OsPT2磷高效利用轉基因大豆培育方法

2023-09-20 09:35:10 2

OsPT2磷高效利用轉基因大豆培育方法
【專利摘要】本發明屬於分子生物學與生物【技術領域】，涉及一種磷轉運蛋白基因OsPT2及該基因在轉基因作物育種中的應用，提供含該基因的表達盒及構建、重組植物表達載體及含該載體的宿主菌、磷高效利用轉基因大豆的培育方法和OsPT2基因相對表達量的測定方法、試劑盒。本發明解決現有技術中磷轉運蛋白基因OsPT2在大豆育種中的空白，通過選擇合適的酶切位點，在OsPT2基因引入35s啟動子和終止子，增加了OsPT2基因在外源基因中的表達調控，構建的重組植物表達載體含有除草劑抗性基因bar基因，既方便檢測又增加轉基因植株對除草劑的抗性，以本發明培育方法生產出的大豆，能高效利用磷。
【專利說明】0sPT2磷高效利用轉基因大豆培育方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於分子生物學與生物【技術領域】，涉及一種磷轉運蛋白基因0sPT2及該基因在轉基因作物育種中的應用，具體涉及一種磷轉運蛋白基因0sPT2表達盒、該表達盒的構建，及利用該表達盒進行磷高效利用轉基因大豆的培育方法、在培育過程中所使用的表達載體和宿主菌及應用以及該種轉基因大豆的檢測試劑盒和定量檢測方法。
技術背景
[0002]磷(P)是植物生長發育所需的大量元素之一，幾乎參與所有生命的重要代謝活動，在植物體內的能量傳遞、信號傳導、光合作用及呼吸作用等過程中起到關鍵作用；此外，磷還是細胞核及磷脂的重要組成成分(Raghothama K G, Phosphate transport andsignaling.Current Opinion in Plant Biology, 2000.3 (3): 182—187)。植物從土壤中獲取磷僅以磷酸鹽(Pi)形式獲取。儘管土壤中總磷含量比較高，但由於磷酸鹽濃度較低(0.1 - 10 μ M)而成為限制植物生長限制因子之一(Raghothama K G and Karthikeyan AS，Phosphate acquisition.Plant and Soil, 2005.274:37-49)。我國農田約有 2/3 嚴重缺磷，其中紅壤作為我國南方主要的耕作土壤，其獨特的理化性質，使其中的磷素更容易被固定，從而表現出嚴重缺磷現象(李傑，石元亮，陳智文，我國南方紅壤磷素研究概況.土壤通報，2011.42 (3): 763-768)。為了獲得較高產量，全球每年約3千萬噸磷肥施用於耕地土壤，其中高達 80 % 被浪費掉(L0pez_Bucio J, de la Vega 0M, Guevara-Garcia A andHerrera-Estrella L.Enhanced phosphorus uptake in transgenic tobacco plants thatoverproduce citrate.Nature Biotechnology, 2000.18:450-453)。大量憐肥的施用加速土壤退化及環境汙染，並造成磷資源浪費，據估算磷礦資源將在本世紀末消耗殆盡(HataS，Kobae Y and Banba M, Interactions between plants and arbuscular mycorrhizal fung1.1nternational Review of Cell and Molecular Biology, 2010.281:1-48)。
[0003]大豆是需磷量較多的作物，也是世界普遍種植的作物之一，是人類最主要的植物油及蛋白來源(Herridge D F，Peoples M B and Boddey R M, Global inputs of biologicalnitrogen fixation in agricultural systems.Plant and Soil,2008.311:1-18)。 土壤低憐限制著大豆的產量(Vance C P, Symbiotic nitrogen fixation and phosphorusacquisition.Plant nutrition in a world of declining renewable resources.PlantPhysiology, 2001.127:390-397)。而近年來包括中國在內的世界各國對大豆的消費迅速增長，使大豆生產的供需矛盾越來越突出，特別是在我國，直接關係到國家經濟發展和糧食安全(程鳳嫻，塗攀峰，嚴小龍，王秀榮，廖紅，酸性紅壤中磷高效大豆新種質的磷營養特性.植物營養與肥料學報，2010.16(1):71-81)。
[0004]近年來，將高親和磷轉運蛋白基因轉入到合適的經濟及農作物中，獲得磷高效的轉基因材料是培育磷高效作物新品種的一種有效途徑，如大豆中超表達GmPT5基因，轉基因植株的磷含量在低磷及高磷條件下均比對照的磷含量顯著增加(Qin L, Zhao J, TianJ, Chen L Y, Sun Z A, Guo Y X, Lu X, Gu M, Xu G H, Liao H.The high-affinity phosphatetransporter GmPT5regulates phosphate transport to nodules and nodulation insoybean.Plant Physiology, 2012, 159:1634-1643)。水稻中分別超表達 OsPTl、0sPT2 及OsPTS,在低磷條件下可增加磷從地下部到地上部的運輸，從而提高植株耐低磷能力(JiaH F，Ren H Y, Gu M, Zhao J N, Sun S B, Zhang X, Chen J Y, Wu P and Xu G H, The phosphatetransporter gene OsPhtl ；8is involved in phosphate homeostasis in rice.PlantPhysiology, 2011.156:1164-1175 ；ffu P, Shou H X, Xu G H and Lian X M, Improvement ofphosphorus efficiency in rice on the basis of understanding phosphate signaling andhomeostasis.Current Opinion in Plant Biology, 2013.16:1-8)。菸草(Nicotiana tabacumL.)NtPTl在水稻中超表達，在低磷及高磷條件下均能夠顯著增加轉基因植株的磷含量(Park M R, Baek S H, Reyes B G and Yun S J, Overexpression of a high-affinity phosphatetransporter gene from tobacco (NtPTl) enhances phosphate uptake and accumulation intransgenic rice plants.Plant and Soil, 2007.292:259-269)。由此可見，植物中超表達憐轉運蛋白基因在低磷條件下可增加磷的吸收及提高耐低磷能力。 [0005]水稻(Oryza sativa L.)Phtl家族基因之一的磷轉運蛋白基因0sPT2主要在根中柱、葉韌皮部、木質部中表達，是磷飢餓信號的應答基因，負責植物對磷的吸收及磷在體內的轉運過程(Wu P, Shou H X, Xu G H and Lian X M, Improvement of phosphorus efficiencyin rice on the basis of understanding phosphate signaling and homeostasis.CurrentOpinion in Plant Biology, 2013.16:1-8)。利用 RNA 沉默技術敲除 0sPT2 顯著增加磷的吸收及從根部到地上部分長距離運輸，並且超表達0sPT2能夠引起水稻地上部過量磷的積累，從而引起磷中毒。由於其特殊的表達模式，0sPT2被認為在植物磷轉運過程中起到重要的作用(Ai P H, Sun S B, Zhao J N, Fan X R, Xin W J, Guo Q, Yu L, Shen Q R, WuP, Miller A J and Xu G H, Two rice phosphate transporters, OsPhtl ；2and OsPhtl ；6, havedifferent functions and kinetic properties in uptake and translocation.The PlantJournal, 2009.57(5):798-809)。利用生物工程手段將此基因導入作物中，可改善作物磷吸收及利用效率，有效降低磷肥的施用量。但到目前為止，尚未發現有此基因在大豆中表達的報導，利用生物工程提高大豆磷高效利用也鮮有報導。

【發明內容】

[0006]本發明目的是解決現有技術中磷轉運蛋白基因0sPT2基因在大豆育種中的空白，實現大豆磷高效轉運、減少磷肥的過度使用，從而降低土壤退化速度。
[0007]為實現上述目的，本發明提供下述技術:
[0008]本發明提供一種磷轉運蛋白0sPT2基因表達盒，其序列為SEQ ID N0.2，具有EcoRI和HindIII雙酶切位點。
[0009]本發明還提供上述磷轉運蛋白0sPT2基因表達盒的構建方法，包括如下步驟:
[0010]I)設計引物，擴增序列為SEQ IDN0.1所示的0sPT2基因片段；其中，上遊引物Pl:如SEQ ID N0.3所示;下遊引物P2:如SEQ ID N0.4所示；
[0011]2)將0sPT2基因連接到PMD19-T質粒載體，轉化T0P10感受態細胞，提取陽性重組質粒，進行SacI和XbaI雙酶切，回收0sPT2基因片段；
[0012]3)進行植物表達載體pBI121SacI和XbaI雙酶切，回收pBI121大片段；[0013]4)以連接酶連接上述回收的0sPT2基因片段和pBI121大片段，形成連接產物，以連接產物轉化T0P10感受態細胞，37°C過夜培養，挑取單克隆擴大培養，篩選出轉化子；
[0014]5)提取步驟4)中轉化子的陽性重組質粒進行EcoRI及HindIII雙酶切，回收小片段，即得到0sPT2基因表達盒；
[0015]其中，步驟2)、3)和步驟5)中雙酶切體系為:50μ L體系中10XBufferl5y L，BSA0.5 μ L，DNA15 μ L, Sacll.0 μ L，XbaI1.0 μ L，ddH20 補至 50 μ L ;37°C反應 2h ;雙酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的片段；
[0016]步驟4)中連接反應體系為:10XT4ligase Buffer2.5μ L，pBI121 大片段 2μ L，0sPT2 基因片段 8 μ L，T4DNA 連接酶 I μ L, ddH20 補至 25 μ L。
[0017]本發明提供0sPT2基因在磷高效利用轉基因植物中的應用，優選地，在磷高效利用轉基因大豆中的應用。
[0018]本發明還提供一種磷高效利用轉基因大豆的培育方法，將水稻磷轉運蛋白基因0sPT2構建至植物表達載體pCAMBIA3301-0sPT2中，通過農桿菌介導的方法導入大豆；具體包括如下步驟:
[0019]I)重組植物表達載體pCAMBIA3301-0sPT2的構建:將水稻磷轉運蛋白0sPT2基因表達盒構建至植物表 達載體PCAMBIA3301中，形成重組植物表達載體pCAMBIA3301_0sPT2 ；
[0020]2) 0sPT2轉基因大豆轉化體的獲得:以大豆子葉節為外植體，通過農桿菌介導法，將植物表達載體pCAMBIA3301-0sPT2導入大豆基因組中，通過除草劑Bialaphos篩選獲得T0代轉化體；
[0021]3)轉0sPT2基因大豆T2代陽性植株的獲得=Ttl代植株通過自花授粉獲得T1代種子，T1代種子萌發後通過PCR及GUS染色鑑定出陽性植株，陽性植株自花授粉獲得T2代種子；T2代種子萌發後通過同樣的方法鑑定出陽性植株，獲得磷高效利用轉基因大豆。
[0022]本發明還提供一種重組植物表達載體pCAMBIA3301_0sPT2，含有上述的磷轉運蛋白0sPT2基因表達盒和除草劑抗性基因bar基因，水稻磷轉運蛋白0sPT2基因表達盒位於植物表達載體PCAMBIA3301的EcoRI及HindIII酶切位點之間。
[0023]上述的植物表達載體pCAMBIA3301-0sPT2，在磷高效利用轉基因植物培育中的應用，優選地，在磷高效利用轉基因大豆培育中的應用。
[0024]本發明還提供一種宿主菌，含有上述植物表達載體pCAMBIA3301_0sPT2。
[0025]本發明提供的宿主菌在磷高效利用轉基因植物培育中的應用，優選地，在磷高效利用轉基因大豆培育中的應用
[0026]本發明還提供一種磷高效利用轉基因大豆0sPT2基因相對表達量的測定方法，以大豆伸長因子EF-laX56856基因TefSl作為內參基因，通過半定量RT-PCR測定0sPT2基因在磷高效利用轉基因大豆中的表達量；
[0027]其中，使用444-bp 0sPT2基因探針的製備引物，上遊引物F:如SEQ ID N0.9所示，下遊引物R:如SEQ ID N0.10所示；
[0028]檢測TefSl基因的上遊引物FT:如SEQ ID N0.11所示;下遊引物RT:如SEQ IDN0.12所示。
[0029]本發明還提供一種磷高效利用轉基因大豆0sPT2基因相對表達量測定的試劑盒，該試劑盒包括如下序列:[0030]444-bp 0sPT2基因探針的製備引物，上遊引物F -M SEQ ID N0.9所示，下遊引物R:如 SEQ ID N0.10 所示；
[0031]TefSl基因的檢測引物，上遊引物FT:如SEQ ID N0.11所示；下遊引物RT:如SEQID N0.12 所示。
[0032]本發明有益效果:
[0033]1.本發明通過選擇合適的酶切位點，將經過人工PCR擴增的0sPT2基因引入35s啟動子和終止子，增加了 0sPT2基因在外源基因中的表達調控，提高了 0sPT2基因的表達水平；同時，通過引入EcoRI及HindIII雙酶切位點，形成的磷轉運蛋白0sPT2基因表達盒可以應用於多種磷高效利用轉基因植株的培育，尤其是磷高效利用轉基因大豆的培育，填補了現有技術中的空白。
[0034]2.採用本發明提供的磷高效利用轉基因大豆的培育方法生產出的含有0sPT2基因的大豆，具有磷高效利用的特點，可在低磷環境下生存，通過試驗鑑定，通過本發明提供的培育方法生產出的轉基因大豆，即使在75天低磷生長環境下，生長狀況仍然良好，產量未發生顯著性減少。
[0035]3.本發明構建的水稻磷轉運蛋白基因0sPT2的重組植物表達載體pCAMBIA3301-0sPT2，含有除草劑抗性基因bar基因，使得攜帶有磷轉運蛋白基因0sPT2的植物表達載體在宿主細胞中表達更容易檢測，額外增加的除草劑抗性基因bar基因提高了轉基因植株對除草劑的抗性，增加了品質。
[0036]4.本發明通過選擇合適的看家基因即大豆伸長因子EF_laX56856基因(TefSl)作為內參基因，以此作為基準，使用集成凝膠顯像系統，凝膠圖像分析0sPT2基因相對於TefSl基因的表達量，通過該方法可以定量測定0sPT2基因轉化率，從而選擇出合適表達的轉基因大豆，為轉基因育種提供方便。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖10sPT2基因表達盒
[0038]圖2 植物表達載體 pCAMBIA3301-0sPT2 的 T-DNA 區
[0039]圖3農桿菌介導大豆子葉節遺傳轉化過程
[0040]A:無菌苗5天苗齡；B:子葉節共培養；C =Bialaphos篩選2個月的外植體；D:抗性芽伸長至3-4cm ；E:GUS陽性芽生根；F:轉基因陽性植株。
[0041]圖4轉基因大豆植株PCR及Southern雜交鑑定
[0042]A:PCR 鑑定 T。代植株:a — gus 基因；b—bar 基因；c—0sPT2 基因；M—DNA Marker:大小分別為2Kb、lKb、0.75Kb,0.5Kb,0.25Kb,0.1Kb ;P—質粒DNA陽性對照；WT—野生型植株陰性對照；1~10—分別為Ttl代轉基因植株12PT2-1~12PT2-10 ；
[0043]B =Southern 雜交分析:M — DNA Marker:大小分別為 15Kb、7.5Kb,0.75Kb,0.5Kb、
0.25Kb,0.1Kb ;P—質粒DNA陽性對照；WT—野生型植株陰性對照；1~10—分別為Ttl代轉基因植株 12PT2-1 ~12PT2-10。
[0044]圖5轉基因大豆⑶S染色鑑定
[0045] A =T0代植株葉片；B =T0代植株花；C:萌發3天的T1代種子；D:萌發24小時的T2代種子:1-3—分別為12PT2-1，12PT2-2，12PT2-4，WT—野生型植株陰性對照。[0046]圖6轉0sPT2基因植株Basta抗性分析
[0047]A:黑色箭頭表示轉基因植株具有Basta抗性；B:白色箭頭表示陰性植株不具有Basta抗性。
[0048]圖7半定量RT-PCR檢測0sPT2在T2代植株中的表達
[0049]A:半定量RT-PCR檢測0sPT2基因表達電泳結果。B:光密度分析0sPT2基因相對表達量。WT—野生型植株陰性對照；1，2，3—分別為轉基因植株12PT2-1，12PT2-2，12PT2-4 ；TefSl—看家基因
[0050]圖8低磷條件下營養液栽培植株生長情況
[0051]A-C:低磷處理10天後；D-F:低磷處理45天後；G:低磷處理75天後；0sPT2T2—T2轉基因植株;WT—野生型植株陰性對照，其中，各豎線長度代表比例尺度(Bar):A、D、G短線長度代表實際Bar = 15cm ；B, C，E與F長線長度代表實際Bar = Icm
[0052]圖9低磷及正常磷條件下營養液栽培植株不同器官磷積累情況
[0053]A:營養液栽培30天後植株根、莖、葉有效磷含量；B:營養液栽培30天後植株根、莖、葉總磷含量；C:落葉中總磷含量；D:種子中 總磷含量；每個株系共選用5棵植株用於分析，不同字母表示LSD比較在P〈0.05水平上差異顯著。
【具體實施方式】
[0054]下述實施例中所用方法若無特殊說明均為本領域慣用的技術手段，所用的試劑、材料，如無特殊說明均可通過商業途徑得到。
[0055]一、植物表達載體pCAMBIA3301_0sPT2的構建
[0056]1.水稻憐轉運蛋白基因0sPT2基因的克隆:
[0057]以水稻葉片為材料，參照TaKaRa公司總RNA提取試劑盒(目錄號:D9108A)說明書方法，提取葉片總RNA並反轉錄成cDNA，用RNase消化cDNA產物，參照水稻磷轉運蛋白基因基因序列信息(NCBI登錄號:AF536962)，設計引物進行PCR反應，擴增出水稻磷轉運蛋白基因0sPT2 ;其中，基因0sPT2的序列如SEQ ID N0.1 ;引物序列:上遊引物Pl序列如SEQ IDN0.3所示，下遊引物P2序列如SEQ ID N0.4所示。
[0058]以上述反轉錄成的cDNA為模板，進行PCR反應；
[0059]PCR 反應體系:10XPCR Buffer5.0 μ L，dNTP mix4.0 μ L(2.5mmol.171)，引物 Pl 和P2 各 1.0 μ L (20 μ mo I.L-1)，PrimeSTAR? HS DNA Polymerase0.4 μ L，cDNA 模板 I μ L, ddH20補至50 μ L ；
[0060]兩步法PCR 反應程序:94°C，5min, 65°C，2min, 72°C，45s，30 個循環後，72°C 總延伸IOmin ；
[0061 ] PCR產物用凝膠回收試劑盒(AXYGEN，目錄號:AP-GX_50)回收純化，用T4DNA連接酶(TaKaRa,目錄號:D2011A)連接到pMD19_T載體(TaKaRa,目錄號:D102A)，轉化T0P10感受態細胞，獲得陽性重組質粒，進行序列測定；
[0062]2.磷轉運蛋白0sPT2基因表達盒的構建
[0063]提取上述陽性重組質粒進行SacI和XbaI雙酶切，回收0sPT2基因片段；
[0064]同時對植物表達載體pBI121進行SacI和XbaI雙酶切，回收pBI121大片段；
[0065]雙酶切體系(50μL):10XBufferl5y L，BSA0.5μ L，DNA15y L，SacIl.0μ L，XbaI1.0 μ L，ddH20補至50 μ L ;37°C反應2h ;雙酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的片段；
[0066]上述回收的pBI121大片段和0sPT2基因片段，按照1:4的比例，用T4DNA連接酶連接，連接反應體系:10XT4ligase Buffer2.5 μ L，pBI121 大片段2 μ L，0sPT2基因片段8 μ L，T4DNA連接酶I μ L，ddH20補至25 μ L ; 16°C反應過夜，取10 μ L連接產物轉化Τ0Ρ10感受態細胞。37°C過夜培養，挑取單克隆擴大培養，篩選轉化子；
[0067]提取轉化子的陽性重組質粒，依據上述酶切體系進行EcoRI及HindIII雙酶切，回收小片段，即得到0sPT2基因表達盒，序列如SEQ ID N0.2所示；
[0068]3.重組植物表達載體pCAMBIA3301_0sPT2的構建
[0069]對植物表達載體pCAMBIA3301依據上述酶切體系進行EcoRI及HindIII雙酶切，回收大片段。
[0070]雙酶切後回收的PCAMBIA3301大片段和0sPT2基因表達盒，按照1:4的比例，用T4DNA 連接酶連接，連 接反應體系:10 X T4Iigase Buffer2.5 μ L, pCAMBIA3301 大片段 2 μ L，0sPT2基因表達盒8yL，T4DNA連接酶I μ L，ddH20補至25 μ L ;16°C反應過夜，取10 μ L連接產物轉化Τ0Ρ10感受態細胞。37°C過夜培養，挑取單克隆擴大培養，提取質粒，進行雙酶切驗證，重組植物表達載體pCAMBIA3301-0sPT2構建成功。
[0071]二、重組植物表達載體pCAMBIA3301-0sPT2轉染農桿菌EHA105
[0072]1.提取10 μ L，即2 μ g純化的重組植物表達載體pCAMBIA3301_0sPT2，加入200 μ L農桿菌ΕΗΑ105感受態，混勻；
[0073]2.冰浴5min,轉入液氮冷凍Imin ；
[0074]3.加入 800 μ L YEB 液體培養基，250rpm, 28°C，4_5h ；
[0075]4.用移液器將菌液移至YEB固體選擇培養基，其中含50mg.L-1卡那黴素，均勻塗布；
[0076]5.28°C培養l-2d，挑取單菌落，提取質粒，酶切鑑定獲得轉化的農桿菌工程菌。
[0077]三、農桿菌介導0sPT2基因表達載體轉化大醜
[0078]1.大豆子葉節外植體的製備及侵染
[0079]取成熟飽滿的大豆『新遼鮮』種子，表面消毒後接種於萌發培養基[B5培養基+3%(w/v) +0.8 % (w/v)瓊脂，ρΗ5.8],25°C 條件下，光照(時間 16h 晝/8h 夜，強度 90 μ molHT2iT1)培養5-6天獲得無菌苗(如圖3-A所示)。保留子葉下方2-3cm的下胚軸，垂直沿下軸胚將子葉分開，水平劃5-7次腋芽原基區，得到子葉節外植體。
[0080]將含重組植物表達載體pCAMBIA3301-0sPT2農桿菌EHA105劃線於平板，28°C培養24h，挑取單克隆液體培養24h，然後取2mL菌液加入200mL YEP液體培養基中，擴大培養至OD650為0.6-0.8，菌液離心後，用液體共培養基[1/10B5培養基+1.67mg ^1^6-苄基氨基嘌呤 +0.25mg.L-1 赤黴素 +200 μ mol.I71 乙醯丁香酮 +3% (w/v)鹿糖 +0.7% (w/v)瓊脂，ρΗ5.4]重懸，調節OD650值為I。
[0081]外植體放入到50mL重懸菌液中，侵染30min。侵染結束後，吸乾多餘菌液，將外植體近軸面向下接種於鋪有一層濾紙的共培養基(添加3mmol.L^1L-半胱氨酸+Immol.L—1硫代硫酸鈉和二硫蘇糖醇)，25°C暗培養4天(如圖3-B所示)。
[0082]2.轉基因植株的再生[0083]共培養結束後的外植體，用液體芽誘導培養基[B5培養基+1.67mg.L^6-苄基氨基嘌呤+500mg.L-1羧苄青黴素+3% (w/v)蔗糖+3mmol.T1MES, ρΗ5.6]搖動洗滌4-5次除去表面多餘菌體，將外植體近軸面向上接種於固體芽誘導培養基(液體芽誘導培養基+0.8% (w/v)瓊脂)。25°C光照(16h光照/8h黑暗，光照強度為90 μ mol 培養10天。10天後，外植體接種於芽誘導篩選培養基(芽誘導培養基+4mg.L—1的雙丙氨磷)，篩選培養4周，每2周繼代一次。
[0084]培養4周後，將有叢生芽分化的外植體(如圖3-C所示)，接種到芽伸長培養基[MS培養基+Img.I/1玉米素+0.5mg.L-1赤黴素+0.1mg.L-1 口引哚乙酸+IOOmg.L-1焦穀氨酸+50mg.L^1L-天冬醯胺+300mg.L-1羧節青黴素+2mg.L-1雙丙氨磷+3% (w/v)鹿糖+3mmol.L^MES+0.8% (w/v)瓊脂，pH5.6]上進行培養，每隔兩周繼代I次，培養約6_8周。
[0085]待芽伸長至3-4cm時(如圖3_D所示)，用手術刀從基部切下，轉入生根培養基[1/2B5 培養基+0.5mg.L-1IBA+3 % (w/v)鹿糖+0.8% (w/v)瓊脂，ρΗ5.6],根長至 l_2cm長時(如圖3-E所示)，馴化移入溫室，常規管理，直至成熟收穫。通過除草劑(Bialaphos)篩選獲得Ttl代轉化體；
[0086]3.轉0sPT2基因大豆1~2代陽性植株的獲得
[0087]T0代植株通過自花授粉獲得T1代種子，T1代種子萌發後通過PCR及GUS染色鑑定出陽性植株，陽性植株自花授粉獲得T2代種子；τ2代種子萌發後通過同樣的方法鑑定出陽性植株。
[0088]四、轉基因大豆的鑑定
[0089]1.轉基因 大豆植株PCR鑑定
[0090]取Ttl代轉基因大豆葉片，SDS法提取基因組DNA，以基因組DNA為模板，分別對gus、bar和0sPT2基因進行PCR檢測，瓊脂糖凝膠電泳檢測(如圖4-A所示)。通過對轉化植株中外源基因gus、bar和0sPT2的PCR檢測，初步證實0sPT2基因成功轉化植株並獲得重組。
[0091]0sPT2基因PCR檢測引物序列，上遊引物Pl:如SEQ ID N0.3所示；下遊引物P2:如 SEQ ID N0.4 所示；
[0092]gus基因PCR檢測引物序列，上遊引物⑶S1:如SEQ ID N0.5所示；下遊引物⑶S2:如 SEQ ID N0.6 所示；
[0093]bar基因PCR檢測引物序列，上遊引物bar 1:如SEQ ID N0.7所示；下遊引物bar2:如 SEQ IDN0.8 所示。
[0094]gus 基因的 PCR 擴增程序:94°C，5min，94t:，45sec，55t:，lmin，72°C，lmin，30 個循環後，72°C總延伸 IOmin ；bar 基因的 PCR 擴增程序:MV，5min, 94°C，45sec，58°C，lmin，72°C，lmin, 30 個循環後，72°C 總延伸 IOmin ；0sPT2 基因的 PCR 擴增程序 94°C，5min, 65°C，2min，72°C，45s，30 個循環後，72°C總延伸 IOmin0
[0095]2.轉基因大?植株Southern blot鑑定
[0096]採用SDS法，大量提取Ttl代轉基因大豆葉片基因組DNA。30 μ g基因組DNA經EcoRI酶切消化後用於Southern blot分析；444_bp 0sPT2探針的標記及雜交方法依據RoachDIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I 說明書進行(Roach,產品號:11745832910)。圖4_B所示，轉基因植株含有1_3個拷貝。
[0097]444-bp 0sPT2探針通過PCR擴增反應獲得:[0098]PCR反應上遊引物F:如SEQ ID N0.9所示，下遊引物R:如SEQ ID N0.10所示。PCR反應程序:95V，4min ；95°C，2min, 55°C，30s ；72°C, 30s ；72°C, IOmin0
[0099]3.轉基因植株花和種子的⑶S染色鑑定
[0100]取Ttl代轉基因大豆和野生型大豆葉片、花和種子，分別置於⑶S染色液[50mmol.L-1 憐酸鈉緩衝液(ρΗ7.0), I % (v/v) Triton X100, 20% (v/v)甲醇，50mmol.L-1六氰合亞鐵酸鉀，50mmol.L-1六氰合鐵酸鉀，ImM X-gluc (G0LDB10，產品號:G1281C) ]，37°C染色12h。70%乙醇脫色後，拍照觀察(如圖5所示)。圖5所示，Ttl代轉基因植株花與種子均檢測有gus基因表達，T1及T2代轉基因種子萌發後也檢測出gus基因的表達，說明外源基因可遺傳給後代。
[0101]以上培養基或染色液中成分的濃度、質量體積百分比均相對於對應培養基或染色液體積而言。
[0102]4.轉基因大豆Basta塗抹鑑定
[0103]選取健康生長的Ttl代轉基因大豆和野生型大豆葉片，用棉棒蘸取0.05 % Basta塗抹於半張葉片，5天之後觀察葉片並拍照記錄(如圖6所示)。圖6所示，非轉基因植株塗抹Basta的葉片表現出失綠，而轉基因植株的葉片正常，表明轉基因植株具有除草劑抗性，進一步證明植株的轉基因特性。
[0104]5.轉基因大豆T2代植株中0sPT2基因相對表達量的測定
[0105]半定量RT-PCR (反轉錄PCR)測定0sPT2基因在上述轉0sPT2基因植株T2代植株中的表達量，以大豆看家基因:大豆伸長因子EF-laX56856基因(TefSl)作為內參基因。使用集成凝膠顯像系統(GenoSenslSSO，上海勤翔科技有限公司，中國)進行溴化乙錠染色後的凝膠圖像獲取及分析。設定看家基因TefSl基因的光密度為l，0sPT2基因的光密度與看家基因TefSl基因的光密度比值為0sPT2基因的相對表達量。
[0106]其中，反轉錄PCR反應中，檢測0sPT2基因的引物採用製備444-bp 0sPT2探針引物，上遊引物F:如SEQ ID N0.9所示；下遊引物R:如SEQ ID N0.10所示；
[0107]檢測看家基因TefSl基因，上遊引物FT -M SEQ IDN0.11所示；下遊引物RT -M SEQIDN0.12 所示。
[0108]為檢測大豆T2代植株中0sPT2基因的表達情況，取3個單拷貝轉基因植株(12PT2-1，12PT2-2與12PT2-4)及野生型對照植株的葉片及根，分別提取總RNA (參照TaKaRaTrizol Reagent說明書)，按照反轉錄試劑盒(TaKaRa，貨號:DRR047A)的方法將RNA反轉錄為cDNA，進行半定量RT-PCR反應。20 μ L反應體系包括:10XPCR Buffer2.0 μ L，dNTP miXI.6 μ L (2.5mmoI.L-1)，Tef SI上遊引物F、下遊引物R和0sPT2基因的上遊引物FT和下遊引物 RT 各 1.0 μ L(20 μ mol.L-1)，PrimeSTAR? HS DNA Polymerase0.2 μ L, cDNA 模板 I μ L，ddH20 補至 20 μ L0 反應程序:95°C,4min ；95°C,2min, 55。。，30s ；72°C,30s ；30 個循環後72°C延伸lOmin。對葉片及根進行TefSl基因表達量和0sPT2基因相對表達量的測定(如圖7所示)。由圖7可觀察到，0sPT2基因在T2代轉基因植株葉片及根部中均為超表達。
[0109]6.轉基因大豆耐低磷鑑定
[0110] 以上述3個超表達轉0sPT2基因大豆T2代株系用於耐低磷試驗。三個超表達轉0sPT2基因大豆T2代株系(12PT2-1，12PT2-2及12PT2-4) 10天苗齡的陽性植株與對照(WT) 10天苗齡植株定植於含有改良的Hoagland溶液(用NH4Cl替代部分NH4H2PO4使溶液中最終P濃度為20 μ M ;其他離子濃度不變；EC = 2.61dS.m-1)的18-L水桶中(上圍直徑為30cm)，每桶含有三棵不同株系的T2代植株及一棵對照植株(四棵植株呈正方形排列，對角線距離為26cm)，對營養液進行連續通氧，並每三天更換(用HCl或NaOH調節pH值至
6.5)。每個T2代株系重複10次。溫室環境採用人工控制，晝夜溫度:28°C晝/20°C夜，光周期:12h 晝/12h 夜(HPS 燈，PPFD:600 μ mol.m_2.s—1)，相對溼度:70 - 80%，CO2 濃度:400 μ M。以標準Hoagland營養液為對照。
[0111]低磷處理期間觀察各植株症狀(如圖8所示)。營養液栽培植株低磷處理10天後，野生型對照葉片邊緣開始出現枯斑(如圖8A，8C所示)；低磷處理30天後，野生型對照植株葉片邊緣枯斑增多，且葉脈也出現枯斑(如圖8D，8F所示)；而轉基因植株葉片始終未出現枯斑(如圖8B，8E所示)。低磷處理75天後，野生型對照植株葉片已全部脫落(如圖8G所示)，而轉基因植株葉片大部分仍在植株上(如圖8G所示)，表明轉0sPT2基因植株在低磷條件下生長狀態顯著優於野生型對照。
[0112]低磷處理30天後測量植株的株聞、根長、生物量及磷含量(如表1及圖9A,9B所示)。由表1可知，在低磷脅迫下，轉基因植株的株高、根長及生物量均顯著高於野生型對照。由圖9可觀察到，低磷脅迫下轉基因植株根、莖、葉中有效磷及全磷含量均顯著高於野生型對照。植株成熟後，測定落葉及種子中磷含量(如圖9C，9D所示)。由圖9C，9D所示，轉基因植株落葉及種子中磷含量顯著高於野生型對照，表明轉基因植株具有較高的磷利用效率。
[0113]低磷處理下，植株進入生殖生長期，對花數、莢數進行測定；種子收穫後測定單株種子數及種子重量(如表2所示)。由表2可知，低磷條件下，轉基因植株花數、莢數及產量均顯著高於野生對照；正常條件下，0sPT2轉基因植株花數、莢數及產量與野生型植株和轉基因植株無顯著差異，表明0sPT2轉基因植株在低磷條件的耐受性好，在低磷條件下可顯
著增加產量。
[0114]表1.營養液栽培條件下植株營養生長指標的比較
[0115]
【權利要求】
1.一種磷轉運蛋白OsPT2基因表達盒，其特徵在於:該表達盒序列如SEQ ID N0.2所示。
2.權利要求1所述的磷轉運蛋白OsPT2基因表達盒的構建方法，其特徵在於，包括如下步驟: 1)設計引物，擴增序列為SEQID N0.1所示的OsPT2基因片段；其中，上遊引物Pl:如SEQ ID N0.3所示;下遊引物P2:如SEQ ID N0.4所示； 2)將OsPT2基因連接到pMD19-T質粒載體，轉化TOPlO感受態細胞，提取陽性重組質粒，進行SacI和XbaI雙酶切，回收0sPT2基因片段； 3)進行植物表達載體pBI121SacI和XbaI雙酶切，回收pBI121大片段； 4)以連接酶連接上述回收的0sPT2基因片段和pBI121大片段，形成連接產物，以連接產物轉化T0P10感受態細胞，37°C過夜培養，挑取單克隆擴大培養，篩選出轉化子； 5)提取步驟4)中轉化子的陽性重組質粒進行EcoRI及HindIII雙酶切，回收小片段，即得到0sPT2基因表達盒； 其中，步驟2)、3)和步驟5)中雙酶切體系為:50 μ L體系中10XBufferl5y L，BSA0.5 μ L，DNA15 μ L, Sacll.0 μ L，XbaI1.0 μ L，ddH20 補至 50 μ L ;37°C反應 2h ;雙酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的片段；
步驟 4)中連接反應體系為=IOXT4Iigase Buffer2.5 μ L, ρΒΙ121 大片段 2 μ L，0sPT2基因片段8 μ L，T4DNA連接酶I μ L，ddH20補至25 μ L。
3.0sPT2基因在磷高效利用轉基因植物中的應用，優選地，在磷高效利用轉基因大豆中的應用。
4.一種磷高效利用轉基因大豆的培育方法，其特徵在於將水稻磷轉運蛋白基因0sPT2構建至植物表達載體PCAMBIA3301中，獲得重組植物表達載體pCAMBIA3301_0sPT2中，通過農桿菌介導的方法導入大豆；具體包括如下步驟: 1)重組植物表達載體pCAMBIA3301-0sPT2的構建:將水稻磷轉運蛋白0sPT2基因表達盒構建至植物表達載體PCAMBIA3301中，形成重組植物表達載體pCAMBIA3301_0sPT2 ； 2)0sPT2轉基因大豆轉化體的獲得:以大豆子葉節為外植體，通過農桿菌介導法，將植物表達載體pCAMBIA3301-0sPT2導入大豆基因組中，通過除草劑Bialaphos篩選獲得Ttl代轉化體； 3)0sPT2轉基因大豆T2代陽性植株的獲得=Ttl代植株通過自花授粉獲得T1代種子，T1代種子萌發後通過PCR及⑶S染色鑑定出陽性植株，陽性植株自花授粉獲得T2代種子；T2代種子萌發後通過同樣的方法鑑定出陽性植株，獲得磷高效利用轉基因大豆。
5.一種重組植物表達載體pCAMBIA3301-0sPT2，其特徵在於含有權利要求1所述的磷轉運蛋白0sPT2基因表達盒和除草劑抗性基因bar基因，水稻磷轉運蛋白0sPT2基因表達盒位於到植物表達載體PCAMBIA3301的EcoRI及HindIII酶切位點之間。
6.權利要求5所述的植物表達載體pCAMBIA3301-0sPT2，在磷高效利用轉基因植物培育中的應用，優選地，在磷高效利用轉基因大豆培育中的應用。
7.—種宿主菌，其特徵在於含有權利要求4所述的重組植物表達載體pCAMBIA3301-0sPT2。
8.權利要求7所述的宿主菌在磷高效利用轉基因植物培育中的應用，優選地，在磷高效利用轉基因大豆培育中的應用。
9.一種磷高效利用轉基因大豆OsPT2基因相對表達量的測定方法，其特徵在於:以大豆伸長因子EF-laX56856基因TefSl作為內參基因，通過半定量RT-PCR測定OsPT2基因在磷高效利用轉基因大豆中的表達量； 其中，使用444-bp OsPT2基因探針的製備引物，上遊引物F:如SEQ ID N0.9所示，下遊引物R:如SEQ IDN0.10所示； 檢測TefSl基因的上遊引物FT:如SEQ ID N0.11所示；下遊引物RT:如SEQ ID N0.12所示。
10.一種磷高效利用轉基因大豆0SPT2基因相對表達量測定的試劑盒，其特徵在於:該試劑盒包括如下序列:
444-bp 0sPT2基因探針的製備引物，上遊引物F:如SEQ ID N0.9所示，下遊引物R:如SEQ ID N0.10 所示； TefSl基因的檢測引物，上遊引物FT:如SEQ ID N0.11所示;下遊引物RT:如SEQ IDN0.12所示。
【文檔編號】C12N1/21GK104004755SQ201410232281
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年5月28日 優先權日:2014年5月28日
【發明者】朱月林, 蓋鈞鎰, 陳國戶, 楊立飛 申請人:南京農業大學