顆粒分選的設備和方法
2023-06-15 02:12:11
專利名稱：顆粒分選的設備和方法
技術領域：
本發明涉及用於分選懸浮液中的顆粒的方法和設備，其中分選模塊的流體進入通道被分成幾個流出通道。本發明尤其涉及一種具有多個互連分選模塊用以提高顆粒通過量的顆粒分選系統。
背景技術：
在生物技術領域，尤其是細胞學和藥物篩選領域，需要以高通過量來分選顆粒。需要分選的顆粒是各種類型的細胞，如血小板、白細胞、腫瘤細胞、胚胎細胞等等。在細胞學領域這些顆粒是人們尤其感興趣的。其它顆粒有(大)分子物質，例如蛋白質、酶和多聚核苷酸。在新藥物的開發的藥物篩選領域中，該顆粒家族是人們特別感興趣的。
用於分選顆粒的方法和設備是已知的，並且現有技術中所描述的大部分是在如下情況下工作的，顆粒懸浮於流經具有至少一個下遊分支點的通道網絡的液體之中，並且依照檢測-決定-導流的原理工作。首先要分析移動的顆粒的特定特性，諸如吸光度、螢光強度、尺寸大小等等。根據該檢測階段的結果，決定在下遊階段如何進一步處理該顆粒。再將所做決定的結果加以應用，使特定的顆粒朝著通道網絡的預定分支方向偏轉(deflect)。
分選設備的通過量，即單位時間內可分選顆粒的數量，是十分重要的因素。對於每單個分選單元，採用閉合通道中的顆粒懸浮液流的分選器的典型分選速率為幾百顆粒每秒至幾千顆粒每秒。
美國專利No.4175662中描述了分選裝置的例子，在此引入其內容作為參考(下文中稱為『662專利)。在『662專利中，顆粒流，此處為細胞，流經直型通道的中央，直型通道在下遊分支點處岔分成兩個垂直通道(T型分支)。流入顆粒被相容流體構成的外層所包圍，使得該顆粒限制在通道的中央。在通常情況下，可調節通過兩個分支的流量比，使顆粒自動地流過其中之一。在通道的一個區域內可用例如光學系統的檢測器檢測顆粒的特性(檢測階段)。在決定階段，當檢測器檢測到具有預定特性的顆粒時，檢測器就發出信號。在導流階段，一旦檢測到顆粒，導流器就被激活使該顆粒發生偏轉。在此例中，導流器包括安裝在通道分支處的電極對，在該分支處顆粒通常流經處於非激活狀態的導流器。通過應用電流脈衝，水溶液被電解，在電極對之間釋放出所產生的氣泡。釋放階段中隨著氣泡尺寸的增大，通過該分支的流速降低。在施加了電流脈衝之後，氣泡停止了增大，並且被流體攜帶著。結果，通過特定分支的流體暫時減少，而目標顆粒改變了流路流向另一分支的下遊。
『662專利中的裝置對於分選顆粒是有效的。然而有一個嚴重的缺陷在於產生的氣泡可能會在流控網絡的某個點聚集。該氣泡的產生可能會阻塞流動通道，造成錯誤分選。另一個缺點在於所產生的氣體(主要是氧氣和氫氣)和離子物質(主要為OH-和H+)影響了顆粒流經具有電極對的分支。另外，細胞和易損傷的蛋白質如酶是非常脆弱的，會被與氣泡共同產生的汙染成分所破壞。另一個缺點在於整個分選裝置很複雜。特別是在系統的小型通道中安裝和組裝微電極構造是十分複雜的。因此，分選單元的成本相對較高。
美國專利3984307中描述了現有技術的顆粒分選系統的另一個例子，在此引入其內容作為參考(下文中稱為『307專利)。在『307專利中，被流動的外層液體限制的顆粒流經通道的中央。經過檢測器區域之後，該通道岔分為之間成銳角的兩個通道(例如，Y型分支)。在通道的分支點稍前處，安裝了一個電激活的換能器，用於偏轉具有適當預定特性的特定的顆粒。所述換能器為壓電致動器或者超聲換能器，電激活後在通道中產生壓力波。所產生的壓力波會暫時幹擾一個分支中的流動，從而使目標顆粒偏轉到另一個分支中。
在『307專利的裝置中，如同前面所討論的裝置一樣，將導流器加到通道系統中會導致較高的造價。該裝置的另一個缺點在於所使用的導流器原理。所產生的壓力波並不局限在分支點，而是向上遊區傳播到檢測器區域，以及向下傳播到兩個分支。這會影響到所有通過通道的流體。如果將此類型的分選器串聯或並聯，如構建高通過量分選系統時所做那樣，此缺點就尤為突出。一個分選器中所產生的壓力波可能接著影響鄰近分選器單元中的顆粒的流動和導流。
美國專利No.4756427中描述了另一種分選器，在此引入其內容作為參考。該分選器類似於『662專利中的分選器。但是，在此例中，通過暫時改變一個分支的阻力來幹擾在該分支中的流動。阻力的改變是通過外部致動器來改變分支通道的高度。在優選實施方案中，該外部致動器為粘合在通道頂部的壓電圓盤，使之在激活後向下移動。
儘管『427專利中所述的分選器構造比先前描述的分選器結構簡單一些，但是當所述類型的多個分選器模塊連接到一起以提高分選速率時，它仍然存在問題。如同『307專利中所述的分選器一樣，這是因為其所產生的壓力波會造成對其它分選器模塊的幹擾。
美國專利第5837200號中描述了另一種顆粒分選裝置，在此引入其內容作為參考。『200專利描述了一種利用磁導流模塊，根據顆粒的磁性特徵來分類或選擇的分選裝置。『200專利還進一步描述了並聯處理和分離單股顆粒流的過程。
發明簡述本法明提供了用於分選流過毛細尺寸的封閉通道系統的顆粒的方法和設備。本發明的顆粒分選系統提供了一種分選模塊，其可以低成本地組裝並提供在每單位時間內準確分選大量顆粒的手段。該顆粒分選系統可包括多個緊密連接的分選模塊，其結合起來以進一步提高了分選速率。為了降低錯誤率，該顆粒分選系統可包括多步分選裝置用於連續地分選顆粒流。
根據本發明，顆粒分選系統實現了改進的流控顆粒轉向的方法和轉向的裝置。該顆粒分選系統包括用於分選顆粒的毛細尺寸的封閉通道系統。該通道系統包括用於引入顆粒流的第一供管和用於提供載液的第二供管。第一供管形成的管口將顆粒流引入載液中。第一供管和第二供管與測量管流體連通，測量管在分支點處岔分成第一支路和第二支路。測量區域被限定在測量管中，並且與檢測器聯合以檢測測量區域中的顆粒的預定特性。兩個相對的氣泡閥與測量管連通放置並彼此相對隔開。氣泡閥通過一對相對的邊路通道與測量管連通。液體可以部分填充這些邊路通道從而在其中形成彎液面，作為載液與氣泡閥儲液池的分界面。還提供了一個外部致動器用於調節其中一個氣泡閥。當外部致動器被激活後，受激活的氣泡閥的儲液池壓力增加，使彎液面發生偏轉並在測量管中造成流動幹擾以使其中的流體發生偏轉。
當位於測量區域的傳感器檢測到流經測量區域的顆粒的預定特性時，該傳感器就發出信號以響應所檢測到的特性。外部致動器對傳感器發生響應，在第一氣泡閥的加壓腔室中產生壓力脈衝，使具有預定特性的顆粒發生偏轉，導致所選顆粒流到第二分支管下遊。
一方面，本發明包括分選顆粒的方法，步驟包括提供具有入口和分支點的測量管，該管在分支點處岔分為兩個分支管道，將其中具有懸浮顆粒流的流體流導入管的入口，這樣該顆粒通常流過第一個分支管道，並且在分支點的上遊提供兩個相對的邊路通道用於使管道中的液流暫時發生偏轉。第一個邊路通道液壓式地與第一個氣泡閥的加壓腔室相連，該氣泡閥通過用於改變其中壓力的外部致動器來激活。第二個邊路通道與第二個氣泡閥的緩衝器腔室液壓式連接用於吸收壓力變化量。該方法進一步包括沿邊路通道上遊的測量管提供測量站，用於檢測液流中顆粒的預定特性，並且當檢測到預定的特性時產生信號。該方法進一步包括以下步驟響應於對預定特性的檢測，激活外部致動器用以在邊路通道之間的管道中產生流動幹擾，從而使具有預定特性的顆粒發生偏轉並使所選顆粒流向第二分支管道的下遊。
本發明的另一些方面，通過分別並聯多個分選模塊或者以二叉樹形構造串聯多個分選模塊，分別增加了顆粒的分選速率或者增加了被分選顆粒的類型。
根據本發明的一個方面，提供了一種顆粒分選系統。該顆粒分選系統包括用於運送限制在載液中的懸浮顆粒流的第一管道，其包含入口、第一出口和第二出口，用於檢測顆粒的預定特性的傳感器，與第一管道相連通的邊路通道，位於邊路通道附近的封閉腔室，其中載液在邊路通道中形成彎液面以將封閉腔室與載液相隔開；以及致動器。當傳感器檢測到所述的預定特性時，致動器改變封閉腔室內的壓力使彎液面發生偏轉。彎液面的偏轉使得具有預定特性的顆粒流向第二出口，而不具有預定特性的顆粒流向第一出口。
預計本發明在高通過量的篩選中將十分有價值；例如在針對抗對一種或多種細胞的活性篩選大量候選化合物時。其對於例如，篩選合成或天然產物庫中的活性化合物或生化特性時尤其具有價值。
另外還預計本發明在高通過量地篩選樣品中的多個諸如生物分子這樣的分子時，將十分有價值。本發明可用於篩選樣品，以確認大量生物分子的存在與否，例如多肽、受體配體、酶底物、酶或受體活性的激動劑或拮抗物，或者核酸。
附圖簡述
圖1是根據本法明的說明性實施方案的顆粒分選系統的示意圖。
圖2至圖4表示了圖1中的顆粒分選系統的工作過程。
圖5表示具有用於致動器腔室和緩衝器腔室的備選位置的顆粒分選系統。
圖6表示根據本發明的另一個實施方案的顆粒分選系統。
圖7表示適用於本發明的顆粒分選系統的氣泡閥。
圖8是本法明的說明性實施方案的顆粒分選系統的示意圖。
圖9表示根據本發明教導的用於分選平行顆粒流的顆粒分選系統的一個實施方案。
圖10表示根據本發明教導的構造成二叉樹型分選構造的顆粒分選系統的一個實施方案。
圖11表示用於以多個階段分選平行顆粒流的多級顆粒分選系統的另一個實施方案。
圖12表示根據本發明的備選實施方案的並聯顆粒分選系統。
圖13表示根據本發明另一個實施方案的並聯顆粒分選系統。
圖14a和14b表示根據本發明另一個實施方案的顆粒分選系統，包括用來測量顆粒尺寸和/或速度的光掩模。
圖15表示根據本發明另一個實施方案的具有可變通道的並聯分選系統。
圖16表示根據本發明另一個實施方案的並聯分選系統的可變陣列設計。
圖17表示根據本發明另一個實施方案的並聯分選系統。
圖18表示用於實施本發明的顆粒分選系統的藥物篩選系統。
發明詳述本發明提供了一種用於分選懸浮在液體中的顆粒的顆粒分選系統。該顆粒分選系統具有對預定特性顆粒的高通過量和低錯誤分選度。以下將結合說明性實施方案來詳細描述本發明。本領域技術人員應明白本發明可以具有多種應用方式和實施方案，並不特別局限於應用在此處所描述的特定實施方案中。
在此所用的術語「管道」「通道」和「流動通道」指的是在媒質裡形成的或者穿過媒質形成的允許流體如液體和氣體移動的路徑。在微流控系統中通道的橫截面尺寸優選為大約1.0μm至大約500μm，優選為大約25μm至大約250μm，最優選為大約50μm至大約150μm。一個本領域的普通技術人員能夠確定該流動通道的容積和長度。該範圍意在包括上述值作為上限或下限。流動通道可具有任何選定的形狀或排布方式，例如包括線性的或非線性的構造以及U型構造。
術語「顆粒」指的是物質的離散單元，包括但不限於細胞。
在此所用的術語「傳感器」指的是用於測量目標物質，例如顆粒的特性的裝置。
在此所用的術語「氣泡閥」指的是可產生壓力脈衝以控制通過通道的流體流動的裝置。
在此所用的術語「載液」指的是用於運載一個或多個顆粒通過管道或通道的顆粒周圍的相容性液體外層。
圖1是根據本發明教導的顆粒分選系統10的示意說明。根據本發明的一項應用，顆粒分選系統10包括用於分選顆粒的毛細尺寸的封閉通道系統。該通道系統包括用於引入顆粒流18的第一供管12和用於提供載液的第二供管14。第一供管12形成管口12a，並且將顆粒流引入載液流中。第一供管12和第二供管14與測量管16流體連通，用於運送懸浮在載液中的顆粒。測量管在分支點21處岔分成第一支路通道22a和第二支路通道22b。測量區域20限定在測量管16中，並且與檢測器19聯合以檢測通過測量區域20的顆粒的預定特性。兩個相對的氣泡閥100a和100b相對於測量管放置並與其流體連通。這些閥彼此相對地隔開，當然普通技術人員應明白還可以用其它的構造方式。氣泡閥100a和100b通過一對相對的邊路通道24a和24b分別與測量管16連通。液體可以部分填充這些邊路通道24a和24b從而在其中形成彎液面25。彎液面確定了載液與相關氣泡閥100的儲液池中其它流體，譬如氣體的分界面。還提供了一個致動器26用於啟動其中一個氣泡閥，當其被致動器26激活後可以在管道中暫時地造成流動幹擾使其中的流體發生偏轉。如圖所示，致動器與氣泡閥100b耦連。第二氣泡閥100a用作緩衝器以吸收由第一氣泡閥100b產生的壓力脈衝。
第一個邊路通道24b與第一個氣泡閥100b中的加壓腔室70b液壓式地相連，這樣如果該加壓腔室的壓力升高，邊路通道附近的測量管中的流動就向內位移，基本垂直於與管內常規的流動方向。與第一邊路通道24b相對設置的第二邊路通道24a與在第二氣泡閥100a內的緩衝器腔室70a液壓式的相連接，用於吸收瞬間壓力。第一邊路通道24b與第二邊路通道24a協同作用從而控制了前面所提到的通過向加壓腔室70b加壓而造成的液體位移，這樣該位移就具有與通過測量管的常規顆粒流的方向相垂直的分量。
通過向加壓腔室70b加壓，許多液體瞬間從第一邊路通道24b中放出。一旦加壓釋放時，第二邊路通道24a的彈性就導致管道中的瞬間液流流入第二邊路通道24a。通過外部致動器26響應於檢測裝置19發出的信號而向加壓腔室70b加壓和減壓，兩個邊路通道的協同作用和它們相互交連的流控構造使得通過測量管16的流體瞬間來回地移動到支路中。這種瞬間液體位移具有與管道中常規流動相垂直的分量，可以被用於使具有預定特性的顆粒發生偏轉，以便將它們和混合物中的剩餘顆粒分離開來。
如圖所示，測量管16在分支點21岔分為兩個支路22a，22b，這些支路中的流體流動速度調整後使得顆粒通常流過兩個支路中的第二個支路22b。支路22a和22b之間的角度為0至180度，優選為10至45度。然而，該角度甚至可以為0度，這對應於兩個彼此間具有直型隔壁的平行管道。
優選將被分選顆粒提供到中心流體流的測量位置上，其周圍是不含顆粒的液體外層。限制顆粒流的方法是已知的，通常稱為「外層流」構型。通常，通過將懸浮顆粒流經過狹窄出口噴嘴注射到在管道16中流動的不含顆粒的載液中，可以得到限制構型。通過調節懸浮液和載液的流速，就可以調整管內的徑向限制構型以及內部顆粒距離。較大流速的載液會導致更受限制的顆粒流，其顆粒之間具有較大的距離。
在由第一供管12引入的懸浮液中，可以區分開兩種類型的顆粒，普通顆粒18a和目標顆粒18b。一但檢測到測量區域20中的顆粒18b有預定特性，檢測器19就發出信號。當外部致動器26收到由檢測器19響應於所檢測的預定特性而發出的信號，就激活第一致動器氣泡閥100b在邊路通道24a，24b之間的測量管16內產生流動幹擾。該流動幹擾使具有預定特性的顆粒18b發生偏轉，使之流向第一支路管道22a而並非第二支路管道22b的下遊。檢測器與致動器26連接，使得當檢測器19檢測到顆粒的預定特性時，致動器就激活第一氣泡閥100b，以在第一氣泡閥的儲液池70b中產生壓力變化。第一氣泡閥的激活使在第一氣泡閥100b內的彎液面25b發生偏轉並在第一邊路通道24b中造成瞬間壓力變化。第二邊路通道24a和第二氣泡閥100a吸收測量管16中由致動器26引起的瞬間壓力變化。主要來說，第二氣泡閥100a的儲液池70a是具有彈性壁或者裝有可壓縮流體如氣體的緩衝器腔室。該彈性特性使得液流從測量管進入第二邊路通道24a，使壓力脈衝被吸收並且防止顆粒流中的非選擇的顆粒的流動受到幹擾。
在測量區域20，利用適當的傳感器19來檢測單個顆粒的特定特性，例如尺寸、形態、螢光強度以及其它對本領域技術人員來說顯而易見的特性。可用的傳感器例如本領域公知的各種類型的光學檢測系統，例如顯微鏡，機器視覺系統以及用於測量顆粒的電子特性的電子裝置。用於測量顆粒的螢光強度的系統是本領域尤為公知的系統。這些系統包括具有適當波長用以引發螢光的光源，以及用於測量所引發的螢光強度的檢測系統。該方法常常與用螢光標記物標記的顆粒結合使用，螢光標記物即那些用特定的第一波長光照射時會產生另一種特定波長光(螢光)的附著分子。如果檢測到該第二波長的光，就感測到所述特性並發出信號。
其它例子包括測量被流經測量區域的顆粒散射的光。分析散射光可得到有關顆粒尺寸和形態的信息，當檢測到預定特性時這些信息可被用於引發信號。
用於向第一氣泡閥的加壓腔室加壓的致動器26可包括外部致動器，其可對傳感器發出的顆粒具有預定特性的信號產生響應。適合於加壓的外部致動器有兩種。第一種直接向第一邊路通道24b內的液體提供氣壓。例如，致動器包括加壓氣體供源，其與邊路通道24b內液柱的轉換閥相連接。轉換器的激活將通道與加壓氣體供源相連接，使得液體內的彎液面發生偏轉。一旦停止激活後，轉換器又將通道24b連接回常規的工作壓力。
或者，位移致動器可以與具有可移動壁的加壓腔室結合使用。當位移致動器使加壓腔室的壁發生向內的位移時，其內部的壓力就升高。如果可移動壁向後位移到最初的位置，則壓力又降回至常規的工作壓力。合適的位移致動器例如通過勵磁線圈使活塞發生位移的電磁致動器。另一個例子是使用壓電材料，例如以柱狀或者疊層圓片的形式，通過施加電壓來產生線性位移。兩種類型的致動器都可驅動加壓腔室70的可移動壁，使其中的壓力發生改變。
圖2-4表示圖1的顆粒分選系統10中的轉換器40的轉換操作情況。圖2中，檢測器19檢測到顆粒中的預定特性並發出信號激活致動器26。一旦致動器被激活，第一氣泡閥100b的儲液池70b內的壓力升高，彎液面25b發生偏轉並使液體瞬間從第一邊路通道24b釋放，如箭頭所示。由於第二氣泡閥100a的儲液池的彈性性能，管內該處壓力的突然增加使得液體流進第二邊路通道24a。箭頭表示出了液體進入第二邊路通道24a的移動過程。結果，如圖所示，測量管16內的流體流動發生偏轉，使位於第一邊路通道24b和第二邊路通道24a之間的所選目標顆粒18b朝著與其常規狀態下的流向相垂直的方向轉移。選擇對測量管16、第一支路22a以及第二支路22b的流動阻力，使到達或者來自第一邊路通道24b和第二邊路通道24a的流體的優選流動方向具有明顯的與測量管16中常規流動方向垂直的分量。該目標可以通過例如第一支路22a和第二支路22b來達到，使它們對流體的阻力比第一邊路通道24b和第二邊路通道24a的大。
圖3表示第一氣泡閥的儲液池處於減壓過程中的顆粒分選系統10，此時目標顆粒18b已離開第一邊路通道24b和第二邊路通道24a之間的容積。致動器26停止激活後，使儲液池70a，70b內的壓力回到常規的壓力下。在該減壓階段，氣泡閥的兩個儲液池70a，70b之間存在負壓差，使第一邊路通道24b和第二邊路通道24a之間通過的液流方向與前幅圖中箭頭所示的液流方向相反。
圖4表示完成了轉換順序的顆粒分選系統10。氣泡閥的儲液池內的壓力相等，使通過測量管16的流體流動趨於正常。因為目標顆粒18b已經發生徑向位移，其將流入第一支路22a，而其它的顆粒則繼續流入第二支路22b，從而根據預定的性質將顆粒分離開。
檢測和選擇性地使顆粒發生偏轉的這種過程可以每秒鐘重複多次，從而高速地分選顆粒。採用所述的流體轉換過程時，轉換操作可以每秒鐘執行到大約幾千次之多，達到的分選速率為每小時大約分選百萬個顆粒。
根據本發明的另一個實施方案，致動器氣泡閥100a和緩衝器氣泡閥100b可放置到不同的位置。例如，如圖5所示，致動器氣泡閥100a與第一邊路通道24a和/或緩衝器氣泡閥100b與第二邊路通道24b可以設置在分支點21的上遊。這些元件可設置在任何適當的位置，以使致動器腔室70a和緩衝器腔室70b之間的流動阻力小於任何這些後面的組件與其它壓力供源之間的流動阻力。更特別的是，致動器腔室70a和緩衝器腔室70b可設置得使它們之間的流動阻力小於在顆粒流中的所選顆粒與後繼顆粒之間的流動阻力。這些組件以這種方式放置，因而防止了由上述使單個所選顆粒發生偏轉的方法產生的壓力波向上遊或者下遊傳播，以及避免影響顆粒流中其餘顆粒的流動。流動阻力之間較大的差異使得具有相關瞬間壓力的流控轉換操作和系統中剩餘部分的流動特性以較高水平分隔開。此外，現場抑制所產生的用於分選的壓力脈衝允許實施包含多個轉換器40的分選網絡，每個轉換器與其它的轉換器之間液壓和氣壓地隔離開。
根據另一個實施方案，如圖6所示，本發明的顆粒分選系統可將任何適合的壓力波發生器(代替氣泡閥)與一個或多個作為緩衝器的氣泡閥，例如閥100b結合使用。例如，壓力波發生器260可包含諸如壓電柱或步進電機這樣的致動器，其具有直接或通過通道系統的偏轉而對流動液體起作用的活塞，用以在致動器被信號激活時選擇性地使顆粒發生偏轉。其它合適的壓力波發生器包括電磁致動器、熱力氣動致動器以及熱脈衝發生器，通過施加熱脈衝用以在流動液體中產生蒸汽氣泡。緩衝器氣泡閥100b設置成可吸收由壓力波發生器260產生的壓力波以防止對顆粒流中其它顆粒的幹擾。通過改變緩衝器腔室70b的容積，邊路通道24b的橫截面面積和/或構成緩衝器腔室70b的彈性膜(圖7中附圖標記72)的剛性或厚度，可使緩衝器100b的彈性常數根據特定的需要而改變。
圖7表示根據本發明的教導，適用於產生壓力脈衝來將目標顆粒從顆粒流中的其它顆粒中分離出來和/或起到緩衝器作用以吸收壓力脈衝的閥100的實施方案。如圖所示，閥100與基板上形成的通向測量管16的邊路通道24a或24b相鄰近。邊路通道24a包括由通道側壁上的開口形成的流體分界面口17。密封的加壓腔室70位於邊路通道24a附近並通過流體分界面口與邊路通道相連通。所示腔室70由密封壁71和彈性膜72構成。邊路通道24a中的載體流在邊路通道和腔室之間的分界面形成彎液面25。致動器26壓下彈性膜使腔室內的壓力升高，使彎液面發生偏轉並在載液中形成壓力脈衝。
圖8表示分選模塊50，其具有適當供管52用於提供被分選的顆粒流，以及第一出口管54和第二出口管56，兩個出口管都可運載在分選模塊50中被分選的顆粒。分選模塊50包括檢測系統19，用於檢測通過供管52進入分選模塊50的顆粒，供管52可操作地與轉換器40連接用以提供所需的轉換性能來分選顆粒。圖1中的第一支路22b與第二支路22a可設置成與出口管54第二出口管56流控連接。
圖9表示根據本發明另一備選實施方案的顆粒分選系統500，包括多個可以以任何結構連接在一起的分選模塊50。例如，該實施方案中的模塊50成並聯形式。分選模塊50的出口管54與第一聯合出口58相連接，第二出口管56與第二聯合出口60相連接。該分選模塊的並聯排布形式得到聯合的分選模塊50系統，其具有的總分選速率為單個分選模塊50分選速率的N倍，其中N為所並聯的分選模塊50的數目。
圖10表示根據另一個實施方案的顆粒分選系統550，包括與第二分選模塊50b串聯的第一分選模塊50a。第二分選模塊50b用於分選具有預定特性的顆粒，該性質與第一分選模塊50a所分選顆粒的預定特性相同或者不同。顆粒流通過供管52進入第一分選模塊50a，可含有至少兩種類型的顆粒。第一類型的顆粒在第一分選模塊50a中分選出，並通過第一出口管54a流出。其餘的顆粒通過第二出口管56a流出第一分選模塊50a，並通過第二供管52b進入第二分選模塊50b。具有其它預定特性的顆粒從該顆粒流分選出來並通過第二出口管54b流出。兩種預定特性都不具備的顆粒通過第二出口管56b流出第二分選模塊50b。本領域技術人員容易得知，根據所需要的結果，可使用任何適合類型的分選模塊50，並以各種方式相連接。
圖11表示根據本發明另一個實施方案的高通過量-低誤差性分選過程的分級構造。該說明性實施方案為兩級顆粒分選系統800，第一步用於分選多個平行的顆粒流，匯集第一步的流出結果，然後在第一步流出結果的基礎上實施第二級分選過程。來自顆粒輸入腔室88的懸浮液80中的流入顆粒流被分在N個單獨的分選通道81a-81n中，每個通道每秒鐘能夠分選預定數目的顆粒。每個通道81包括檢測區域84，用於檢測顆粒並識別具有預定特性的顆粒，以及轉換區域82，用於將具有預定特性的顆粒與流體中的其它顆粒分離開來，如上面所述。轉換區域82根據在檢測區域84所測的顆粒特性在該轉換區域82形成兩股顆粒的流出流「選定」流和「廢棄」流。來自每一通道的「選定」流在匯集區域86匯集成一股流，以便在二級分選通道810中再次被分選。如圖所示，二級分選通道810根據預定的特性重複檢測和分選的分選過程。
假如每個單獨通道的分選過程產生某個誤選擇的誤差(y)率(y是顆粒被錯誤選擇的概率，小於1)，則對如圖所示的2步分級過程來說分級構造產生更低的錯誤率y2，或者對n步分級過程來說產生錯誤率為yn。例如，如果單個通道的錯誤率為1％，則2步的錯誤率為0.01％，或者104分之一。
或者，該構造是每個二級通道有M套初級裝置，每套初級裝置包含N個分選通道。假設在該應用中需要捕獲在輸入流中存在概率為Z的顆粒，並且單個的通道分選器的每秒最大顆粒分選率為x。系統的通過量為M*N*x個顆粒每秒。每秒聚集在N個通道中的顆粒數目為N*x*z，這樣N*z必須小於1以使從N個通道聚集的所有顆粒可以由單個二級通道來分選。為了使通過量高於N＝1/z，必須增加並聯的N個初級+1個二級通道。這樣總通過量就來自M*N*x並具有M個二級通道。
圖12表示根據本發明另一個實施方案的並聯-串聯顆粒分選系統160。該並聯-串聯顆粒分選系統160包括第一併聯分選模塊161和第二並聯分選模塊162。第一併聯分選模塊161用於分選多重標記的顆粒，並且分選出具有兩種標記物的顆粒並運送到出口通道165。
圖13表示另一種並聯-串聯顆粒分選系統170。第一併聯分選模塊171分離具有第一標記物的顆粒，收集這些來自於不同通道的顆粒並運送這些具有第一標記物的顆粒通過第一出口通道175。然後所有其它的顆粒被引入第二並聯分選器172，用以分選具有第二標記物的顆粒。收集具有第二標記物的顆粒並運送通過第二出口通道176。既不具有第一標記物也不具有第二標記物的顆粒被運送通過第三出口通道177。
根據本發明的一個實施方案，如圖14a和14b中所示，顆粒分選系統可包括用於測量顆粒速度、位置和/或尺寸的傳感器。對速度、位置和/或尺寸的測量可以與對分選顆粒的分類同時進行或不同時進行。如圖11所示，基於並聯通道的系統中，不同的通道可具有不同的流動阻力，使每個通道中顆粒或細胞的速度不同。在檢測區84與轉換區域82以距離L相隔開的系統中，必須已知通道81中顆粒的速度以便設定轉換滯後時間T(即相對於檢測目標顆粒的時刻滯後的致動轉換時間)。
在用於檢測細胞或顆粒的大多數光學系統中，在其中細胞引起檢測區中的光電檢測器發光的區域具有比細胞直徑大得多的尺寸。這樣，當在檢測區域檢測到光時，細胞可以在該區域的任何位置，使得難以定位細胞的確切位置。為了提供更精確的檢測，可以使光學檢測器的多個像素覆蓋檢測區，但是這樣將會造成很高的費用而且需要複雜的支持電子設備。
根據本發明所示的實施方案，可將光掩膜140加到檢測區域，以便通過在分選晶片上直接沉積「掩膜圖案」，提供對速度的準確檢測。可以這樣沉積掩膜圖案，使掩膜圖案的邊緣相對於細胞分選致動器區域82定位精確(現有技術精確至＜1um)。當細胞沒有被掩膜時，用於捕獲檢測區84內細胞發出的光的單個光學檢測器就可見到光。通過已知長度的掩膜的不透明連接組件「條」中的一個所產生的避光持續時期，可以對速度進行測定。
具有一些尺寸為10um到30um、變化幅度為1um的條141的掩膜圖案導致只有尺寸大於細胞的條可以最小化來自於細胞的信號。因此，這樣的圖案也可以用於測量細胞大小，而不依賴細胞的信號。這樣一種「梯度掩膜」也可在光學檢測器上產生圖案，其可用於多次分析和測量速度以減小速度估計值的偏差。由掩膜140引起的光圖案還使檢測器能識別掩膜140的每條邊緣。如果所有條141都相同，則對每個條的光信號也相同，並且人們只有通過順序才可以把它們區分開。因此，梯度掩膜圖案將使得單個檢測器監測到較寬範圍的區域(細胞大小的幾倍)，從而測量細胞的速度，測量檢測區域84內位置精度為1um，其和通道結構以及晶片上致動器的位置相關的準確，以及識別細胞尺寸，其精度由梯度圖案決定。梯度掩膜140使檢測器能測量這些參數，而與光學系統的放大倍率或光學檢測器本身的性質無關。
本領域技術人員應明白，按照本發明的教導，分選系統也可以利用用於測量顆粒尺寸、位置和或速度的其它裝置。這些適合的裝置對本領域普通技術人員來說是很容易獲得並已知的。
根據被發明的另一個實施方案，如圖15所示，顆粒分選系統包括不相同分選通道的陣列8000。就空間、光強度利用以及和最佳外部致動器的適配性來說，使用包括一系列不相同的分選器通道810a-810n的並聯陣列更為有效率。由於能夠準確地感測顆粒的速度，因此在性能檢測過程和使具有預定特性的顆粒發生偏轉的轉換激活過程之間，通道就不需要固定的滯後段。這樣就可以改變通道的一些參數，例如檢測器84和轉換器82之間的距離L，或檢測器84與轉換器82之間的通路形狀。
將單個雷射器用作垂直於晶片方向的單波長光源時，需要該雷射器照射的區域限定為(通道數目)×((檢測區域處通道的寬度)+(內部通道間隔C))(見圖15)。然而，能吸收光從而產生螢光的活性區域僅僅是通道面積(通道數目)×(通道寬度)，其得到填充因子為(通道寬度)/(通道寬度+C)。優選接近100％的填充因子以避免浪費有效入射光。
因此，使並聯分選系統的通道間間隔最小化對於光檢測區域和光學系統的效率來說十分重要。在本發明的可變陣列設計中，如圖16所示，在檢測區域84中的通道間隔達到了通道的寬度，這樣光利用率達到了大約50％。在致動區域82中的通道間隔可以更大，如圖16所示。沿通道的致動器26的位置也可以改變以便使外部驅動致動器具有較大的有效半徑。
可變陣列8000在選定通道處還可包括用於平衡所有通道的流動阻力的曲徑(meander)，這樣假如所有通道的壓力都降了定值，顆粒的速度也幾乎相匹配。這些可以加在所示系統的上遊或者下流，即在檢測器和致動器之間的區域中。由於通過設計可以得知每個通道的檢測區域82I與其致動器26i之間的長度Li，測量顆粒速度與確定哪些顆粒應保留下來可以同時進行，就提供了一種改進的細胞分選系統。
圖17表示根據本發明另一個實施方案的顆粒分選系統1700。該顆粒分選系統1700包括多個並聯工作的分選模塊1701。顆粒分選系統1700包括用於將樣品引入各個分選模塊的注入區域1710和用於測量檢測區域內每個分選通道1702中的顆粒預定特性的檢測區域1720。系統還含有轉換區域1730，包括在每個分選模塊中的致動器，用於將具有預定特性的顆粒與不具有預定特性的顆粒分離開來。如圖所示，在圖17的實施方案中，檢測區域1720中每個分選通道1702之間的分選通道距離小於轉換區域1730中通道間距離。檢測區域中靠近的間距節約了用雷射檢測顆粒時的成本，而轉換區域1730內較大的距離間隔可適應各種尺寸的致動器。
顆粒分選系統1700還可包括二級分選模塊1740，用於根據預定的特性重複檢測和分選的分選過程，以提高分選過程的準確度。根據一個實施方案，在初級分選模塊1701和二級分選模塊1740陣列之間，系統可包括富集區域1750，用於將顆粒從初級分選過程過渡到二級分選過程。根據所示實施方案，富集區域1750對顆粒的過渡是通過在顆粒進入二級分選模塊1740之前從顆粒中去除多餘的載液來完成的。富集區域1750還可包括水合裝置，用於向富集後的顆粒中加入二級載液。富集區域1750可包括插入出口通道1703的膜件，隔斷出口通道1703的富集通道，以及將出口通道與富集通道相隔開的膜件。在將所選顆粒送入第二分選模塊1740之前，通過膜件去除出口通道1703中所選顆粒流中的過量載液，並將其送入富集通道。
申請號為10/329018，題目為「微流控系統中微流控組件的實現」的美國專利中描述了適用於形成富集區域的系統，在此引入其內容作為參考。
根據所示實施方案，去掉的載液可以再利用並填注回初級通道的入口。回收通道或者其它裝置可以將富集區域連接到初級通道，使後面的分選過程可以再利用上述載液。或者，可以在去除廢棄顆粒之前將載液中從廢棄顆粒中去掉並引入初級通道進口中。
本發明的顆粒分選系統在微流控技術領域具有多種應用。根據一種應用，可以將顆粒分選系統實施於如圖18所示藥物篩選系統中。如圖18所示，藥物篩選系統140包括顆粒分選模塊10，用於將目標細胞從包含該目標細胞的樣品中識別和分離出來。將含有目標細胞的樣品由注入通道引入篩選系統，並通過顆粒分選模塊，其使目標細胞與剩餘樣品分離開來並使目標細胞經過混合溫育區域141。將測試化合物通過測試通道142引入混合溫育區域141並與由顆粒分選子系統10提供的目標細胞接觸。然後在檢測區域145檢測測試化合物對目標細胞產生的效果。
具有顆粒分選器10的說明性藥物篩選系統140可以使用多種類型的標記物。該藥物篩選系統可使用能測量特定酶的活性的標記物，從而可以用來搜尋對酶存在的通路的調節器。藥物篩選系統還可以使用能測量任何細胞內信使/信號和標記物的濃度的標記物，以識別特定細胞類型，特別是稀有的(每一百個細胞中少於一個)類型。例如，適合的標記物包括但不限於，細胞表面標記物，如抗體和重組體顯示技術，以及螢光酶底物標記物，細胞內信號結合化合物如Ca++結合螢光染料(Fura-3，Indo-1)，和生物發光酶底物標記物。在螢光酶底物標記物中，化合物進入細胞並被特定的細胞內酶轉變成螢光物質。例如用於ALDH酶的Bodipy氨基乙醛或BAAA，用於磷酸酶的MUP(4-methylumbelliferyl phosphate)和用於細胞氧化還原體系的二氫羅丹明123。可用於本發明方法的其它螢光染料的例子包括，在生物發光酶底物標記物中，化合物進入細胞並與特定的胞內酶作用直接發光。通常該技術可與報導基因結合以觀察基因的活化。例子包括D-螢光素和相關的報導基因，以及DMNPE和相關的報導基因。
在所示的應用中，可以根據對各種化學和生化體系的效應篩選任何數目的不同化合物。例如可以篩選化合物對阻斷、減緩或其它方式抑制與效應不可預料的生化體系相關的關鍵事件的效應。例如，可以篩選測試化合物阻斷體系的能力，該體系造成，或至少部分造成了疾病的發作或疾病出現特殊的症狀，包括例如，遺傳性疾病，癌症，細菌或病毒感染等等。在這些篩選測定方法中顯示了樂觀結果的化合物可接著被用於進一步的試驗以鑑別對疾病或疾病症狀治療有效的藥理學試劑。
或者，可以針對促進，提高或者其它方式引發生化體系的能力篩選化合物，該生化系統具有預期的功能，例如治療患者中存在的缺陷症。
本發明可用於分離稀有細胞(即組成不到注入樣品的0.1％-1％)的各種應用，例如但不限於細胞再植，細胞移植和細胞轉染或者再植或移植前的基因修飾。本發明還可用於分離樣品中的腫瘤細胞，以用於發展特定治療法。
本發明還可被用於篩選作用於原生細胞的化合物，例如在通過血液分離(apheresis)獲得1011個細胞並且篩選任何亞群而非細胞系。本發明還可以用於篩選作用於不完全細胞系的化合物，其中在該篩選程序中不到100％的細胞系表達了正確的基因。本發明還可被用於篩選對處於特定細胞周期階段的細胞起作用的化合物，例如，篩選對僅處於複製期的細胞起作用的化合物。
本發明已通過有關說明性實施方案進行了描述。由於在不偏離本發明範圍的情況下，上述構造可以做一定的改變，因此上述說明中所包含或附圖所示的所有內容只意在解釋性說明而並無限制性含義。
還應明白的是，下面的權利要求將包含這裡描述的本發明的所有一般和特殊的特徵，並且可以說本發明所有要求的範圍，作為語言表述，都落在其中。
說明了本發明之後，作為新發明所要求的並被專利許可證保護的內容有
權利要求
1.一種微流控系統，包括基板形成於所述基板上的細胞分選系統，用於基於預定的特性分選細胞；以及形成於所述基板上用於篩選細胞的篩選系統，所述篩選系統具有用於混合具有預定特性的細胞和測試化合物的混合區域，以及用於檢測所述測試化合物對具有特定特性細胞的作用的檢測區域。
2.如權利要求1的微流控系統，進一步包括在細胞分選系統和篩選系統之間的連接通道，用於將所選定的細胞從細胞分選系統運送到篩選系統。
3.如權利要求1的微流控系統，其中所述細胞分選系統包括用於運送載液中的懸浮細胞流的第一管道，包括入口、第一出口和第二出口；用於檢測顆粒的預定特性以及顆粒的尺寸和速度之一的傳感器；與第一管道相連通的邊路通道；位於所述邊路通道附近的封閉腔室，其中載液在邊路通道中形成彎液面以將封閉腔室與載液相隔開；以及致動器，當檢測器檢測到所述預定特性時，該致動器改變封閉腔室內的壓力使彎液面發生偏轉，藉由彎液面的偏轉使得具有所述預定特性的細胞流進第二出口，而不具有所述預定特性的顆粒流進第一出口。
4.如權利要求3的微流控系統，其中所述細胞分選系統進一步包括用於吸收第一管道中壓力變化量的緩衝器。
5.如權利要求3的微流控系統，其中所述致動器包括加壓氣體源。
6.如權利要求3的微流控系統，其中所述封閉腔室包括可移動壁。
7.如權利要求5的微流控系統，其中所述致動器包括位移致動器，用於移動所述封閉腔室的可移動壁以改變所述封閉腔室中的壓力。
8.如權利要求7的微流控系統，其中所述致動器包括電磁致動器和壓電元件中的一種。
9.一種用於篩選測試化合物的系統，包括一種用於將目標顆粒從含有所述目標顆粒的樣品中分離出來的顆粒分選系統，所述顆粒分選系統包括用於運送樣品的第一管道，包括入口、第一出口和第二出口；用於檢測目標顆粒中的預定特性的傳感器；與第一管道相連通的邊路通道；位於所述邊路通道附近的封閉腔室，其中所述第一管道中的載液在所述邊路通道中形成彎液面以將所述封閉腔室與所述載液相隔開；以及致動器，當傳感器檢測到所述預定特性時，該致動器改變封閉腔室內的壓力使彎液面發生偏轉，藉由彎液面的偏轉使得具有所述預定特性的顆粒流進第二出口，而不具有所述預定特性的顆粒流進第一出口與所述第二出口連接的混合溫育區域，用於接收目標顆粒和測試化合物以及用於將所述測試化合物與所述目標顆粒混合；以及用於檢測所述測試化合物對目標顆粒的作用的檢測區域。
10.一種測試化合物對靶細胞的作用的方法，包括基於預定的特性分選一組細胞；通過連接通道將具有所述預定特性的細胞運送到混合區域；以及將化合物引入到所述混合區域。
11.一種篩選原生細胞的方法，包括分選一組細胞以將一個細胞亞群從該組中分離出來；將化合物加入所述細胞亞群中；以及分析所述細胞亞群以確定所述化合物對所述細胞亞群的作用。
12.一種分析化合物副作用的方法，包括提供一組原生細胞；將化合物加入所述原生細胞中；測量所述原生細胞以確定由所述化合物引起的活性；將具有活性的原生細胞與不具有活性的原生細胞分離開來。
13.權利要求10所述的方法，其中所述預定特性為存在預期的標記物。
14.權利要求13所述的方法，其中所述預期的標記物為抗體、酶、底物、輔助因子、螢光染料或者報導基因。
15.一種用於篩選化合物對調節細胞活性的能力的方法，其中使所述細胞與測試化合物接觸，並且用權利要求1的微流控系統監測所述細胞對所述測試化合物的響應。
16.一種利用微流控系統從細胞群體中分離細胞亞群的方法，包括從具有預期表現型的群體中識別細胞；以及從不具有所述預期表現型的細胞中分離所述細胞。
17.權利要求16所述的方法，其中所述細胞群體為分離的原生細胞培養物。
18.權利要求16所述的方法，其中所述細胞群體為細胞培養物。
19.一種分離用於細胞移植的細胞亞群的方法，包括識別具有預期表現型的細胞；利用微流控裝置分離所述細胞；從而分離用於移植的細胞亞群。
20.一種分離將進行遺傳修飾的細胞亞群的方法，包括基於預期的表現型識別細胞群體中的細胞亞群；利用微流控裝置分離所述細胞；從而分離將進行遺傳修飾的細胞亞群。
21.權利要求20的方法，其中所述分離的將進行遺傳修飾的細胞被再植入目標中。
22.一種分離細胞亞群的方法，包括識別顯示了細胞周期階段特定標記物的細胞亞群；利用微流控裝置分離所述細胞；從而分離處於相同細胞周期階段的細胞亞群。
23.一種測試化合物對體內酶活性調節能力的方法，包括向細胞群體加入化合物，其中所述化合物被所述細胞酶激活時會發出螢光；以及測量所述細胞螢光以確定所述化合物對調節酶活性的能力。
全文摘要
本發明涉及一種通過毛細尺寸的封閉通道系統來分選顆粒的方法和設備，包括氣泡閥，用於選擇性地產生壓力脈衝以將具有預定特性的顆粒從顆粒流中分選出來。該顆粒分選系統可進一部包括用於吸收所述壓力脈衝的緩衝器。顆粒分選系統可包括多個緊密相連的分選模塊，它們相結合可進一步提高分選率。顆粒分選系統可包括多級分選裝置，用於連續地分選顆粒流，以降低錯誤率。
文檔編號B07C5/00GK1735466SQ03825178
公開日2006年2月15日 申請日期2003年9月16日 優先權日2002年9月16日
發明者J·R·吉爾伯特, S·貝姆, M·德什潘德 申請人:塞通諾米公司