一種獼猴桃根多糖提取物的製備方法

2023-09-20 06:47:40 2

專利名稱：：一種獼猴桃根多糖提取物的製備方法
技術領域：
：本發明涉及一種獼猴桃根多糖提取物(包括獼猴桃根粗多糖與獼猴桃根精製多糖)的製備方法。(二)
背景技術：
：獼猴t兆根(RadixActinidiaChinensis)，為中華獼猴申兆(ActindiachinensisPlanch)的根，又名藤梨根，收載於《中國藥典》(1977年版)，具有清熱、利尿、活血、消腫等作用，臨床上主要用於治療胃腸道腫瘤及乳腺癌，瘡癤，瘰癧結核，肝炎等。現代藥理研究發現獼猴桃根中的多糖成分-中華獼猴桃根多糖(ActindiaChinensisPlanchPolysaccharide,ACPS)具有抗腫瘤、增強免疫機能、消除活性氧自由基等作用，且無副作用。近年來，對於獼猴桃根多糖的藥理研究已有文獻報導，閻家麒等發現中華獼猴桃根提取物對超氧自由基的去除能力與SOD相同，對氫自由基的去除能力比VC略強。張菊明、林佩芳等研究表明獼猴桃根多糖複合物可以抑制小鼠腫瘤的增長以及增強細胞天然殺傷功能，並且對於宿主具有保護作用，機體特異抗菌抗體的水平，激活巨噬細胞的吞噬功能。目前，獼猴桃根多糖提取物的製備主要採用以下兩種方法方法1:獼猴桃根藥材加20倍的水加熱提取，每次0.5h，提取2次，水提液加入乙醇使含醇量達80%(v/v)，靜置過夜，抽濾，得沉澱。這種方法製備的獼猴桃根多糖提取物提取率低，純度低，藥效活性低，顏色深、質量差，能耗大，成本高。方法2:是本專利發明人申請(並授權)的專利，專利公告號CN1067258C，具體方法獼猴桃根藥材加28倍量2050%(v/v)的乙醇浸漬13次，每次1830小時，靜置，取上清液，合併，加乙醇調至含乙醇量為6095%(v/v)，靜置24小時，離心，沉澱物再加27倍量5080%乙醇(v/v)、無水乙醇各洗一次，棄去洗液，沉澱物再加24倍量乙醚洗滌一次，棄去乙醚液，沉澱物室溫減壓乾燥。它的缺點是獼猴桃根多糖提取率、純度與藥效活性較低，能耗大，操作繁瑣，耗時長，成本高，而且由於使用了乙醚，增加了安全隱患。(三)
發明內容本發明目的是提供一種工藝簡便，提取率高，純度高，藥效活性高，能耗小、成本低的獼猴桃根多糖提取物的製備方法。本發明採用的技術方案是—種獼猴桃根多糖提取物的製備方法，所述的方法包括取乾燥獼猴桃根(RadixActinidiaChinensis)(含飲片)以水加熱回流提取，提取液高速離心(轉速500025000r/min，時間530min)除去不溶物，上清液先用截留分子量為3000000Da的膜超濾除去蛋白質等大分子物質；超濾液再用截留分子量為5000Da的膜超濾除去無機鹽、胺基酸、小分子色素等小分子雜質，同時除去濾液中的部分水份，濃縮至所得濃縮液中藥材含量為0.15g/mL，濃縮液加入乙醇至乙醇濃度為5090%(v/3v)，靜置醇沉，離心，取沉澱洗滌後乾燥，即得所述獼猴桃根(粗)多糖。獼猴桃根粗多糖，還可進一步採用以下純化步驟(1)取獼猴桃根粗多糖，每g加蒸餾水50200ml配製成水溶液，水溶液採用聚醯胺或活性炭或硅藻土等脫色劑脫色，過濾，取濾液進行下一步純化操作；(2)步驟(1)濾液上大孔吸附樹脂柱(可除去蛋白質，多肽，核酸等雜質)或DEAE纖維素柱(可除去多糖中的蛋白質，多肽，核酸等雜質)，以NaCl溶液洗脫，洗脫液採用截留分子量為10005000Da的超濾膜洗濾13次，除鹽並濃縮，得濃縮液；(3)濃縮液乾燥即得獼猴桃根多糖。上述步驟(2)中的大孔吸附樹脂柱和DEAE纖維素柱純化技術可以單獨使用，也可以兩項聯用，即步驟(2)可重複進行，通常先用大孔吸附樹脂純化，再用DEAE纖維素柱純化。以上所述大孔吸附樹脂的型號可以是AB-8型，MG-1型，LSA-5B型，X-5型，H107型，S-8型，D900型，HPSIP1300型，SIP1400型，NKA-9型，DM130型或D3520型等，所述DEAE纖維素可以是DEAE-32或DEAE-52。具體的，優選的，所述的方法按如下步驟進行取乾燥獼猴桃根，加入質量為獼猴桃根質量630倍的水，加熱回流提取13次、每次13小時，合併提取液，500025000r/min離心10min30min，除去不溶物，上清液過0.20.8iim孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液用截留分子量5000Da的膜超濾，濃縮至所得濃縮液中生藥材含量為0.22g/mL，濃縮液在2545。C下加入8595%乙醇至乙醇體積濃度為6080%，靜置672小時，500025000r/min離心10min20min，取沉澱以無水乙醇洗滌13次，洗滌後的沉澱6080°C真空乾燥，得到所述獼猴桃根粗多糖。獼猴桃根粗多糖純化步驟如下(1)取獼猴桃根粗多糖，每g加蒸餾水50200ml配製成水溶液，水溶液按藥脂比5070mg:lg加入聚醯胺吸附脫色，調pH至56，在室溫下振搖5060min，過濾，取濾液進行下一步純化操作；(2)步驟(1)濾液上大孔吸附樹脂柱，以NaCl溶液洗脫，洗脫液採用截留分子量為10005000Da的超濾膜洗濾13次，除鹽並濃縮，得濃縮液1;所述大孔樹脂的型號為下列之一AB-8型、MG-1型、LSA-5B型、X-5型、H107型、S-8型、D900型、HPSIP1300型、SIP1400型、NKA-9型、DM130型或D3520型；(3)步驟(1)濾液或步驟(2)濃縮液1上DEAE纖維素柱，以NaCl溶液洗脫，洗脫液採用截留分子量為10005000Da的超濾膜洗濾13次，除鹽並濃縮，得濃縮液2;(4)濃縮液1或濃縮液2乾燥即得獼猴桃根多糖。本發明主要採用高速離心結合超濾、柱層析等分離、純化技術，對獼猴桃根多糖的製備方法進行了改進。本發明集成了超濾法與柱層析等技術的優點，以藥效作用為指標，最大限度的除去無機鹽、胺基酸、小分子色素等小分子雜質，與蛋白質等大分子雜質。該方法是一個純物理過程，條件溫和，節能環保，適合工業生產。本發明的有益效果主要體現在(1)本發明方法將獼猴桃根水提液離心、微濾後，濾液先用截留分子量為3000000Da的超濾膜除去蛋白質等大分子物質，再用截留分子量為5000Da的超濾膜除去無機鹽、胺基酸、小分子色素等小分子雜質，同時除去濾液中的水份濃縮，再醇沉製備獼猴桃根多糖，與現有技術相比，最大限度的分離除去了小分子與大分子雜質、顯著提高了獼猴桃根多糖的得率與純度，藥效明顯優於現有技術製備的獼猴桃根多糖；(2)採用本發明製備獼猴桃根多糖，大大節約了乙醇用量，降低了成本；(3)採用本發明製備獼猴桃根多糖，大大減少了乙醇用量、且不需要使用乙醚，提高了生產安全性。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於此實施例1:猴桃根粗多糖提取物活性部位的確定取乾燥獼猴桃根飲片5000g，加10倍質量水，加熱回流提取3次、每次2小時，合併提取液，高速離心(15000r/min，20min)，上清液過0.45ym孔徑的微孔濾膜，濾液依次採用截留分子量為300萬，100萬，10萬，3萬，5千的超濾膜，進行超濾分級，得到A(5000以下)，B(5000-3萬)，C(3萬-10萬)，D(10萬-100萬)，E(100萬-300萬)，F(300萬以上)等6個部位。各部位分別濃縮、乾燥，並分別測定其多糖含量，計算其佔總提取物(多糖)的百分比例。各部位獼猴桃根提取物以注射給藥進行抗小鼠H22肝癌藥效實驗選擇體重(20±1.0)g，雄性ICR小鼠140隻，隨機分成7組模型對照組(生理鹽水)，A組(5000以下)，B組(5000-3萬)，C組(3萬-10萬)，D組(10萬-100萬)，E組(100萬-300萬)，F組(300萬以上)。按法造模，各組於皮下瘤液接種的第2天開始給藥(80mg/kg日)，連續8天。停藥一天後，分離腫瘤組織，並稱取瘤重，得各組抑瘤率，結果見表1:表1獼猴桃根提取物各部位含多糖比例及抑瘤率比較tableseeoriginaldocumentpage5由以上數據可知A(5000以下)及F(300萬以上)部位含多糖量低、藥效活性低，獼猴桃根提取物中有效部位主要是B、C、D與E。因此，本發明確定分子量5000DA至3000000DA部分為有效多糖部位，選用截留分子量5000DA的超濾膜除去小分子雜質，截留分子量3000000DA的超濾膜，除去大分子物質，以有效保留藥性活性多糖，然後進行醇沉、離心、乾燥等操作製備獼猴桃根多糖。實施例2:本發明工藝與現有工藝的比較取同批獼猴桃根，按文獻工藝、專利工藝及本發明工藝等方法分別提取獼猴桃根多糖，進行比較(每種方法5個批次)文獻工藝(即
背景技術：
部分的方法1):乾燥獼猴桃根飲片1000g，加20倍質量的水加熱提取，每次O.5h，提取2次，水提液加入乙醇使含醇量達80X(v/v)，靜置過夜，抽濾，但A口《守廣口口o專利工藝(即
背景技術：
部分的方法2):乾燥獼猴桃根飲片1000g，加5倍質量30X(v/v)的乙醇浸漬2次，每次24小時，靜置，取上清液，合併，加乙醇調至含乙醇量為72%(v/V)，靜置24小時，離心，沉澱物再加5倍量72%乙醇(v/v)、無水乙醇各洗一次，棄去洗液，沉澱物再加3倍量乙醚洗滌一次，棄去乙醚液，沉澱物室溫減壓乾燥。本發明工藝取乾燥獼猴桃根飲片1000g，加10倍量水，加熱回流提取3次、每次2小時，合併提取液，高速離心(15000r/min，20min)，上清液過0.45ym孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液用截留分子量為5000Da的膜超濾、濃縮至1000毫升，濃縮液加入乙醇至乙醇體積濃度為70%(v/v，下同)，靜置12小時，高速離心(15000r/min，20min)，取沉澱以無水乙醇洗滌3次，乾燥，即得到所述獼猴桃根粗多糖。製備的獼猴桃根粗多糖稱重，採用硫酸_苯酚法測定含糖量、計算其純度及得率，結果見表2、表3:表2:3種工藝獼猴桃根多糖提取率與純度比較tableseeoriginaldocumentpage6ACPS純度(%)=ACPS中總多糖量(mg)/ACPS質量(mg)X100%ACPS得率(％)=ACPS質量(g)/藥材(飲片)質量(g)X100%表3本發明與現有工藝以lkg藥材投料計運行成本比較(單位元)tableseeoriginaldocumentpage7實施例3:獼猴桃根多糖的製備取乾燥獼猴桃根飲片500g，加6倍質量的水，加熱回流1小時，提取3次，合併提取液，高速離心(10000r/min，20min)，上清液過0.65ym孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液以截留分子量為5000Da的膜超濾、濃縮至500ml，濃縮液加入乙醇調醇濃度至55%(v/v)，靜置60小時，高速離心(10000r/min，20min)，沉澱以無水乙醇洗1次，乾燥即得獼猴桃根粗多糖，經測定、計算，獼猴桃根粗多糖得率為2.07%、純度為55.81%。取上述獼猴桃根粗多糖加蒸餾水配製濃度為10mg/ml的水溶液，按藥脂比20mg:lg加入聚醯胺，調pH至5，在室溫下振搖30min，濾過，濾液上AB-8型大孔樹脂柱，採用0.lmol/LNaCl溶液洗脫，洗脫液採用1000Da的超濾膜洗濾1次，除鹽並濃縮，濃縮液上DEAE-52纖維素柱，以0.01mol/LNaCl洗脫至顯色(硫酸-苯酚法，下同)無色，洗脫液採用1000Da的超濾膜洗濾1次，除鹽並濃縮，乾燥即得獼猴桃根精製多糖，經測定其純度為83.10%，得率0.91%。實施例4:取乾燥獼猴桃根800g，加8倍質量水，加熱回流2小時，提取3次，合併提取液，高速離心(20000r/min，10min)，上清液過0.22ym孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為300000Da的膜超濾，超濾液以截留分子量為5000Da的超濾膜超濾、濃縮至1600ml，加入乙醇調醇濃度至90%(v/v)，靜置6小時，高速離心(20000r/min，10min)，沉澱以無水乙醇洗2次，乾燥即得獼猴桃根粗多糖，經測定、計算，獼猴桃根多糖純度為58.97%、得率為2.47%。所得獼猴桃根粗多糖每克加蒸餾水150ml配製水溶液，按藥脂比40mg:lg加入聚醯胺，調pH至6，在室溫下振搖60min，濾過，濾液上MG-1型大孔樹脂柱，採用0.2mol/LNaCl溶液洗脫，洗脫液用3000Da的超濾膜洗濾2次，除鹽並濃縮，乾燥即得獼猴桃根精製多糖，經測定其純度為78.23%，得率1.34%。實施例5:取乾燥獼猴桃根1000g，加10倍質量水，加熱回流3小時，提取2次，合併提取液，離心(5000r/min，30min)，上清液過0.8ym孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液以截留分子量為5000Da的膜超濾、濃縮至5000毫升，加入乙醇調醇濃度至85%(v/v)，靜置8小時，離心(5000r/min，30min)，沉澱以無水乙醇洗3次，乾燥即得獼猴桃根粗多糖，經測定、計算，獼猴桃根多糖純度為60.11%，提取率為2.39%。所得獼猴桃根粗多糖每克加蒸餾水200ml配製水溶液，按藥脂比60mg:lg加入聚醯胺，調pH至7，在室溫下振搖80min，濾過，濾液上DEAE-32纖維素柱，以0.02mol/LNaCl7洗脫至顯色無色，洗脫液採用2000Da的超濾膜洗濾3次，除鹽並濃縮，乾燥即得獼猴桃根(精製)多糖，經測定其純度為79.89%，得率1.37%。實施例6:取乾燥獼猴桃根1500g，加12倍質量水，加熱回流4小時，提取2次，合併提取液，高速離心(12000r/min，20min)，上清液過0.65ym孔徑的微孔濾膜，微濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液用截留分子量為5000Da的膜超濾，濃縮至750毫升，加入乙醇調醇濃度至60%(v/v)，靜置48小時，高速離心(12000r/min，20min)，沉澱以無水乙醇洗1次，乾燥即得獼猴桃根粗多糖，經測定、計算，獼猴桃根粗多糖純度為55.10%，提取率為2.41%。所得獼猴桃根粗多糖每克加蒸餾水200ml配製水溶液，按藥脂比80mg:lg加入聚醯胺，調pH至8，在室溫下振搖100min，濾過，濾液上LSA-5B型大孔樹脂柱，採用0.5mo1/LNaCl溶液洗脫，洗脫液採用1000Da的超濾膜洗濾1次，除鹽並濃縮；濃縮液上DEAE-52纖維素柱，以0.06mol/LNaCl洗脫至顯色無色，洗脫液採用5000Da的超濾膜洗濾2次，除鹽並濃縮，乾燥即得獼猴桃根(精製)多糖，經測定其純度為83.10%，得率1.18%。實施例7:取乾燥獼猴桃根飲片2000g，加12倍質量水，加熱回流1小時，提取3次，合併提取液，高速離心(7500r/min，25min)，上清液過0.8ym孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液用截留分子量為5000Da的膜超濾，濃縮至1000毫升，加入乙醇調醇濃度至70%(v/v)，靜置48小時，高速離心(7500r/min，25min)，沉澱以無水乙醇洗2次，乾燥即得獼猴桃根粗多糖，經測定、計算，獼猴桃根粗多糖純度為56.13%，得率為2.56%。所得獼猴桃根粗多糖每克加蒸餾水50ml配製水溶液，按藥脂比100mg:lg加入聚醯胺，調pH至4，在室溫下振搖30min，濾過，濾液上D3520型大孔樹脂柱，採用0.6mo1/LNaCl溶液洗脫，洗脫液採用1000Da的超濾膜洗濾2次，除鹽並濃縮，濃縮液上DEAE-52纖維素柱，以0.07mol/LNaCl洗脫至顯色無色，洗脫液採用3000Da的超濾膜洗濾1次，除鹽並濃縮，乾燥即得獼猴桃根(精製)多糖，經測定其純度為83.97%，得率0.89%。實施例8:取乾燥獼猴桃根飲片3000g，加30倍質量水，加熱回流2小時，提取液高速離心(15000r/min，20min)，上清液過0.45ym孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液用截留分子量為5000Da的膜超濾，濃縮至600毫升，加入乙醇調醇濃度至80%(v/v)，靜置24小時，離心(10000r/min，20min)，沉澱以無水乙醇洗3次，乾燥即得獼猴桃根粗多糖，經測定、計算，其純度為59.10%，得率為2.87%。所得獼猴桃根粗多糖每克加蒸餾水80ml配製水溶液，按藥脂比20mg:lg加入聚醯胺，調pH至5，在室溫下振搖40min，濾過，濾液上S-8型大孔樹脂柱，採用0.7mol/LNaCl溶液洗脫，洗脫液採用1000Da的超濾膜洗濾，除鹽並濃縮，乾燥即得獼猴桃根(精製)多糖，經測定其純度為78.58%，得率1.51%。實施例9:取乾燥獼猴桃根500g，加20倍質量水，加熱回流2小時，提取2次，合併提取液，高速離心(20000r/min，10min)，上清液過0.22ym孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液用截留分子量為5000Da的膜超濾，濃縮至500毫升，加入乙醇調醇濃度至50%(v/v)，靜置60小時，離心(20000r/min，5min)，沉澱以無水乙醇洗1次，乾燥即得獼猴桃根粗多糖，經測定、計算，獼猴桃根粗多糖純度58.67%，得率2.16%。所得獼猴桃根粗多糖每克加蒸餾水100ml配製水溶液，按藥脂比40mg:lg加入聚醯胺，調pH至6，在室溫下振搖50min，濾過，濾液上H107型大孔樹脂柱，採用0.8mo1/LNaCl溶液洗脫，洗脫液採用2000Da的超濾膜洗濾2次，除鹽並濃縮；濃縮液上DEAE-52纖維素柱，以0.08mol/LNaCl洗脫至顯色無色，洗脫液採用2000Da的超濾膜洗濾1次，除鹽並濃縮，乾燥即得獼猴桃根(精製)多糖，經測定其純度為82.31%，得率1.07%。實施例10:取乾燥獼猴桃根800g，加25倍質量水，加熱回流提取3小時，提取液，高速離心(22000r/min，5min)，上清液過0.22ym孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液用截留分子量為5000Da的膜超濾，濃縮至800毫升，加入乙醇調醇濃度至70%(v/v)，靜置36小時，離心(22000r/min，5min)，沉澱以無水乙醇洗2次，乾燥即得獼猴桃根粗多糖，經測定、計算，獼猴桃根粗多糖純度56.78%，得率2.81%。所得獼猴桃根粗多糖每克加蒸餾水150ml配製水溶液，按藥脂比60mg:lg加入聚醯胺，調pH至7，在室溫下振搖60min，濾過，濾液上HPSIP1300型大孔樹脂柱，採用0.9mol/LNaCl溶液洗脫，洗脫液採用3000Da的超濾膜洗濾2次，除鹽並濃縮。濃縮液上DEAE-32纖維素柱，以0.09mol/LNaCl洗脫至顯色無色，洗脫液採用3000Da的超濾膜洗濾3次，除鹽並濃縮，乾燥即得獼猴桃根(精製)多糖，經測定其純度為83.49%，得率1.28%。實施例11:取乾燥獼猴桃根1000g，加25倍質量水，加熱回流提取6小時，提取液高速離心(25000r/min，5min)，上清液過0.22ym孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液用截留分子量為5000Da的膜超濾，濃縮至2000毫升，加入乙醇調醇濃度至80%(v/v)，靜置時間48小時，離心(25000r/min，5min)，沉澱以無水乙醇洗3次，乾燥即得獼猴桃根粗多糖，經測定、計算，獼猴桃根粗多糖純度59.78%，得率3.01%。所得獼猴桃根粗多糖每克加蒸餾水180ml配製水溶液，按藥脂比70mg:lg加入聚醯胺，調pH至8，在室溫下振搖70min，過濾收集濾液，濾液上NKA-9型大孔樹脂柱，採用1.Omol/LNaCl溶液洗脫，洗脫液採用3000Da的超濾膜洗濾2次，除鹽並濃縮，濃縮液上DEAE-32纖維素柱，以0.lmol/LNaCl洗脫至顯色無色，洗脫液採用3000Da的超濾膜洗濾2次，除鹽並濃縮，乾燥即得獼猴桃根(精製)多糖，經測定其純度為85.10%，得率1.24%。實施例12:取乾燥獼猴桃根1500g，加8倍質量水，加熱回流1.5小時，提取3次，合併提取液，高速離心(20000r/min，8min)，上清液過0.45ym孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液用截留分子量為5000Da的膜超濾，濃縮至15000毫升，加入乙醇調醇濃度至70%(v/v)，靜置48小時，離心(20000r/min，8min)，沉澱以無水乙醇洗2次，乾燥即得獼猴桃根粗多糖，經測定、計算，獼猴桃根粗多糖純度60.21%，得率2.13%。所得獼猴桃根粗多糖每克加蒸餾水200ml配製水溶液，按藥脂比80mg:lg加入聚醯胺，調pH至4，在室溫下振搖80min，濾過，濾液上LSA-5B型大孔樹脂柱，採用0.lmo1/LNaCl溶液洗脫，洗脫液採用1000Da的超濾膜洗濾3次，除鹽並濃縮，乾燥即得獼猴桃根(精製)多糖，經測定其純度為83.03%，得率1.31%。實施例13:稱取乾燥獼猴桃根2000g，加10倍質量水，加熱回流2.5小時/次，提取2次，合併提取液，高速離心(22500r/min，5min)，上清液過0.22ym孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液用截留分子量為5000Da的膜超濾，濃縮至2000毫升，加入乙醇調醇濃度至80%(v/v)，靜置時間54小時，離心(22500r/min，5min)，沉澱以無水乙醇洗2次，乾燥即得獼猴桃根粗多糖，經測定、計算，獼猴桃根粗多糖純度56.79%，得率2.94%。所得獼猴桃根粗多糖每克加蒸餾水50ml配製水溶液，按藥脂比90mg:lg加入聚醯胺，調pH至5，在室溫下振搖90min，濾過，濾液上LSA-5B型H107型大孔樹脂柱，採用0.3mol/LNaCl溶液洗脫，洗脫液上DEAE-52纖維素柱，以0.07mol/LNaCl洗脫至顯色無色，洗脫液採用3000Da的超濾膜洗濾3次，除鹽並濃縮，乾燥即得獼猴桃根(精製)多糖，經測定其純度為77.79%，得率1.03%。實施例14:取乾燥獼猴桃根飲片3000g，加12倍質量水，加熱回流1小時，提取3次，合併提取液，高速離心(25000r/min，5min)，上清液過0.22ym孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液用截留分子量為5000Da的膜超濾，濃縮至1000毫升，加入乙醇調醇濃度至60%(v/v)，靜置60小時，離心(20000r/min，5min)，沉澱以無水乙醇洗3次，乾燥即得獼猴桃根粗多糖，經測定、計算，獼猴桃根粗多糖純度58.25%，得率2.55%。所得獼猴桃根粗多糖每克加蒸餾水70ml配製水溶液，按藥脂比100mg:lg加入聚醯胺，調pH至6，在室溫下振搖100min，濾過，濾液上H107型大孔樹脂柱，採用0.6mo1/LNaCl溶液洗脫，洗脫液採用5000Da的超濾膜洗濾2次，除鹽並濃縮；濃縮液上DEAE-32纖維素柱，以0.05mol/LNaCl洗脫至顯色無色，洗脫液採用2000Da的超濾膜洗濾2次，除鹽並濃縮，乾燥即得獼猴桃根(精製)多糖，經測定其純度為82.67%，得率1.17%。實施例15:取乾燥獼猴桃根500g，加14倍質量水，加熱回流2小時，提取2次，提取液高速離心(15000r/min，15min)，上清液過0.45ym孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液用截留分子量為1000Da的膜超濾，濃縮至1500毫升，加入乙醇調醇濃度至70%(v/v)，靜置66小時，離心(15000r/min，15min)，沉澱以無水乙醇洗2次，乾燥即得獼猴桃根粗多糖，經測定、計算，其純度為60.05%，得率2.47%。所得獼猴桃根粗多糖每克加蒸餾水90ml配製水溶液，按藥脂比20mg:lg加入聚醯胺，調pH至7，在室溫下振搖30min，濾過，濾液上HPSIP1300型大孔樹脂柱，採用0.4mo1/LNaCl溶液洗脫，洗脫液採用1000Da的超濾膜洗濾2次，除鹽並濃縮，濃縮液上DEAE-52纖維素柱，以0.03mol/LNaCl洗脫至顯色無色，洗脫液採用3000Da的超濾膜洗濾1次，除鹽並濃縮，乾燥即得獼猴桃根(精製)多糖，經測定其純度為81.85%，得率0.91%。實施例16:取乾燥獼猴桃根1000g，加16倍質量水，加熱回流2小時，提取2次，合併提取液，高速離心(10000r/min，25min)，上清液過0.65ym孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液用截留分子量為5000Da的膜超濾，濃縮至1250毫升，加入乙醇調醇濃度至80%(v/v)，靜置72小時，離心(10000r/min，25min)，沉澱以無水乙醇洗3次，乾燥即得獼猴桃根粗多糖，經測定、計算，獼猴桃根粗多糖純度57.9%，得率2.93%。所得獼猴桃根粗多糖每克加蒸餾水100ml配製水溶液，按藥脂比50mg:lg加入聚醯胺，調pH至8，在室溫下振搖60min，濾過，濾液上HPSIP1300型大孔樹脂柱，採用0.6mol/LNaCl溶液洗脫，洗脫液採用1000Da的超濾膜洗濾3次，除鹽並濃縮，乾燥即得獼猴桃根(精製)多糖，經測定其純度為76.53%，得率1.17%。實施例17:取乾燥獼猴桃根飲片500g，加10倍質量水，加熱回流提取3次、每次2小時，合併提取液，高速離心(9000r/min，20min)，上清液過0.8ym孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液用截留分子量為5000Da的膜超濾、濃縮至250毫升，濃縮液加入乙醇至乙醇體積濃度為70%(v/v)，靜置12小時，高速離心(9000r/min，20min)，取沉澱以無水乙醇洗滌3次，乾燥即得獼猴桃根粗多糖，經測定、計算，獼猴桃根粗多糖純度60.12%，得率3.18%。所得獼猴桃根粗多糖每克加蒸餾水120ml配製水溶液，按藥脂比80mg:lg加入聚醯胺，調pH至5，在室溫下振搖80min，濾過，濾液上SIP1400型大孔樹脂柱，採用0.6mo1/LNaCl溶液洗脫，洗脫液採用1000Da的超濾膜洗濾2次，除鹽並濃縮，濃縮液上DEAE-32纖維素柱，以0.05mol/LNaCl洗脫至顯色無色，洗脫液採用3000Da的超濾膜洗濾1次，除鹽並濃縮，乾燥即得獼猴桃根(精製)多糖，經測定其純度為82.50%，得率1.36%。實施例18:稱取乾燥獼猴桃根1000g，加10倍質量水，加熱回流3小時，提取3次，合併提取液，高速離心(12500r/min，15min)，上清液過0.65ym孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液用截留分子量為5000Da的膜超濾，濃縮至800毫升，加入乙醇調醇濃度至70%(v/v)，靜置24小時，離心(12500r/min，15min)，沉澱以無水乙醇洗3次，乾燥即得獼猴桃根粗多糖，經測定、計算，獼猴桃根粗多糖純度55.8%，得率2.74%。所得獼猴桃根粗多糖每克加蒸餾水150ml配製水溶液，按藥脂比80mg:lg加入聚醯胺，調pH至5，在室溫下振搖80min，濾過，濾液上SIP1400型大孔樹脂柱，採用0.6mo1/LNaCl溶液洗脫，洗脫液採用1000Da的超濾膜洗濾2次，除鹽並濃縮，濃縮液上DEAE-52纖維素柱，以0.05mol/LNaCl洗脫至顯色無色，洗脫液採用3000Da的超濾膜洗濾1次，除鹽並濃縮，乾燥即得獼猴桃根精製多糖，經測定其純度為84.90%，得率1.25%。實施例19:稱取乾燥獼猴桃根20kg，加10倍質量水，加熱回流2.5小時，提取2次，合併提取液，高速離心(10000r/min，20min)，上清液過0.8ym孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液用截留分子量為5000Da的膜超濾，濃縮至10升，加入乙醇調醇濃度至70%(v/v)，靜置24小時，離心(10000r/min，20min)，沉澱以無水乙醇洗3次，乾燥即得獼猴桃根粗多糖，經測定、計算，獼猴桃根粗多糖純度55.8%，得率1.95%。所得獼猴桃根粗多糖每克加蒸餾水150ml配製水溶液，按藥脂比80mg:lg加入聚醯胺，調pH至5，在室溫下振搖80min，濾過，濾液上SIP1400型大孔樹脂柱，採用0.6mo1/LNaCl溶液洗脫，洗脫液採用1000Da的超濾膜洗濾2次，除鹽並濃縮，濃縮液上DEAE-52纖維素柱，以0.05mol/LNaCl洗脫至顯色無色，洗脫液採用3000Da的超濾膜洗濾1次，除鹽並11濃縮，乾燥即得獼猴桃根(精製)多糖，經測定其純度為80.90%，得率1.01%。實施例20:藥效學實驗用按上述實施實例19中提供的方法製備得到的獼猴桃根粗多糖與精製多糖，注射給藥進行藥效學實驗—、抗小鼠H22肝癌實驗(—)材料與方法1、動物模型的建立1.l製備腫瘤細胞懸液在無菌條件下從H22瘤株腹腔抽取含腫瘤細胞的半透明、未溶血、未感染的腹水(符合要求者呈半透明乳白色，含血細胞者呈淡紅色，已感染者呈黃綠色)，用生理鹽水稀釋10倍、100倍。瑞氏染色，光鏡下計數每毫升腹水中的瘤細胞數(光鏡下腫瘤細胞為大而圓的透明亮點)，用生理鹽水稀釋腹水液使細胞終濃度為1X107ml，存活的瘤細胞^95%，並充分混勻。整個操作過程嚴格注意無菌操作，避免汙染。1.2接種腫瘤細胞用酒精棉球在小鼠右前腋下進行消毒處理，皮下注射已製備好的腫瘤細胞懸液0.2mL/只。2、分組與給藥2.1分組選擇體重(20±1.0)g，雄性ICR小鼠120隻，隨機分成6組模型對照組(生理鹽水注射)，ACPS低、中、高劑量組(20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg)，獼猴桃根粗多糖組(80mg/kg)，陽性對照組(香菇多糖注射液，市售注射劑)(0.7mg/kg日，相當於人臨床常用量的58倍)。2.2給藥於皮下瘤液接種的第2天開始給藥，連續8天。3、給藥後動物處理及標本採集3.1用於觀察抑瘤率等指標的各組(10隻/組)小鼠於停藥後第1天稱重後，摘眼球取血，每隻小鼠取血量0.51.Oml，置1.5ml離心管中，室溫下靜置2_4小時，離心(2000r/min，20min)，分離血清。全程避免交叉汙染，分裝後置1.5ml離心管中，冰箱中-2(TC保存，用於檢測血清中腫瘤壞死因子TNFa濃度。3.2脫臼處死摘眼球取血後的動物，分離腫瘤組織，並稱取瘤重，計算抑瘤率。將腫瘤組織標本在中性緩衝福馬林(pH=7.4)中固定，12小時後取材製成石蠟切片。3.3用於觀察生命延長期的各組(10隻/組)小鼠停藥後正常飼養，記錄生存天數，計算生命延長期。4、標本檢領[J4.1瘤組織石蠟切片HE染色(蘇木素-伊紅染色)鏡下觀察結果，主要觀察腫瘤組織的增生，壞死及凋亡情況。4.2TNFaELISAKit試劑盒測定血清中腫瘤壞死因子TNFa濃度。5、數據分析SPSS11.0對所得結果進行處理，多組間比較採用單因素方差分析，各組間兩兩比較採用T檢驗。(二)結果1、獼猴桃根多糖對小鼠H22肝癌細胞的抑制作用，結果見表4:表4獼猴桃根多糖注射給藥對H22肝癌小鼠抑瘤率的影響組別齊糧(mg/kg)動物數平均瘤重(g)抑瘤率(％)模型對照91.217±0.276ACPS(低)2091.051±0.08113.64ACPS(中)4090.681±0.184**44.08ACPS(高)8090.435±0.144**64.28獼猴桃根粗多糖8090.693±0.112**43.09香菇多糖0.790.636±0.141**47.72注"**"表示與模型組比較具有極顯著差異P<0.01(1)與模型組抑瘤率數據比較，ACPS注射液對小鼠H22肝癌具有良好的抑制作用，且在20至80mg/kg範圍內呈現量效關係，中劑量組和高劑量組與模型組比較差異極顯著(P<0.01)，低劑量組抑瘤率較低，與模型組比較無顯著差異。(2)獼猴桃根粗多糖組的抑瘤率低於相同劑量的ACPS注射液組，而與中劑量ACPS注射液組相當。高劑量ACPS注射液組的抑瘤率高於陽性對照組，說明ACPS藥效確切，具有很好的開發價值。(3)瘤組織切片HE染色鏡下可以見到腫瘤壞死，少數標本壞死較嚴重；陽性對照組和ACPS注射劑治療組(高、中劑量)多數腫瘤壞死非常明顯，只剩下周邊少量的腫瘤細胞；ACPS注射劑低劑量組及獼猴桃根粗多糖組腫瘤壞死也較明顯。2、獼猴桃根多糖對荷瘤小鼠生命延長期的影B向，結果見表5:表5獼猴桃根多糖注射給藥對荷瘤小鼠生命延長期的影響組別劑量(mg/kg)動物數平均生存天數生命延長期(％)模型對照92.167±1.169ACPS(低)20102.556±2.06817.95ACPS(中)40103.600±1.64766.15ACPS(高)80103.667±1.87169.23獼猴桃根粗多糖8094.000±2.44984.6213tableseeoriginaldocumentpage14由上表可知ACPS具有延長平均生存天數的作用，且呈現一定的量效關係，中劑量和高劑量組ACPS的生命延長期與香菇多糖相近。3、獼猴桃根多糖注射給藥對荷瘤小鼠血清TNFa的影響，結果見表6:表6獼猴桃根多糖注射給藥對荷瘤小鼠血清TNFa的影響組別劑量(mg/kg)動物數TNFa濃度(pg/ml)模型對照9148.03±22.50ACPS(低)209167.13±42.80ACPS(中)409173.58±28.00ACPS(高)809180.18±31.37獼猴桃根粗多糖809164.17±33.92香菇多糖0.79189.46±45.49由上表可知，ACPS低、中、高劑量組、獼猴桃根粗多糖組，及香菇多糖組的TNFa濃度均比模型組高，可見獼猴桃根多糖具有一定的提高血清TNFa濃度的作用。(三)結論獼猴桃根多糖對小鼠H22肝癌細胞具有抑制作用，並可延長H22肝癌小鼠的生存期，該作用可能與其提高小鼠血清TNFa濃度有關。二、抗小鼠S180荷瘤實驗(—)材料與方法1、動物模型的建立1.l製備腫瘤細胞懸液在無菌條件下從S180瘤株腹腔抽取含腫瘤細胞的半透明、未溶血、未感染的腹水(符合要求者呈半透明乳白色，含血細胞者呈淡紅色，已感染者呈黃綠色)，用生理鹽水稀釋10倍、100倍。瑞氏染色，光鏡下計數每毫升腹水中的瘤細胞數(光鏡下腫瘤細胞為大而圓的透明亮點)，用生理鹽水稀釋腹水液使細胞終濃度為1X107ml，存活的瘤細胞^95%，並充分混勻。整個操作過程嚴格注意無菌操作，避免汙染。1.2接種腫瘤細胞用酒精棉球在小鼠右前腋下進行消毒處理，皮下注射已製備好的腫瘤細胞懸液0.2mL/只。2、分組與給藥每組10隻小鼠，其餘同前(抗小鼠H22肝癌實驗)操作。3、各組小鼠於停藥後第1天稱重後，頸椎脫臼處死小鼠，脫臼處死後的動物，分離14腫瘤組織，並稱取瘤重，計算抑瘤率。4、數據分析SPSSll.0對所得結果進行處理，多組間比較採用單因素方差分析，各組間兩兩比較採用T檢驗。(二)結果獼猴桃根多糖注射給藥對小鼠S180荷瘤細胞的抑制作用，結果見表7:表7:獼猴桃根多糖注射給藥對S180荷瘤小鼠抑瘤率的影響tableseeoriginaldocumentpage15注"**"表示與模型組比較具有極顯著差異P<0.01由上表可知與模型組抑瘤率數據比較，獼猴桃根多糖對S180荷瘤小鼠具有良好的抑制作用，且在20至80mg/kg範圍內呈現量效關係；獼猴桃根粗多糖組的抑瘤率低於相同劑量的ACPS組，而與低劑量ACPS組相當，高劑量ACPS組的抑瘤率高於陽性對照組，說明ACPS藥效確切。(三)結論獼猴桃根多糖對S180荷瘤小鼠具有明確的抑制作用。權利要求一種獼猴桃根多糖提取物的製備方法，其特徵在於所述方法包括取乾燥獼猴桃根(RadixActinidiaChinensis)以水加熱回流提取，提取液離心除去不溶物，取上清液過0.2～0.8μm孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液用截留分子量5000Da的膜超濾，濃縮至所得濃縮液中生藥材含量為0.1～5g/mL，濃縮液加入85～95％乙醇至乙醇體積濃度為50～90％，靜置醇沉，離心，取沉澱洗滌後在60～80℃真空乾燥，得到獼猴桃根粗多糖。2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述方法還包括獼猴桃根粗多糖純化步驟(1)取獼猴桃根粗多糖，每g加蒸餾水50200ml配製成水溶液，水溶液脫色，過濾，取濾液進行下一步純化操作；(2)步驟(1)濾液上大孔吸附樹脂柱或DEAE纖維素柱，以NaCl溶液洗脫，洗脫液採用截留分子量為10005000Da的超濾膜洗濾13次，除鹽並濃縮，得濃縮液；(3)濃縮液乾燥即得獼猴桃根多糖。3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於所述步驟(2)聯用大孔吸附樹脂柱和DEAE纖維素柱純化進行獼猴桃根粗多糖的純化。4.如權利要求2或3所述的方法，其特徵在於所述大孔吸附樹脂的型號為下列之一AB-8型、MG-l型、LSA-5B型、X_5型、H107型、S_8型、D900型、HPSIP1300型、SIP1400型、NKA-9型、DM130型或D3520型；所述DEAE纖維素為DEAE-32或DEAE_52。5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的方法按如下步驟進行取乾燥獼猴桃根，加入質量為獼猴桃根質量630倍的水，加熱回流提取13次、每次13小時，合併提取液，500025000r/min離心10min30min，除去不溶物，上清液過0.20.8iim孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液用截留分子量5000Da的膜超濾，濃縮至所得濃縮液中生藥材含量為0.22g/mL，濃縮液在2545。C下加入8595%乙醇至乙醇體積濃度為6080%，靜置672小時，500025000r/min離心10min20min，取沉澱以無水乙醇洗滌13次，洗滌後的沉澱608(TC真空乾燥，得到所述獼猴桃根粗多糖。6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於所述方法還包括獼猴桃根粗多糖純化步驟(1)取獼猴桃根粗多糖，每g加蒸餾水50200ml配製成水溶液，水溶液按藥脂比5070mg:lg加入聚醯胺吸附脫色，調pH至56，在室溫下振搖5060min，過濾，取濾液進行下一步純化操作；(2)步驟(1)濾液上大孔吸附樹脂柱，以NaCl溶液洗脫，洗脫液採用截留分子量為10005000Da的超濾膜洗濾13次，除鹽並濃縮，得濃縮液1;所述大孔樹脂的型號為下列之一AB-8型、MG-1型、LSA-5B型、X-5型、H107型、S-8型、D900型、HPSIP1300型、SIP1400型、NKA-9型、DM130型或D3520型；(3)步驟(1)濾液或步驟(2)濃縮液1上DEAE纖維素柱，以NaCl溶液洗脫，洗脫液採用截留分子量為10005000Da的超濾膜洗濾13次，除鹽並濃縮，得濃縮液2;(4)濃縮液1或濃縮液2乾燥即得獼猴桃根多糖。全文摘要本發明提供了一種獼猴桃根多糖提取物的製備方法，所述的方法包括取乾燥獼猴桃根(RadixActinidiaChinensis)以水加熱回流提取，提取液離心，取上清液過微孔濾膜，濾液超濾，濃縮至生藥材含量為0.1～5g/mL，濃縮液加入85～95％乙醇至乙醇體積濃度為50～90％，靜置醇沉，離心，取沉澱洗滌後在60～80℃真空乾燥，得到獼猴桃根粗多糖經進一步純化得到獼猴桃根精製多糖；本發明的有益效果主要體現在(1)採用本發明方法製備獼猴桃根多糖，達到最大限度的分離、純化作用，獼猴桃根多糖純度高、提取率大，使有效成分得到富集，藥效得以提高；(2)採用本發明方法，大大節約了乙醇用量，降低了成本；(3)採用本發明方法，大大減少了乙醇用量、且不需要使用乙醚，提高了生產安全性。文檔編號C08B37/00GK101704899SQ20091015505公開日2010年5月12日申請日期2009年12月15日優先權日2009年12月15日發明者吳瑾瑾,夏聰華,李昌煜,楊悅,王麗麗,石森林,葛衛紅申請人:浙江中醫藥大學