一種利用pcr技術將核酸應用於仿偽的方法

2023-06-29 20:36:31 1

專利名稱：一種利用pcr技術將核酸應用於仿偽的方法
技術領域：
本發明公開一種利用聚合酶鏈式反應分析技術將核酸應用於防偽的方法，屬於生物防偽技術領域。
常用的防偽技術包括雷射全息防偽、磁性防偽、條形碼防偽、螢光防偽、隱形防偽、核隱形防偽、等離子隱形防偽、紫外光防偽、噴碼防偽、溫致變防偽、計算機編碼防偽等等。
傳統的防偽標記大多是物理或化學性質的製品，如光學變色膜、圖象擾頻、熱變油墨、磁條、軟體等。
目前國際上開始將生物技術利用於防偽上，形成了多樣的生物防偽技術和相應的生物防偽標記。這些防偽技術主要採用抗原抗體反應原理，比一般的防偽技術準確、靈敏。由於抗原抗體是蛋白質，穩定性較差，尤其在高溫環境中容易失活，從而降低防偽的靈敏度和可靠性。此外，抗原抗體反應變化少，一旦知道其中一種成分，就容易被仿製。
本發明的一個目的是在生物防偽的技術領域克服已有標記容易被仿製的缺陷，設計出將聚合酶鏈式反應分析技術應用於防偽的方法。
本發明的另一個目的是提供一種新的防偽標記及檢測其真偽的方法。
本發明提供了一種新的防偽技術和防偽標記，其核心是生物大分子——核酸。一切生命的基本遺傳物質(基因)都是核酸，也就是脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)核酸是由四種鹼基交互排列組成，其排列組合的差異，形成地球上生命類型的多樣性。一條含有1000個鹼基對(1kb)的DNA鏈就可能有10603種排列組合方式。現在自然界的生物種類(動植物和微生物)在一百萬種以上，因此可以利用作防偽的天然生物基因數不勝數。每個物種基因級的長度一般均大於104至106kb。假若設定用1kb長度的核酸作防偽標記，則可供選擇的核酸密碼就有105×(104--106)＝1010--1012之多。因此核酸中所包含的的海量信息為防偽技術提供了取之不盡的來源。利用核酸密碼序列這樣巨大的信息量可以有數以億萬計的密碼可用於防偽標記。
聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)的原理為聚合酶鏈式反應用於擴增位於兩段已知序列之間的DNA區段。在由DNA聚合酶催化的一系列合成反應中，使用了兩段寡聚核苷酸作為反應的引物。一般情況下，這兩段寡聚核苷酸引物的序列互不相同，並分別與模板DNA兩條鏈上的各一段序列互補，而這兩段模板序列又分別位於待擴增DNA區段的兩側。反應時，首先在摩爾數大大過量的兩段寡聚核苷酸及4種dNTP參與下對模板DNA進行加熱變性。隨之，將反應混合液冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發生退火。此後退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。如此反覆進行變性、退火和DNA合成這一循環。由於一輪擴增的產物又充當下一輪擴增的模板，所以在這一周而復始的過程中每完成一個循環，就基本上使目的DNA產物增加1倍。
本發明是將篩選的一段核酸(可以是DNA，或是RNA)，以一定量(可少到10-8克)固定到固相載體上。固相載體可以是各種各樣的材料，如各種天然或人造纖維製成的紙張或薄膜、多孔顆粒或粉末，天然或合成的皮革、塑料或各種有機或無機多聚體和樹脂、固體石臘、天然或合成的無機物質如陶瓷、玻璃、水晶、金屬、硅藻土等。各種油墨和塗料也可作為防偽核酸的載體。
為了達到保護固相載體上作為防偽標記的核酸的目的，可以在含有核酸的固相載體表面加上保護層，例如可用塑料薄膜，海藻糖等製成保護層。這種核酸防偽標記可固定在商品或物件上或其包裝物及附屬物上。
當需要檢驗辨別真偽時，將本發明的防偽標記揭去保護層，用緩衝液溶解附著在載體上的核酸片段。檢測人員已知檢測商品或物件上核算防偽標記的種類，就可用特定的核酸分子雜交或聚合酶鏈式反應(PCR)特定引物進行探測。如能顯出雜交信號或具有正確長度的PCR產生(PCR特定引物法)，即能判定檢測商品或物件為真品，否則為假冒的偽品或贗品。
利用核酸製作防偽標記有如下優點1.不可仿製性首先核酸密碼無色，肉眼難以看到，其次，密碼來自自然界龐大的基因庫，即使知道是基因的密碼但不知是哪一種，仿冒者也無法破譯和仿造。而對檢驗人員來說，只要以專用的分析方法測試，真偽則一目了然。
2.可靠性只有按預定的核酸密碼設計的探針或PCR引物進行檢驗，才有可能探測出密碼的存在與密碼的種類，所以核酸密碼具有極高的專一性。
3.多樣性可以很容易設計出千萬種核酸密碼作為防偽標記，每種都有自身相應的探針和引物，互不通用。所以核酸密碼可為多種多樣的商品和物件分別提供獨特的防偽標記體系。
4.穩定性核酸(特別是DNA)穩定，特別是乾燥的DNA存放經久，不易分解，適於一些長期保存物件的防偽。
5.廣泛的適用性核酸密碼只需極微量(10-8-10-10克)存在於商品或物件中即可探測出來，因此適用於種類貴重的商品和物件。如科學儀器和家用電器；高檔服裝、家具及文體、文娛用品；高級菸酒、食品及營養品；農業和園藝的珍奇或重要種子；重要的證件和文件；經鑑定的珍貴文物和藝術品等等，幾乎所有固態的物件上都可適用。
本發明提供一張附圖

圖1為聚合酶鏈式反應法檢測DNA防偽標記真偽圖，圖中，A為空白(無DNA模板)；B為非特異性DNA，1微克；C為lambda噬菌體DNA模板。
下面結合附圖就利用聚合酶鏈式反應分析技術將核酸應用於防偽提出一項實施例。
2、反應溫度和程序94℃-10秒 50℃-30秒 或 94℃-60秒 55℃-60秒 72℃-120秒重複20-30次，最後延伸10分鐘。
3、電泳分離取10微升反應液，置2％瓊脂糖凝膠(含溴乙啶染料)中，用100V直流電壓進行電泳，電泳後將瓊脂糖凝膠取出，置於250-300nm波長紫外燈下觀察並攝影。
4、鑑定如圖1(C)所示顯示預定大小的DNA帶，以次條狀帶是否存在以及大小是否正確來判別鑑定物件的真偽。圖2(A，B)未顯示條狀帶則可認定為偽品。
需要說明的是實施例只是通例，不是固定的操作程序。實際操作中，常隨DNA模板和引物設計上的不同而有所變化，否則不能達到預期結果。這種嚴格的操作條件對於防偽又極為有利，因防冒者不知反應條件，無從破譯密碼。
權利要求
1.一種利用聚合酶鏈式反應分析技術將核酸應用於防偽的方法，其特徵在於將核酸或其片斷，固定在固相載體上用來作為防偽標記，利用聚合酶鏈式反應分析技術檢驗真偽。
2.如權利要求1所述的防偽標記，其特徵在於所述的防偽標記可直接固定在任何固態的物體上。
3.如權利要求1所述的防偽標記，其特徵在於所述的防偽標記可以加覆塑料薄膜或海藻糖等保護層。
4.如權利要求1所述的固相載體，其特徵在於所述的固相載體可以是天然或人造纖維、紙張、薄膜、皮革、塑料、多孔顆粒、粉末、樹脂、固體石臘、陶瓷、玻璃等有機或無機的固態材料。
5.根據權利要求1所述的防偽方法，其特徵在於防偽標記辨別的探測檢驗方法可以採用核酸分子探針法，其步驟依次是樣品處理，變性、中和，固相雜交，X光顯影鑑定。
6.根據權利要求1或5所述的防偽方法，其特徵在於核酸分子雜交所用的探針可以用同位素標記物，也可以用其他類型非同位素標記物。
7.根據權利要求1所述的防偽方法，其特徵在於防偽標記辨別的探測檢驗方法也可以採用聚合酶鏈式反應(PCR)引物法，探測檢驗時取下DNA並溶於一定量緩衝液中，在加入專一性引物和TagDNA聚合酶或其他聚合酶及其他反應液，用PCR儀進行擴增反應，取出反應液進入電泳分析，然後用溴乙啶染色，在紫外光下觀察辨別鑑定DNA產物是否在及大小是否正確。
8.根據權利要求7所述的防偽方法，其特徵在於PCR反應所用的TagDNA聚合酶，也可以是其他任何一種DNA聚合酶或使DNA擴增的任何技術。
9.如權利要求1所述的檢驗防偽標記真偽的方法，其特徵在於根據防偽標記上核酸的聚合酶鏈式反應分析結果與已知的聚合酶鏈式反應結果比較，即能判定防偽標記的真假。
全文摘要
本發明公開了一種新的將核酸應用於防偽的方法,將核酸製成防偽標記並利用聚合酶鏈式反應分析技術檢測出真偽。本發明還公開了以此技術製作防偽標記的方法。本發明還公開了這種新方法的用途。
文檔編號G09F3/02GK1360055SQ001279
公開日2002年7月24日 申請日期2000年12月18日 優先權日2000年12月18日
發明者毛裕民, 謝毅 申請人:上海博德基因開發有限公司