苦瓜中的口服活性成分,其活性肽,及它們治療糖尿病的用途的製作方法

2023-06-09 18:12:51

專利名稱：苦瓜中的口服活性成分,其活性肽,及它們治療糖尿病的用途的製作方法
技術領域：
本發明領域是糖尿病。
背景技術：
非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM或II型糖尿病)是居美國第四位導致死亡的原因，在全世界有5-7％的人口受它的困擾，並且在西方國家中它的影響日漸嚴重。患糖尿病時，或者身體不能產生足夠的胰島素，或者產生的胰島素無效，導致血液中葡萄糖水平升高，這種疾病醫學上稱為高血糖症。儘管任何年齡的人都有可能患糖尿病，但多數糖尿病患者的年齡超過45歲。此病似乎有家族性，並且體重超標的個體發病的危險率增加。
糖尿病是一種慢性病，無法根治並且伴發其它幾種疾患。它是導致25-74歲年齡段人失明的主要原因。10％的糖尿病患者並發腎病。糖尿病是導致非創傷性下肢切除最常見的原因。糖尿病患者腿切除的危險率增加30倍。糖尿病患者並發心臟疾病的危險率增加2-4倍，並且中風的可能性增加5倍。
導致糖尿病的原因還不清楚，遺傳因素和環境因素似乎均起作用。有兩種糖尿病胰島素依賴性(I型)和非胰島素依賴性(II型)。I型糖尿病是自身免疫疾病，常發生於兒童和青年。導致I型糖尿病的自身抗原還不知道，患者的存活依賴每日靜脈注射胰島素。
II型糖尿病是由於機體不能產生足夠量的胰島素或者雖然能產生胰島素但是不能恰當地使用從而導致的新陳代謝疾病，它被認為是最常見的糖尿病類型。儘管知道缺乏胰島素的分泌和對胰島素的抗性是導致II型糖尿病的主要原因，但是其中的精確的遺傳因素目前還不清楚。糖尿病患者通常有下列一種或幾種缺陷。它們是胰臟產生的胰島素過少；肝臟分泌的葡萄糖過量；骨骼肌利用葡萄糖功能障礙；葡萄糖轉運蛋白(Glut-1，Glut-2)功能障礙；胰島素受體失敏和多糖代謝分解功能障礙。
目前臨床除了靜脈注射胰島素外還應用四類口服降血糖藥。簡述如下

上表清楚地表明目前可用於治療糖尿病的每種藥物都有一定的缺陷。因此人們一直有興趣鑑定和研製用於治療糖尿病的新藥。
苦瓜是一種果實可作為蔬菜的熱帶植物。一些研究小組已經報導了苦瓜在哺乳動物模型(Shibib等，生物化學雜誌，292，267-270(1993)；Ali等，植物醫學，59408-412(1993)；Akhtar等，植物醫學，42205-212(1981))和人體(Leatherdale等，英國醫學雜誌，2821823-1824(1981)；Aslam等，Lancet，I.607(1979))中的降血糖活性。但是其中的降血糖成分及作用機理還不清楚。
從苦瓜中分離出一種具有類胰島素活性的11kDal肽的報導見於Khanna等，「植物來源的多膚P的降血糖活性」，美國藥學會第20屆年會，Purdue University，West Lafayette，1979年7月29日-8月3日；Baldwa等，Upsala J.Med.Sci.(1977)8239-41和美國專利第3945988號。在所有這些報導中，這種類胰島素多肽都不是口服給藥，即是靜脈注射或皮下注射。
最近的一篇報導指出，苦瓜的乙醇粗提取物能夠通過刺激肝臟中的糖原合成而部分地降低血漿中葡萄糖水平，而不象是作為刺激胰島素分泌的藥物(Sarkar等，藥學研究(Pharmacol.Res.)，33，1-4(1996))。
發明概述提供了一種苦瓜的水溶性組分(MC6)和它的製備方法及在治療高血糖症中的用途。MC6的特徵是在SDS-PAGE凝膠電泳上以單一條帶形式泳動，分子量小於10kDal，小於重組胰島素。它含三種肽，無高分子量蛋白質汙染。同時提供的還有MC6的一種特定肽成分，標為MC6.1，還提供了MC6.1的肽衍生物MC6.2和MC6.3，它們的長度小於MC6.1，表現出降血糖活性，可以口服給藥來治療多種高血糖症。
附圖簡述

圖1A顯示了苦瓜的各種水溶性成分在SDS-20％-PAGE凝膠電泳中的結果；圖1B顯示純化過的MC6製備物；圖1C顯示了MC6的HPLC分析結果。
圖2A圖示了未純化的苦瓜含水提取物和對照組在一段時間內對SD大鼠血糖水平的作用；圖2B圖示了口服給藥的MC6在一段時間內對SD大鼠血糖水平的作用。
圖3A-B圖示了MC6對SZC誘導患糖尿病的大鼠血糖水平的作用。
圖4圖示了口服給藥的MC6不使血清中胰島素的水平升高。
圖5圖示了口服給藥的MC6與靜脈注射的重組胰島素有著相同的降血糖效果。
圖6(a)-(b)顯示了MC6.1在4-20％tris-甘氨酸梯度凝膠上的SDS-PAGE分析結果(分別用考馬斯亮蘭和銀染染色)。
圖7圖示了用C18 RP-HPLC柱純化MC6.1的結果。
圖8(a)-(b)顯示了MC6.1的等電點分析結果。
圖9顯示了MC6.1的核磁共振分析結果。
圖10圖示了MC6.1對血糖水平的作用。
圖11圖示了MC6.1、MC6.2和MC6.3在正常大鼠口服葡萄糖耐受實驗中的降血糖活性。
圖12圖示了MC6.2對糖尿病大鼠的降血糖作用。
圖13圖示了MC6.2對非肥胖型糖尿病大鼠的降血糖作用。
具體實施方案的詳述本發明提供了苦瓜的一種水溶性成分MC6，MC6的一種活性肽成分MC6.1以及MC6.1的肽衍生物MC6.2和MC.3，它們的製備方法及在治療高血糖症中的用途。MC6的特徵是它含三種肽，在SDS-PAGE凝膠電泳上以單一條帶形式一起泳動，分子量10kDal，比重組胰島素小。MC6和MC6.1表現出降血糖活性並且具有口服活性。在對本發明後面的敘述中，將對MC6和MC6.1的特性，以及它的製備方法及在治療高血糖症中的用途，尤其是在治療人糖尿病患者中的用途作具體描述。
MC6.2和MC6.3分別是MC.1這種18胺基酸肽的11胺基酸和7胺基酸肽衍生物。
在進一步敘述本發明之前，應當說明，本發明並不僅限於下面敘述的實施特例，因為實施特例可以有一些變化但仍然在下面所附的權利要求範圍內。還需要說明的是在此用到的術語只是為了描述實施特例，並非為了限制。所以本發明的範圍以所附的權利要求書為準。
應當說明的是在本實施特例和權利要求書中，除非上下文清楚指明，單數形式「一個(種)」，「這個(種)」均有其複數對應形式。除非指明，所有的科學和技術術語都具有本發明所屬領域普通技術人員的理解相同的含義。
本發明中的MC6是植物品種苦瓜中的一種水溶性成分或提取物。儘管MC6可以從苦瓜的一種或多種組織或組成中得到，包括葉、莖、根、果實、種子及其它組織，甚至整株苦瓜，但MC6通常從苦瓜果實、尤其是已與種子分離的未成熟果實中得到。
MC6的特徵是在SDS-20％PAGE凝膠電泳上呈單一條帶，該單一條帶分子量小於10kDal(SDS-20％PAGE凝膠的電場強度100V)。MC6比重組胰島素小，因此應小於約6kDal。MC6的進一步特徵在於，經過C8或C18進行反相高效液相色譜(HPLC)柱層析，MC6洗脫為三個峰。在此條件下，第一峰在11.33分鐘時流出，第二峰在25.35分鐘時流出，第三峰在34.67分鐘時流出。
本發明中的MC6是不包含高分子量汙染物(如蛋白質)的製劑，在本申請中高分子量汙染物指分子量大於約50kDal的分子。通常MC6中不包含分子量大於10kDal的任何汙染物。
MC6對哺乳動物有降血糖活性。降血糖活性是指哺乳動物經MC6處理後血糖的水平下降，並且血糖水平下降的量與處理哺乳動物的MC6的量成比例。口服給藥和靜脈內給藥均有降血糖的活性，也就是說MC6具有口服活性或口服生物可獲得性，即它在經過哺乳動物胃腸道時不失去活性。
MC6可利用任何一種能從苦瓜組織中分離MC6的簡便方法製備。一種能從苦瓜組織中得到MC6的方法是首先在一種溶劑(如磷酸鹽緩衝液(PBS)、水或者其它溶劑)中利用攪拌器或其它浸漬方法將組織浸漬得到組織的粗懸物。然後將所得懸浮液中的顆粒物與液相分離並去掉，這一步可以通過離心來實現，常用轉速在10,000-16,000rpm之間，再將上清用孔徑在0.5-0.10μ範圍內的濾膜過濾，常用0.45-0.22μ的濾膜，可在真空下過濾。再將得到的過濾液依次通過30kDal和10kDal的截留膜，得到包含MC6的初始苦瓜組織水溶性組分，在本領域中已知這類膜，代表性的膜包括Amicon分子量截留膜等。得到的水溶性組分可馬上使用或者進一步處理以便後面使用，這種進一步處理可包括脫水如冷凍乾燥等。得到的水溶性成分也可以在有防腐劑如苯甲酸鈉等的存在下，在1-5℃，常在2-4℃的條件下，以液態形式保存。
MC6.1是MC6中的一種特殊肽成分，它在SDS-PAGE凝膠電泳(4-20％tris-甘氨酸梯度凝膠電泳)上呈現單一條帶，通過SDS-PAGE凝膠電泳判斷其分子量小於2.5kDal。MC6.1的等電點是8.2。它有18個胺基酸，序列如下K-T-N-M-K-H-M-A-G-A-A-A-A-G-A-V-V-G(SEQ ID NO01)MC6.1在哺乳動物中有降血糖的活性。本發明中的MC6.1是從其天然環境中分離出來的MC6.1，如存在於MC中的，是分離或純化形式的，等。
同時還提供了有降血糖活性的MC6.1肽類似物或模擬物。MC6.1的肽類似物或模擬物將包含至少8個胺基酸，通常不少於約12個胺基酸，最常見的是至少約18個但少於約40個胺基酸(通常少於30個)作為活性基元序列。其中某一種11胺基酸的MC6.1肽衍生物MC6.2有如下的序列K-T-N-M-K-H-M-A-G-A-A(SEQ ID NO02)另一個7胺基酸的衍生物有如下的序列K-T-N-M-K-H-M(SEQ ID NO03)可以理解，在本該序列中最多可以有三個置換或缺失，但變化的胺基酸的個數不能超過活性基元內胺基酸總數的約20％，通常不超過約10％。優選的是本領域內熟知的保守性置換，包括大的疏水組內的置換異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸；絲氨酸和蘇氨酸間；甘氨酸和丙氨酸間；天冬醯氨和穀氨醯氨間；天冬氨酸和穀氨酸間；賴氨酸、精氨酸和組氨酸間。
除了從其天然來源純化得到，MC6.1及其肽類似物或模擬物如MC6.2和MC6.3也可以用傳統技術製備，如合成(例如使用Beckman 990型多肽合成儀或其它商業合成儀)。肽也可以用重組的方法直接製備(Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，CSHL出版社，冷泉港，紐約，1989)或產生融合蛋白質，例如與作為特定結合對成員之一的蛋白質融合的蛋白質，然後通過親和物將融合蛋白質純化出來，再經過蛋白水解切割，通常在事先設計好的位點切割，以獲得目的蛋白質。(例如Driscoll等，1993，分子生物學雜誌，232342-350)。
寡肽(即MC6.1、MC6.1的類似物或模擬物)可以被延伸以便提供方便的連接位點，如半胱氨酸或賴氨酸，以增加穩定性、與特異受體結合、提供定點作用、簡便純化、改變物理性狀(如溶解度、帶電性等)和穩定構型等。寡肽可以藉助連接基團或半胱氨酸介導的共價連接(二硫鍵)或肽鍵而連接在側翼的非野生型區域上，形成融合蛋白質。寡肽也可以藉助多種雙功能試劑如順丁烯二醯亞胺苯甲酸、甲基二巰基乙酸、巰基苯甲酸、S-吡啶基二巰基丙酸等連接。寡肽還可以連接到胺基酸鏈N端或C端的單個胺基酸上，也可以內部連接。例如，本發明肽可以共價連接到一個免疫原蛋白質上，如匙孔蝛血藍蛋白、卵清蛋白等，以協助產生針對本發明寡肽的抗體。
另外，本發明寡肽也可以與其它蛋白質或肽結合起來表達，成為該鏈的內部或N端或C端一部分。還可以進行一些表達後的修飾，例如設計合適的編碼序列，就可以進行法呢基化、異戊二烯基化，使本發明肽能夠在一端結合脂類基團，並且能夠插入到脂膜如脂質體中。
本發明寡肽可以被聚乙二醇化，其中聚乙烯氧基能夠增加其在血流中的半衰期。本發明寡肽還可以與其它蛋白質組合，如與免疫球蛋白同種型的Fc組合，以促進補體結合，或者同蓖麻蛋白、相思豆毒素、白喉毒素等毒素尤其是它們的A鏈組合。本發明寡肽可以與抗體連接以執行定向作用。連接技術，參見如美國專利第3817837，3853914，3850752、3905654，4156081，4069105，和4043989號；均引入本文作為參考文獻。
本發明中的MC6、MC6.1、MC6.2(及其類似物和模擬物)可用於治療以血糖水平較高為特徵的疾病，如高血糖疾病，例如糖尿病(包括I型和II型)和其它高血糖相關的疾病如肥胖症、腎膽固醇升高相關的疾病等。「治療」意味著給予MC6、MC6.1、MC6.2、MC6.3(及其類似物和模擬物)，以至少降低高血糖疾病宿主的血糖水平。在應用MC6和本發明寡肽對高血糖疾病的治療中，宿主接受的MC6或寡肽的量足以使其血糖水平降低到容許的範圍(容許的範圍是指宿主正常血糖的平均值的±10％，一般±8％，通常在±5％)。
本發明中可以對多種宿主進行處理，以降低其血糖水平，它們有哺乳動物，包括家畜、珍貴或稀少的動物、寵物如狗和貓，以及人。
最令人感興趣的是治療人類高血糖疾病，如糖尿病(包括I型和II型)的方法，其中將MC6、MC6.1、MC6.2、MC6.3及其類似物和模擬物給予高血糖疾病患者，以至少使其血糖水平下降，其中血糖水平下降到人正常血糖範圍附近。儘管活性藥物可以通過上述任何一種方便的途徑給予人體，但最令人感興趣的是口服給予活性藥物。
為了用組分MC6或者肽MC6.1、MC6.2和/或MC6.3進行治療，活性化合物可以通過任何一種方便的途徑給予患高血糖疾病的宿主，如靜脈注射、皮內注射、肌肉內注射、皮下注射和口服等等，其中口服途徑給藥是最令人感興趣的。給予宿主的劑量必須根據給藥途徑確定，一般對體重70千克的人給藥約50-500毫克(通常在100-200毫克之間)。在用MC6治療高血糖疾病患者時，活性成分或化合物的給藥量一般是約50-500毫克/70kg人體重，通常是100-200毫克/70kg人體重。
按照本發明，在應用此活性成分或化合物時，它們可以與生理學上可接受的載體結合，形成藥物組合物。與活性成分或化合物可以結合形成藥物組合物的生理學上可接受載體的性質必須由該藥物組合物預定的給藥途徑決定，可列舉的載體包括水，例如注射用無菌水、鹽水等。最令人感興趣的是造用於口服給藥的生理學上可接受載體。在本領域中熟知這類載體，包括水，如去離子水；鹽溶液，如磷酸鹽緩衝液，片狀或膠囊狀的凍乾粉，這類形式可以包括填充劑、結合劑等。藥物組合物中存在活性成分的量由其給藥方式決定，可由本領域技術人員經驗性地確定。
治療中，MC6.2和/或MC6.3及其寡肽類似物或模擬物可以口服給藥、局部給藥或者不經過胃腸道給藥，如在一些特殊的部位注射，例如皮下注射、腹膜內注射、靜脈注射、鼻內注射以及經皮注射等。口服給藥的劑型包括以上提到的適合於MC6使用的那些。注射用劑型中包括生理學上可接受的介質，如水、鹽溶液、磷酸鹽緩衝液、含水乙醇、含水乙二醇等。可利用的水溶性防腐劑包括亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、抗壞血酸鹽、潔爾滅、氯代丁醇、硫柳汞、硼酸苯汞、對羥基苯甲酸酯類、苄基醇和苯乙醇。這些藥劑分別可以佔到重量的約0.001-5％，優選0.01-2％。適於使用的水溶性緩衝劑包括鹼或鹼土碳酸鹽、磷酸鹽、碳酸氫鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽、醋酸鹽、琥珀酸鹽等，如磷酸鈉、檸檬酸鈉、硼酸鈉、醋酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鈉。添加劑如羧甲基纖維素可作為載體使用，用量為重量的約0.01-5％。劑型可以根據目的不同，用於調整受體活性的具體方式、擬用治療等而不同。劑型可包括貼劑、膠囊、脂質體、緩釋包裝、丸劑或者為了連續給藥而製成灌注液。具體劑量可根據本領域的常規方法經驗性確定。參見如Harrison’s，《內科學原理》，11版，Braunwald等編，McGraw Hill Book Co.，Mew York，1987。
通常地，活性成分或肽，其類似物或模擬物的治療有效劑量的範圍約在0.005-10毫克每千克宿主體重，更普遍的約在0.01-1毫克每千克宿主體重。這樣的劑量將足以取得期望的降血糖活性。給藥的頻率可以是每天給藥(通常不超過每天一次或每天多次)，甚至長達一周一次，這要根據所給藥物的水平來確定。所給的寡肽量通常根據此肽的半衰期來調整，當肽有延長的半衰期或者以長效製劑的形式給藥時，它的劑量就可以取此範圍的下限部分，例如，將含有顆粒的緩釋組合物引入可延期維持肽的基質(如膠原基質)中，在相當長的時間裡利用泵將肽以基本比較連續的速度注入體內，諸如此類。Heeler，受控藥物送遞中的可生物降解性聚合物，《治療性藥物載體系統CRC評述》，第1卷，CRC出版社，Boca Raton，FL，1987，第39-90頁中描述了受控藥物送遞的膠囊化。DiColo(1992)生物材料，13850-856中描述了由疏水性聚合物控制的藥物釋放。
下面的例子作為例舉而不是為了限制。例1A. 分離和純化苦瓜提取物中的活性成分新鮮未成熟的苦瓜果實洗淨，擦乾，去掉種子。果漿在磷酸鹽緩衝液或去離子水中混勻。懸浮物於12,000xg離心，然後在真空下通過0.22μ的無菌濾膜(得自Whatman)過濾。澄清上清再依次通過30kDal、10kDal和3kDal的截留膜(得自Amicon filtration)。用SDS-20％-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析經過0.45μ(第一步)、0.22μ(第二步)和10kDal(第三步)的截留膜而流出的組分，結果顯示在圖1A中。第三步純化後組分顯示為小於人類胰島素的單一條帶。從凝膠電泳分析可以明顯看出，純化後組分不包含各種高分子量的蛋白質條帶。純化了幾批克級水平的10K截留組分標為MC6，見圖1B。得到的純化組分被凍幹，以獲得去除游離水的MC6。
對100-500毫克的凍幹MC6經過高效液相色譜(HPLC)(利用C8或C18柱，用TFA/乙腈線性梯度進行的反相HPLC)分析，結果見圖1C。HPLC分析結果顯示有保留時間分別為17.35、25.35和34.67分鐘的三個主峰，說明MC6包含三種肽。B.MC6的降血糖活性將純化後組分的降血糖活性與起始的粗提物製劑比較。SD大鼠(平均體重200克，得自Charles River，MA)飢餓3小時後，從尾靜脈取血，以測量基礎血糖水平。每隻大鼠口服給予5毫升粗提物或1毫升純化後的於磷酸鹽緩衝液中的MC6組分(在A部分中製備)(500克)。對照動物接受同體積的磷酸鹽緩衝液。用硫戊巴比妥(suritol)麻醉大鼠(腹膜內注射)(0.08μg/ml/kg，萘心安(1.7μg/min/kg))。將導管插入每隻大鼠的頸靜脈，灌注溶在5mM氯化鉀和140mM氯化鈉溶液中的葡萄糖(18mg/min/kg體重)3小時。在30、60、90、150、180分鐘時從頸動脈取血。血糖水平用Kadish等(臨床化學(1968)，14116)敘述的量熱測定法測定。
結果顯示在圖2A中。結果顯示接受粗提物的動物在各個檢測點的血糖水平均有顯著下降，60分鐘時效果就已經很好(相對差別幾乎達100％)。在平行實驗中，如圖2B所示，1毫升在磷酸鹽緩衝液中的MC6純化水溶液組分(500克)口服給藥，其效果與粗提物的效果類似，暗示分離後的MC6多肽混合物是粗提物中的主要活性成分。C.MC6的預防和治療效果進行下面一系列實驗，以驗證純化組分在動物模型上對糖尿病的預防和治療效果。用鏈脲黴素(40mg/千克體重)(得自Sigma Chem.，MO)誘導雄性SD大鼠(每隻200-225克)發生糖尿病。在預防模型中，動物從第0天開始，每天口服接受1毫升(500克)純化過的MC6組分。在治療模型中，動物從第5天開始發病後口服接受1毫升(500克)純化過的MC6組分。在15天內每天觀察血糖的水平。如圖3A和3B所示，純化後的MC6組分有很好的預防和治療效果(第10天時p＜0.001)。
MC6對鏈脲黴素誘導的糖尿病的良好預防效果很好地支持了它對於治療I型自身免疫糖尿病的適用性。D.MC6對血清中胰島素水平的作用在C部分敘述的實驗中，在不同的天數測量血清中胰島素的水平，以觀察在降血糖過程中MC6在調節全身性胰島素中起的作用。血清中胰島素水平的定量測定採用的是放免方法(LINKO實驗)(如Hales Randle，生物化學雜誌(1963)88137所述)。圖4顯示了口服給藥並不提高血清中胰島素的水平，說明此組分的作用並不是通過胰臟分泌胰島素來實現。圖4中，糖尿病是鏈脲黴素誘導的。未處理組只接受磷酸鹽緩衝液，SZC組接受40毫克每千克的鏈脲黴素；預防組從第一天開始口服MC6；治療組從第5天開始接受MC6。胰島素用常規的放免法測定。數據顯示的是三個平行測定的平均值。E.口服給藥MC6與系統注射胰島素有相同的療效在接下去的實驗中，將SD大鼠口服純化過的MC6(500克)與靜脈注射胰島素(150mU)的結果進行比較。動物被分成四組，飢餓3小時。第一組只接受磷酸鹽緩衝液，第二組在灌注葡萄糖前60分鐘口服MC6；第三組在頸靜脈灌注葡萄糖後60分鐘靜脈注射150mU重組胰島素(Humalin-R，Novo-Nordisk)；第四組在頸靜脈灌注葡萄糖後60分鐘接受溶於1毫升磷酸鹽緩衝液的純化過的MC6(500克)(靜脈注射)。所有組中葡萄糖均以18毫克/分鐘/千克灌注。在不同的時間間隔從頸動脈取血，用量熱術定量測定血糖的水平。
結果見圖5。結果顯示，在120分鐘內，口服MC6有著與靜脈注射重組胰島素相似的效果。而且系統注射此組分和重組胰島素有著相同的降血糖曲線。說明純化組分經口服和系統給藥均有活性。F.MC6.1的特性對MC6.1進一步在4-20％tris-甘氨酸梯度凝膠上進行SDS-PAGE分析，用考馬斯亮蘭或銀染顯示分開的條帶。結果見圖6a和6b。G.進一步純化MC6.1MC6.1用C18反相高效液相色譜進一步純化和分析(梯度0.1％TFA緩衝液A；60％乙腈於0.1％TFA中)，結果見圖7。H.MC6.1的等電點對MC6.1進行等電點分析，結果為8.2。見圖8a和8b。I.MC6.1的核磁共振分析對MC6.1進行質子核磁共振分析，結果見圖9。J.MC6.1的降血糖活性MC6.1降血糖活性的檢測類似於上面例B。使用體重平均為220克的SD雄性大鼠。給大鼠口服50微克MC6.1(500μl)。對照組接受PBS。結果見圖10。顯示MC6.1口服後有降血糖活性。例2圖11顯示MC6.1和它的衍生物MC6.2、MC6.3在正常大鼠口服葡萄糖耐受實驗中的降血糖活性。實驗中這三種多肽與載體處理組相比均有效地降低了血糖的水平。
MC6.2(11個胺基酸的肽)的降血糖活性在糖尿病大鼠上進一步驗證。給平均體重在200克的SD大鼠以40毫克每千克體重的量注射鏈脲黴素。如圖12所示，以100微克/只大鼠(0.5毫克/千克體重)的劑量給糖尿病大鼠(平均血糖330mg/dl)口服MC6.2後，其血糖水平比對照組顯著下降。
在非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠上實驗MC6.2(11個胺基酸的肽)的降血糖活性。如圖13所示，NOD小鼠每天口服MC6.2，對其血糖水平的影響比載體處理組動物更為顯著。
這些結果證明，MC6.1的N端7-11個胺基酸殘基對於降低血糖水平比較重要，可用於開發用於治療人類糖尿病的藥物中。
以上的結果和討論明確說明，本發明提供了一種可用於治療高血糖疾病，尤其是糖尿病的新的苦瓜提取物和特殊肽藥物。因為本發明中的活性物不導致體內產生的胰島素量升高，因此它提供了另外一種調節血糖水平的機制。此外，由於MC6和肽MC6.1、MC6.2、MC6.3有口服活性，它們比傳統上用於糖尿病治療的胰島素產品更具優勢，因為傳統藥物必須通過更具侵害性且更為不便的方式給藥，如靜脈注射。
本詳述中引用的論文和專利申請在此處引用作為參考，就象每一單獨的論文和專利申請被分別引用作為參考。任一篇引用的文獻僅僅因為其公開早於此申請，並不應該解釋為因為有前人發明而承認本發明不能早於這些文獻。
儘管為了清楚理解的目的，本發明通過圖和例子進行了一些詳細的描述。但是很明顯，對於本領域普通技術人員來說，根據本發明教導，可以在不脫離所附權利要求的精神和範圍的前提下進行某些改變和調整。
序列表(1)一般資料(i)申請人Natpro，Inc(ii)發明題目苦瓜中的口服活性成分，其活性多肽，及它們治療糖尿病的用途(iii)序列數3(iv)聯繫地址(A)收信人Fish Richardson，P.C.
(B)街道2200 Sand Hill Road，Suite 100(C)城市Menlo Park(D)州名加利福利亞(E)國家美國(F)郵政編碼(ZIP)94025(v)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC可兼容機(C)作業系統DOS(D)軟體FastSEQ for Windows Version 2.0(vi)目前申請資料(A)申請號未知(B)提交日期1998年4月1日(C)分類(vii)以前申請資料(A)申請號08/850,855(B)提交日期1997年5月2日(A)申請號08/831,039(B)提交日期1997年4月1日(viii)代理/代理信息(A)姓名Suyat，Reginald J(B)登記號28，172(C)參考/備案號08948/006WO1(ix)通訊信息(A)電話650-322-5070(B)傳真650-854-0875(C)電報(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特徵(A)長度18個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO1Lys Thr Asn Met Lys His Met Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val1 5 10 15Val Gly(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特徵(A)長度11個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO2Lys Thr Asn Met Lys His Met Ala Gly Ala Ala1 5 10(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特徵(A)長度7個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO3Lys Thr Asn Met Lys His Met1 權利要求
1.水溶性組分MC6。
2.按照權利要求1的組分，其特徵在於在SDS-20％-PAGE凝膠電泳中遷移為單一條帶。
3.按照權利要求2的組分，其中所說的單一條帶分子量小於10kDal，並且比重組胰島素更小。
4.按照權利要求1的組分，其中包括三種肽。
5.按照權利要求1的組分，其有降血糖活性，且口服給藥具有活性。
6.水溶性組分MC6，其特徵在於在SDS-20％-PAGE凝膠電泳中遷移為分子量小於10kDal的單一條帶，其中包括三種肽，有降血糖活性，口服給藥有活性。
7.包含存在於生理學上可接受載體內的MC6的藥物組合物。
8.按照權利要求7的藥物組合物，其中所說的生理學上可接受載體是一種能口服的載體。
9.按照權利要求8的藥物組合物，其中所說的能口服的載體包括去離子水或磷酸鹽緩衝液。
10.降低宿主血糖水平的方法，所述方法包括給該宿主施用MC6。
11.按照權利要求10的方法，其中所說的MC6存在於生理學上可接受載體內。
12.按照權利要求10的方法，其中所說的施用是口服或者靜脈內注射給藥。
13.按照權利要求10的方法，其中所說的宿主患有高血糖疾病。
14.按照權利要求13的方法，其中所說的高血糖疾病是糖尿病。
15.按照權利要求14的方法，其中所說的糖尿病是I型糖尿病。
16.按照權利要求14的方法，其中所說的糖尿病是II型糖尿病。
17.降低患有高血糖疾病的哺乳動物宿主內血糖水平的方法，所述方法包括給該宿主口服含有MC6的藥物組合物。
18.按照權利要求17的方法，其中所說的哺乳動物宿主是人。
19.按照權利要求18的方法，其中所說的高血糖疾病是糖尿病。
20.按照權利要求19的方法，其中所說的糖尿病選自I型糖尿病和II型糖尿病。
21.降低因患糖尿病而有高血糖症的人體內血糖水平的方法，所述方法包括給該宿主口服含有MC6的藥物組合物。
22.按照權利要求21的方法，其中所說的糖尿病選自I型糖尿病和II型糖尿病。
23.選自MC6.1、MC6.2、MC6.3及它們的類似物或模擬物的一種肽。
24.按照權利要求23的肽MC6.1，其具有胺基酸序列K-T-N-M-K-H-M-A-G-A-A-A-A-G-A-V-V-G (SEQ ID NO01).
25.按照權利要求23的肽MC6.2，其具有胺基酸序列K-T-N-M-K-H-M-A-G-A-A(SEQ ID NO02).
26.按照權利要求23的肽MC6.3，其具有胺基酸序列K-T-N-M-K-H-M(SEQ ID NO03).
27.含有於生理學上可接受載體內的肽MC6.1、MC6.2、MC6.3、它們的類似物或模擬物或者其混合物的藥物組合物。
28.降低宿主血糖水平的方法，所述方法包括給該宿主施用權利要求27的藥物組合物。
29.按照權利要求28的方法，其中的施用是口服或者靜脈內注射給藥。
30.按照權利要求28的方法，其中所說的宿主患有高血糖疾病。
31.按照權利要求30的方法，其中所說的高血糖疾病是糖尿病。
32.按照權利要求31的方法，其中所說的糖尿病是I型糖尿病或II型糖尿病。
全文摘要
提供了苦瓜的一種水溶性提取物稱為MC6,它的製備方法及在治療高血糖症中的使用方法。有活性的MC6的特徵是在SDS－PAGE凝膠電泳上以單一條帶形式遷移,分子量小於10kDal,包含三種肽。同時提供的還有MC6的肽成分,稱為MC6.1,以及MC6.1的衍生物和模擬物。活性MC6、MC6.1、MC6.2、M6.3有降血糖作用,口服給藥後也有這種活性。同時提供的還有利用這些活性藥物治療高血糖疾病的方法,尤其是糖尿病,其中優選口服給予這些活性藥物。
文檔編號A61K38/17GK1255044SQ98805001
公開日2000年5月31日 申請日期1998年4月1日 優先權日1997年4月1日
發明者B·納格, S·麥迪徹拉, S·D·沙瑪 申請人:卡裡克斯治療公司