靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物的製備方法、其產品及含有該產品的注射劑的製作方法
2023-06-15 19:27:06
專利名稱：靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物的製備方法、其產品及含有該產品的注射劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種耙向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物的製備方法，具 體涉及氯化兩面針鹼與單壁碳納米管的水溶性複合物的製備方法；本發明 還涉及由這種方法製得的靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物以及以該 產品為活性成分的注射劑。
背景技術：
氯化兩面針鹼(l，英文名nitidine chloride),結構如下述l式所示， 為苯並菲啶類生物鹼，黃色或淡黃綠色針狀結晶。1980年，黃志勳等(化 學學報，1980， 38 (6): 535.)從芸香科花椒屬植物兩面針(Zanthoxylum nitidum (Roxb.) DC)根的乾燥粉末中分離得到氯化兩面針鹼以及其它5 種生物鹼，並通過動物實驗發現氯化兩面針鹼能夠延長艾氏腹水癌小鼠的 生命，對小鼠艾氏腹水癌的抑制率達到279%，對小鼠肝癌腹水也有效。氯 化兩面針鹼具有廣譜的抗腫瘤活性，對Lewis肺癌、鼻咽癌、肝癌、乳腺 癌和慢性細胞型白血病等均有治療效果。formula see original document page 5
我們對氯化兩面針鹼的抗腫瘤活性進行了初步的研究，發現其抗癌活
性很強，對口腔上皮癌KB細胞(時珍國醫國藥，2007， 9: 2104)、乳腺癌 MDA-MB-231、肝癌bel-7402、鼻咽癌ECV2和7111 (華西藥學雜誌，2007， 22(5):514)、舌癌Tca8113和肺癌spc-a-l(中國藥理學通報，2007， 23(2): 279)等均有明顯的抑制率，其IG。為0. 28 2. 7 u g/mL，且對耐藥株KBV200 (中國藥理學與毒理學雜誌，2007， 21(6): 512)也有較強的殺傷作用，能 夠引起腫瘤細胞凋亡，在抗腫瘤治療方面具有非常廣泛的開發利用價值和 應用前景。但是，氯化兩面針鹼存在水溶性差(0.2 mg/mL)和毒副作用 較強的缺點，這就極大地限制了氯化兩面針鹼在抗腫瘤治療藥物方面的研 究、開發和應用。碳納米管(carbon nanotubes， CNT)是一類具有完美石墨結構的管 形碳材料，包括單壁碳納米管(single-walled CNT， SWNT)和多壁碳納 米管(multi-walled CNT， MWNT)，均具有優異的導電性、電磁特性和力 學性能，在儲氫和光電轉換功能材料等方面的應用得到了極大的發展；並 且由於碳納米管在細胞和生物體內具有很低的細胞毒性和很好的生物兼 容性(Nature, 2008， 3: 216)，這使得它在生物和醫學領域獲得了廣泛 的應用研究，例如在生物傳感器、藥物載體、體內成像和分子診斷以及DNA 調整等方面的應用。其中，單壁碳納米管(S麗T)的外徑範圍為O. 5 3. 0 mn，長度範圍為1.0 15.0 " m，經過氧化或超聲剪裁後，可以獲得更短 的單壁碳納米管。經修飾後的單壁碳納米管可以增加藥物在水溶液中的溶 解度，而且可以實現該藥物對腫瘤組織的被動靶向給藥，降低毒副作用。 目前有關抗癌藥氯化兩面針鹼與單壁碳納米管的水溶性複合物及其製備 方法，尚未有公開的成果和技術報導。
發明內容
本發明要解決的技術問題是針對現有技術中抗腫瘤藥物氯化兩面針 鹼存在的水溶性差和毒副作用較大的不足，提供一種溶解度大、毒副作用 小的靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物的製備方法及其產品，以及含有 該產品的注射劑。
本發明靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物的製備方法，將氯化兩面 針鹼進行預處理得到羧酸修飾的氯化兩面針鹼，然後用雙親性聚合物對裁 剪至20 500 nm長的單壁碳納米管的外壁進行非共價功能化修飾；再將 羧酸修飾的氯化兩面針鹼與功能化修飾後的單壁碳納米管通過酯化和醯 胺化反應進行偶聯，即得到靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼與單壁碳納米管 的水溶性複合物。
優選的靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物的製備方法為包括以下
步驟，其中步驟(1)和步驟(2)可以不分前後
(1)氯化兩面針鹼的預處理
① 在惰性氣體保護下，將氯化兩面針鹼加入到濃的氫滷酸中，使氯化
兩面針鹼的濃度為1. OX 10" 1. 0 mol/L,邊攪拌邊升溫到50 200 。C反 應l 72h，反應結束後，以氨水調節混合溶液的pH值為鹼性，用二氯甲 烷溶劑對反應混合物反覆萃取三次，將水相溶劑蒸乾，剩餘物用甲醇或乙 醇溶解，加鹽酸調節pH值為2 3，放置，析晶，即得到C-8和/或C-9 位置的甲氧基被羥基取代的氯化兩面針鹼晶體；
② 將上述得到的羥基取代的氯化兩面針鹼與二元羧酸或羥基羧酸化 合物按1:1 1:20的摩爾比溶解在極性溶劑中，反應0.5 48h後，蒸乾 溶劑，所得固體以去離子水溶解，過濾，所得沉澱溶解於丙酮中，然後緩 慢加入去離子水，放置，析晶，即得到C-8和/或C-9位置被二元羧酸或 羥基羧酸酯化的氯化兩面針鹼晶體；
6(2)單壁碳納米管的功能化修飾
① 將單壁碳納米管的長度裁剪至20 500 nm備用，優選裁剪至50 200 nm;
② 將兩親表面活性劑與二元羧酸或羥基羧酸按1:1 1:20的摩爾比 溶解在除水除氧的有機溶劑中，反應2 72h後，蒸乾溶劑，所得固體溶 解於去離子水中，以超濾膜透析6 96 h，固體以真空冷凍乾燥法製成粉 末，得到乾燥的羧酸修飾的兩親表面活性劑；
③ 在惰性氣體保護下，在冰浴或冰鹽浴中，將上述獲得的羧酸修飾 的兩親表面活性劑和活化劑按1: 1 10:1的摩爾比溶解於除水除氧的有機 溶劑中，充分攪拌0.5 6 h;然後加入催化劑和聚乙二醇修飾劑，繼續 攪拌反應6 72 h;反應結束後，將有機溶劑蒸乾，加入去離子水進行充 分溶解，接著以孔徑為0.22 um的微孔濾膜過濾除去催化劑，以超濾膜 透析6 72 h除去過量的聚乙二醇修飾劑，得到聚乙二醇修飾劑進一步修 飾的兩親表面活性劑溶液；所述加入的催化劑與羧酸修飾的兩親表面活性 劑的摩爾比為1:10 1:1，所述加入的聚乙二醇修飾劑與羧酸修飾的兩親 表面活性劑的摩爾比為1:10 10:1;
將經過剪裁的單壁碳納米管與步驟③中所得到的聚乙二醇修飾劑 進一步修飾的兩親表面活性劑溶液加入到適量除水除氧的有機溶劑中，使 單壁碳納米管的濃度為0. 01 20. 0 mg/mL,聚乙二醇修飾劑進一步修飾的 兩親表面活性劑的濃度為O. 1 10.0 mmol/mL;超聲振蕩30 1000 min， 頻率為40 100kHz，然後將混合溶液在10000Xg 30000Xg的離心力下 離心1 24 h，接著以超濾膜透析6 72 h來除去過量的聚乙二醇修飾劑 進一步修飾的兩親表面活性劑，乾燥，即得到非共價功能化修飾的水溶性 單壁碳納米管；
(3)在惰性氣體保護下，將步驟(1)得到的經羧酸修飾的氯化兩面 針鹼，與非共價功能化修飾的水溶性單壁碳納米管，溶解在適量除水除氧 後的有機溶劑中，使經羧酸修飾的氯化兩面針鹼的濃度為0. 1 50.0 mmol/L，非共價功能化修飾的水溶性單壁碳納米管的濃度為10 1000 mg/L;然後加入活化劑和催化劑，充分攪拌反應0.5 48h後，向混合反 應液中加入pH為7.2 7.4的1XPBS磷酸鹽緩衝溶液，以3 10 kDa 的超濾膜透析1 48 h除去未參與反應的羧酸修飾的氯化兩面針鹼，收集 產物，乾燥，即得到靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼與單壁碳納米管的水溶 性複合物；所述加入的活化劑與經羧酸修飾的氯化兩面針鹼的摩爾比為 1:1 5:1，所述加入的催化劑與經羧酸修飾的氯化兩面針鹼的摩爾比為 1:1 5:1。
上述製備方法中，
所述的惰性保護氣體為氮氣、氦氣、氖氣或氬氣； 所述的濃氫滷酸為選自濃鹽酸、濃氫溴酸和濃氫碘酸中的任意一種；所述的二元羧酸為選自草酸、丙二酸、丁二酸、戊二酸、己二酸、庚 二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、順丁烯二酸、鄰苯二甲酸以及對苯二酸 中的任意一種；
所述的羥基羧酸為選自酒石酸、檸檬酸以及蘋果酸中的任意一種； 所述的極性溶劑為選自醯胺類、氯仿、吡啶、吡咯、二甲基亞碸(DMSO) 中的任意一種；
所述的除水除氧的有機溶劑為選自烷烴、滷代垸、苯、垸基苯、滷代 苯、腈類、醯胺類、酯類、二甲基亞碸、吡啶、吡咯、二硫化碳、四氫呋 喃、四氫化萘、十氫化萘以及六氫吡啶中的任意一種；
所述活化劑為選自N，N'-二環己基碳二亞胺(DCC)、 N，N'-二異丙基 碳二醯亞胺(DIC)和1_(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽 (EDC)中的任意一種；
所述的催化劑為選自4-羥基苯並三唑(H0Bt)、 4-二甲氨基吡啶 (DMAP)、2-(7-偶氮苯並三氮唑)-N， N， N， ， N，-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU) 以及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)中的任意一種。
其中，步驟(1)的第①步中，以氨水調節混合溶液的pH值為鹼性， 優選調節該混合溶液的pH值為9 10。
其中，步驟(2)的第①步中，所述的單壁碳納米管可以是由化學氣 相沉積法(CVD)、催化熱解、電弧放電、模板法或高壓一氧化碳歧化法 (HiPco)製備得到的、外徑尺寸為0.5 3.0nm，長度尺寸為1. 0 15. 0 lim的單壁碳納米管；
單壁碳納米管的剪裁方法可以是超聲波振蕩、強氧化劑處理中的單獨 一種或者兩種方法聯合使用；其中，超聲波剪裁方法具體可為將單壁碳 納米管進行超聲波振蕩10 2000 min，頻率為40 100 kHz，抽濾， 以去離子水反覆洗滌至中性，乾燥，以得到所需長度的單壁碳納米管；強 氧化劑剪裁方法具體可為將單壁碳納米管與強氧化劑溶液混合，在20 200 t溫度下反應10 1000 min;抽濾，以去離子水反覆洗滌至中性， 乾燥，以得到所需長度的單壁碳納米管；
所述強氧化劑處理時使用的強氧化劑可以是濃硝酸、1:10 10:1摩 爾比的硝酸和硫酸的混合溶液、1:10 10:1摩爾比的過氧化氫和硫酸的 混合溶液、1:10 10:1摩爾比的高錳酸鉀和硫酸的混合溶液或者是 1:10 10:1摩爾比的高錳酸鉀和硝酸的混合溶液。
其中，步驟(2)的第②步中，所述的兩親表面活性劑是指一端為疏 水基，另一端為胺基或羥基的表面活性劑；具體可以是選自生物素聚乙二 醇胺基(Biotin-PEG-,2，分子量為2 5 kDa)、 Fmoc-NH-聚乙二醇胺基 (FM0C-NH-PEG-NH2 ，分子量為5 kDa ) 、 Fmoc-NH-聚乙二醇羥基 (FM0C-NH-PEG-0H，分子量為5 kDa)、 二硬脂醯甘油磷脂醯乙醇胺-聚乙 二醇胺基(DSPE-PEG-NH2，分子量為3 10 kDa)以及二硬脂醯甘油磷脂醯乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG，分子量為3 10 kDa)中的任意一種；
所述的羧酸修飾的兩親表面活性劑是指二元羧酸或羥基羧酸的羧基 與兩親表面活性劑的端羥基或端胺基發生發生酯化或者醯胺化反應生成
白勺聚合物。
其中，步驟(2)的第③步中，所述的聚乙二醇修飾劑為選自分子量 為5 40 kDa的多臂聚乙二醇胺基、分子量為5 40 kDa的多臂聚乙二醇 羥基、分子量為2 10 kDa的a，"-雙端胺基聚乙二醇(NH2-PEG_NH2) 以及分子量為2 7 kDa的a-羥基-"-胺基聚乙二醇(HO-PEG-NH2)中的 任意一種。
本發明還包括由上述製備方法製備得到的水溶性抗腫瘤藥氯化兩面 針鹼複合物。
本發明還提供一種靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物注射液，它含
有
(a) 0. 1 10 g/L的靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼與單壁碳納米管 的水溶性複合物；
(b) 藥學上可接受的溶劑或輔料。 其中溶劑為注射用水，輔料為聚醚F-68。
耙向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物注射液的製備方法為先取適量 聚醚F-68配製質量百分比為0. 1 10%的聚醚F-68水溶液，再稱取適量 靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼與單壁碳納米管的水溶性複合物溶於聚醚 F-68水溶液中，使其濃度為O. 1 10 g/L，定量灌封，即得成品注射液。
本發明還提供一種耙向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物粉針劑，它是 由耙向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼與單壁碳納米管的水溶性複合物和水溶 性藥用輔料製備而成，其中耙向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼與單壁碳納米管 的水溶性複合物的質量百分比含量為0. 1 10%。
其中，所述水溶性藥用輔料為磷酯、聚醚F-68、支架劑和膽固醇； 或者是磷酯、聚醚F-68、支架劑和單硬酸甘油酯。輔料中，所述磷脂可 為大豆卵磷脂或蛋黃卵磷脂；所述支架劑為選自葡萄糖、乳糖、氨基乙酸、 山梨糖和山梨醇中任意一種。
當粉針劑由靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼與單壁碳納米管的水溶性 複合物(以下簡稱水溶性複合物)與磷酯、聚醚F-68、支架劑和膽固醇為 組分製備時，其各組分的質量百分比含量如下水溶性複合物0.1 10%; 磷脂5. 0 60%;聚醚F-68 0. 5 腦;支架劑5. 0 40%;膽固醇1. 0
它採用薄膜-超聲分散法製備，具體製備方法如下
按上述質量百分比分別稱取水溶性複合物、磷酯、聚醚F-68、和膽固 醇溶於適量有機溶劑中(以剛好溶解為宜)，以旋轉蒸發儀在20 80。C下 減壓回收溶劑，在瓶壁上形成類脂薄膜；然後加入適量pH為6. 5的水溶 液將類脂膜洗脫並分散至水溶液中，所得的脂質體溶液以細胞破碎儀設定超聲時間和功率進行處理，再以0.22 um微孔濾膜進行過濾，最後向溶 液中加入上述質量百分比的支架劑，在_60 一5(TC和0. 1 0. 5 MPa下 真空冷凍乾燥，所得的產品定量裝瓶，即得成品粉針劑。
當粉針劑由水溶性複合物與磷酯、聚醚F-68、支架劑和單硬酸甘油酯 為組分製備時，其各組分的質量百分含量如下水溶性複合物0.1 10%; 磷脂5. 0 60%;聚醚F-68 0. 5 10%;支架劑5. 0 40%;單硬酸甘油酯 5.0 60%。它採用高壓均質法製備，具體製備方法如下
按上述質量百分比分別稱取水溶性複合物、磷脂、聚醚F-68和單硬 酸甘油脂溶於適量有機溶劑中(以剛好溶解為宜)，以旋轉蒸發儀在20 80。C下減壓回收溶劑，在瓶壁上形成類脂薄膜；然後加入適量pH為6.5 的水溶液輕搖，將類脂膜洗脫並分散至水溶液中，將所得的固體納米粒溶 液注入高壓均質機中，設定壓力和循環次數進行處理，再以0. 22 p m微孔 濾膜進行過濾，最後向溶液中加入上述質量百分比的支架劑，在_60 一 5(TC和0. 1 0.5 MPa下真空冷凍乾燥，所得的產品定量裝瓶，即得成品 粉針劑。
上述薄膜-超聲分散法和高壓均質法中，所述的有機溶劑為選自乙酸 乙酯、乙醚、乙醇、甲醇和氯仿中的任意一種。
由本發明提供的方法製得的靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼與單壁碳 納米管的水溶性複合物在水生理環境下表現出良好的溶解性(其溶解度可 達5.0mg/mL，是普通氯化兩面針鹼的25倍)、穩定性和生物兼容性，在 抗腫瘤藥物治療方面擁有十分突出的優點
1、 對單壁碳納米管進行功能化修飾所使用的聚合物均為低毒和生物 兼容的，在增加該複合物的親水性的同時，減少血漿蛋白與該複合物相互 作用的機率，降低被單核吞噬細胞系統(MPS)吞噬的可能性，延長氯化 兩面針鹼複合藥物的血液循環半衰期；
2、 控制單壁碳納米管的長度尺寸，以實現該藥物複合物對腫瘤組織 的被動靶向性，改善氯化兩面針鹼在體內的分布，提高藥效的同時降低氯 化兩面針鹼的毒副作用；
3、 氯化兩面針鹼與單壁碳納米管偶聯的酯鍵在體內組織中被羧酸酯酶 水解後，釋放出氯化兩面針鹼；
4、 由於氯化兩面針鹼與單壁碳納米管複合物的體積較大，因而可以減 緩該複合藥物被腎、肝等網狀內皮吞噬系統(RES)器官濾出的速度，延 長其血液循環半衰期；
5、 單壁碳納米管具有很低的細胞毒性和很好的生物兼容性，釋放藥物 後逐漸被人體代謝排出。
本發明所提供的靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼與單壁碳納米管的水 溶性複合物具備高溶解性、低毒性等特點，可作為氯化兩面針鹼的替代品 應用於臨床，為氯化兩面針鹼的臨床試用提供了新的水溶性複合物。
10
圖1為實驗例中各分組給藥10天後，處死小白鼠後剝離的瘤體的形貌 圖片。
其中A為空白對照組；B為普通氯化兩面針鹼組；C為本發明提供的 複合物注射液實驗組；D為陽性對照組。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步說明。在以下各實施例中所涉及的 百分數均為質量百分數，即為單個組分佔全部組分之和的質量百分數。 實施例1
一靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物的製備。
(1) 氯化兩面針鹼的預處理
在氮氣保護下，準確稱取氯化兩面針鹼加入到適量的濃氫碘酸中，使
氯化兩面針鹼的濃度為0.001 mol/L，邊攪拌邊升溫到50 °C;反應6 h 後冷卻至室溫，以氨水調節混合溶液的pH約為10，利用二氯甲烷反覆萃 取混合溶液三次，將水相的溶劑蒸乾，剩餘物用甲醇溶解，加鹽酸調節pH 為2.5，放置後析出針狀晶體，即為C-8和/或C-9位置的甲氧基被羥基取 代的氯化兩面針鹼晶體。
準確稱取上述針狀晶體和丙二酸(摩爾比為1:1)加入到150 mL的三 口燒瓶中，再加入50 mL的吡啶，在室溫下攪拌反應20 h後，在真空條 件下蒸乾吡啶。所得的固體以20 mL去離子水溶解，攪拌20min後過濾， 將沉澱溶解在丙酮中，然後緩慢加入去離子水，對析出的晶體進行乾燥， 即得到C-8和/或C-9位置被丙二酸酯化的氯化兩面針鹼。
(2) 單壁碳納米管的功能化修飾
首先將單壁碳納米管進行超聲波振蕩300 min，頻率為100 kHz。抽 濾，乾燥後即得到20 200 nm的單壁碳納米管。
準確稱取生物素聚乙二醇胺基(Biotin-PEG-NH2,分子量為5 kDa) 和丙二酸(摩爾比為1:1)加入到150 mL的三口燒瓶中，再加入50 mL 氯仿，在室溫下攪拌反應24h;反應結束後，蒸乾氯仿，所得固體溶解在 去離子水中，以3 kDa的MWCO超濾膜透析36 h後，將所得的固體進行冷 凍乾燥即得丙二酸修飾的Biotin-PEG-NH2。
準確稱取丙二酸修飾的Biotin-PEG-NH2和活化劑N， N' -二環己基碳 二亞胺(摩爾比為1:1)溶於50 mL的氯仿中，攪拌2 h;再加入與丙二 酸修飾的Biotin-PEG-麗2的摩爾比均為1:1的催化劑4-羥基苯並三唑和 六-臂聚乙二醇胺基(6-Arm-PEG_NH2， 10 kDa)在冰鹽浴條件下攪拌反應 6h，在室溫下繼續攪拌反應36h;然後將溶劑蒸乾，加入去離子水進行 充分溶解，接著以孔徑為0.22 um的微孔濾膜過濾除去活化劑N，N' -二環己基碳二亞胺和催化劑4-羥基苯並三唑，以15 kDa的MWC0超濾膜透析 20 h除去過量的6-Arm-PEG-NH2，即得到六-臂聚乙二醇胺修飾的生物素聚 乙二醇胺基(Biotin-PEG-6-Arm-(PEG-NH2))。
將Biotin-PEG-6-Arm-(PEG-NH2)和剪裁好的單壁碳納米管加入到氯 仿中，使得Biotin-PEG-6-Arm-(PEG-順2)的濃度為0.5隱ol/mL，單壁碳 納米管的濃度為0. 5 mg/mL,超聲振蕩120 min，頻率為100 kHz,然後將 混合溶液在26000Xg離心力條件下進行離心8 h，接著以100 kDa的麗CO 超濾膜透析24 h除去未反應的Biotin_PEG-6-Arm-(PEG-NH2)，乾燥後即 可獲得Biotin-PEG-6-Arm-(PEG-NH2)修飾的水溶性單壁碳納米管。
(3)將丙二酸修飾的氯化兩面針鹼與Biotin-PEG-6-Arm-(PEG-順2)修
飾的單壁碳納米管複合
在氮氣保護下，稱取丙二酸修飾的氯化兩面針鹼和
Biot in-PEG-6-Arm- (PEG-NH2)修飾的單壁碳納米管加入到250 mL三口燒瓶 中，加入適量除水除氧後的二甲基亞碸進行溶解，使丙二酸修飾的氯化兩 面針鹼衍生物的濃度為0. 5 mmol/L， Biotin-PEG-6-Arm-(PEG-NH2)修飾的 單壁碳納米管的濃度為100mg/L;然後加入與丙二酸修飾的氯化兩面針鹼 的摩爾比均為1:1的活化劑1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽 酸鹽和催化劑N-羥基琥珀醯亞胺，充分攪拌反應12h後，向混合反應液 中加入pH為7. 2的1 XPBS磷酸鹽緩衝溶液，以3 kDa的麗C0膜透析20 h除去沒有參與反應的丙二酸修飾的氯化兩面針鹼，收集產物，乾燥，即 得到靶向性抗腫瘤藥靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼與單壁碳納米管的水 溶性複合物。
二靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物注射液的製備。
取0. 5 g聚醚F-68溶於500 mL的注射用水中，得到質量百分比為0. 1% 的聚醚F-68水溶液，備用；準確稱取0.5 g本實施例製得的耙向性抗腫 瘤藥氯化兩面針鹼與單壁碳納米管的水溶性複合物於500 mL的容量瓶中， 以配好的聚醚F-68水溶液定容配製成500 mL注射液，定量灌封為2 mL/ 支的注射液，每支含靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼與單壁碳納米管的水溶 性複合物2 mg。
實施例2
一靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物的製備。
重複實施例1靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物的製備方法，不同 的是，以二硬脂醯甘油磷脂醯乙醇胺-聚乙二醇胺基(DSPE-PEG-NH2， 10 kDa)替代生物素聚乙二醇胺基(Biotin-PEG-NH2，分子量為5 kDa)，以 4-臂聚乙二醇胺基(4-Arm-PEG-NH2 ， 5 kDa)替代六-臂聚乙二醇胺基 (6-Arm-PEG-NH2， 10 kDa)。
二靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物注射液的製備。
取16. 3 g聚醚F-68溶於800 mL的注射用水中，得到質量百分比為
122%的聚醚F-68水溶液，備用；準確稱取2.0 g本實施例製得的靶向性抗
腫瘤藥氯化兩面針鹼與單壁碳納米管的水溶性複合物於500 mL的容量瓶 中，以配好的聚醚F-68水溶液定容配製成500 mL注射液，定量灌封為2 mL/ 支的注射液，每支含靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼與單壁碳納米管的水溶 性複合物8 mg。
三溶解度的測定。
將一定量本實施例製備得到的靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼與單壁 碳納米管的水溶性複合物溶於5 mL去離子水中，100 kHz頻率下超聲振蕩 到不再溶解，過濾，將所得複合物溶液以紫外可見分光光度計進行測試， 可以得到該複合物中氯化兩面針鹼與單壁碳納米管的重量比約為1:1，其 中氯化兩面針鹼的溶解度為5. 0 mg/mL，是普通氯化兩面針鹼(0. 2 mg/mL) 的25倍。
實施例3
一靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物的製備。
重複實施例1中靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物的製備方法，不 同的是，以己二酸替代丙二酸。
二靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物粉針劑的製備。
取本實施例製得的靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼與單壁碳納米管的 水溶性複合物(0.1%)、蛋黃卵磷脂(50%)、膽固醇(20%)和聚醚F-68 (5%)溶於適量乙酸乙酯中，以旋轉蒸發儀在40 。C下減壓回收溶劑，在 瓶壁上形成有類脂薄膜；然後加入適量pH為6. 5的水溶液，將類脂膜洗 脫並分散至水溶液中，所得的脂質體溶液以細胞破碎儀在400 w功率下超 聲30min，以孔徑為0.22 Pm的微孔濾膜過濾，最後向溶液中加入葡萄 糖(24.9%)，充分溶解後，在一5(TC和0. lMPa條件下真空冷凍乾燥，所 得的產品定量裝瓶為含2 mg靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼與單壁碳納米 管的水溶性複合物(即活性成分，以下同)/瓶規格的粉針劑。
實施例4
一靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物的製備。
重複實施例1中靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物的製備方法，不 同的是，以a, co-雙端胺基聚乙二醇(H2N-PEG_NH2， 4 kDa)替代六-臂聚 乙二醇胺基(6-Arm-PEG-NH2， 10 kDa),以庚二酸替代丙二酸。
二 靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物粉針劑的製備。
取本實施例製得的靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼與單壁碳納米管的 水溶性複合物(1%)、單硬酸甘油脂(35%)、大豆卵磷脂(20%)和聚醚F-68 (8%)溶於適量無水乙醇中，以旋轉蒸發儀在40 。C下減壓回收溶劑，在 瓶壁上形成類脂薄膜。然後加入適量pH為6. 5的水溶液將類脂膜洗脫並
1分散至水溶液中。將所得的溶液注入高壓均質機中，在1000 bar壓力下 循環10次進行處理，以孔徑為0.22 um微孔濾膜過濾，最後向溶液中加 入乳糖(36%)，充分溶解後，在一60'C和0.2MPa下真空冷凍乾燥，所得 的產品定量裝瓶為含活性成分5 mg/瓶規格的粉針劑。
實施例5
重複實施例1中靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物的製備方法，不 同的是，將適量單壁碳納米管與2:3的濃硝酸和濃硫酸混合酸溶液混合， 在20 'C溫度下超聲處理1000 min;抽濾，以去離子水反覆洗滌至中性， 乾燥，以得到所需長度的單壁碳納米管，以a-羥基-o)-胺基聚乙二醇 (HO-PEG-NH2，分子量為7 kDa)替代六-臂聚乙二醇胺基(6-Arm-PEG-NH2， 10 kDa)，以辛二酸替代丙二酸。
實施例6
一氯化兩面針鹼與單壁碳納米管的水溶性複合物的製備。
(1) 氯化兩面針鹼的預處理
在氬氣保護下，準確稱取氯化兩面針鹼加入到適量的濃氫溴酸中，使 氯化兩面針鹼的濃度為1. OX 10—4 mol/L邊攪拌邊升溫到180 °C 。反應1 h 後冷卻至室溫，以氨水調節混合溶液的pH約為9，利用二氯甲烷反覆萃取 混合溶液三次，將水相的溶劑蒸乾，剩餘物用乙醇溶解，加鹽酸調節pH 為2，放置後析出針狀晶體，即為C-8和/或C-9位置的甲氧基被羥基取代 的氯化兩面針鹼晶體。
準確稱取上述針狀晶體和丁二酸(摩爾比為1:20)加入到250 mL的 三口燒瓶中，再加入100 mL二甲基亞碸，在室溫下攪拌反應0.5 h後， 在真空條件下蒸乾二甲基亞碸。所得的固體以適量去離子水溶解，攪拌20 min後過濾，將沉澱溶解在丙酮中，然後緩慢加入去離子水，對析出的晶 體進行乾燥，即得到C-8和/或C-9位置被丁二酸酯化的氯化兩面針鹼晶 體。
(2) 單壁碳納米管的功能化修飾
將單壁碳納米管與濃硝酸混合，在200 。C溫度下反應20min;抽濾， 以去離子水反覆洗滌至中性，乾燥，得到20 200 nm的單壁碳納米管。
準確稱取二硬脂醯甘油磷脂醯乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG， 10kDa) 和丁二酸(摩爾比為1:20)加入到250 mL的三口燒瓶中，再加入150 mL 二氯甲垸，在室溫下攪拌反應2 h;反應結束後，蒸乾二氯甲烷，將所得 的固體溶解在去離子水中，以3 kDa的麗C0超濾膜透析6 h後，將所得 的固體進行冷凍乾燥即得丁二酸修飾的DSPE-PEG。
準確稱量該化合物和活化劑N,N' -二異丙基碳二醯亞胺(摩爾比為 10:1)溶於150 mL的二氯甲烷中，攪拌0.5 h;再加入催化劑4-二甲氨基吡啶(與丁二酸修飾的DSPE-PEG的摩爾比為1:10)和8-臂聚乙二醇胺 基(8-Arm-PEG-NH2， 20 kDa，與丁二酸修飾的DSPE-PEG的摩爾比為1:10)， 在冰浴條件下攪拌反應6 h，在室溫下繼續攪拌反應6 h;然後將溶劑蒸 幹，加入去離子水進行充分溶解，接著以孔徑為0.22 ym的微孔濾膜過 濾除去活化劑N，N' -二異丙基碳二醯亞胺和催化劑4-二甲氨基吡啶，以 20 kDa的麗C0超濾膜透析6 h除去過量的8-Arm-PEG-NH2，即得到8-臂 聚乙二醇胺基修飾的二硬脂醯甘油磷脂醯乙醇胺-聚乙二醇 (DSPE-PEG-8-Arm-(PEG-NH2))。
將DSPE-PEG-8-Arm-(PEG-NH2)和剪裁好的單壁碳納米管加入到二氯 甲垸中，使得DSPE-PEG-8-Arm-(PEG-NH2)的濃度為0. 1 mmol/mL，單壁碳 納米管的濃度為0.01 mg/mL，超聲振蕩30 min，頻率為80 kHz,然後將 混合溶液在10000 X g離心力條件下進行離心6 h，接著以100 kDa的麗CO 超濾膜透析6 h除去未反應的DSPE-PEG-8-Arm-(PEG-NH2)，乾燥後即可獲 得DSPE-PEG-8-Arm-(PEG-NH2)修飾的水溶性單壁碳納米管。
(3)將丁二酸修飾的氯化兩面針鹼與DSPE-PEG-8-Arm-(PEG-朋2)修
飾的單壁碳納米管複合
在氬氣保護下，稱取丁 二酸修飾的氯化兩面針鹼和
DSPE-PEG-8-Arm-(PEG-NH2)修飾的單壁碳納米管加入到250 mL三口燒瓶 中，加入適量除水除氧後的二甲基甲醯胺溶劑進行溶解，使丁二酸修飾的 氯化兩面針鹼衍生物的濃度為0.1 mol/L， DSPE-PEG-8-Arm-(PEG-腿2)修 飾的單壁碳納米管的濃度為10 mg/L;然後加入與丁二酸修飾的氯化兩面 針鹼的摩爾比為5:1的活化劑1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺 鹽酸鹽和催化劑N-羥基琥珀醯亞胺，充分攪拌反應0.5h後，向混合反應 液中加入pH為7. 4的1XPBS磷酸鹽緩衝溶液，以2 kDa的麗CO超濾膜 透析1 h除去沒有參與反應的丁二酸修飾的氯化兩面針鹼，收集產物，幹 燥，即得到靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼與單壁碳納米管的水溶性複合 物。
二靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物粉針劑的製備。 取本實施例製得的靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼與單壁碳納米管的 水溶性複合物(10%)、大豆卵磷脂(5.0%)、膽固醇(40%)和聚醚F-68 (10%)溶於適量氯仿中，以旋轉蒸發儀在30'C下減壓回收溶劑，在瓶壁 上形成類脂薄膜。然後加入適量pH為6. 5的水溶液，將類脂膜洗脫並分 散至水溶液中。所得的脂質體溶液以細胞破碎儀在600 w功率下超聲20 min，以孔徑為0.22的微孔濾膜過濾，最後向溶液中加入氨基乙酸 (35%)，充分溶解後，在一6(TC和0.3MPa條件下真空冷凍乾燥，所得的 產品定量裝瓶為含活性成分10 mg/瓶規格的粉針劑。
實施例7一耙向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物的製備。
重複實施例6中靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物的製備方法，不
同的是，單壁碳納米管以摩爾比為3:1的濃硝酸和濃硫酸混合酸來進行氧 化剪裁，以Fmoc-NH-聚乙二醇羥基(FM0C-NH-PEG-0H， 5 kDa)替代二硬 脂醯甘油磷脂醯乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG， 10kDa)，以壬二酸替代丁
二靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物注射液的製備。 取100 g聚醚F-68溶於900 mL的注射用水中，得到質量百分比為10% 的聚醚F-68水溶液，備用；準確稱取5.0 g本實施例製得的靶向性抗腫 瘤藥氯化兩面針鹼與單壁碳納米管的水溶性複合物，取配好的聚醚F-68 水溶液定容配製成500 mL的注射液產品。
實施例8
一靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物的製備。
重複實施例6中靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物的製備方法，不
同的是，單壁碳納米管以摩爾比為1:3的高錳酸鉀和濃硝酸混合溶液來進 行氧化剪裁，以癸二酸替代丁二酸。
二靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物粉針劑的製備。 取本實施例製得的靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼與單壁碳納米管的 水溶性複合物(5.0%)、單硬酸甘油脂(60%)、蛋黃卵磷脂(5.0%)和聚 醚F-68 (0. 5%)溶於適量甲醇中，以旋轉蒸發儀在35 。C下減壓回收溶劑， 在瓶壁上形成類脂薄膜。然後加入適量pH為6. 5的水溶液將類脂膜洗脫 並分散至水溶液中。將所得的溶液注入高壓均質機中，在1500 bar壓力 下循環20次進行處理，以孔徑為0.22 um微孔濾膜過濾，最後向溶液中 加入山梨糖(29. 5%)，充分溶解後，在一6(TC和0. 1 MPa下真空冷凍乾燥， 所得的產品定量裝瓶為含活性成分10 mg/瓶規格的粉針劑。
實施例9
重複實施例6中靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物的製備方法，不 同的是，單壁碳納米管以摩爾比為1:3的高錳酸鉀和濃硫酸混合溶液來進 行氧化剪裁，以順丁烯二酸替代丁二酸。
實施例10
重複實施例6中靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物的製備方法，不 同的是，單壁碳納米管以摩爾比為1:3的雙氧水和濃硫酸混合溶液來進行 氧化剪裁，以鄰苯二甲酸替代丁二酸。
實施例11一 氯化兩面針鹼與單壁碳納米管的水溶性複合物的製備。
(1) 氯化兩面針鹼的預處理
在氦氣保護下，準確稱取氯化兩面針鹼加入到適量的濃氫氯酸中，使
氯化兩面針鹼的濃度為0.2 mol/L，邊攪拌邊升溫到200 °C。反應72 h 後冷卻至室溫，以氨水調節混合溶液的PH約為11，利用二氯甲烷反覆萃 取混合溶液三次，將水相的溶劑蒸乾，剩餘物用甲醇溶解，加鹽酸調節pH 為3，放置後析出針狀晶體。
準確稱取上述針狀晶體和戊二酸(摩爾比為1:10)加入到250 mL的 三口燒瓶中，再加入100 mL二甲基甲醯胺，在室溫下攪拌反應48 h後， 在真空條件下蒸乾二甲基甲醯胺。所得的固體以適量去離子水溶解，攪拌 20min後過濾，將沉澱溶解在丙酮中，然後緩慢加入去離子水，對析出的 晶體進行乾燥，即得到戊二酸修飾的氯化兩面針鹼。
(2) 單壁碳納米管的功能化修飾.-
首先將單壁碳納米管進行超聲波振蕩2000 min，頻率為60 kHz。抽 濾，乾燥後即得到長度為20 500 nm的單壁碳納米管。
準確稱取Fmoc-NH-聚乙二醇胺基(FMOC-NH-PEG-NH2，分子量為5 kDa) 和戊二酸(摩爾比為1:10)加入到250 mL的三口燒瓶中，再加入150 mL 四氫呋喃，在室溫下攪拌反應72h;反應結束後，蒸乾四氫呋喃，將所得 的固體溶解在去離子水中，以2 kDa的麗CO超濾膜透析96 h後，將所得 的固體進行冷凍乾燥即得戊二酸修飾的FMOC-NH-PEG-NH2 。
準確稱取該化合物和活化劑N, N' -二環己基碳二亞胺(摩爾比為5:1) 溶於150mL的二氯甲烷中，攪拌2h;再加入催化劑2-(7-偶氮苯並三氮 唑)-N，N，N，，N，-四甲基脲六氟磷酸酯(與戊二酸修飾的FM0C-NH-PEG-腿2 的摩爾比為1: 6)和3-臂聚乙二醇胺基(3-Arm-PEG-NH2， 5 kDa，與戊 二酸修飾的FMOC-NH-PEG-NH的摩爾比為3:1 )，在冰浴條件下攪拌反應5 h， 在室溫下繼續攪拌反應48 h;然後將溶劑蒸乾，加入去離子水進行充分 溶解，接著以孔徑為0.22 Pm的微孔濾膜過濾除去活化劑N，N' -二環己 基碳二亞胺和催化劑2- (7-偶氮苯並三氮唑)-N， N， N，， N，-四甲基脲六氟磷 酸酯，以5 kDa的麗CO超濾膜透析48 h除去過量的3-Arm-PEG-麗2，即 得到3-臂聚乙二醇胺基修飾的Fmoc-NH-聚乙二醇胺 (FMOC-NH-PEG-3-Arm-(PEG-NH》)。
將FMOC-NH-PEG-3-Arm-(PEG-NH2)和剪裁好的單壁碳納米管加入到四 氫呋喃中，使得FMOC-NH-PEG-3-Arm-(PEG-NH2)的濃度為2. Ommol/mL，單 壁碳納米管的濃度為5.0 mg/mL;超聲振蕩600 min，頻率為60 kHz，然 後將混合溶液在30000Xg離心力條件下進行離心6 h，接著以50 kDa的 MWCO超濾膜透析48 h除去未反應的FMOC-NH-PEG-3-Arm-(PEG-NH2)，乾燥 後即可獲得FM0O麗-PEG-3-Arm-(PEG-麗2)修飾的水溶性單壁碳納米管。 (3)將戊二酸修飾的氯化兩面針鹼與FMOC-NH-PEG-3-Arm-(PEG-NH2)
17修飾的水溶性單壁碳納米管複合
在氮氣保護下，稱取戊二酸修飾的氯化兩面針鹼和
FMOC-NH-PEG-3-Arm-(PEG-NH2)修飾的單壁碳納米管加入到250 mL三口燒 瓶中，加入適量除水除氧後的二甲基乙醯胺溶劑進行溶解，使戊二酸修飾 的氯化兩面針鹼的濃度為10. 0mmol/L，使FMOC-NH-PEG-3-Arm-(PEG-NH2) 修飾的單壁碳納米管(濃度為300mg/L;然後加入與戊二酸修飾的氯化兩 面針鹼的摩爾比均為1:4的活化劑1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二 亞胺鹽酸鹽和催化劑N-羥基琥珀醯亞胺，充分攪拌反應12h後，向混合 反應液中加入pH為7. 3的1 XPBS磷酸鹽緩衝溶液，以1. 5 kDa的MWCO 超濾膜透析48 h除去沒有參與反應的氯化兩面針鹼，收集產物，乾燥， 即得到靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼與單壁碳納米管的水溶性複合物。 二 靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物粉針劑的製備。 取本實施例製得的耙向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼與單壁碳納米管的 水溶性複合物(10.0%)、單硬酸甘油脂(35%)、大豆卵磷脂(5%)和聚醚 F-68 (5%)溶於適量乙醚中，以旋轉蒸發儀在30 'C下減壓回收溶劑，在 瓶壁上形成類脂薄膜。然後加入適量pH為6. 5的水溶液將類脂膜洗脫並 分散至水溶液中。將所得的溶液注入高壓均質機中，在1000 bar壓力下 循環30次進行處理，以孔徑為0. 22 u m微孔濾膜過濾，最後向溶液中加 入山梨醇(45%),充分溶解後，在一6CTC和0. lMPa下真空冷凍乾燥，所 得的產品定量裝瓶為含活性成分50 mg/瓶規格的粉針劑。
實施例12
一靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物的製備。
重複實施例6的製備方法，不同的是，以a-羥基-co-胺基聚乙二醇 (HO-PEG-NH2，分子量為7 kDa)替代3-臂聚乙二醇胺基(3-Arm-PEG-NH2， 5 kDa)，以對苯二酸替代戊二酸。
二靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物注射液的製備。
取25 g聚醚F-68溶於475 ml的注射用水中，得到質量百分比為5% 的聚醚F-68水溶液，備用；稱取1. 25 g本實施例製得的耙向性抗腫瘤藥 氯化兩面針鹼與單壁碳納米管的水溶性複合物於250 mL的容量瓶中，以 配好的聚醚F-68水溶液定容配製成250 mL注射液，定量灌封為2 mL/支 的注射液，每支含靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼與單壁碳納米管的水溶性 複合物10 mg。
實施例13
重複實施例11靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物的製備方法，不 同的是，以8-臂聚乙二醇胺基(8-Arm-PEG-NH2， 40 kDa)替代3-臂聚乙 二醇胺基(3-Arm-PEG-NH2， 5 kDa)，以酒石酸替代戊二酸。
18實施例14
重複實施例11靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物的製備方法，不
同的是，以4-臂聚乙二醇胺基(4-Arm-PEG-NH2， 20 kDa)替代3-臂聚乙 二醇胺基(3-Arm-PEG-NH2， 5 kDa)，以檸檬酸替代戊二酸。
實施例15
重複實施例11靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物的製備方法，不 同的是，以6-臂聚乙二醇胺基(6-Arm-PEG-NH2， 20 kDa)替代3-臂聚乙 二醇胺基(3-Arm-PEG-NH2， 5 kDa)，以蘋果酸替代戊二酸。
實施例16
重複實施例11靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物的製備方法，不 同的是，以3-臂聚乙二醇羥基(3-Arm-PEG-服2， 5 kDa)替代3-臂聚乙 二醇胺基(3-Arm-PEG-NH2， 5 kDa)，以草酸替代戊二酸。
實驗例氯化兩面針鹼與單壁碳納米管的水溶性複合物注射液對人 肝癌H印G2裸鼠移植瘤的抑制作用的評價 1實驗材料與對象
l.l實驗腫瘤細胞株為國際通用的腫瘤細胞株肝癌H印G2。 1.2實驗對象24隻昆明種小白鼠(SPF級)，6~8周齡，體重22士2g。 1. 3實驗分組
將24隻昆明小鼠隨機分成A、 B、 C、 D四個試驗組，每組6隻，其中，
A組為空白對照組；
B組為普通氯化兩面針鹼組；
C組為本發明提供的複合物注射液實驗組；
D組為陽性對照組。
2具體實驗步驟
(1) 建立人肝癌H印G2裸鼠移植瘤模型用2 mL注射器抽吸人肝癌 細胞株H印G2，以無菌生理鹽水l: 3稀釋，調整細胞濃度為(1-2) X107 個細胞/mL;經臺盼藍染色，鏡檢細胞存活率》95 %。
(2) 取待接種昆明小鼠，消毒腋下皮膚，於超淨臺上將腫瘤細胞懸 液以每隻0.2 mL接種於小鼠右側腋窩皮下，30 min內接種完四個分組的 昆明小鼠。接種完成後小鼠於動物房詞養，自由攝食飲水。
(3) 接種24 h後開始給藥，給藥情況如下
A組空白對照組(腹腔注射含0.5。/。聚醚F-68的生理鹽水200 u L/
只)；
B組普通氯化兩面針鹼組(以聚醚F-68助溶，將氯化兩面針鹼配製成含0. 5%聚醚F-68的生理鹽水溶液，腹腔注射該溶液200uL/只，劑量為10 mg/kg);
C組本發明提供的複合物注射液實驗組(將本申請實施例2製備的注射液稀釋配製為含0. 9%氯化鈉的水溶液，腹腔注射200 yL/只，劑量為10 mg/kg);
D組陽性對照組(腹腔注射含0. 5%聚醚F-68的環磷醯胺生理鹽水溶液200 uL/只，劑量為20 mg/kg)。以上各組均每日給藥一次。
(4)給藥10天結束後，次日處死全部動物，剝離瘤塊，生理鹽水衝洗，濾紙吸乾後稱重，計算腫瘤生長抑制率。
抑瘤率(%)二 (空白對照組平均瘤重-實驗組平均瘤重)/空白對照組平
均瘤重xiooy。
3實驗觀察及結果
接種第4天可見皮下腫瘤生長，出瘤率100%，移植瘤多呈圓型，實質性，呈局限性膨脹生長，表面凹凸不平，呈多個結節融合狀。腫瘤組織為淡紅色魚肉狀，瘤塊較大的表面可見增粗的血管網分布，部分中心有壞死，實驗中各組無一例死亡。
各組實驗的抑瘤率如表1所示
表l:
組別劑量(mg/kg)瘤重(g)抑瘤率(％)
A (n=6)1.24±0. 19
B (n=6)100. 6±0. 18*45. 96
C (n=6)100. 5±0. 16*52. 42
D (n二6)200. 5±0. 12*55.64
注1. *各組與生理鹽水組比，p<0.05
抑瘤率是否有效的判定根據《新藥(西藥)臨床前研究指導原則彙編》、《藥理實驗方法學》中對抗腫瘤藥物的體內實驗要求，藥物的抑瘤率〉30%，即被認為有效。
表l中的實驗數據顯示給藥後複合物注射液實驗組對人肝癌H印G2裸小鼠移植瘤有較明顯的生長抑制作用，抑瘤率為52.42%，平均瘤重低於生理鹽水對照組，與陽性對照藥環磷醯胺組的瘤重、抑瘤率相當，優於普通氯化兩面針鹼對照組。
實驗結果表明，靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼與單壁碳納米管的水溶性複合物注射液較普通氯化兩面針鹼具有更好的制腫瘤生長效果。
權利要求
1、一種靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物的製備方法，其特徵在於將氯化兩面針鹼進行預處理得到羧酸修飾的氯化兩面針鹼，然後用雙親性聚合物對裁剪至20～500nm長的單壁碳納米管的外壁進行非共價功能化修飾；再將羧酸修飾的氯化兩面針鹼與非共價功能化修飾後的單壁碳納米管通過酯化和醯胺化反應進行偶聯，即得到靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼與單壁碳納米管的水溶性複合物。
2、 根據權利要求1所述的靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物的制 備方法，其特徵在於包括以下步驟(1) 氯化兩面針鹼的預處理① 在惰性氣體保護下，將氯化兩面針鹼加入到濃的氫滷酸中，使氯化兩面針鹼的濃度為1.0X10—4 1.0mol/L，邊攪拌邊升溫到50 200 。C反 應l 72h，反應結束後，以氨水調節混合溶液的pH值為鹼性，用二氯甲 垸溶劑對反應混合物反覆萃取三次，將水相溶劑蒸乾，剩餘物用甲醇或乙 醇溶解，加鹽酸調節pH值為2 3，放置，析晶，即得到C-8禾n/或C-9 位置的甲氧基被羥基取代的氯化兩面針鹼晶體；② 將上述得到的羥基取代的氯化兩面針鹼與二元羧酸或羥基羧酸化 合物按1:1 1:20的摩爾比溶解在極性溶劑中，反應0.5 48h後，蒸乾溶劑，所得固體以去離子水溶解，過濾，所得沉澱溶解於丙酮中，然後緩 慢加入去離子水，放置，析晶，即得到C-8和/或C-9位置被二元羧酸或 羥基羧酸酯化的氯化兩面針鹼晶體；(2) 單壁碳納米管的功能化修飾① 將單壁碳納米管的長度裁剪至20 500 nm備用；② 將兩親表面活性劑與二元羧酸或羥基羧酸按1:1 1:20的摩爾比 溶解在除水除氧的有機溶劑中，反應2 72h後，蒸乾溶劑，所得固體溶 解於去離子水中，以超濾膜透析6 96 h，固體以冷凍乾燥法製成粉末， 得到乾燥的羧酸修飾的兩親表面活性劑；③ 在惰性氣體保護下，在冰浴或冰鹽浴中，將上述獲得的羧酸修飾 的兩親表面活性劑和活化劑按1: 1 10:1的摩爾比溶解於除水除氧的有機 溶劑中，充分攪拌0.5 6h;然後加入催化劑和聚乙二醇修飾劑，繼續攪 拌反應6 72 h;反應結束後，將有機溶劑蒸乾，加入去離子水進行充分 溶解，接著以孔徑為0.22 "m的微孔濾膜過濾除去催化劑，以超濾膜透 析6 72 h除去過量的聚乙二醇修飾劑，得到聚乙二醇修飾劑進一步修飾 的兩親表面活性劑溶液；所述加入的催化劑與羧酸修飾的兩親表面活性劑 的摩爾比為1:10 1:1，所述加入的聚乙二醇修飾劑與羧酸修飾的兩親表 面活性劑的摩爾比為1:10 10:1;④將經過剪裁的單壁碳納米管與步驟(D中所得到的聚乙二醇修飾劑 進一步修飾的兩親表面活性劑溶液加入到適量除水除氧的有機溶劑中，使單壁碳納米管的濃度為0. 01 20. 0 mg/mL，聚乙二醇修飾劑進一步修飾的 兩親表面活性劑的濃度為0. 1 10.0 ramol/mL;超聲振蕩30 1000 min， 頻率為40 100kHz,然後將混合溶液在10000Xg 30000Xg的離心力下 離心1 24 h，接著以超濾膜透析6 72 h來除去過量的聚乙二醇修飾劑 進一步修飾的兩親表面活性劑，乾燥，即得到非共價功能化修飾的水溶性 單壁碳納米管；(3)在惰性氣體保護下，將步驟(1)得到的經羧酸修飾的氯化兩面 針鹼，與非共價功能化修飾的水溶性單壁碳納米管，溶解在適量除水除氧 後的有機溶劑中，使羧酸修飾的氯化兩面針鹼的濃度為0. 1 50.0 mmol/L，非共價功能化修飾的單壁碳納米管的濃度為10 1000 mg/L;然 後加入活化劑和催化劑，充分攪拌反應0.5 48h後，向混合反應液中加 入pH為7. 2 7. 4的1 XPBS磷酸鹽緩衝溶液，以3 10 kDa的超濾膜透 析l 48h除去未參與反應的羧酸修飾的氯化兩面針鹼，收集產物，乾燥， 即得到靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼與單壁碳納米管的水溶性複合物；所 述加入的活化劑與經羧酸修飾的氯化兩面針鹼的摩爾比為1: 1 5:1，所述 加入的催化劑與經羧酸修飾的氯化兩面針鹼的摩爾比為1: 1 5:1 。
3、 根據權利要求2所述的靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物的制 備方法，其特徵在於其中，所述的二元羧酸為選自草酸、丙二酸、丁二酸、戊二酸、己二酸、庚 二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、順丁烯二酸、鄰苯二甲酸以及對苯二酸 中的任意一種；所述的羥基羧酸為選自酒石酸、檸檬酸以及蘋果酸中的任意一種； 所述的活化劑為選自N，N'-二環己基碳二亞胺、N，N'-二異丙基碳二醯亞胺和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽中的任意一種；所述的催化劑為選自4-羥基苯並三唑、4-二甲氨基吡啶、2-(7-偶氮 苯並三氮唑)-N， N， N' ， N'-四甲基脲六氟磷酸酯以及N-羥基琥珀醯亞胺中 的任意一種。
4、 根據權利要求2所述的靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物的制 備方法，其特徵在於步驟(2)的第②步中，所述的兩親表面活性劑是指一端為疏水基，另一端為胺基或羥基的表 面活性劑；所述的羧酸修飾的兩親表面活性劑是指二元羧酸或羥基羧酸的羧基 與兩親表面活性劑的端羥基或端胺基發生酯化或者醯胺化反應生成的聚合物。
5、 根據權利要求2所述的靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物的製備方法，其特徵在於步驟(2)的第③步中，所述的聚乙二醇修飾劑為選自分子量為5 40 kDa的多臂聚乙二醇胺基、分子量為5 40 kDa的多 臂聚乙二醇羥基、分子量為2 10 kDa的a,"-雙端胺基聚乙二醇以及 分子量為2 7 kDa的a-羥基-"-胺基聚乙二醇中的任意一種。
6、 權利要求1 5中任何一項所述的製備方法製備得到的靶向性抗腫 瘤藥氯化兩面針鹼複合物。
7、 一種靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物注射液，其特徵在於 它含有(a) 0. 1 10 g/L的靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼與單壁碳納米管 的水溶性複合物；(b) 藥學上可接受的溶劑或輔料。
8、 根據權利要求7所述的水溶性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物注射 液，其特徵在於所述溶劑為注射用水，輔料為聚醚F-68。
9、 一種靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物粉針劑，其特徵在於 它是由靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼與單壁碳納米管的水溶性複合物和 水溶性藥用輔料製備而成，其中靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼與單壁碳納 米管的水溶性複合物的質量百分比含量為0. 1 10%。
10、 根據權利要求10所述的靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物粉針劑，其特徵在於所述水溶性藥用輔料為磷酯、聚醚F-68、支架劑和 膽固醇或單硬酸甘油酯。
全文摘要
本發明將公開一種靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物的製備方法，其產品及含有該產品的注射劑。所述靶向性抗腫瘤藥氯化兩面針鹼複合物的製備方法為將氯化兩面針鹼進行預處理得到羧酸修飾的氯化兩面針鹼，然後用雙親性聚合物對裁剪至20～500nm長的單壁碳納米管的外壁進行非共價功能化修飾；再將羧酸修飾的氯化兩面針鹼與非共價功能化修飾後的單壁碳納米管通過酯化和醯胺化反應進行偶聯，即得。本發明複合物製備方法簡單，所得產品的溶解度可達5.0mg/mL，且抗腫瘤的靶向性強，較好地解決了氯化兩面針鹼的低溶解性和毒性大的問題，可作為氯化兩面針鹼的替代品應用於臨床，為氯化兩面針鹼的臨床試用提供了新的水溶性複合物。
文檔編號A61K31/4738GK101474183SQ20091011385
公開日2009年7月8日 申請日期2009年1月23日 優先權日2009年1月23日
發明者劉華鋼, 賴澤鋒 申請人:劉華鋼;賴澤鋒