖維素酶可以在水性介質中對其發揮作用時，生產諸如纖維二糖和纖維三糖等纖維寡糖以及葡萄糖的酶活性。該活性通過在1mL反應溶液中1分鐘內產生的纖維寡糖和葡萄糖的總摩爾數(μmol/mL*min)來測量，並由單位U(單位)/mL表示。該結晶性纖維素分解活性可以通過上述β-葡糖苷酶活性測量方法來測量，即，使用5質量％的結晶性纖維素(通過使用轉速為126rpm的萬能攪拌混合機(商品名，三英製作所製造)的鉤狀槳葉(hook blade)捏合併攪拌含水量被調整為60％的Ceolus PH-101(商品名，旭化成化學株式會社製造)90分鐘而獲得)代替纖維二糖，並使用與上述相同的方法進行酶分解，以定量測量反應溶液中分解和生成的諸如纖維寡糖和葡萄糖等糖的總量。
在上述各種活性測量方法中，反應溶液中的纖維寡糖和葡萄糖可以通過高效液相色譜(柱Asahipak NH2P-50(商品名，島津製作所製造)，高效液相色譜SCL-10A型(商品名，島津製作所製造)，移動床乙腈/水＝75/25(體積比)，循環量1mL/min，樣品溶液10μL)進行定量測定。
獲得具有滿足本發明範圍的β-葡糖苷酶活性與結晶性纖維素分解活性的活性比(β-葡糖苷酶活性/結晶性纖維素分解活性)的纖維素酶的方法包括以下方法優選將能夠生產活性比(溫度為40℃時的β-葡糖苷酶活性/結晶性纖維素分解活性)小於或等於0.5的纖維素酶的菌株用作生產纖維素酶的細菌。可以使用任何菌株，只要其活性比滿足上述範圍即可。任何通過菌株的人工誘變方法(例如紫外線照射、X射線照射、使用突變誘導劑處理)獲得的突變株、天然存在的突變株或者通過基因操作或細胞融合獲得的突變株均可以用在本發明中，只要這些突變株能夠生產具有小於或等於0.5的活性比(溫度為40℃時的β-葡糖苷酶活性/結晶性纖維素分解活性)的纖維素酶即可。該比例(溫度為40℃時的β-葡糖苷酶活性/結晶性纖維素分解活性)優選小於或等於0.35，更優選小於或等於0.2。由於較小的活性比可以更好地改善纖維寡糖的收率，因此最小活性比不受特別限制，但是，考慮到容易實現的活性比的範圍，最小活性比大於或等於0.01。
溫度為40℃時的β-葡糖苷酶活性與結晶性纖維素分解活性比通過以下方法測量。
(1)結晶性纖維素分解活性向懸浮在50mM的乙酸-乙酸鈉緩衝液(pH5)中的0.4ml的5質量％結晶性纖維素(通過使用轉速為126rpm的萬能攪拌混合機(商品名，三英製作所製造)的鉤狀槳葉捏合併攪拌含水量被調整為60％的CeolusPH-101(商品名，旭化成化學株式會社製造)90分鐘而獲得)的基質溶液中加入0.1ml適當稀釋的酶溶液後，使該混合物在40℃的水浴中反應4小時，接下來，將其在95℃加熱10分鐘，結束反應，然後通過HPLC法(高效液相色譜法)定量測量反應溶液中的葡萄糖濃度。將在1分鐘內釋放葡萄糖和纖維寡糖的總量為1μmol的酶的量定義為1酶單位(1U)。
(2)β-葡糖苷酶活性向溶解在50mM的乙酸-乙酸鈉緩衝液(pH5)中的0.4ml的2.5質量％纖維二糖(Aldrich製造，特級)的基質溶液中加入0.1ml酶溶液後，使該混合物在40℃的水浴中反應4小時，接下來，將其在100℃加熱10分鐘，結束反應，然後通過HPLC法定量測量反應溶液中的葡萄糖濃度。將在1分鐘內釋放1μmol葡萄糖的酶的量定義為1酶單位(1U)。
在上述各種活性測量方法中，反應溶液中的纖維寡糖和葡萄糖可以通過上述高效液相色譜來定量測量。
此處，所用的典型菌株的實例包括裡氏木黴(Trichoderma reesei)NBRC31329菌株。
另外，活性比(溫度為40℃時的β-葡糖苷酶活性/結晶性纖維素分解活性)較小的菌株可以通過例如下述方法獲得。如果需要，可以對能夠生產纖維素酶的微生物進行本領域中已知的誘變處理，例如紫外線照射或者使用突變誘導劑(例如亞硝基胍)，然後從其菌株中選擇活性比(β-葡糖苷酶活性/結晶性纖維素分解活性)較小的菌株。例如，可以將裡氏木黴NBRC31329用作誘變處理中使用的微生物(母株)，在28℃下將其在馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基上培養3至10天。生成的孢子以105個孢子/mL～108個孢子/mL懸浮在鹽水中，使用EMS(甲磺酸乙酯)(100μg/ml～500μg/ml，pH7.0，28℃，5～24小時)進行誘變處理。活性比(溫度為40℃時的β-葡糖苷酶活性/結晶性纖維素分解活性)較小的菌株的選擇可以通過下述方法實現通過離心分離從經誘變處理的孢子的懸浮液中收集孢子，洗滌孢子，再使用葡萄糖作為碳源培養這些孢子，然後使用本領域中已知的方法測量所得培養物的酶活性。通過使用得自各經誘變處理的菌株的培養物並酶分解用作基質的纖維二糖或結晶性纖維素以定量測量生成的還原糖可以定量地選擇感興趣的菌株，或者另外也可以通過使用本領域中已知的與培養物發生酶反應的比色基質來定性地選擇感興趣的菌株。
纖維素酶可以由通過培養生產纖維素酶的細菌菌株獲得的培養上清液獲得。培養基中使用的碳源的實例有纖維素粉末、纖維二糖、濾紙、普通紙、鋸末、麩皮、穀殼、甘蔗渣、豆餅、咖啡渣、澱粉和乳糖。諸如硝酸銨和硫酸銨等無機銨鹽以及諸如尿素、胺基酸、肉汁、酵母膏、多聚蛋白腖和蛋白質分解產物等含氮有機物可以用作氮源。KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、Fe2Cl3·6H2O、MnCl3·4H2O、ZnSO4·7H2O、等可以用作無機鹽。可以選擇性地使用含有有機微量養料的培養基。對於培養物，可以使用常用通氣攪拌培養裝置，且可以使用上述培養基，並將溫度和pH控制到能使生產菌株生長的溫度和pH附近。然後，使用本領域中已知的方法，例如離心分離和過濾，從所得培養溶液中除去菌株體，以獲得上清液。該上清液可以直接用作粗酶溶液。
可以進一步降低活性比(溫度為40℃時的β-葡糖苷酶活性/結晶性纖維素分解活性)的培養方法的實例包括將培養期間的培養溶液的pH控制在小於3.5並大於或等於能使生產纖維素酶的細菌生長的pH值的方法。具體是，在25℃～35℃下，將上述裡氏木黴NBRC31329菌株或其突變株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面上培養3至10天。將所得培養物在下述培養基中在28℃接種並預培養2至4天，其中將100mL包含纖維素作為懸浮並溶解的碳源的培養基分散到500mL的錐形瓶中並高壓消毒。將預培養溶液接種到將3L具有與上述培養基相同組成的培養基放到5L的廣口發酵罐(jar fermentor)中並高壓消毒的培養基中，在溫度為28℃、攪拌速率為200rpm～400rpm、通氣速率為0.3vvm～1vvm的條件下培養。使用NaOH或氨水將培養期間的pH控制為2～3.5，優選為2.5～3.0。經過4至7天的培養後，使用本領域中已知的方法，例如離心分離和過濾，從培養溶液中除去菌株體，以獲得上清液。該上清液可以直接用作粗酶溶液。
這樣獲得的粗酶溶液可以通過常用蛋白質提純方法，例如硫酸銨分離、利用溶劑的沉澱分離或柱色譜進行進一步提純。
可選地是，當纖維素酶是來自可商業獲得的酶時，該酶可以通過常用蛋白質提純方法，例如硫酸銨分離、利用溶劑的沉澱分離或柱色譜來提純，以獲得活性比(溫度為55℃時的β-葡糖苷酶活性/結晶性纖維素分解活性)小於或等於0.7的部分。
下面將描述本發明的生產纖維寡糖的方法。
本發明的生產纖維寡糖的方法是在纖維素酶的存在下酶分解本發明的天然纖維素類物質的方法。優選該方法中使用的纖維素酶的β-葡糖苷酶活性與結晶性纖維素分解活性之比(溫度為55℃時的β-葡糖苷酶活性/結晶性纖維素分解活性)小於或等於0.7。本發明中獲得的主要由纖維寡糖構成的水溶液通過本領域中已知的方法提純和/或乾燥。
本領域中任何已知的方法都可以被用作酶分解的方法，而不受特別限制。該方法的實例包括下述方法將作為基質的本發明的纖維素類物質懸浮在水性介質中，然後加入本發明的纖維素酶，並在攪拌或振動下加熱以進行糖化反應。
在上述方法中，需要適當調整諸如懸浮和攪拌方法、加入纖維素酶/基質的方法和順序以其濃度等反應條件，以便高收率地生產纖維寡糖。在該情況下，反應溶液的pH和溫度可以落在不會使酶失活的範圍內，當反應在常壓下進行時，它們通常會落在5℃～95℃的溫度範圍內和1～11的pH範圍內。此時，如上所述，壓力、溫度和pH都得到了適當的調整，從而能夠以較高收率生產纖維寡糖。然而，當使用通過將上述裡氏木黴NBRC31329菌株或其突變株作為生產纖維素酶的細菌獲得的纖維素酶時，優選將纖維素在常壓、溫度為50℃～60℃、pH為3.0～5.5的條件在乙酸鹽或磷酸鹽緩衝液中酶分解。
該酶反應可以在分批系統和連續系統中進行。為避免在酶分解反應中纖維二糖成為生產障礙，反應系統中的纖維二糖濃度應保持在一定範圍內，這對於改善纖維寡糖的生產率是很重要的。將反應系統中纖維二糖的濃度保持在一定範圍內的方法可以是下述方法通過諸如超濾或反向滲透過濾等薄膜過濾從反應系統中提出生成的纖維二糖的方法；將諸如乾燥的植物粉末(例如活性炭、竹子和木頭)等多孔的有機基材、諸如二氧化矽等多孔的無機基材引入反應系統中並使纖維二糖吸附於其上的方法；將纖維素基質固定在柱等之中的方法，在所述柱中使含有纖維素酶的反應溶液循環；或者將纖維素酶固定在聚合物等之中的方法，在所述聚合物中使含有纖維素的反應溶液循環。
可以選擇性地對通過上述酶分解獲得的主要由纖維寡糖構成的水溶液進行諸如脫色、脫鹽和除酶等提純處理。提純方法不受特別限制，只要是本領域中已知的方法即可。但是，例如可以使用活性炭處理、離子交換樹脂處理、色譜處理、諸如微濾、超濾和反向滲透過濾等過濾處理、以及結晶處理。這些方法可以單獨使用，也可以兩種或兩種以上組合使用。
經上述方法提純的主要由纖維寡糖構成的水溶液可以不進行其它處理而使用，但是，如果需要，也可以通過乾燥而固化。乾燥方法不受特別限制，只要是本領域中已知的方法即可。但是，例如，可以使用噴霧乾燥、冷凍乾燥、滾筒乾燥、薄膜乾燥、板式乾燥(plate drying)、閃速乾燥和真空乾燥。這些方法可以單獨使用，也可以兩種或兩種以上組合使用。
在上述提純和乾燥處理中，例如，除水以外還可以選擇性地使用有機溶劑作為纖維寡糖的介質。對於該處理中所使用的有機溶劑不作特別限制。優選的有機溶劑為在例如藥品、食品和其添加劑的生產步驟中所用的任意溶劑，並且包括在《醫藥品添加物事典》(Dictionary ofPharmaceutical Additives)(藥事日報社出版)、《日本藥典》和《食品添加物公定書》(Official Method for Food Additives)(廣川書店出版)中分類為溶劑的那些溶劑。可以單獨使用水和有機溶劑，也可以組合使用它們中的兩種或兩種以上溶劑。可選地是，在將一種介質用在分散液中然後將其除去後，可以將纖維寡糖再次分散到不同介質中。
進行了上述步驟後的纖維寡糖在常溫下的使用形態包括但不特別限於固體、懸浮液、乳液、糖漿或溶液。固體纖維寡糖的實例包括粉末、顆粒、丸狀、成型物、層壓體和固態分散體。
下面將介紹通過本發明的方法獲得的纖維寡糖。
本發明的纖維寡糖中的可溶於二乙醚的物質的含量優選小於或等於2000ppm，更優選小於或等於1000ppm。此處所用的可溶於二乙醚的物質的含量是指諸如纖維素類物質中的木質素或木質素分解產物等可溶於二乙醚的雜質的含量，並且可以通過如「Japanese Pharmacopoeia(日本藥典)，第14版」(廣川書店出版)中的結晶性纖維素純度試驗(2)中所規定的可溶於二乙醚的物質的定量分析方法測量。優選纖維寡糖中具有小於或等於2000ppm的可溶於二乙醚的物質的含量，原因在於其包含較少的雜質，從而呈現較高的白色，在將其應用於食品、化妝品和藥用製劑時可以容易地進行提純。特別是，當將纖維寡糖與諸如藥劑等活性成分結合使用時是優選的，因為它可以抑制活性成分的分解。當將纖維寡糖用作用於化學轉化的原料時是優選的，因為由於它包含的雜質較少，因此不容易引發副反應，並能提高化學轉化收率。可溶於二乙醚的物質的含量更優選小於或等於1000ppm，進而優選小於或等於500ppm，更進而優選小於或等於300ppm，最優選小於或等於100ppm。可溶於二乙醚的物質的含量越低，上述效果就會變得越好。因此，雖然其下限不受特別限制，但是通過簡便方法能夠實現的木質素含量的範圍大於或等於0.1ppm。
通過本發明獲得的纖維寡糖的應用不受特別限制，例如可以用作食品、化妝品、藥物和一般工業製品等領域中的食品成分、化妝品成分、顏料成分、香料成分、藥物活性成分、農藥成分、飼料成分、化肥成分、培養基成分和分析試劑成分、以及添加劑、中間原料和發酵原料。
通過本發明獲得的纖維寡糖在食品中的應用包括凝膠，如果凍、布丁和酸乳酪；調料，如蛋黃醬、調味品、沙司、肉汁、湯和經加工的蔬菜；殺菌罐頭和冷藏食品，如咖喱、碎肉、肉羹、燉品和湯；經加工的畜牧製品，如漢堡包、燻肉、香腸、義大利香腸和火腿；魚醬製品，如清煮魚醬、管狀魚醬餅、魚火腿/香腸和炸魚醬；經加工的麥類製品，如麵包、溼麵條、乾麵條、通心粉、義大利麵條、中國饅頭皮、蛋糕粉、預混合料、白汁沙司、餃子皮和春卷皮；罐裝或瓶裝食品，例如咖喱、沙司、湯、用醬油煮的食品和果醬；糖果點心，如糖果、糖錠、糖片、巧克力、餅乾、甜餅、米餅、日本/西方糖果點心、未烤制的蛋糕、小吃、蜜餞和布丁；熟食和經處理的食品，如油炸食品、油炸丸子、餃子和中國饅頭；以及糊狀食品，如蔬菜醬、肉餡、果醬、魚醬和其它海產品醬。還包括奶製品，如冰淇淋、牛奶凍、乳冰(lact ice)、生奶油、煉乳、黃油、酸乳酪、乳酪和白汁沙司，以及經加工的油類和脂肪類製品，如人造黃油、塗抹人造奶油(fat spread)和起酥油。另外，纖維寡糖還可以用於諸如可樂等碳酸飲料；諸如碳酸水果飲料、酒精水果飲料、混有奶製品的水果飲料、混有果汁或果肉的飲料和牛奶飲料等飲料；諸如咖啡、牛奶、豆奶、可可奶、果奶和酸乳酪等乳酸/牛奶飲料；和諸如煎茶、烏龍茶、綠茶和紅茶等茶飲品。
在本發明中獲得的纖維寡糖預計可以獲得多種生理活性，如激活有益的腸道菌落(例如激活乳酸菌和乳桿菌)、降低血糖濃度和血胰島素濃度、降低血液中的膽固醇、降低體內脂肪比例、促進脂類/糖類代謝機能、通便/改善便臭和防齲齒性。因此，除了上述在常見食品中的應用之外，纖維寡糖還可以在保健食品、健康食品和膳食等應用中用作具有生理活性的物質。
此外，因為在本發明中獲得的纖維寡糖具有高純度，所以該纖維寡糖還可以用作化學轉化為各種纖維寡糖衍生物的原料。
雖然將參考實施例來描述本發明，但本發明並不僅限於這些實施例。
(實施例1)向低速攪拌器(30-L反應器)中加入2kg可商業獲得的源於針葉樹的溶解漿(平均聚合度781，可溶於二乙醚的物質的含量1.1％，平均粒徑174μm)和30L 3N的鹽酸溶液，在105℃下攪拌水解30分鐘。使用吸濾器(Nutsche)過濾所得酸不溶性殘餘物，並在70L純水中洗滌四次，獲得固體含量為40.1％的溼濾餅(平均聚合度220，可溶於二乙醚的物質的含量0.03質量％，平均粒徑69.1μm，膠態纖維素含量13.4質量％，纖維素I晶體含量85％)。
將溶解在0.2N乙酸-乙酸鈉緩衝液(PH4.5)中的可商業獲得的源於木黴素的纖維素酶製劑(商品名T「Amano」4)加入溼濾餅中，以便將溼濾餅中的固體含量和蛋白質濃度分別調整為5％和0.25％。將這樣獲得的混合物(共計25mL)放置在50mL的玻璃瓶中。將該玻璃瓶放置在48℃的恆溫振蕩水槽中，並在90rpm的振蕩速度下反應如表1中所示的固定的一段時間。在開始反應後如表1所示的固定的時間段中，分配300μL仍處於懸浮狀態的反應溶液。使用超濾組件(截流分子量5000)除去酶後，通過高效液相色譜(島津製作所製造，柱TSK-GEL AMIDO-80(商品名，Tosoh製造)，移動床乙腈/水＝6/4)分析所得溶液。所得到的結果如表1中所示。表中的寡糖的選擇性是通過(纖維二糖濃度+纖維三糖濃度)/總糖濃度×100(％)計算的值。
(實施例2)使用與實施例1中相同的方法，對可商業獲得的源於針葉樹的溶解漿(平均聚合度781，可溶於二乙醚的物質的含量1.1％，平均粒徑174μm)進行加酸水解。將所得溼濾餅製成絮團形態，然後放到60℃的快速乾燥機中，乾燥12小時。
使用家用混合器粉碎所得乾燥物，將獲得的粉碎的纖維素物質用噴氣粉碎機(Seishin Enterprise製造，商品名Jet Mill STJ-2000型)粉化，以獲得纖維素粉末(平均聚合度220，可溶於二乙醚的物質的含量0.03質量％，平均粒徑16.4μm，膠態纖維素含量17.5質量％，纖維素I晶體含量86％)。將該纖維素粉末用作基質，並使用與實施例1中相同的方法進行酶分解。得到的結果如表1中所示。
實施例2使用的平均聚合度和可溶於二乙醚的物質的含量與實施例1中的相同，平均粒徑比實施例1中的小，膠態纖維素含量比實施例1中的大。由表1可以看出，在實施例2中，與實施例1相比，通過減小基質的平均粒徑，使糖濃度達到10％和20％所需的反應時間縮短，且對於每種糖濃度改善了寡糖的選擇性。
(實施例3)使用與實施例1中相同的方法，對可商業獲得的源於闊葉樹的溶解漿(平均聚合度1682，可溶於二乙醚的物質的含量0.9％，平均粒徑91μm)進行加酸水解。向所得溼濾餅中加入純水，以製成纖維素濃度為10％的分散液。使用高剪切均化器(特殊機化(株)製造，商品名TKHomogenizer)攪拌該分散液30分鐘，以獲得纖維素分散液(平均聚合度151，可溶於二乙醚的物質的含量0.1質量％，平均粒徑8.7μm，膠態纖維素含量55.5質量％，纖維素I晶體含量85％)。將該纖維素分散液用作基質，並使用與實施例1中相同的方法進行酶分解。得到的結果如表1中所示。
實施例3使用的平均聚合度比實施例1和實施2中的小，使用的可溶於二乙醚的物質的含量比實施例1和實施例2中的大，使用的平均粒徑比實施例1和實施例2中的小，使用的膠態纖維素含量比實施例1和實施例2中的高。由表1中可以看出，在實施例3中，與實施例1和實施例2相比，反應時間得到了進一步的縮短，對應每種糖濃度寡糖的選擇性也得到了改善。雖然在實施例1和實施例2中寡糖的選擇性隨糖濃度的升高而降低，但是在實施例3中寡糖的選擇性即使是糖濃度升高也沒有降低。
(實施例4)除了將水解條件改變為使用鹽酸濃度為5N的鹽酸溶液在18℃下進行12小時之外，使用與實施例1中相同的方法對可商業獲得的源於針葉樹的溶解漿(平均聚合度781，可溶於二乙醚的物質的含量1.1質量％，平均粒徑174μm)進行水解。與實施例1相似，洗滌並過濾所得酸不溶性殘餘物，以獲得溼濾餅(平均聚合度690，可溶於二乙醚的物質的含量0.7％，平均粒徑49.8μm)。將該溼濾餅製成纖維素濃度為10％的水分散液。使用超高性能分散機/溼式粉磨機(Ashizawa製造，商品名Pearl Mill RL，氧化鋁珠直徑2mm，填充率80％)對該水分散液進行壓密/研磨處理，以獲得纖維素微粒分散體(平均聚合度690，可溶於二乙醚的物質的含量0.7質量％，平均粒徑7.1μm，膠態纖維素含量87.5質量％，纖維素I晶體含量77％)。將該纖維素微粒分散體用作基質，並使用與實施例1中相同的方法進行酶分解。得到的結果如表1中所示。
實施例4使用的平均聚合度和可溶於二乙醚的物質的含量比實施例1、實施例2和實施例3中的大，使用的平均粒徑比實施例1、實施例2和實施例3中的小，使用的膠態纖維素含量比實施例1、實施例2和實施例3中的高。由表1中可以看出，在實施例4中，寡糖的選擇性與實施例3中的相同，但是反應時間與實施例3相比得到了改善。此外，在實施例4中，寡糖的選擇性即使是升高糖濃度也很難降低。
(實施例5)除了使用可商業獲得的源於棉籽絨的紙漿(平均聚合度1853)，並在130℃的5N的鹽酸水溶液中水解12小時之外，使用與實施例1中相同的方法進行水解，以獲得溼濾餅(平均聚合度49)。將該溼濾餅製成纖維素濃度為10％的水分散液。使用超高性能分散機/溼式粉磨機(Ashizawa製造，商品名Pearl Mill RL，氧化鋁珠直徑2mm，填充率80％)對該水分散液進行壓密/研磨處理，以獲得纖維素微粒分散體(平均聚合度49，可溶於二乙醚的物質的含量0.9質量％，平均粒徑10.3μm，膠態纖維素含量94.1質量％，纖維素I晶體含量75％)。將該纖維素微粒分散體用作基質，除了將酶改變為源於黑麴黴的CELLULASENAGASE(Nagase Co.，Ltd.製造，商品名)之外，使用與實施例1相同的方法進行酶分解。得到的結果如表1中所示。
實施例5使用的平均聚合度比實施例4中的低，使用的可溶於二乙醚的物質的含量比實施例4中的高，使用的平均粒徑比實施例4中的大，但是使用的膠態纖維素含量比實施例4中的高。由表1中可以看出，在實施例5中，與實施例4相比，反應時間縮短了一半，寡糖的選擇性也得到了提高。
(比較例1)將實施例1中使用的可商業獲得的源於針葉樹的溶解漿加入3N鹽酸溶液中，以製造纖維素濃度為10％的分散液。使用高剪切均化器(特殊機化(株)製造，商品名TK Homogenizer)在常溫下將該分散液攪拌60分鐘，獲得纖維素分散液(平均聚合度723，可溶於二乙醚的物質的含量0.9質量％，平均粒徑49.3μm，膠態纖維素含量10.2質量％，纖維素I晶體含量85％)。將未進行加酸水解的該纖維素分散液用作基質，並使用與實施例1中相同的方法進行酶分解。得到的結果如表1中所示。
比較例1使用的平均粒徑和可溶於二乙醚的物質的含量在本發明的範圍內，而平均聚合度超出了本發明的範圍。由表1中可以看出，在比較例1中，與各實施例相比，糖濃度達到10％和20％所需的反應時間被延長，且酶分解變慢。另外，對於每種糖濃度寡糖的選擇性達不到各實施例所達到的水平。
(比較例2)將通過實施例4中的步驟所獲得的溼濾餅製成纖維素濃度為10％的水分散液。使用目徑為45μm的網篩對該水分散液進行溼法分離。將殘存在網篩上的固體物質(平均聚合度690，可溶於二乙醚的物質的含量0.7質量％，平均粒徑107.3μm，膠態纖維素含量5.2質量％，纖維素I晶體含量85％)用作基質，並使用與實施例1相同的方法進行酶分解。得到的結果如表1中所示。
比較例2使用的平均聚合度和可溶於二乙醚的物質的含量在本發明的範圍內，而平均粒徑超出了本發明的範圍。由表1中可以看出，在比較例2中，與各實施例相比，反應時間變慢，且寡糖的選擇性達不到各實施例所達到的水平。
(比較例3)除了將水解條件改變為使用鹽酸濃度為4N的鹽酸溶液在35℃下進行18小時之外，使用與實施例1中相同的方法對可商業獲得的源於針葉樹的未漂白的牛皮紙紙漿(平均聚合度1670，可溶於二乙醚的物質的含量12質量％，平均粒徑154μm)進行水解。與實施例1相似，洗滌並過濾所得酸不溶性殘餘物，以獲得溼濾餅(平均聚合度490，可溶於二乙醚的物質的含量4.4質量％，平均粒徑48.7μm，膠態纖維素含量12.8質量％，纖維素I晶體含量86％)。
使用該溼濾餅並以與實施例1相同的方法進行酶分解。得到的結果如表1中所示。
比較例3使用的平均聚合度和平均粒徑在本發明的範圍內，而可溶於二乙醚的物質的含量超出了本發明的範圍。由表1中可以看出，在比較例3中，與比較例1和比較例2相比，纖維寡糖的收率略有提高，但是反應時間和寡糖的選擇性均達不到實施例所達到的水平。


(製備例1)將裡氏木黴NBRC31329接種到馬鈴薯葡萄糖培養基(Difco製造)中，並在37℃下培養7天，然後，將取自該培養基表面的一鉑環量孢子在下述培養基中接種並在28℃下預培養3天，所述培養基為將1g多聚蛋白腖、0.5g酵母膏、2g磷酸一鉀、1.5g硫酸銨、0.3g硫酸鎂、0.3g氯化鈣、1mL痕量元素(通過將6mg硼酸、26mg四水合鉬酸銨、100mg六水合氯化鐵(III)、40mg五水合硫酸銅、8mg四水合硫酸錳和200mg七水合硫酸鋅溶解在總量為100mL的純水中獲得)、1mL AdecanolLG-109和10g結晶性纖維素(旭化成化學株式會社製造，商品名PH-101)懸浮、溶解在總量為1L的純水中，再將其中的100mL分配到500mL的錐形瓶中並進行高壓消毒。此外，將10mL預培養溶液接種到5L廣口發酵罐中，該發酵罐中盛有與上述培養基組成相同的培養基，在溫度為28℃、攪拌速率為400rpm、通氣速率為0.5vvm的條件下進行培養。培養期間使用NaOH將pH控制為3。培養7天後，離心分離所得溶液。使用目徑為0.46μm的微孔濾膜，從獲得的上清液中除去菌株體。使用截流分子量為13000的超濾膜(旭化成化學株式會社製造，商品名Microza Pencil Module ACP-0013)，將濾液體積濃縮為原來的十分之一，以獲得粗酶。
表2列出了該粗酶活性比(溫度為55℃時的β-葡糖苷酶活性/結晶性纖維素分解活性)的測量結果。
(製備例2)將裡氏木黴NBRC31329接種到馬鈴薯葡萄糖培養基(Difco製造)中，並在37℃下培養7天，然後，將取自該培養基表面的一鉑環量孢子在下述培養基中接種並在28℃下培養3天，所述培養基為將1g多聚蛋白腖、0.5g酵母膏、2g磷酸一鉀、1.5g硫酸銨、0.3g硫酸鎂、0.3g氯化鈣、1mL痕量元素(通過將6mg硼酸、26mg四水合鉬酸銨、100mg六水合氯化鐵(III)、40mg五水合硫酸銅、8mg四水合硫酸錳和200mg七水合硫酸鋅溶解在總量為100mL的純水中獲得)、1mL AdecanolLG-109和10g結晶性纖維素(旭化成化學株式會社製造，商品名PH-101)懸浮、溶解在總量為1L的純水中，再將其中的100mL分配到500mL的錐形瓶中並進行高壓消毒。此外，將10mL預培養溶液接種到5L廣口發酵罐中，該發酵罐中盛有1L與上述培養基組成相同的培養基，並在溫度為28℃、攪拌速率為400rpm、通氣速率為0.5vvm的條件下進行培養。培養期間使用NaOH將pH控制為4。培養7天後，離心分離所得溶液。使用目徑為0.46μm的微孔濾膜，從獲得的上清液中除去菌株體。使用截流分子量為13000的超濾膜(旭化成化學株式會社製造，商品名Microza Pencil Module ACP-0013)，將濾液體積濃縮為原來的十分之一，以獲得粗酶。
表2列出了該粗酶的活性比(溫度為55℃時的β-葡糖苷酶活性/結晶性纖維素分解活性)的測量結果。
(製備例3)將可商業獲得的纖維素酶(合同酒精製造，商品名GODO-TCD)溶解在50mM的乙酸-乙酸鈉緩衝液(PH4.8)中，使纖維素酶的濃度為500mg/mL。將該混合物引入陰離子交換柱(Amersham製造，商品名DEAE-Sepharose FF)中。通過線性梯度法，使50mM的乙酸-乙酸鈉緩衝液(pH4.8)和溶解在50mM的乙酸-乙酸鈉緩衝液(pH4.8)中的1摩爾％的氯化鈉在柱中循環，從而從可商業獲得的酶中獲得分離樣品。測量獲得的所有餾分的β-葡糖苷酶活性和結晶性纖維素分解活性，合併活性比(溫度為55℃時的β-葡糖苷酶活性/結晶性纖維素分解活性)小於或等於0.5的餾分。使用截流分子量為10000的超濾組件(Millipore製造，商品名Amicon Ultra-15離心過濾機)，將獲得的纖維二糖餾分的體積濃縮為原來的五分之一，以獲得純化酶(提純的酶中的蛋白質濃度15.4mg/mL)。
表2列出了該純化酶活性比(溫度為55℃時的β-葡糖苷酶活性/結晶性纖維素分解活性)的測量結果。
(實施例6)在低速攪拌器(30-L反應器)中加入2kg可商業獲得的源於針葉樹的溶解漿(平均聚合度781，可溶於二乙醚的物質的含量1.1％，平均粒徑174μm)，並在110℃下使用的3N鹽酸溶液的水解條件下水解30分鐘。洗滌並過濾所得酸不溶性殘餘物，以獲得溼濾餅。將獲得的溼濾餅製成絮團形態，並在60℃的烘箱內通氣/乾燥12小時。向所得乾燥物中加入純水，以將其含水量調整為60％，並使用混合器(三英製作所製造，商品名萬能攪拌混合機，鉤狀槳葉轉速為126rpm，90分鐘)研磨，獲得磨碎的纖維素(平均聚合度220，平均粒徑9.1μm，膠態纖維素成分含量66.1質量％，可溶於二乙醚的物質的含量0.03質量％，纖維素I結晶含量78％)。
然後，將5質量％的該磨碎的纖維素懸浮並溶解在製備例1中獲得的粗酶的50mM的乙酸-乙酸鈉緩衝液(pH4.8)中。將這樣獲得的混合物(共計25mL)放置在玻璃瓶中。將該玻璃瓶放置在55℃的恆溫振蕩水槽中，在90rpm的振蕩速度下反應。在開始反應後的固定的一段時間中，分配300μL仍處於懸浮狀態的反應溶液。使用超濾組件(截流分子量10000)除去酶和未分解的纖維素後，通過高效液相色譜分析所得溶液的糖濃度。得到的結果如表2中所示。
反應溶液中的纖維寡糖和葡萄糖通過高效液相色譜(柱AsahipakNH2P-50(商品名，島津製作所製造)，高效液相色譜SCL-10A型(商品名，島津製作所製造)，移動床乙腈/水＝75/25(體積比)，循環量1mL/min，樣品溶液10μL)進行定量分析。
表中的反應時間是生成的糖(纖維寡糖和葡萄糖)的總量與所用纖維素的量之間的比達到20質量％時所需要的反應時間。寡糖的選擇性通過用(纖維二糖濃度+纖維三糖濃度)/總糖濃度×100(％)計算的值表達。
(實施例7)除了將水解條件變為使用鹽酸濃度為5N的鹽酸溶液在18℃下進行12小時之外，使用與實施例1中相同的方法對可商業獲得的源於針葉樹的溶解漿(平均聚合度781，可溶於二乙醚的物質的含量1.1％，平均粒徑174μm)進行水解。與實施例1相似，洗滌並過濾所得酸不溶性殘餘物，以獲得溼濾餅(平均聚合度690，可溶於二乙醚的物質的含量0.7質量％，平均粒徑49.8μm)。將該溼濾餅製成纖維素濃度為10％的水分散液。使用超高性能分散機/溼式粉磨機(Ashizawa製造，商品名Pearl Mill RL，氧化鋁珠直徑2mm，填充率80％)對該水分散液進行壓密/研磨處理，以獲得纖維素微粒分散體(平均聚合度690，可溶於二乙醚的物質的含量0.7質量％，平均粒徑7.1μm，膠態成分含量87.5質量％，纖維素I晶體含量77％)。此外，使用與實施例6相似的方式酶分解獲得的溼濾餅。得到的結果如表2中所示。
在實施例7中，對與實施例6中的纖維素相比具有較小平均粒徑和較高的膠態成分含量的纖維素進行酶分解。與實施例6相比，縮短了反應時間，改善了寡糖的選擇性。
(實施例8)以與實施例1中相同的方法使用實施例6中獲得的纖維素溼濾餅並使用製備例3中獲得的純化酶進行酶分解。得到的結果如表2中所示。
實施例8使用的酶具有比實施例6中使用的酶小的活性比(β-葡糖苷酶活性/結晶性纖維素分解活性)。雖然通過改變酶延長了反應時間，但是選擇性得到了改善。
(實施例9)將可商業獲得的源於針葉樹的溶解漿(平均聚合度781，可溶於二乙醚的物質的含量1.1質量％，平均粒徑174μm)在105℃下攪拌水解30分鐘。使用吸濾器過濾所得酸不溶性殘餘物，並在70L純水中洗滌四次，以獲得固體含量為40.1％的溼濾餅(平均聚合度220，平均粒徑69.1μm，膠態成分含量13.4質量％，可溶於二乙醚的物質的含量0.03質量％，纖維素I晶體含量85％)。使用該纖維素溼濾餅並以與實施例6中相同的方法使用製備例3中獲得的純化酶進行酶分解。得到的結果如表2中所示。
實施例9使用的酶具有比實施例6使用的酶小的活性比(β-葡糖苷酶活性/結晶性纖維素分解活性)，並且與實施例6相比，實施例9使用的纖維素具有更大的平均粒徑和更小的膠態成分含量。雖然通過改變酶和基質延長了反應時間，但是選擇性得到了改善。
(實施例10)使用實施例6中獲得的纖維素溼濾餅並以與實施例6中相同的方法使用製備例2中獲得的酶進行酶分解。得到的結果如表2中所示。
實施例10使用的酶具有比實施例6中使用的酶大的活性比(β-葡糖苷酶活性/結晶性纖維素分解活性)。雖然改變酶後反應時間與實施例6中的相等，但是降低了選擇性。
(比較例4)使用實施例6至實施例9中使用的可商業獲得的紙漿(平均聚合度781)，而進行水解。向該紙漿中加入純水(固體含量40質量％)，並使用與實施例6相同的方法進行研磨處理，以獲得溼濾餅(平均聚合度781，平均粒徑49.3μm，膠態纖維素成分含量10.2質量％，可溶於二乙醚的物質的含量0.9質量％，纖維素I晶體含量85％)。使用該溼濾餅並以與實施例6相同的方法進行酶分解。得到的結果如表2中所示。
比較例4使用的纖維素的平均聚合度超出了本發明的範圍，而平均粒徑和膠態纖維素成分含量在本發明的範圍內。與各實施例相比，延長了反應時間並降低了纖維寡糖的選擇性。
(比較例5)將通過實施例6中的步驟獲得的溼濾餅製成纖維素濃度為10％的水分散液。使用目徑為45μm的網篩對該水分散液進行溼法分離。將殘存在網篩上的固體物質(平均聚合度220，平均粒徑103.4μm，膠態成分含量9.7質量％，可溶於二乙醚的物質的含量0.03質量％，纖維素I晶體含量85％)用作基質，並使用與實施例6相同的方法進行酶分解。得到的結果如表2中所示。
比較例5使用的平均聚合度和可溶於二乙醚的物質的含量在本發明的範圍內，而平均粒徑超出了本發明的範圍，膠態成分含量小於本發明的範圍。與各實施例相比，在比較例5中，反應時間變慢，纖維寡糖的選擇性達不到各實施例所達到的水平。


(實施例11)在28℃下將裡氏木黴NBRC31329在馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基上培養7天。生成的孢子以106個孢子/mL懸浮在2ml 100mM的磷酸鈣緩衝液(pH7)中，並加入24μl的EMS(甲磺酸乙酯)。在28℃下振蕩該混合物16小時，從而對該混合物施加誘變處理。通過離心分離從該孢子懸浮液中收集孢子，然後在100mM的磷酸鈣緩衝液(pH7)中充分洗滌，並稀釋為100～300個孢子/板。在28℃下將該稀釋液在下述培養基中培養5天，所述培養基為將1g葡萄糖、1g酵母膏、2g(NH4)2SO4、4g KH2PO4、2g Na2HPO4、200mg MgSO4·7H2O、1mg CaCl2·2H2O、TritonX-100、1mL痕量元素(通過將6mg硼酸、26mg四水合鉬酸銨、100mg六水合氯化鐵(III)、40mg五水合硫酸銅、8mg四水合硫酸錳和200mg七水合硫酸鋅溶解在總量為100mL的純水中獲得)和20g瓊脂溶解並懸浮在1L純水中，再進行高壓消毒，並通過使用薄膜過濾器過濾進行消毒。測量所得培養溶液的B-葡糖苷酶活性和結晶性纖維素分解活性，以選擇突變株裡氏木黴GL-1。該突變株根據布達佩斯條約從2005年4月15日起保藏在獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏所(International Patent Organism Depositary National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology)(AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashil-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566，Japan)，保藏登記號為FERMBP-10323。
(實施例12)在25℃下將裡氏木黴NBRC31329和在實施例11中獲得的突變株GL-1各自在馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基上培養7天，以充分形成孢子。將1鉑環量孢子接種在下述培養基中，並在28℃、攪拌下培養5天，所述培養基為將1.0g多聚蛋白腖、0.5酵母膏、2.0g KH2PO4、1.5g(NH4)2SO4、0.3g MgSO4·7H2O、0.3g CaCl2·2H2O、1.0ml Tween 80(半井化學藥品(株)製造)、1.0ml痕量元素溶液(通過將6mg H3BO4、26mg(NH4)6Mo7O24·4H2O、100mg FeCl3·6H2O、40mg CuSO4·5H2O、8mg MnSO4·4H2O和200mg ZnSO4·7H2O溶解並懸浮在100ml水中獲得)和7.5g酒石酸溶解並懸浮在1L水中，然後將pH調整為4.0，將其中100mL分配到500mL的錐形瓶中，再加入1g結晶性纖維素(旭化成化學株式會社製造，商品名PH-101)，並進行高壓消毒。在第五天，離心分離該培養溶液。測量所得上清液在40℃下的纖維素酶活性和β-葡糖苷酶活性。得到的結果如表3中所示。
(實施例13)將裡氏木黴NBRC31329接種到馬鈴薯葡萄糖培養基(Difco製造)中，並在37℃下培養7天。將取自該培養基表面的一鉑環量孢子接種在下述培養基中，並在28℃下預培養3天，所述培養基為將1g多聚蛋白腖、0.5g酵母膏、2g磷酸一鉀、1.5g硫酸銨、0.3g硫酸鎂、0.3g氯化鈣、1mL痕量元素(通過將6mg硼酸、26mg四水合鉬酸銨、100mg六水合氯化鐵(III)、40mg五水合硫酸銅、8mg四水合硫酸錳和200mg七水合硫酸鋅溶解在總量為100mL的純水中獲得)和1mL AdecanolLG-109懸浮並溶解在總量為1L的純水中，再將其中的100mL分配到500mL的錐形瓶中，二者中均加入1g結晶性纖維素(旭化成化學株式會社製造，商品名PH-101)，並進行高壓消毒。此外，將30mL預培養溶液接種到5L廣口發酵罐中，該發酵罐中盛有與上述培養基組成相同的培養基，在溫度為28℃、攪拌速率為400rpm、通氣速率為0.5vvm的條件下進行培養。培養期間使用NaOH溶液將最小pH控制為3.0。培養5天後，離心分離所得溶液，獲得作為粗酶的上清液。通過上述方法，測量獲得的酶溶液的結晶性纖維素分解活性和β-葡糖苷酶活性。培養期間pH隨時間的變化如圖1所示，活性測量的結果如表4中所示。
(實施例14)當使用與實施例13相同的方法對裡氏木黴NBRC31329進行培養時，使用NaOH將培養期間的最低pH控制為2.5，獲得粗酶溶液。通過上述方法測量獲得的酶溶液的結晶性纖維素分解活性和β-葡糖苷酶活性。培養期間pH隨時間的變化如圖1所示，活性測量的結果如表4中所示。
(比較例6)當使用與實施例13相同的方法對裡氏木黴NBRC31329進行培養時，使用NaOH將培養期間的最低pH控制為3.5或4或5，獲得粗酶溶液。通過上述方法測量獲得的酶溶液的結晶性纖維素分解活性和β-葡糖苷酶活性。培養期間pH隨時間的變化如圖1所示，活性測量的結果如表4中所示。
(實施例15)使用與實施例13相同的方法培養實施例11中獲得的GL-1菌株。當培養該菌株時，使用NaOH將培養期間的最低pH控制為3或4，獲得粗酶溶液。培養期間pH隨時間的變化如圖2所示。
(實施例16)向8ml 5質量％的結晶性纖維素(通過使用126rpm的萬能攪拌混合機(商品名，三英製作所製造)的鉤狀槳葉捏合併攪拌含水量被調整為60％的Ceolus PH-101(商品名，旭化成化學株式會社製造)90分鐘而獲得)中分別加入2mL在實施例13和實施例15中獲得的纖維素酶粗酶溶液，並在55℃、攪拌的條件下進行水解。反應2小時、4小時、6小時、8小時後，將該混合物在95℃加熱15分鐘，以結束酶反應。通過離心分離得到清液，使用上述HPLC法測量該上清液的纖維寡糖濃度和葡萄糖濃度。得到的結果如圖3中所示。
(比較例7)當使用與實施例16相同的方法酶分解結晶性纖維素時，將比較例6中獲得的纖維素酶用作粗酶溶液。結果如圖3中所示。



(實施例17)將可商業獲得的結晶性纖維素(旭化成化學株式會社製造，商品名PH-101)製成固體含量為10質量％的水分散液，並使用珠磨機(AshizawaFinetech製造，商品名Pearl Mill RL5，容積5L，研磨介質直徑為1mm的氧化鋯珠，轉速1800rpm，在容器內的停留時間70分鐘)進行溼磨。然後，向100ml所獲磨碎的纖維素水分散液(平均聚合度220，平均粒徑0.7μm，膠態纖維素含量54質量％，可溶於二乙醚的物質的含量0.03質量％，纖維素I晶體含量75％)中加入200mL粗酶溶液，所述粗酶溶液是通過利用超濾(截流分子量13000)濃縮實施例15中pH為3時培養的上清液(體積濃縮為原來的五分之一)而獲得的。通過加入50mM的乙酸/乙酸鈉緩衝液(pH 4.5)將其總體積調整為500mL。將該混合物放到1L玻璃可分燒瓶中，在使用3-1 Motor(商品名)進行內部攪拌下，使其在55℃的溫浴中反應。在反應開始兩小時後，分配300μm仍處於懸浮狀態的反應溶液。使用超濾組件(截流分子量10000)除去酶和未分解的纖維素後，通過高效液相色譜分析所得溶液的糖濃度，從而定量分析反應溶液中存在的纖維素殘餘物。結果，在反應兩小時後，纖維素分解速率為82％，寡糖的選擇性為81％。
(實施例18)將實施例17中獲得的磨碎的纖維素水分散液放在與實施例17相同的燒瓶中，並在與實施例17相同的條件下，使用反應槽來進行反應，在所述反應槽中安裝了截流分子量為13000的聚丙烯腈制中空超濾組件(旭化成化學株式會社製造，商品名Microza ACP-0013)。在使反應溶液在壓力為0.1MPa、循環流速為4L/小時下在超濾組件中循環的同時，使反應進行2小時。測量通過超濾獲得的透過液的糖濃度，從而定量分析反應溶液中存在的纖維素殘餘物。
結果，纖維素的分解率為95質量％，寡糖的選擇性為85％。
(實施例19)除了將反應溶液中纖維素濃度設定為2.5質量％之外，使用與實施例18相同的設備進行酶分解。在酶分解期間，纖維素的分解率通過對透過液的分析來測量。將該反應進行24小時，同時加入磨碎的纖維素水分散液，以便將反應溶液中的纖維素濃度恆定保持為2.5質量％。使用與實施例18相同的方法測量透過液中的糖濃度，從而定量分析反應溶液中存在的纖維素殘餘物。
結果，纖維素的分解率為98質量％，寡糖的選擇性為92％。
(實施例20)通過離子交換樹脂(三菱化學製造，商品名DIAION WA30和SK1B)除去實施例19中獲得的纖維寡糖水溶液中的乙酸，然後在60℃下乾燥8小時，並在研缽中粉碎，以獲得纖維寡糖粉末。按照《日本藥典》(第14版，廣川書店出版)的結晶性纖維素純度試驗(2)中所規定的可溶於二乙醚的物質的定量分析方法，測量該粉末中可溶於二乙醚的物質的含量。獲得的可溶於二乙醚的物質的含量為200ppm。
(比較例8)使用家用混合器粉碎可商業獲得的未漂白的溶解漿(源於Spuruce，平均聚合度1680，平均粒徑128μm，膠態纖維素含量4質量％，可溶於二乙醚的物質的含量1.5質量％，纖維素I晶體含量85％)。向作為基質的所獲得的經粉碎的纖維素中加入pH為5.5的乙酸緩衝液，以製備纖維素含量為2質量％的水分散液。在上述纖維素水分散液中，以基於所述水分散液為0.1質量％的濃度溶解可商業獲得的纖維素酶(合同酒精製造，商品名GODO-TCD)，並使用與實施例17中相同的方法，在pH為5.0下進行酶分解24小時。結果，纖維素的分解率為29質量％，寡糖的選擇性為55％。使用與實施例20相同的方法粉碎該纖維寡糖水溶液，並測量其可溶於二乙醚的物質的含量。可溶於二乙醚的物質的含量為3200ppm。
工業實用性通過本發明的方法獲得的纖維寡糖不僅優選用作普通食品的原料，還優選用作保健食品的原料、化學轉化的原料如用於合成醫藥中間體和其它化學品的材料，以及食品、藥物和一般工業製品領域中用於發酵的原料。
權利要求
1.一種生產纖維寡糖的方法，所述方法包括在纖維素酶的存在下酶分解水不溶性天然纖維素類物質，所述水不溶性天然纖維素類物質具有小於或等於700的平均聚合度、小於或等於100μm的平均粒徑並且可溶於二乙醚的物質的含量小於1質量％。
2.一種生產纖維寡糖的方法，所述方法包括在纖維素酶的存在下酶分解水不溶性天然纖維素類物質，所述水不溶性天然纖維素類物質具有小於或等於700的平均聚合度，含有大於或等於10質量％的膠態纖維素成分，並且可溶於二乙醚的物質的含量小於1質量％。
3.如權利要求1或2所述的生產纖維寡糖的方法，其中所述水不溶性天然纖維素類物質的平均粒徑小於或等於100μm，並包含大於或等於10質量％的膠態纖維素成分。
4.如權利要求1至3任一項所述的生產纖維寡糖的方法，其中所述水不溶性天然纖維素類物質的平均聚合度小於或等於500，並且平均粒徑小於或等於50μm。
5.如權利要求1至4任一項所述的生產纖維寡糖的方法，其中所述水不溶性天然纖維素類物質的平均聚合度小於或等於400，並且平均粒徑小於或等於30μm。
6.如權利要求1至5任一項所述的生產纖維寡糖的方法，其中所述水不溶性天然纖維素類物質包含大於或等於15重量％的膠態纖維素成分。
7.如權利要求1至6任一項所述的生產纖維寡糖的方法，其中所述纖維素酶的活性比(溫度為55℃時的β-葡糖苷酶活性/結晶性纖維素分解活性)小於或等於0.7。
8.如權利要求7所述的生產纖維寡糖的方法，其中所述纖維素酶的活性比小於或等於0.5。
9.如權利要求8所述的生產纖維寡糖的方法，其中所述纖維素酶的活性比小於或等於0.35。
10.如權利要求1至9任一項所述的生產纖維寡糖的方法，其中所述可溶於二乙醚的物質為木質素。
11.如權利要求1至10任一項所述的生產纖維寡糖的方法，其中所述水不溶性天然纖維素類物質包含纖維素I型晶體。
12.一種如權利要求1至11任一項所述的纖維素酶的生產方法，其中，在通過培養生產纖維素酶的細菌而獲得的培養液中，β-葡糖苷酶活性與結晶性纖維素分解活性的活性比(溫度為40℃時的β-葡糖苷酶活性/結晶性纖維素分解活性)小於或等於0.5。
13.如權利要求12所述的纖維素酶的生產方法，其中β-葡糖苷酶活性與結晶性纖維素分解活性的活性比小於或等於0.35。
14.如權利要求12或13所述的纖維素酶的生產方法，其中所述生產纖維素酶的細菌是作為生產β-葡糖苷酶少的菌株而選擇得到的菌株。
15.如權利要求12至14任一項所述的纖維素酶的生產方法，其中在培養所述生產纖維素酶的細菌時，將培養期間的pH控制為小於3.5。
16.如權利要求12至15任一項所述的纖維素酶的生產方法，其中所述生產纖維素酶的細菌是屬於木黴菌屬的菌株。
17.一種纖維寡糖，其特徵在於，所述纖維寡糖可溶於二乙醚的物質的含量小於或等於2000ppm。
18.通過如權利要求1至11任一項所述的方法獲得的纖維寡糖，其特徵在於可溶於二乙醚的物質的含量小於或等於2000ppm。
19.如權利要求18所述的纖維寡糖，其中所述可溶於二乙醚的物質的含量小於或等於1000ppm。
20.一種食品、化妝品或藥用製劑，其特徵在於包含通過如權利要求1至11任一項所述的方法獲得的纖維寡糖。
21.一種食品、化妝品或藥用製劑，其特徵在於包含如權利要求17或18所述的纖維寡糖。
全文摘要
本發明提供了一種生產纖維寡糖的方法，所述方法包括在纖維素酶的存在下酶分解水不溶性天然纖維素類物質，所述水不溶性天然纖維素類物質具有小於或等於700的平均聚合度、小於或等於100μm的平均粒徑並且可溶於二乙醚的物質的含量小於1質量％。本發明還提供了一種生產纖維寡糖的方法，所述方法包括在纖維素酶的存在下酶分解水不溶性天然纖維素類物質，所述水不溶性天然纖維素類物質具有小於或等於700的平均聚合度，含有大於或等於10質量％的膠態纖維素成分，並且可溶於二乙醚的物質的含量小於1質量％。
文檔編號C12N9/42GK1989254SQ20058002535
公開日2007年6月27日 申請日期2005年7月26日 優先權日2004年7月27日
發明者山崎有亮, 伊吹一郎, 井阪光二 申請人:旭化成化學株式會社