一種化學發光檢測試劑盒及製備方法

2023-09-20 17:09:45 2

專利名稱：一種化學發光檢測試劑盒及製備方法
技術領域：
本發明屬於生物醫藥技術領域，具體地說涉及一種檢測人血管內皮細胞生長因子(VEGF)的化學發光檢測試劑盒。
背景技術：
腫瘤的發展和轉移是多階段的、複雜的、具有高度選擇性的過程，涉及腫瘤細胞與宿主之間錯綜複雜的關係，其機理尚不甚清楚。近年來關於新的血管生成與腫瘤發展、轉移和預後關係的研究進展迅速，證明新的血管生成是腫瘤生成、轉移和轉移灶生長的必要條件，血管內皮細胞生長因子(VEGF)是調節新血管生成的最重要的細胞因子。研究表明血管內皮細胞生長因子(VEGF)在血管系統的發育分化中具有不可替代的作用(Ferrara et al. Endocr. Rev. 1997, 18:4-25)。VEGF是一個分子量為45KD的高度糖基化的鹼性蛋白，有兩個相同亞單位通過二硫鍵結合形成，等電點為8. 5，有很強的耐熱和耐酸能力。人VEGF基因有5種不同的異構體，分別為 VEGF206、VEGF189, VEGF165、VEGF145, VEGF121。VEGF高親和力結合位點僅位於血管內皮細胞上的3種VEGF受體，即VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3，這3種受體主要分布於血管內皮細胞表面，均是跨膜受體。研究表明，VEGF受體在體外與VEGF有高度的親和力(Kendall et al. PNAS USA, 1993，90:10705-9)。VEGF是癌症生長、轉移所必需的一種因子。目前研究表明，在人類各種惡性腫瘤(即癌症)疾病中，VEGF的分泌增加有著普遍性和廣泛性。有大量文獻報導，VEGF在正常人和癌症患者中的濃度明顯不同，正常人中的VEGF濃度很低或檢測不到，而在癌症患者中VEGF濃度很高。因此，檢測人血液中的VEGF濃度，能夠用於癌症的早期普查診斷。另一方面，VEGF在人體血液中的濃度隨腫瘤的消長情況而變化。腫塊大、生長快時，VEGF的血液濃度就高；而當腫瘤因化療或手術「臨床治癒」時，VEGF的血液濃度降低。故VEGF得檢測可作為療效觀察和預後的指標。VEGF是惡性腫瘤診斷中的一個重要組成部分。另外，血液VEGF水平增高亦見於糖尿病、血管炎症性疾病、某些免疫性疾病和妊娠等。化學發光免疫測定(chemiluminesent immunoassay, CLEIA)是免疫測定技術繼酶免技術、放免技術、突光免疫技術和時間分辨突光免疫技術之後發展的一項新興測定技術。其基本原理是將化學發光系統與免疫反應相結合，以檢測樣本中的抗原或抗體，由於它既具有免疫反應的高度特異性，又具有發光反應的高敏感性，近年來已被國內外臨床實驗室及科研單位，廣泛應用於各種激素、特種蛋白及藥物的監測和分析。該方法具有高靈敏度、檢測範圍寬、操作簡便快捷、標記物穩定、無汙染、儀器簡單經濟等有點。目前，用過氧化氫和辣根過氧化物酶(HRP)聯合催化魯米諾類化合物發光的化學發光免疫測定效果比較好，應用比較廣泛
發明內容
本發明的目的是提供一種化學發光免疫檢測人血管內皮細胞生長因子(VEGF)的檢測試劑盒。該試劑盒結果準確穩定、特異性強、靈敏度高、使用方便、便於推廣。本發明的另一目的是提供上述發光檢測試劑盒的生產製備及使用方法。為實現上述目的，本發明提供的試劑盒組成為
I.反應板；2.酶結合物；3.標準品；4.樣品稀釋液；5.濃縮洗滌液；6.發光底物Α、Β;7·封板膠紙。本發明提供的上述試劑盒的製備方法及操做步驟如下
Ca)以發光反應板為固體支持物，將VEGF單克隆抗體包被於固體支持物上；
(b)用封閉液封閉；
(c)將生物標本與固定於發光板上的VEGF單克隆抗體接觸和保溫，生物標本中的VEGF特異地與VEGF單克隆抗體結合；
Cd)從VEGF單克隆抗體上分離生物標本；
(e)用辣根過氧化物酶(HRP)標記的VEGF多克隆抗體檢測VEGF，所用的發光底物為魯米諾溶液。本發明試劑盒的獨特性在於，它使用VEGF單克隆抗體包被發光板，能夠確保VEGF能被本試劑盒所檢測，能對標本有準確的測定。本試劑盒檢測生物標本中的VEGF，優選來自癌症、血管病病人或其他疾病病人的標本。
具體實施例方式下述實施例是為了更詳細的解釋本發明，但不應理解為本發明局限於此。實施例I :
本發明的試劑盒舉例可以是下列物質
(1)VEGF單克隆抗體包被固體發光板；
(2)酶結合物辣根過氧化物酶標記血管內皮生長因子多克隆抗體，I瓶；
(3)VEGF標準品，2支;
(4)樣品稀釋液0.05%吐溫-20，1%牛血清白蛋白，IOmM乙二胺四乙酸二鈉，O. 05%硫柳汞，0.4M NaCl，pH6.5，l 瓶;
(5)濃縮洗滌液為137mMNaCl, 2. 7 mM KCl, IOmM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4 , O. 05% 吐溫-20，Ph7. 4, I瓶；
(6)發光底物A、B，其中A液為H2O2溶液，B液為魯米諾溶液，各I瓶；
(7)封板膠紙2張。本例所述的各種物質量均以發光板為96孔(12條8孔或8條12孔)的例子計算的，如果發光板的孔數多於或少於96孔，則各物質量也相應或多或少。其製備方法
(I)VEGF基因的克隆
以人胎盤cDNA文庫為模板進行聚合酶鏈式反應(PCR)。依據VEGF基因的報導序列設計引物，PCR反應條件94°C變性40秒，52°C退火I分鐘，72°C延伸I分鐘，30個循環後72 °C保溫10分鐘，反應體系ddH2020. Ομ I
IOXBuffer2. 5 μ I
dNTP(IOmM)O. 5 μ I
3 primer(lOOng/μ I)O.5 μ I 5 primer(lOOng/μ I)O.5 μ I
Taq 酶(5U/μ I)O. 5 μ I
模板 NDAO. 5 μ I
總體積25 μ I
凝膠電泳回收PCR擴增的片段，克隆到載體ΡΜΤ18-Τ中，轉化大腸桿菌DH5 α，提取重組質粒進行酶切鑑定。VEGF基因的重組質粒命名為pMT18-l。DNA序列分析由上海博亞生物工程有限公司完成。(2)昆蟲表達載體的構建
用Sal I、BamH I酶切質粒ρΜΤ18_1，回收VEGF基因片段。同時用Sal I、BamH I酶切質粒PFastBac-HT，回收4. 7kb片段。將VEGF基因片段與4. 7kb片段進行連接，構建載體pFastBac-Ι。用不同的限制性內切酶進行酶切鑑定，表明所構建載體正確。將載體pFastBac-Ι轉化DHlOBac感受態細胞。採用藍白斑篩選，24小時後將白斑劃到新平板上，確認其是否白斑。將菌落挑到2ml LB培養基中，37°C，250rpm振蕩培養12小時。提取培養的菌液中的質粒方法如下
(a)將1.5ml菌液轉入離心管中，10，OOOrpm離心30s，棄上清，將離心管倒立於紙巾上，使細菌沉澱儘可能乾燥；
(b)加300 μ I 溶液 I (50mM 葡萄糖，25mM Tris-HCl，IOmM EDTA，pH8. 0),在震蕩器上振蕩混勻；
(c)加300μ I現配的溶液II (0. 2Ν NaOH，1%SDS)，混勻，室溫放置5分鐘；
(d)加300μ I預冷的溶液IIK5Μ KAc，ρΗ5· 5)，冰浴5分鐘；
(e)12, OOOrpm 離心 15 分鐘；
Cf)轉移上清至一新離心管中，加2倍體積的無水乙醇，混勻；
(g)10，000-12，OOOrpm 離心 10 分鐘；
(h)用70%和無水乙醇洗滌沉澱；
(i)吹乾，溶於50μ I 加 RNase 的 TE (IOmM Tris-HCl ; ImM EDTA, ρΗ8· 0)中，於 37°C放置一小時，置於_20°C備用。對提取的質粒進行PCR鑑定，PCR反應依據前述的方法。(3)轉染昆蟲細胞(以sf9細胞為例，但不僅限於sf9細胞，採用sf21、sf 158、cl27細胞株都可以得到相同的效果，在此不一一敘述)。sf9細胞培養於Grace培養液中，添加15%胎牛血清、青黴素50U/ml、鏈黴素50ug/ml，轉染方法如下
Ca)轉染前一天將細胞分到24孔板；
(b)轉染前2小時，更換新鮮無血清、無雙抗培養液，洗一次，然後加入500 μ I培養液； (C)在50 μ I無血清、無雙抗培養液中分別加入2μ I脂質體、5 μ I前述的重組質粒，室溫放置5分鐘，將質粒加入到脂質體中，室溫放置20分鐘；
Ce)將上一步驟的混合物加到細胞中，27°C培養；
(f)轉染4小時後，吸掉培養液，加入Iml新鮮有血清、有雙抗Grace培養液，27°C培養72小時；
(g)轉染72小時後，觀察是否有出毒跡象；
(h)將有杆狀病毒上清感染新sf9細胞。(4)昆蟲表達蛋白的純化(Ni柱吸附法)
(a)Ni柱的製備
(I )取Iml Ni-NTA到一離心管中，1500g離心5分鐘；
(II)去掉上清，將Ni-NTA用I倍體積的洗滌緩衝液(20mMTris-HCl，500mM KCl，20mM咪唑，2mM巰基乙醇，10%甘油，pH8. 5)重懸；
(III)將重懸液到入柱中，用5-10倍體積的washbuffer平衡；
(b)細胞抽提物的準備
(I ) 500g離心5分鐘收集50ml細胞；
(II)用裂解緩衝液(50mMTris-HCl，IOOmM KCl，20mM咪唑，5mM巰基乙醇，I mM苯甲基磺醯氟，PH8. 5)重懸細胞；
(III)10, OOOg離心10分鐘，將上清液轉移到一新管中；
(C )蛋白純化
(I )將上一步驟的上清液加到平衡好的Ni柱中；
(II)用10 倍體積的 buffer A (20mM Tris-HCl，500mM KCl，20mM 咪唑，5mM 巰基乙醇，10%甘油，pH8. 5)洗柱；
(III)用2 倍體積的 buffer B (20mM Tris-HCl，IM KCl，20mM 咪唑，5mM 巰基乙醇，10%甘油，ρΗ8· 5)洗柱；
(IV)用2倍體積的bufferA洗柱；
(V)用5-10 倍 buffer C (20mM Tris-HCl，IOOmM KCl，IOOmM 咪唑，5mM 巰基乙醇，10%甘油，pH8. 5)洗脫，收集洗脫液；
(VI)用SDS-PAGE膠檢測所純化蛋白的濃度與純度。(5) VEGF單克隆抗體的製備及純化
以小鼠為免疫動物，重組VEGF為抗原進行免疫。根據小鼠免疫效價，挑選免疫效價最高的動物，取脾臟進行細胞融合，採用間接ELISA方法進行陽性雜交瘤細胞株的篩選。挑選有一個細胞團的陽性孔進行有限稀釋，一個孔中只有此一個克隆細胞團，中央密集成圓形向四周鋪開。待有限稀釋的所有的孔皆如此且全部檢測為陽性，可認為克隆完成。由其中單一細胞來源的雜交瘤分泌所得到的抗體為單克隆抗體。正辛酸一硫酸銨沉澱法純化單克隆抗體，純度在95%以上。(6) VEGF多克隆抗體的製備、純化及標記
用家兔作為免疫動物，先用5-10mg卡介苗注射刺激動物。一周後，將VEGF蛋白製成弗氏完全佐劑，採用皮下多點注射進行第一次免疫。2周後，進行第二次免疫。2周後，試血並測效價。如效價偏低，則進行加強免疫。採集家兔全血，離心取血清。向血清中加入飽和硫酸銨,血清與硫酸銨的體積比為2:1，使抗體沉澱，離心分離，抗體純度達98%以上。採用戊二醛法將辣根過氧化物酶(HRP)標記到VEGF多克隆抗體上。(7)試劑盒的製備
發光板的包被採用以下步驟抗體用包被緩衝液稀釋一定的倍數，每孔加100 μ I。37°C水浴或溫箱中包被2小時，然後放在室溫過夜。每孔加滿PBST洗滌液，放置30秒左右，甩幹。每孔加120 μ I封閉液，室溫放置2小時。封閉液配方主要含有BSA、一些鹽類等。甩掉封閉液，拍打除去殘餘封閉液。超淨臺上吹乾。或超淨臺上吹數小時，然後室溫放置過夜。用真空包裝機進行包裝。實施例2 :試劑盒使用方法
1.從以平衡至室溫的密封袋中取出所需板條，其它板條密封放回4°C ；
2.留一孔為空白孔，其他各孔加入樣品稀釋液 οομI (或2滴)；
3.除空白孔外，加入標準品稀釋液(用標準品稀釋8個梯度)、血清標本各100μ I至相應孔中，輕彈混勻。用封板膠紙封住反應孔，37°C 60分鐘；
4.洗板3次(1)自動洗板機甩盡孔內液體，要求注入的洗滌液為350μ 1，注入與吸出間隔15-30秒，洗板3次。(2)手工洗板甩盡孔內液體，每孔加洗滌液350 μ 1，靜置30秒後甩盡液體，在厚迭吸水紙上拍幹，洗3次；
5.除空白孔外，每孔加酶結合物200μ I (或4滴)，封住板孔，37°C 60分鐘；
6.洗板3次；
7.發光反應將發光底物A、B液各100μ I (或2滴)加到反應孔(包括空白孔)內；
8.輕微振蕩30秒，室溫(18— 25°C )避光反應5分鐘後，用化學發光儀測定各孔發光
值；
9.以標準品濃度值為橫坐標(X軸)，以標準品發光強度值為縱坐標(Y軸)，建立標準曲線，計算測定結果。本發明具有的優點
1.結果特異性強。本發明採用VEGF單克隆抗體為包被物包被固體發光板，因此，檢測VEGF的特異性高；
2.靈敏度高。檢測靈敏度能打到ng/L水平；
4.穩定。本發明於4°C保存，有效期達9-12個月；
5.方便。本發明操作簡便，所需檢測儀器(化學發光儀)在各大醫院和檢測中心普遍使用。
權利要求
1.一種發光檢測試劑盒，其組成為 反應板、酶結合物、標準品、樣品稀釋液、濃縮洗滌液、發光底物A、B和封板膠紙； 其中 反應板為血管內皮細胞生長因子單克隆抗體包被的固體反應板； 酶結合物為辣根過氧化物酶標記血管內皮生長因子多克隆抗體。
2.權利要求I的試劑盒，其特徵在於 標準品為血管內皮細胞生長因子蛋白凍乾粉； 樣品稀釋液為0. 05%吐溫-20，1%牛血清白蛋白，IOmM乙二胺四乙酸二鈉，0. 05%硫柳汞，0. 4M NaCl，pH6. 5; 濃縮洗滌液為 137mM NaCl, 2. 7 mM KCl, IOmM Na2HPO4, 2 mMKH2P04，0. 05% 吐溫-20，Ph7. 4 ； 發光底物A、B，其中發光底物A為H2O2溶液，發光底物B為魯米諾溶液。
3.權利要求I的試劑盒，其特徵在於，各物質的量以發光板的孔數為標準。
4.權利要求I的試劑盒，其特徵在於，所述發光板為96孔。
5.上述試劑盒的製備和操作方法，主要步驟為 Ca)將血管內皮細胞生長因子單克隆抗體包被於固體支持物發光反應板上； (b)用封閉液封閉； (C)將生物標本加入到預包被的發光反應板反應孔中，生物標本中的血管內皮細胞生長因子特異地與血管內皮細胞生長因子單克隆抗體結合； Cd)用血管內皮細胞生長因子多克隆抗體檢測血管內皮細胞生長因子； Ce)發光底物為魯米諾溶液。
6.權利要求5的方法，其特徵在於，步驟a所述的單克隆抗體是用血管內皮細胞生長因子免疫小鼠所得。
7.權利要求5的方法，其特徵在於，步驟c所述的生物標本為癌症、血管病、糖尿病視網膜病及類風溼關節炎的血清、血漿、腦脊液、唾液、組織提取液或尿液。
8.權利要求5的方法，其特徵在於，步驟d所述的血管內皮細胞生長因子多克隆抗體製備用的血管內皮細胞生長因子用昆蟲細胞表達並用Ni柱純化。
9.權利要求5的方法，其特徵在於，步驟d所述的多克隆抗體是用血管內皮細胞生長因子免疫家兔所得。
10.權利要求5的方法，其特徵在於，步驟d所述的多克隆抗體用辣根過氧化物酶標記。
11.權利要求6的方法，其特徵在於，所述的血管內皮細胞生長因子用昆蟲細胞表達並用Ni柱純化。
全文摘要
一種檢測人血管內皮生長因子(VEGF)的發光檢測試劑盒。試劑盒盒體內包括VEGF單克隆抗體包被的固體反應板、辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗體加保護劑配置的酶結合物、VEGF標準品、樣品稀釋液、PBST濃縮洗液、魯米諾配置的發光底物、封板膠紙。本試劑盒可用於癌症、血管病、糖尿病視網膜病及類風溼關節炎的診斷和預後，具有準確、特異、靈敏、穩定、方便等優點。
文檔編號G01N33/543GK102798723SQ20121027450
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月3日 優先權日2012年8月3日
發明者鄒檢平 申請人:北京華創遠航科技有限公司