包括因子VII多肽和PAl－1多肽的藥物組合物的製作方法

2023-09-21 06:10:45 2

專利名稱：包括因子VII多肽和PAl－1多肽的藥物組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及包括因子VII或因子VII相關多肽以及PAI-1或PAI-1相關多肽的組合物。本發明還涉及因子VII或因子VII相關多肽和PAI-1或PAI-1相關多肽的組合在製備用於治療患有出血發作的受試者或預防他們的出血發作的藥物中的應用。本發明還涉及受試者出血發作的治療方法，並涉及增強受試者內凝塊形成的方法。本發明還涉及含有這些化合物的試劑盒。
背景技術：
因血管壁損傷而接觸循環血液的組織因子(TF)與以相當於約1％總FVII蛋白質量的量存在於循環中的FVIIa之間形成複合體而啟動止血。這種複合體錨定在含有TF的細胞上並使細胞表面上的FX活化成Fxa和FIX活化成FIXa。FXa將凝血酶原活化成凝血酶，而凝血酶使FVIII、FV、FXI和FXIII活化。此外，在止血的起始步驟中形成的有限量的凝血酶也使血小板活化。在凝血酶對血小板起作用後，這些血小板改變形狀並暴露其表面上的帶電荷的磷脂類。這種活化的血小板表面形成了進一步FX活化和全部凝血酶生成的模板。活化血小板表面上的進一步FX活化是通過活化血小板表面上形成的FIXa-FVIIIa複合體發生的，然後FXa將凝血酶原轉化成凝血酶，同時仍然保留在表面上。凝血酶隨後將血纖蛋白原轉化成不溶性的且使起始血小板塞保持穩定的血纖蛋白。這一過程是區室化的，即該過程定位於TF表達或暴露部位，由此將凝血系統的全身性活化的危害減小到最低限度。形成所述血小板塞的不溶性血纖蛋白通過FXIII-催化的血纖蛋白纖維交聯而進一步穩定化。
FVIIa主要作為單鏈酶原存在於血漿中，它被FXa裂解成其雙鏈活化形式FVIIa。已經將重組活化因子VIIa(rFVIIa)開發為促止血劑(pro-haemostatic agent)。給予rFVIIa可在患有因抗體形成而不能用凝血因子產品治療的出血的血友病患者中提供快速而高效的促止血反應(pro-haemostatic response)。還可以用FVIIa成功地治療因子VII缺乏的出血受試者或凝血系統正常、但發生出血過度的受試者。在這些研究中，尚未發現rFVIIa的任何不利副作用(特別是發生血栓栓塞的情況下)。
額外地外部給予FVIIa可增加活化血小板表面上凝血酶的形成。這種情況在缺乏FIX或FVIII、由此喪失了完整凝血酶形成的最有效途徑的血友病患者中會發生。此外，在血小板量少或存在功能缺陷的血小板的情況下，額外的FVIIa增加了凝血酶形成。
重組人FVIIa的商品製劑作為NovoSeven(Novo NordiskA/S，Denmark)銷售。Novoseven的適應徵有治療A型和B型血友病患者的出血發作。Novoseven是唯一可在市場上得到的、用於有效和可靠治療出血發作的重組FVIIa。
已經證實纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-1)在調節纖溶酶介導的蛋白水解中起重要作用。也稱作內皮型纖溶酶原激活物抑制劑(e-PAI)的PAI-1可抑制尿激酶型纖溶酶原激活物(u-PA)和組織型纖溶酶原激活物(t-PA)，一般獲自人內皮細胞、人血小板和大鼠肝細胞瘤細胞(HTC)。PAI-1抑制劑可以如美國專利US6,271,352中所述自HT-1080品系的人纖維肉瘤細胞中純化，或如van Mourik，J.A.等(1984)在《生物化學雜誌》(J.Biol.Chem.)259，14914-14921中所述自牛內皮細胞純化。PAI-1是具有50kDa分子量的單鏈糖蛋白(Van Mourik J A等《生物化學雜誌》(J.Biol.Chem.)(1984)25914914-14921)，它是目前已知對單鏈和雙鏈形式的tPA和uPA最有效的抑制劑(Lawrence D等《歐洲生物化學雜誌》(Eur J Biochem)(1989)186523-533)。PAI-1還抑制纖溶酶和胰蛋白酶(Hekman C M等《生物化學》(Biochemistry)(1988)272911-2918)，也可抑制凝血酶和活化蛋白C，不過功效極低。
眾所周知，發生與手術或嚴重創傷有關的過度出血且需要輸血的受試者比那些未發生任何出血的受試者更易發生併發症。然而，需要給予人血或血液製品(用於治療凝固缺陷等的血小板、白細胞、來源於血漿的濃縮物)的中度出血也可能導致與人病毒(肝炎、HIV、細小病毒及其它目前未知的病毒)轉移的危害相關的併發症。需要大輸血的廣泛出血可以導致包括肺和腎功能損害在內的多器官衰竭的發生。一旦受試者已經發展了這些嚴重的併發症，則開始出現一連串涉及許多細胞因子和炎症反應的事件，使得極難進行任何治療，且通常令人遺憾地不成功。因此，手術和治療大組織損害中的主要目的在於避免出血或將其減小到最低限度。為了避免這類出血或將其減小到最低限度，重要的是確保形成屬於不易被纖維蛋白溶解酶溶解的穩定而堅固的止血塞(haemostatic plugs)。此外，重要的是確保快速而有效地形成這類塞或凝塊。
目前，因為FVIIa的半衰期短(2.5小時)，可能需要給藥一次以上以便維持一定的止血能力水平，所以通常通過注射或輸注FVIIa幾次來治療發生出血發作的受試者，包括創傷受害者和與手術相關的出血的受試者。使出血較迅速的停止對這類受試者而言具有重要的有益作用。所以需要減少給藥次數以終止出血並維持止血。
歐洲專利EP225,160(Novo Nordisk)涉及用於治療並非由凝血因子缺乏或凝血因子抑制劑導致的出血性疾病的FVIIa組合物和方法。
歐洲專利EP 82,182(Baxter Travenol Lab.)涉及用於對抗受試者凝血因子缺乏或抑制劑對凝血因子的影響的因子VIIa組合物。
國際專利公開號WO 93/06855(Novo Nordisk)涉及FVIIa的局部應用。
本領域中仍然需要有對經歷出血發作的受試者改進療法的需求，包括具有下列情況的受試者因手術、創傷或其它形式的組織損害導致的出血發作；誘發的凝血病，包括多次輸血受試者的凝血病；先天性或獲得性凝血或出血性疾病，包括肝功下降(″肝病″)；血小板功能缺陷或血小板數量減少；必需的凝血″化合物″(例如血小板或馮·維勒布蘭德因子蛋白)缺乏或異常；纖維蛋白溶解增加；抗凝療法或溶栓療法；或幹細胞移植。
本領域中仍舊需要有可增強凝固、增強或確保穩定止血塞(haemostatic plugs)形成或增強受治療的受試者的便利性或在受試者、特別是在具有凝血酶產生異常的受試者中實現完全止血的改進的可靠和可廣泛應用的方法。還需要有縮短了止血時間的方法。
發明概述本發明的一個目的是提供可以有效用於治療或預防出血發作和凝血性疾病的組合物。
本發明的第二個目的是提供可以有效用於治療或預防出血發作或用作促凝血劑的單一單位劑型形式的組合物。本發明的另一個目的是提供表現出協同作用的組合物、治療方法或試劑盒。
本發明的另一個目的是提供沒有表現出明顯的副作用、諸如高水平全身性凝固系統活化的組合物、治療方法或試劑盒。
在閱讀本說明書時顯然可以得出本發明的其它目的。
本發明在第一個方面中提供了包括因子VII或因子VII有關多肽和PAI-1或PAI-1相關多肽的藥物組合物。
本發明在第二個方面中提供了含有用於治療出血發作的組成部分的試劑盒，包括a)第一單位劑型形式的有效量的因子VII或因子VII有關多肽和藥物上可接受載體的製劑；b)第二單位劑型形式的有效量的PAI-1或PAI-1相關多肽和藥物上可接受載體的製劑；和c)用於包含所述第一和第二單位劑型的容器用具。
本發明在第三個方面中提供了因子VII或因子VII有關多肽和PAI-1或PAI-1相關多肽的組合在製備用於治療受試者中的出血發作的藥物中的應用。本發明在另一個方面中提供了如權利要求1-18中任意一項所述的組合物在製備用於治療受試者中出血發作的藥物中的應用。
在本發明不同的實施方案中，所述藥物可用於減少獲得完全止血所需的時間、減少維持止血所需的時間、減少凝固時間、延長凝塊溶解時間並增加凝塊強度。
在不同的實施方案中，所述的藥物用於治療因下列情況而經歷出血發作的受試者手術、創傷或其它形式的組織損害；凝血病，包括多次輸血受試者的凝血病；先天性或獲得性凝血或出血性疾病，包括肝功下降(″肝病″)；血小板功能缺陷或血小板數量減少；必需的凝血″化合物″(例如血小板或馮·維勒布蘭德因子蛋白)缺乏或異常；纖維蛋白溶解增加；抗凝療法或溶栓療法；或幹細胞移植。在一系列實施方案中，出血發生在諸如腦、內耳區、眼、肝、肺、腫瘤組織、胃腸道這樣的器官；在另一系列實施方案中，出血是彌散性出血，諸如出血性胃炎和子宮出血過多。在另一系列實施方案中，出血發作是與具有急性關節積血(關節內出血)、慢性血友病性關節病、血腫(例如肌肉、腹膜後、舌下和咽後)、其它組織中的出血、血尿(從腎道中出血)、大腦出血、手術(例如肝切除術)、拔牙和胃腸出血(例如UGI出血)的受試者中的手術或創傷相關的出血。在一個實施方案中，所述的藥物用於治療因受試者創傷或手術或血小板計數或活性降低所導致的出血發作。
本發明在另一個方面中提供了受試者內出血發作的治療方法，該方法包括根據受試者需要對其給予第一用量的因子VII或因子VII有關多肽的製劑和第二用量的PAI-1或PAI-1相關多肽的製劑，其中所述的第一用量和第二用量一起可有效治療出血。
本發明在另一個方面中提供了減少受試者中凝固時間的方法，該方法包括根據受試者需要對其給予第一用量的因子VII或因子VII有關多肽的製劑和第二用量的PAI-1或PAI-1相關多肽的製劑，其中所述的第一用量和第二用量一起可有效減少凝固時間。
本發明在另一個方面中提供了增強受試者內止血的方法，該方法包括根據受試者需要對其給予第一用量的因子VII或因子VII有關多肽的製劑和第二用量的PAI-1或PAI-1相關多肽的製劑，其中所述的第一用量和第二用量一起可有效地增強止血。
本發明在另一個方面中提供了延長受試者內凝塊溶解時間的方法，該方法包括根據受試者需要對其給予第一用量的因子VII或因子VII有關多肽的製劑和第二用量的PAI-1或PAI-1相關多肽的製劑，其中所述的第一用量和第二用量一起可有效延長凝塊溶解時間。
本發明在另一個方面中提供了增加受試者內凝塊強度的方法，該方法包括根據受試者需要對其給予第一用量的因子VII或因子VII有關多肽的製劑和第二用量的PAI-1或PAI-1相關多肽的製劑，其中所述的第一用量和第二用量一起可有效地增加凝塊強度。
在一系列所述方法的實施方案中，以單一劑型形式給予所述的因子VII或因子VII有關多肽和PAI-1或PAI-1相關多肽。
在另一系列所述方法的實施方案中，以含有因子VII或因子VII有關多肽的製劑的第一劑型和含有PAI-1或PAI-1相關多肽的製劑的第二劑型的形式給予所述的因子VII或因子VII有關多肽和PAI-1或PAI-1相關多肽。在一系列其實施方案中，給予所述第一劑型與給予所述第二劑型之間的時間間隔不超過15分鐘。
本發明在另一個方面中提供了含有用於出血發作的治療用品的試劑盒，包括d)單一單位劑型的有效量的因子VII或因子VII有關多肽和有效量的PAI-1或PAI-1相關多肽以及藥物上可接受載體；和e)用於包含所述單一單位劑型的容器用具。
在本發明的一系列實施方案中，所述的因子VII或因子VII有關多肽是因子VII有關多肽。在本發明的一系列實施方案中，所述的因子VII有關多肽是因子VII胺基酸序列變體。在一個實施方案中，當用如本說明書中所述的″體外水解試驗″測定時，所述的因子VII有關多肽的活性與天然人因子VIIa(野生型FVIIa)的活性之比至少約為1.25。
在本發明的一系列實施方案中，所述的因子VII或因子VII有關多肽是因子VII。在一個實施方案中，所述的因子VII是牛、豬、犬、馬、鼠或鮭魚的因子VII。在另一個實施方案中，因子VII是以重組方式製備的。在另一個實施方案中，所述的因子VII來源於血漿。在優選的實施方案中，所述的因子VII是重組人因子VII。在本發明的一系列實施方案中，所述的因子VII或因子VII有關多肽是其活化形式。在本發明的一個優選實施方案中，所述的因子VII是重組人因子VIIa。
在一系列實施方案中，所述的PAI-1或PAI-1相關多肽是PAI-1相關多肽。在一個實施方案中，所述的PAI-1相關多肽是PAI-1胺基酸序列變體。在一個實施方案中，當用如本說明書中所述的″PAI-1試驗″測定時，所述的PAI-1相關多肽的活性與天然人血漿PAI-1(野生型PAI-1)的活性之比至少約為1.25。在一個實施方案中，所述的PAI-1或PAI-1相關多肽是PAI-1多肽。在一個實施方案中，所述的PAI-1是人PAI-1。在一個實施方案中，所述的PAI-1是牛、豬、犬、馬、鼠或大鼠的PAI-1。在優選的實施方案中，所述的PAI-1是以重組方式製備的。在一個實施方案中，所述的PAI-1來源於血小板；在另一個實施方案中，它來源於內皮細胞。在優選的實施方案中，所述的PAI-1是重組人PAI-1。在一個實施方案中，所述的PAI-1相關多肽是PAI-1片段。在一個實施方案中，所述的PAI-1相關多肽是雜合PAI-1多肽，例如豬/人雜合體。
在一個實施方案中，所述的因子VII或因子VII有關多肽和PAI-1或PAI-1相關多肽存在的重量比約為100∶1-約1∶100(w/w因子VII∶PAI-1)。
在一個實施方案中，所述的VII相關多肽是與野生型因子VII(即具有美國專利US4,784,950中所公開的胺基酸序列的多肽)相比具有不超過20個胺基酸取代、缺失或插入的胺基酸序列變體。在另一個實施方案中，所述的因子VII變體與野生型因子VII相比具有不超過15個胺基酸取代、缺失或插入；在其它實施方案中，所述的因子VII變體與野生型因子VII相比具有不超過10個胺基酸、諸如8個、6個、5個或3個胺基酸取代、缺失或插入。在一個實施方案中，所述的因子VII變體選自L305V-FVIIa、L305V/M306D/D309S-FVIIa、L305I-FVIIa、L305T-FVIIa、F374P-FVIIa、V158T/M298Q-FVIIa、V158D/E296V/M298Q-FVIIa、K337A-FVIIa、M298Q-FVIIa、V158D/M298Q-FVIIa、L305V/K337A-FVIIa、V158D/E296V/M298Q/L305V-FVIIa、V158D/E296V/M298Q/K337A-FVIIa、V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVIIa、K157A-FVII、E296V-FVII、E296V/M298Q-FVII、V158D/E296V-FVII、V158D/M298K-FVII和S336G-FVII的組。
在另一個實施方案中，VII相關多肽與天然人凝血因子VIIa相比具有增加的組織因子非依賴性活性。在另一個實施方案中，這種增加的活性並不伴有底物特異性的改變。在本發明的另一個實施方案中，VII相關多肽和組織因子的結合併未受到損害，且VII相關多肽在與組織因子結合時至少具有野生型因子VIIa的活性。
在優選的實施方案中，所述的因子VII或因子VII有關多肽和PAI-1或PAI-1相關多肽是重組人因子VIIa和重組人PAI-1。
在一個實施方案中，哺乳動物血液的凝固時間得到減少。在另一個實施方案中，哺乳動物血液中的止血得到增強。在另一個實施方案中，哺乳動物血液中的凝塊溶解時間得到延長。在另一個實施方案中，哺乳動物血液中的凝塊強度得到提高。在一個實施方案中，所述的哺乳動物血液是人血液。在另一個實施方案中，所述的哺乳動物血液是正常人血液。在一個實施方案中，所述的血液來自凝血酶產生異常的受試者。在一個實施方案中，所述的血液是來自其中一種或多種凝血因子缺乏的受試者的血液；在另一個實施方案中，所述的血液是來自具有針對一種或多種凝血因子的抑制劑的受試者的血液；在一個實施方案中，所述的血液來自具有血纖蛋白原濃度降低的受試者；在一個實施方案中，所述的血液是PAI-1-缺陷型人血液。在一系列實施方案中，所述的血液是血漿。
在本發明的一個實施方案中，所述的因子VII或因子VII有關多肽和PAI-1或PAI-1相關多肽是包含在所述組合物中的僅有止血劑。在另一個實施方案中，所述的因子VII或因子VII有關多肽和PAI-1或PAI-1相關多肽是包含在所述組合物中的僅有活性止血劑。在另一個實施方案中，所述的因子VII或因子VII有關多肽和PAI-1或PAI-1相關多肽是給予受試者的僅有凝血因子。在本發明的一個實施方案中，所述的因子VII或因子VII有關多肽和PAI-1或PAI-1相關多肽是給予患者的僅有活性劑。在一個實施方案中，所述的組合物基本上不含凝血酶或凝血酶原；在另一個實施方案中，所述的組合物基本上不含FX；在另一個實施方案中，所述的組合物基本上不含FXa。
在另一個實施方案中，藥物組合物被配製成用於靜脈內給藥，優選注射或輸注，特別是注射。在一個實施方案中，所述的組合物含有至少一種藥物上可接受的賦形劑或載體。
在本發明的一個實施方案中，所述的組合物是單一單位劑型，其中該單一單位劑型含有這兩種凝血因子。在本發明的一個實施方案中，所述的組合物是包括VII或因子VII有關多肽的製劑作為第一單位劑型和PAI-1或PAI-1相關多肽的製劑作為第二單位劑型、並包括用於包含所述第一和第二單位劑型的容器用具的試劑盒。在一個實施方案中，所述的組合物或試劑盒可以適當地進一步包含用於分別給予所述組合物或獨立成分的說明書。
在本發明的一個實施方案中，以單一劑型形式給予所述的因子VII或因子VII有關多肽和PAI-1或PAI-1相關多肽。在本發明的一個實施方案中，以包括VII或因子VII有關多肽的製劑的第一單位劑型和包括PAI-1或PAI-1相關多肽的製劑的第二單位劑型的形式給予所述的因子VII或因子VII有關多肽和PAI-1或PAI-1相關多肽。
在本發明的一個實施方案中，同時給予所述的因子VII或因子VII有關多肽和PAI-1或PAI-1相關多肽。在另一個實施方案中，依次給予所述的因子VII或因子VII有關多肽和PAI-1或PAI-1相關多肽。在一個實施方案中，以不超過15分鐘、優選10分鐘、更優選5分鐘、更優選2分鐘的時間間隔給予所述的因子VII或因子VII有關多肽和PAI-1或PAI-1相關多肽。在一個實施方案中，以至多2小時、優選1-2小時、更優選至多1小時、更優選30分鐘-1小時、更優選至多30分鐘、更優選15-30分鐘的時間間隔給予所述的因子VII或因子VII有關多肽和PAI-1或PAI-1相關多肽。
在一個實施方案中，所述的因子VII或因子VII有關多肽的有效量約為0.05mg/天-約500mg/天(70-kg受試者)。在一個實施方案中，PAI-1或PAI-1相關多肽的製劑的有效量約為0.01mg/天-約500mg/天(70-kg受試者)。
在一個實施方案中，所述的因子VII或因子VII有關多肽和PAI-1或PAI-1相關多肽以重量比約為100∶1-約1∶100(w/w因子VII∶PAI-1)的比例存在。
在本發明的一個實施方案中，所述的藥物組合物是單一單位劑型，主要由因子VII或因子VII有關多肽的製劑、PAI-1或PAI-1相關多肽的製劑和一種或多種選自藥物上可接受載體、穩定劑、去汙劑、中性鹽、抗氧化劑、防腐劑和蛋白酶抑制劑的組中的成分所組成。
在本發明的另一個實施方案中，所述的藥物組合物是由組成部分組成的試劑盒形式，其中包含第一單位劑型和第二單位劑型，所述的第一單位劑型主要由因子VII或因子VII有關多肽的製劑和一種或多種選自藥物上可接受載體、穩定劑、去汙劑、中性鹽、抗氧化劑、防腐劑和蛋白酶抑制劑的組中的成分組成；所述的第二單位劑型主要由PAI-1或PAI-1相關多肽的製劑和一種或多種選自藥物上可接受載體、穩定劑、去汙劑、中性鹽、抗氧化劑、防腐劑和蛋白酶抑制劑的組中的成分組成。
在另一個實施方案中，所述的受試者是人；在另一個實施方案中，所述的受試者具有凝血酶產生異常；在一個實施方案中，所述的受試者的血纖蛋白原血漿濃度降低(例如多次輸血的受試者)；在一個實施方案中，所述的受試者中因子VIII或FIX血漿濃度降低。
本發明在另一個方面中涉及與用因子VII作為唯一凝固蛋白來治療受試者對相比在患有因子VII反應性症候群的受試者中增強止血的方法，該方法包括根據受試者需要對其給予第一用量的因子VII或因子VII有關多肽的製劑和第二用量的PAI-1或PAI-1相關多肽的製劑，其中所述的第一用量和第二用量一起可有效地增強止血。
本發明在另一個方面中涉及增強受試者內凝血酶形成的方法，該方法包括根據受試者需要對其給予第一用量的因子VII或因子VII有關多肽的製劑和第二用量的PAI-1或PAI-1相關多肽的製劑，其中所述的第一用量和第二用量一起可有效地增強凝血酶形成。
本發明在另一個方面中涉及與用因子VII作為唯一凝固蛋白來治療受試者時相比在患有因子VII反應性症候群的受試者中增強凝血酶形成的方法，該方法包括根據受試者需要對其給予第一用量的因子VII或因子VII有關多肽的製劑和第二用量的PAI-1或PAI-1相關多肽的製劑，其中所述的第一用量和第二用量一起可有效地增強凝血酶形成。
本發明在另一個方面中涉及與用因子VII作為唯一凝固蛋白來治療受試者時相比在患有因子VII反應性症候群的受試者中減少完成止血所需的凝血因子給藥次數的方法，該方法包括根據受試者需要對其給予第一用量的因子VII或因子VII有關多肽的製劑和第二用量的PAI-1或PAI-1相關多肽的製劑，其中所述的第一用量和第二用量一起可有效地減少凝血因子蛋白給藥次數。
本發明在另一個方面中涉及對患有因子VII反應性症候群的受試者中的出血進行治療的方法，該方法包括根據受試者需要對其給予第一用量的因子VII或因子VII有關多肽的製劑和第二用量的PAI-1或PAI-1相關多肽的製劑，其中所述的第一用量和第二用量一起可有效地治療出血。
在一個實施方案中，所述的因子VII是人重組因子VIIa(rFVIIa)。在另一個實施方案中，rFVIIa是NovoSeven(NovoNordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark)。
本發明在另一個方面中涉及因子VII或因子VII有關多肽和PAI-1的組合在製備可用於增強哺乳動物血漿中血纖蛋白塊形成的藥物中的應用。
本發明在另一個方面中涉及增強受試者中血纖蛋白塊形成的方法，該方法包括根據受試者需要對其給予第一用量的因子VII或因子VII有關多肽的製劑和第二用量的PAI-1或PAI-1相關多肽的製劑，其中所述的第一用量和第二用量一起可有效地治療出血。
附圖目錄附

圖1添加FVIIa導致凝塊溶解時間以劑量依賴性方式延長。這種作用在10nM FVIIa下最佳。
附圖2在有10nM FVIIa存在的情況下，添加PAI-1導致凝塊溶解時間進一步延長。這種作用是劑量依賴性的，且在10nM PAI-1下為最佳。
附圖3利用血栓彈性描記法(roTEG)測定值分析FVIIa與PAI-1的組合對最大凝塊硬度(Maximal Clot Firmness，MCF)和凝塊對t-PA介導的溶解的耐受性的影響。在正常人血漿中，添加PAI-1(30nM)不會改變MCF，但可將半數凝塊溶解時間延長至16.1分鐘。時間標度按分鐘計。
附圖4利用血栓彈性圖描記法(roTEG)測定值分析FVIIa與PAI-1的組合對最大凝塊硬度(MCF)和凝塊對t-PA介導的溶解的耐受性的影響。在血友病患者的血漿中，單獨添加PAI-1將MCF增加至5mm，並將半數凝塊溶解時間延長至32.4分鐘。時間標度按分鐘計。
發明詳述因手術或大型創傷而過度出血、由此需要輸血的受試者比那些未發生任何出血的受試者更易產生併發症。然而，如果需要給予人血液或血液製品(用於治療凝血缺陷等的血小板、白細胞、來源於血漿的濃縮物)，則中度出血也可以導致併發症，這是因為它與轉移人病毒(肝炎、HIV、細小病毒及其它目前未知的病毒)以及非病毒病原體的危害相關。需要大輸血的廣泛出血可以導致包括肺和腎功能損害在內的多器官衰竭的發生。一旦受試者發生這些嚴重的併發症，則開始出現一連串涉及許多細胞因子和炎症反應的事件，使得極難進行任何治療，且通常令人遺憾地不成功。發生大失血的患者在臨床上變得不穩定。這類患者有發生心房纖維性顫動的風險，這可以導致致命性的心臟功能停止、腎功能異常或肺中流體外滲(所謂的″肺積水″或ARDS)。因此，手術和治療主要組織損害的主要目的在於避免出血或將其減小到最低限度。為了避免這類不期望的出血或將其減小到最低限度，重要的是確保形成不易被纖維蛋白溶解酶溶解的穩定、堅固的止血塞(haemostatic plugs)。此外，重要的是確保快速而有效地形成這類止血塞或凝塊。
患有血小板減少(血小板計數或活性下降)的受試者也存在凝血酶產生異常和纖維蛋白塞難於穩定的問題，從而使止血塞傾向於過早溶解。此外，發生大型創傷或器官損害、因而已經進行頻繁輸血的受試者通常具有低血小板計數和低血纖蛋白原、因子VIII和其它凝固蛋白水平。這些受試者中凝血酶產生異常(或低下)。因此，這些受試者在止血能力上存在缺陷或效力較低，導致形成的血纖蛋白塞可很容易並過早地被蛋白水解酶溶解，而這類酶還在以廣泛創傷和器官損害為特徵的情況中廣泛釋放。
組織中的出血還可以導致血腫形成。血腫(特別是顱間和脊椎血腫)的大小與神經功能喪失、恢復困難和/或恢復後神經功能永久性損傷的嚴重性和程度密切相關。當血腫位於大腦中時，可觀察到最嚴重的後果，甚至可以導致患者死亡。
因此，治療出血的主要目的在於在最短時間內達到止血，由此使失血保持在最低水平上。
本發明由此提供了可用於治療有此需要的受試者內出血發作的有益的組合物、應用和治療方法。所述的組合物、應用和方法可以帶來有益作用，諸如在獲得止血前就減少失血；在手術過程中需要的血液量減少；將血壓保持在可接受的水平上直至獲得止血；使血壓較快速地保持穩定；對所治療的患者而言恢復時間縮短；減少血腫形成或形成更小的血腫(包括腦內血腫)；更快速地制止出血；減少使出血停止並維持止血所需的給藥次數。
與單獨給予因子VIIa或PAI-1相比，聯合給予因子VII或因子VII有關多肽、例如因子VIIa的製劑與PAI-1或PAI-1相關多肽的製劑時凝固時間縮短，凝塊較硬且對纖維蛋白溶解的耐受性增加。
聯合給予因子VII或因子VII有關多肽(例如因子VIIa)的製劑與PAI-1或PAI-1相關多肽的製劑時，與單獨給予因子VIIa或PAI-1之一的情況相比，前者達到止血的時間減少，且維持止血所需的給藥次數減少。本發明提供了同時或依次給予因子VII或因子VII有關多肽的製劑與PAI-1或PAI-1相關多肽的製劑的有益作用。本發明的藥物組合物可以是單一組合物形式，或它可以是多成分試劑盒(多組成部分組成的試劑盒)的形式。本發明的組合物可用作包括諸如人這樣的靈長類在內的哺乳動物中的治療和預防性促凝血劑。本發明進一步提供了治療包括人類在內的受試者內的出血發作的方法(包括預防性治療或預防)。
本說明書的上下文中無論在何種情況下提及第一或第二或第三單位劑量等時，這一劑量並不表示給藥的優選順序，而僅僅是為了便於說明。
因子VII或因子VII有關多肽的製劑與PAI-1或PAI-1相關多肽的製劑的組合是確保凝固時間縮短、止血塞快速形成和形成穩定止血塞(haemostatic plugs)的有利產品。本發明者已經發現，因子VII或因子VII有關多肽的製劑與PAI-1或PAI-1相關多肽的製劑的組合是確保堅固、穩定且快速形成的止血塞形成的有利產品。
本發明者已經證實，與單獨的因子VIIa或PAI-1相比因子VIIa與PAI-1的組合可以更有效地增加凝塊的硬度。還證實與單獨的因子VIIa或PAI-1相比，因子VII或因子VII有關多肽與PAI-1的組合可以更有效地延長正常人血漿的體外凝塊溶解時間。另外證實與單獨的因子VIIa或PAI-1相比，因子VII或因子VII有關多肽與PAI-1的組合可以更有效地延長正常人血漿中的半數凝塊溶解時間。也證實與單獨的因子VIIa或PAI-1之一相比，因子VII或因子VII有關多肽與PAI-1的組合可以更有效地防止正常人血漿中凝塊發生纖維蛋白溶解，特別是tPA-介導的纖維蛋白溶解。因此，通過增強凝固作用，可以在受試者中更有效地治療出血。
不希望受到理論束縛，據信完整的凝血酶產生是形成堅實、穩定的止血塞、由此維持止血所必不可少的。這類塞的纖維蛋白結構依賴於形成的凝血酶的量和開始凝血酶產生的速率。在凝血酶產生異常的情況下，形成高滲透性的多孔纖維蛋白塞。血纖蛋白表面上通常存在的纖維蛋白溶解酶易於溶解這類血纖蛋白塞。穩定的血纖蛋白塞的形成也依賴於被凝血酶活化的因子XIIIa的存在，由此也依賴於完整的凝血酶產生。此外，近來描述的凝血酶可活化纖維蛋白溶解抑制劑TAFI要求相當高的凝血酶量用於其活化。因此，在凝血酶的形成並非完全合適的情況下，TAFI可能不活化，導致形成通常更易於被正常纖維蛋白溶解活性所溶解的止血塞。在血小板數量下降、即血小板減少症的情況中，通過給予額外的外源性因子VIIa可以啟動快速凝血酶產生。然而，因子VIIa即使在高濃度下也不可能使總凝血酶產生正常化。
在血纖蛋白原的血漿濃度低的受試者(因多創傷或廣泛手術而導致多次輸血的受試者)中，不會發生完整凝血酶活化。更有效的止血通過聯合給予因子VII或因子VII有關多肽與PAI-1而達到。
患有血小板減少的受試者中凝血酶產生異常，血纖蛋白塞的穩定化有缺陷，導致止血塞(haemostatic plugs)傾向於過早溶解。此外，發生大創傷或器官損害、由此頻繁輸血的受試者通常具有低血小板計數和低血纖蛋白原、因子VIII和其它凝固蛋白水平。這些受試者的凝血酶產生異常(或低下)。此外，其降低的血纖蛋白原水平對因子XIII的活化產生了負面的幹擾作用。因此，這些受試者的止血能力存在缺陷或效力較低，導致形成可容易並過早地被蛋白水解酶所溶解的血纖蛋白塞，而這類酶還在以廣泛創傷和器官損害為特徵的情況中廣泛釋放。
為了有利於形成具有維持受試者內止血的完整能力的完全穩定化的塞，給予本發明的組合物。該組合物對血小板數量低的受試者和血纖蛋白原和/或其它凝固蛋白的血漿水平低的受試者尤其有利。
因子VII多肽在實施本發明的過程中，可以使用有效預防或治療出血的任何因子VII多肽。包括來源於血液或血漿或者通過重組方式生產的因子VII多肽。
本發明包括因子VII多肽，諸如例如那些具有美國專利US4,784,950中所公開的胺基酸序列的因子VII(野生型人因子VII)。在某些實施方案中，所述的因子VII多肽是如美國專利US4,784,950中所公開的人因子VIIa(野生型因子VII)。在一系列實施方案中，因子VII多肽包括表現出人因子VIIa的特異性生物活性的至少約10％、優選至少約30％、更優選至少約50％且最優選至少約70％的多肽。在一系列實施方案中，因子VII多肽包括表現出人因子VIIa的特異性生物活性的至少約90％、優選至少約100％、優選至少約120％、更優選至少約140％且最優選至少約160％的多肽。在一系列實施方案中，因子VII多肽包括表現出與美國專利US4,784,950中所公開的野生型因子VII序列具有至少約70％、優選至少約80％、更優選至少約90％且最優選至少約95％同一性的多肽。
本文所用的″因子VII多肽″包括、但不限於因子VII和因子VII有關多肽。術語″因子VII″用以包括、但不限於具有野生型人因子VII(如美國專利US4,784,950所公開的)第1-406位胺基酸序列的多肽以及來源於其它種類的野生型因子VII，諸如來自牛、豬、犬、鼠或鮭魚的因子VII，所述的因子VII來源於血液或者血漿，或者通過重組方式產生。該術語進一步包括可以在個體之間存在並出現的因子VII的天然等位變化形式。此外，糖基化或其它翻譯後修飾的程度和位置可以隨所選擇的宿主細胞和宿主細胞環境的性質的不同而改變。術語″因子VII″還用以包括未裂解(酶原)形式的因子VII多肽和那些已經經蛋白酶解加工成其相應的生物活性形式的多肽，可以將它們命名為因子VIIa。一般來說，裂解因子VII的第152位-第153位殘基而得到因子VIIa。
″因子VII有關多肽″包括、但不限於相對於人因子VII而言已經進行化學修飾和/或相對於人因子VII而言含有一個或多個胺基酸序列改變(即因子VII變體)和/或相對於人因子VII而言含有截短的胺基酸序列(即因子VII片段)的因子VII多肽。這類因子VII有關多肽可以表現出與人因子VII不同的特性，包括穩定性、磷脂結合、改變的比活性等。術語″因子VII有關多肽″用以包括這類未裂解形式(酶原)的多肽和那些已經經蛋白酶解加工成其相應的生物活性形式的多肽，可以將它們命名為″因子VIIa相關多肽″或″活化的因子VII相關多肽″。
本文所用的″因子VII有關多肽″包括、但不限於與野生型人因子VII表現出基本上相同或改善的生物活性的多肽，以及相對於野生型人因子VIIa而言因子VIIa生物活性已經實質上改變或降低的多肽。這些多肽包括、但不限於已經進行化學修飾的因子VII或因子VIIa和已經導入了改變或破壞所述多肽的生物活性的特定胺基酸序列改變的因子VII變體。
其中進一步包括具有輕微修飾的胺基酸序列的多肽，例如，帶有修飾的N-末端、包括N-末端胺基酸缺失或添加的多肽和/或相對於人因子VIIa而言已經進行化學修飾的多肽。
包括因子VII變體在內的因子VII有關多肽，無論是表現出與野生型因子VII基本上相同或更好的生物活性，還是與野生型因子VII相比表現出實質上改變或降低的生物活性，都包括、但不限於因插入、缺失或取代一個或多個胺基酸而具有不同於野生型因子VII序列的胺基酸序列的多肽。
當用如上所述的凝血試驗、蛋白水解試驗或TF結合試驗中的一種或多種測試時，包括變體在內的因子VII有關多肽包括表現出在相同細胞類型中產生的野生型因子VIIa的比活性的至少約10％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約40％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約90％、至少約100％、至少約110％、至少約120％或至少約130％的那些多肽。
當用如上所述的凝血試驗、蛋白水解試驗或TF結合試驗中的一種或多種測試時，與野生型因子VIIa具有基本上相同或有所改善的生物活性的因子VII有關多肽(包括變體在內)包括表現出在相同細胞類型中產生的野生型因子VIIa的比活性的至少約25％、優選至少約50％、更優選至少約75％、更優選至少約100％、更優選至少約110％、更優選至少約120％且最優選至少約130％的那些多肽。
當用如上所述的凝血試驗、蛋白水解試驗或TF結合試驗中的一種或多種測試時，與野生型因子VIIa相比具有實質上降低的生物活性的因子VII有關多肽(包括變體在內)是表現出在相同細胞類型中產生的野生型因子VIIa的比活性的低於約10％、更優選低於約5％且最優選低於約1％的那些多肽。與野生型因子VII相比具有實質上改變的生物活性的因子VII變體包括、但不限於表現出TF非依賴性因子X蛋白水解活性的因子VII變體和那些結合TF、但不裂解因子X的因子VII變體。
在某些實施方案中，因子VII多肽是因子VII有關多肽，特別是在用″體外水解試驗″(參見下面的″試驗″)測試時其活性與天然人因子VIIa(野生型FVIIa)的活性之比至少約為1.25的變體；在其它實施方案中，該比值至少約為2.0；在其它實施方案中，該比值至少約為4.0。在本發明的某些實施方案中，因子VII多肽是因子VII有關多肽，特別是在用″體外蛋白水解試驗″(參見下面的″試驗″)測試時其活性與天然人因子VIIa(野生型FVIIa)的活性之比至少約為1.25的變體；在進一步實施方案中，該比值至少約為2.0；在進一步實施方案中，該比值至少約為4.0；在進一步實施方案中，該比值至少約為8.0。
在某些實施方案中，所述的因子VII多肽是如美國專利US4,784,950中所公開的人因子VII(野生型因子VII)。在某些實施方案中，所述的因子VII多肽是人因子VIIa。在一系列實施方案中，因子VII多肽是表現出人因子VIIa的特異性生物活性的至少約10％、優選至少約30％、更優選至少約50％且最優選至少約70％的因子VII有關多肽。在某些實施方案中，所述的因子VII多肽具有因插入、缺失或取代一個或多個胺基酸而不同於野生型因子VII的序列的胺基酸序列。
具有與野生型因子VIIa基本上相同或優於它的生物活性的因子VII變體的非限制性實例包括、但不限於丹麥專利申請PA 2000 00734和PA 2000 01360(相當於WO 01/83725)以及PA 2000 01361(相當於WO 02/22776)中所述的因子VII變體。具有與野生型因子VII基本上相同或改善的生物活性的因子VII變體的非限制性實例包括S52A-FVII、S60A-FVII(lino等《生物化學與生物物理學檔案》(Arch.Biochem.Biophys.)352182-192，1998)；L305V-FVII、L305V/M306D/D309S-FVII、L305I-FVII、L305T-FVII、F374P-FVII、V158T/M298Q-FVII、V158D/E296V/M298Q-FVII、K337A-FVII、M298Q-FVII、V158D/M298Q-FVII、L305V/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII、V1 58D/E296V/M298Q/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII、K157A-FVII、E296V-FVII、E296V/M298Q-FVII，V158D/E296V-FVII、V158D/M298K-FVII和S336G-FVII；如美國專利US5,580,560中所公開的表現出增加的蛋白水解穩定性的FVIIa變體；已經在第290-291位殘基或第315-316位殘基上進行了蛋白水解切割的因子VIIa(Mollerup等《生物技術與生物工程》(Biotechnol. Bioeng.)，48501-505，1995)；和因子VIIa的氧化形式(Kornfelt等《生物化學與生物物理學檔案》(Arch.Biochem.Biophys.)36343-54，1999)。與野生型因子VII相比具有實質上降低或改變的生物活性的因子VII變體的非限制性實例包括R152E-FVIIa(Wildgoose等《生物化學》(Biochem)293413-3420，1990)、S344A-FVIIa(Kazama等《生物化學雜誌》(J.Biol.Chem.)27066-72，1995)、FFR-FVIIa(Hoist等《歐洲血管與血管內手術雜誌》(Eur.J.Vasc.Endovasc.Surg.)15515-520，1998)和缺乏Gla結構域的因子VIIa(Nicolaisen等《FEBS通訊》(FEBS Letts.)317245-249，1993)。化學修飾的因子VII多肽和序列變體的非限制性實例描述在例如美國專利US5,997,864中。
因子VIIa在血液凝固中的生物活性來源於其(i)結合組織因子(TF)和(ii)催化因子IX或因子X的蛋白水解切割而產生活化因子IX或X(分別為因子IXa或Xa)的能力。
為了本發明的目的，可以如美國專利US5,997,864中所述通過使用缺乏因子VII的血漿和組織促凝血酶原激酶測定製劑增強血液凝固的能力來對因子VII多肽的生物活性(″因子VII生物活性″)定量。在該試驗中，將生物活性表示為與對照樣品相比凝固時間的減少，通過與含有1單位/ml因子VII活性的合併人血清標準品比較而轉化成″因子VII單位″。或者，可以通過下列步驟對因子VIIa生物活性定量(i)測定因子VIIa或因子VIIa相關多肽在包括包埋在脂膜中的TF和因子X的系統中產生活化因子X(因子Xa)的能力。(Persson等《生物化學雜誌》(J.Biol.Chem.)27219919-19924，1997)；(ii)在含水系統中測定因子X水解(″體外蛋白水解試驗″，參見下文)；(iii)使用基於表面胞質基因共振的儀器測定因子VIIa或因子VIIa相關多肽與TF的物理結合(Persson，《FEBS通訊》(FEBSLetts.)413359-363，1997)；和(iv)測定因子VIIa和/或因子VIIa相關多肽對合成底物的水解(″體外水解試驗″，參見下文)；和(v)測定非TF依賴性體外系統中凝血酶的產生。
術語″因子VII生物活性″或″因子VII活性″用以包括產生凝血酶的能力；該術語還包括在沒有組織因子存在的情況下在活化血小板的表面上產生凝血酶的能力。
可以按照本發明使用的因子VIIa製劑是、但不限於NovoSeven(Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark)。
PAI-1多肽本發明包括PAI-1多肽的應用，諸如例如那些具有Gils等在《生物化學與生物物理學學報》(Biochim Biophys Acta.)1998年9月8日；1387(1-2)291-7、Sui等在《生物活性雜誌》(Biochem J.)19984月15日；331(Pt2)409-15、Ginsburg等在《臨床研究雜誌》(J.Clin.Invest.)，第78卷，pp.1673-1680(1986)中所公開的胺基酸序列的PAI-1多肽；那些描述在美國專利US6,303,338、美國專利6,103,498或如Pannekoek等在《歐洲分子生物學協會雜誌》(JOURNAL EMBOJ.)5(10)，2539-2544(1986)中所公開的PAI-1多肽(野生型PAI-1)。
在實施本發明的過程中，可以使用有效預防或治療出血的任意PAI-1多肽。這包括來源於血液或血漿或者通過重組方式產生的PAI-1多肽。術語″PAI-1″用以包括活性形式(包括組成型活性形式，例如PAI-1(14-1b，Molecular Innovations))和潛在構象的天然出現的PAI-1多肽。
本文所用的″PAI-1多肽″包括、但不限於PAI-1以及PAI-1-相關多肽。
術語″PAI-1″用以包括、但不限於具有Pannekoek等在《歐洲分子生物學協會雜誌》(JOURNAL EMBO J.)5(10)，2539-2544(1986)、Gils等在《生物化學與生物物理學學報》(Biochim BiophysActa.)1998 9月8日；1387(1-2)291-7、Sui等在《生物活性雜誌》(Biochem J.)1998 4月15日；331(Pt2)409-15、Ginsburg等在《臨床研究雜誌》(J.Clin.Invest.)，第78卷，pp.1673-1680(1986)中所述的胺基酸序列的多肽；或那些描述在美國專利US6,303,338、美國專利6,103,498中的多肽；和來源於其它物種的野生型PAI-1，諸如牛、豬、犬、鼠和大鼠PAI-1。
其中進一步包括可能在個體之間存在且出現的PAI-1的天然等位變化形式。此外，糖基化或其它翻譯後修飾的程度和位置可以隨所選擇的宿主細胞和宿主細胞環境性質的不同而改變。術語″PAI-1″還用以包括酶原形式的PAI-1多肽和那些已經加工成其相應的生物活性形式的多肽。
″PAI-1相關多肽″包括、但不限於相對於人PAI-1而言已經進行化學修飾和/或相對於人PAI-1而言含有一個或多個胺基酸序列改變(即PAI-1變體)和/或相對於人PAI-1而言含有截短的胺基酸序列(即PAI-1片段)的PAI-1多肽。這類PAI-1相關多肽可以表現出與人PAI-1不同的特性，包括穩定性、磷脂結合、改變的比活性等。
術語″PAI-1相關多肽″用以包括酶原形式的這類多肽和那些已經加工成其相應的生物活性形式的多肽。
本文所用的″PAI-1相關多肽″包括、但不限於表現出與野生型人PAI-1基本上相同或有所改善的生物活性的多肽，以及與野生型人PAI-1的活性相比其PAI-1生物活性已經實質上改變或降低的多肽。這些多肽包括、但不限於已經化學修飾的PAI-1和已經導入了改變或破壞所述多肽的生物活性的特定胺基酸序列改變的PAI-1變體。
其中進一步包括具有輕微修飾的胺基酸序列的多肽，例如，帶有修飾的N-末端、包括N-末端胺基酸缺失或添加的多肽和/或相對於人因子PAI-1而言已經進行化學修飾的多肽。
包括因子PAI-1變體在內的因子PAI-1相關多肽，無論是表現出與野生型PAI-1基本上相同或優於它的生物活性，還是與野生型PAI-1相比表現出實質上改變或降低的生物活性，均包括、但不限於具有因插入、缺失或取代一個或多個胺基酸而不同於野生型PAI-1的序列的胺基酸序列的多肽。
當用本說明書中所述的PAI-1活性試驗測試時，包括變體在內的PAI-1相關多肽包括表現出在相同細胞類型中產生的野生型PAI-1的比活性的至少約10％、至少約20％、至少約30％、至少約40％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約90％、至少約100％、至少約110％、至少約120％和至少約130％的那些多肽。
與野生型PAI-1具有基本上相同或改善的生物活性的PAI-1相關多肽(包括變體在內)包括，在用如上所述的特異性PAI-1活性試驗中的一種或多種測試時，表現出在相同細胞類型中產生的野生型人PAI-1的特異性生物活性的至少約25％、優選至少約50％、更優選至少約75％、更優選至少約100％、更優選至少約110％、更優選至少約120％且最優選至少約130％的那些多肽。為了本發明的目的，可以通過例如如本文所述測定製劑抑制tPA-介導的凝塊溶解或纖溶酶介導的凝塊溶解的能力來對PAI-1的生物活性進行定量。在兩種試驗中，將生物活性表示為與對照樣品相比凝塊溶解時間的減少。或者，可以通過例如Chandler等在《臨床化學》(Clinical Chemistry)，35(5)787-793(1989)中所述或用於功能性人PAI-1的酶聯免疫吸附測定(HPAIKT，Molecular Innovations)或本領域中公知的其它試驗測定PAI-1和/或PAI-1等同物對tPA醯胺水解活性(amidolytic activity)的抑制作用來對PAI-1的生物活性定量。
當用如上所述的特異性PAI-1活性試驗中的一種或多種測試時，具有實質性低於野生型PAI-1生物活性的PAI-1相關多肽(包括變體在內)是表現出在相同細胞類型中產生的野生型PAI-1的比活性的低於約25％、優選低於約10％、更優選低於約5％且最優選低於約1％的那些多肽。
PAI-1等同物的非限制性實例包括例如美國專利US6103498中所述的PAI-1等同物。
在某些實施方案中，所述的PAI-1多肽是當用″PAI-1試驗″(Chandler等《臨床化學》(Clinical Chemistry)，35(5)787-793(1989)，參見上文)測試時其活性與天然人PAI-1(野生型PAI-1)的活性之比至少約為1.25的PAI-1等同物；在其它實施方案中，該比值至少約為2.0；在進一步的實施方案中，該比值至少約為4.0。
PAI-1相關多肽還包括保持其特徵性止血相關活性的PAI-1或PAI-1相關多肽的片段。例如，可以使用本說明書中所述的PAI-1活性試驗測定PAI-1多肽的止血相關活性。
定義在本說明書的上下文中，按照表1中所示的常規含義使用三字母或單字母胺基酸表示法。除非詳細說明，本文中所提及的胺基酸是L-胺基酸。應理解例如在K337中的第一個字母代表天然出現在野生型因子VII指定位置上的胺基酸，並且，例如[K337A]-FVIIa指其中由單字母代碼K代表的天然出現在指定位置上的胺基酸被由單字母代碼A代表的胺基酸取代的FVII-變體。
表1胺基酸縮寫
術語″因子VIIa″或″FVIIa″可以互換使用。
在本說明書的上下文中，「具有凝血酶產生異常的受試者」指的是不能在活化血小板表面上使凝血酶完全爆發的受試者，包括凝血酶的產生少於具有完全有功能的正常止血系統的受試者體內凝血酶產生的受試者，所述的完全有功能的正常止血系統包括凝血因子、血小板和血纖蛋白原的正常量和功能(例如在匯集的正常人血漿中)；包括、但不限於缺乏因子VIII的受試者；具有低血小板數量或具有功能缺陷的血小板的受試者(例如血小板減少或格蘭茲曼血小板機能不全或過度出血的受試者)；具有低水平凝血酶原、FX或FVII的受試者；幾種凝血因子的水平降低(例如因創傷或廣泛手術導致的過度出血)的受試者；和血纖蛋白原血漿濃度低的受試者(例如多次輸血的受試者)。
所謂″凝血酶產生水平″或″正常凝血酶產生″指的是與健康受試者體內的水平相比患者內凝血酶的產生水平。將該水平表示成正常水平的百分比。如果合適，這些術語可以互換使用。
術語″增強止血系統″指的是增強產生凝血酶的能力。術語″增強止血″用以包括在相同凝血酶產生試驗測試時，分別與僅含有因子VII或因子VII有關多肽或者PAI-1或PAI-1相關多肽的對照樣品中各自的凝血酶產生相比，含有因子VII或因子VII有關多肽的製劑和PAI-1或PAI-1相關多肽的製劑的測試樣品中測定的凝血酶產生得到延長的情形。可以如本說明書中的凝血酶產生試驗(參見″試驗部分″)中所述檢測凝血酶產生。
本文所用的″僅有″活性劑或因子指的是因子VII或因子VII有關多肽和PAI-1或PAI-1相關多肽彼此共同為包含在藥物組合物或試劑盒中的唯一止血劑或活性止血劑或凝血因子，或者是在特定治療過程中、諸如在特定的出血發作過程中對患者給予的唯一止血劑或活性止血劑或凝血因子的情況。應理解這些情況包括其它止血劑或凝血因子在使用時不以量或活性足以顯著影響一種或多種凝固參數存在的那些情況。
凝塊溶解時間、凝塊強度、血纖蛋白塊形成和凝固時間是用以檢測患者止血系統狀態的臨床參數。以適當的間隔從患者體內取血樣，且如下列文獻中所述通過例如血栓彈性描記法檢測這些參數中的一種或多種例如Meh等《血液凝固和纖維蛋白溶解》(Blood Coagulation Fibrinolysis)2001；12627-637；Vig等《血液學》(Hematology)，第6卷(3)pp.205-213(2001)；Vig等《血液凝固和纖維蛋白溶解》(Blood Coagulation Fibrinolysis)，第12卷(7)pp.555-561(2001)10月；Glidden等《臨床和應用血栓形成/止血》(Clinical andapplied thrombosis/hemostasis)，第6卷(4)pp.226-233(2000)10月；McKenzie等《心臟病學》(Cardiology)，第92卷(4)pp.240-247(1999)4月；或Davis等《美國腎病學協會雜誌》(Journal of theAmerican Society of Nephrology)，第6卷(4)pp.1250-1255(1995)。
術語″延長凝塊溶解時間″用以包括在相同凝塊溶解試驗中測試時，含有因子VII或因子VII有關多肽的製劑和PAI-1或PAI-1相關多肽的製劑的測試樣品的凝塊溶解時間測定值相對於比僅分別含有因子VII或因子VII有關多肽或者PAI-1或PAI-1相關多肽的對照樣品的各凝塊溶解時間有所延長的情況。可以如上所述檢測凝塊溶解時間。
術語″增加凝塊強度″用以包括在相同凝塊強度試驗中測試時，對含有因子VII或因子VII有關多肽的製劑和PAI-1或PAI-1相關多肽的製劑的測試樣品測定的凝塊強度、例如機械強度比僅含有因子VII或因子VII有關多肽或者PAI-1或PAI-1相關多肽的對照樣品的各凝塊裂解時間有所增加的情況。可以如Carr等1991所述(Carr ME，Zekert SL.「血漿凝塊形成過程中血小板介導的力發生的測定」(Measurement of platelet-mediated force development duringplasma clot formation.)-《美國藥物科學雜誌》(AM J MED SCI)1991；30213-8)或如上所述通過血栓彈性描記法檢測凝塊強度。
術語″增強血纖蛋白凝塊形成″用以包括在相同凝血試驗中測試時，對含有因子VII或因子VII有關多肽的製劑和PAI-1或PAI-1相關多肽的製劑的測試樣品測定的血纖蛋白凝塊形成速率或程度比對僅含有因子VII或因子VII有關多肽或PAI-1或PAI-1相關多肽的對照樣品測定的血纖蛋白凝塊形成速率或程度有所增加的情況。可以如上所述檢測血纖蛋白凝塊形成。
術語″縮短凝固時間″用以包括在相同凝血試驗中測試時，含有因子VII或因子VII有關多肽的製劑和PAI-1或PAI-1相關多肽製劑的測試樣品的凝塊形成時間(凝固時間)測定值比分別僅含有因子VII或因子VII有關多肽或者PAI-1或PAI-1相關多肽的對照樣品的個體凝固時間有所增加的情況。可以通過本領域普通技術人員所公知的標準PT og aPTT試驗測定凝固時間。
術語″降低的血小板計數或活性″指的是存在於受試者血漿中的血小板數量(血小板)和這類血小板的凝血相關生物活性。降低的計數可能是由於例如血小板破壞增加、血小板產生減少和脾中匯集了高於正常的血小板級分所造成的。例如，將血小板減少定義為血小板計數低於150,000個血小板/微升；一般正常血小板計數的上限為350,000-450,000個血小板/微升。可以通過自動化血小板計數器測定血小板計數；這是本領域技術人員眾所周知的方法。因血小板計數降低所導致的症候群包括、但不限於血小板減少、凝血病。″活性″包括、但不限於血小板的聚集、粘著和凝固活性。活性降低可能是由於例如糖蛋白異常、膜-細胞骨架相互作用異常、血小板顆粒異常、血小板凝固活性異常、信號傳導和分泌異常導致的。可通過本領域技術人員所公知的方法測定血小板活性，包括聚集、粘著和凝固活性，例如，參見《血細胞那-實用手段》(Platelets.A Practical Approach)，Ed.S.P.Watson K.S.Authi《血小板疾病的臨床方面》(Clinical Aspects ofPlatelet Disorders)(K.J.Clemetson)15299-318，1996，OxfordUniversity Press；WilliamsHematology，第6版，Eds.Butler，Lichtman，Coller，Kipps Selig-sohn，2001，McGraw-Hill。因血小板活性降低導致的症候群包括、但不限于格蘭茲曼血小板機能不全、伯-索症候群、抗凝療法和溶栓療法。″降低的″指的是當在相同試驗中測定時，與正常的匯集血漿樣品中的計數或活性相比較，測試樣品中的計數或活性降低。
本文所用的術語″出血疾病″反映了表現出出血發作的細胞或分子來源的任何缺陷，可以是先天性的、獲得性的或誘發性的。出血疾病的實例包括、但不限於凝血因子缺乏(例如凝血因子VIII、IX、XI或VII缺乏)；凝血因子抑制；血小板功能缺陷(例如格蘭茲曼血小板機能不全和伯-索症候群)；血小板減少；馮·維勒布蘭德氏病；和凝血病，諸如因凝固蛋白稀釋、纖維蛋白溶解增加和因出血和/或輸血造成血小板數量降低(例如在已經進行了手術或發生創傷的多次輸血的患者中)所導致的凝血病。
出血指的是血液從循環系統的任何成分中外滲。術語″出血發作″用以包括與手術、創傷或其它形式的組織損害相關的不需要的、未受控制且通常是過度的出血，以及患有出血疾病的受試者中不需要的出血。出血發作可以在具有基本上正常的凝固系統、但發生(暫時性)凝血病的受試者和患有先天性或獲得性凝固或出血疾病的受試者中發生。在患有血小板功能缺陷的受試者中，出血可能與血友病導致的出血相似，這是因為與血友病一樣，其中止血系統缺乏必需的凝血″化合物″(例如血小板或馮·維勒布蘭德因子蛋白質)或這樣的化合物異常。在發生例如與手術或大量創傷相關的廣泛組織損害的受試者中，正常的止血機制可能不能滿足即刻止血的需要，因此，儘管這些機制基本上(創傷前或手術前)正常，但他們仍然可能發生過度出血。通常進一步輸血的這類受試者會發生因出血和/或輸血導致的(暫時性)凝血病(即因出血和/或輸血導致的凝固蛋白稀釋、纖維蛋白溶解增加和血小板計數降低)。出血還可以在諸如腦部、內耳區和眼部這樣的器官中發生；它們是手術止血可能性很小，從而難於獲得令人滿意的止血效果的區域。類似的問題可能在從不同器官(肝、肺、腫瘤組織、胃腸道)中取活檢組織的過程中產生，也可能在腹腔鏡手術和恥骨後前列腺根除術(radical retropubic prostatectomy)的過程中產生。就所有這些情況而言，常見的是難以通過手術技術(縫合線、鉗等)止血，當出血是彌散性的(例如出血性胃炎和子宮大出血)時也是如此。出血還可以在進行抗凝療法的受試者中發生，其中已經因給予的療法而誘導了止血缺陷；這些出血通常是急性的和大量的。抗凝療法通常是為了預防血栓栓塞性疾病。這類療法可包括使用肝素、其它形式的蛋白聚糖、華法令或其它形式的維生素K-拮抗劑以及阿司匹林和其它血小板聚集抑制劑、諸如GP IIb/IIIa活性的抗體或其它抑制劑。出血還可以因所謂的溶栓療法而發生，該溶栓療法包括用抗血小板藥(例如乙醯水楊酸)、抗凝劑(例如肝素)和纖維蛋白溶解劑(例如組織纖溶酶原激活物tPA)進行聯合療法。出血發作還用以包括、但不限於與患有下列疾病的受試者中的手術或創傷相關的未受控制和過度的出血急性關節積血(關節內出血)、慢性血友病性關節病、血腫(例如肌肉、腹膜後、舌下和咽後)、其它組織中的出血、血尿(從腎道中出血)、腦部出血、手術(例如肝切除術)、拔牙和胃腸出血(例如UGI出血)。出血發作可能與下列情況相關抗因子VIII的抑制劑；A型血友病；抑制劑結合A型血友病；B型血友病；因子VII缺乏；PAI-1缺乏；血小板減少；馮·維勒布蘭德因子缺乏(馮維勒布蘭德病)；嚴重組織損害；重度創傷；手術；腹腔鏡手術；出血性胃炎；取活檢組織；抗凝療法；胃腸道上部出血(UGI)；或幹細胞移植。出血發作可以是子宮大出血、發生在機械止血可能性較小的器官中的出血、發生在腦部的出血、發生在內耳區域的出血或發生在眼內的出血。如果合適，術語″出血發作″和″出血″可以互換使用。
在本說明書的上下文中，術語″治療″用以包括預防預計的出血、諸如手術中的出血，和調節已經發生的出血、諸如創傷中的出血，目的在於抑制出血或將其減少到最低限度。上文提及的″預計的出血″可以是預計在特定組織或器官中發生的出血，或可以是未指明的出血。因此，預防性給予因子VII或因子VII有關多肽的製劑與PAI-1或PAI-1相關多肽的製劑包括在術語″治療″的範圍內。
本文所用的術語″受試者″用以指任何動物，特別是哺乳動物，諸如人，如果合適的話則可以與術語″患者″互換使用。本發明還包括因子VII或FVII相關多肽和tPA抑制劑在獸醫手術中的應用。
可以同時或依次給予如本說明書中所定義的因子VII或因子VII有關多肽和PAI-1或PAI-1相關多肽。可以將所述的因子作為單一劑型形式提供，其中所述的單一劑型含有這兩種凝血因子；或可以將所述的因子作為組成部分試劑盒(kit-of-parts)形式提供，所述的組成部分試劑盒中包括因子VII或因子VII有關多肽的製劑作為第一單位劑型，並包括PAI-1或PAI-1相關多肽的製劑作為第二單位劑型。本說明書的上下文中無論在何種情況下提及第一或第二或第三種等單位劑量時，這一劑量並不表示給藥的優選順序，而僅是為了便於說明。
所謂″同時″給予因子VII或因子VII有關多肽的製劑與PAI-1或PAI-1相關多肽的製劑指的是以單一劑型形式給予這些凝血因子蛋白，或先給予第一凝血因子，隨後以不超過15分鐘、優選不超過10分鐘、更優選不超過2分鐘的時間間隔給予第二凝血因子蛋白。可以首先給予兩種因子中任何一種。
所謂″依次″給藥指的是給予第一凝血因子蛋白，隨後給予第二凝血因子蛋白，其時間間隔為至多2小時，優選1-2小時，更優選至多1小時，更優選30分鐘-1小時，更優選至多30分鐘，更優選15-30分鐘。可以首先給予其中任何一種單位劑型或凝血因子蛋白。優選通過相同的靜脈內途徑注射這兩種產品。
所謂″PAI-1的水平″或″PAI-1水平″指的是與健康受試者的水平相比患者的PAI-1活性水平。將該水平表示為正常水平的百分比。如果合適，這些術語可以互換使用。
所謂″PAI-1水平降低″或″降低的PAI-1水平″指的是與不存在PAI-1缺乏或PAI-1抑制劑的受試者群體中的平均PAI-1水平相比，血流中PAI-1的存在水平或活性下降。可以通過促凝劑或免疫試驗測定循環PAI-1的水平。通過患者血漿校正PAI-1缺乏型血漿的凝固時間的能力來確定PAI-1活性(例如APTT試驗，參見下文；另外參見本說明書的″試驗部分″)。
已經將1個單位的PAI-1定義為1毫升正常(匯集的)人血漿中所含的PAI-1的量(相當於100％的PAI-1水平)。
已經將1個單位的因子VII定義為1毫升正常血漿中所含的因子VII的量，相當於約0.5μg蛋白質。活化後，50個單位相當於約1μg蛋白質。
所謂″缺乏″指的是與正常健康個體相比血漿中諸如PAI-1的存在水平或其活性下降。如果合適，該術語可以與″降低的PAI-1水平″互換使用。
所謂″APTT″或″aPTT″指的是部分組織凝血酶原激酶活化時間(例如由Proctor RR，Rapaport SI所述「使用高嶺土的部分組織凝血酶原激酶時間-用於第一階段血漿凝血因子缺乏的簡單篩選試驗」(The partial thromboplastin time with kaolin；a simple screeningtest for first-stage plasma clotting factor deficiencies.)-《美國臨床病理學雜誌》(Am J Clin Pathol)36212，1961)。
所謂″PAI-1反應性症候群″指的是對有此需要的受試者給予外源性PAI-1後可以預防、治癒或改善任何由該症候群導致的預計或已存在的任何症狀、情況或疾病的症候群。包括、但不限於因PAI-1水平降低所導致的症候群，例如由PAI-1的抑制劑導致的出血疾病。還可以用本發明的組合物治療PAI-1-反應性症候群。
所謂″因子VII-反應性症候群″指的是對有此需要的受試者給予外源性因子VII、優選因子VIIa後可以預防、治癒或改善任何由該症候群導致的預計或已存在的任何症狀、情況或疾病的症候群。包括、但不限於因凝血因子VIII、IX、XI或VII水平降低、凝血因子抑制劑、血小板功能缺陷(例如格蘭茲曼血小板機能不全和伯-索症候群)、血小板減少、馮維勒布蘭德病和諸如因凝固蛋白稀釋、纖維蛋白溶解增加和因出血和/或輸血造成血小板數量降低(例如在已經進行了手術或發生創傷的多次輸血的患者中)造成的凝血病所導致的症候群。
″半衰期″指的是因子VII或因子VII有關多肽或者PAI-1或PAI-1相關多肽的血漿濃度從特定值減少至該值一半所需的時間。
所謂″初步止血″指的是開始由FXa和TF因子VIIa產生凝血酶，隨後血小板活化並形成初部的鬆散並活化、粘著、但尚未被血纖蛋白穩定化的血小板塞，並最後由交聯的血纖蛋白穩定。如果未被止血第二步的過程中形成的血纖蛋白穩定化(維持止血)，那麼它易於被纖維蛋白溶解系統溶解。
所謂″次級止血″或″維持止血″指的是在活化的血小板表面上發生並由因子VIIIa和因子VIIIa催化的凝血酶次級、完全且大量的爆發或產生，隨後形成血纖蛋白，穩定初期血小板塞。血纖蛋白對該塞的穩定化可導致完全止血。
所謂″完全止血″指的是在損傷部位上形成穩定和堅固的血纖蛋白凝塊或塞，該凝塊或塞可使出血有效停止且不易於被纖維蛋白溶解系統溶解。在本說明書的上下文中，術語止血用於代表如上所述的完全止血。
可以通過一般公知的方法、例如通過測定光密度來測定製劑中蛋白質的總量。可以通過一般公知的方法、諸如標準Elisa免疫試驗測定PAI-1-或因子VII蛋白質(″抗原″)的量。一般來說，通過下列步驟來進行這類試驗使例如含有PAI-1蛋白的製劑溶液與固定在elisa平板上的抗-凝血調節蛋白抗體接觸，隨後使固定的抗體-PAI-1複合物與攜帶標記的二次抗PAI-1抗體接觸，在第三步中測定它們的量。可以按照類似方式、使用適宜的抗體測定各凝血因子的量。通過添加一定量的各凝血因子蛋白來測定製劑中所含的凝血因子蛋白總量。在一個實施方案中，所述製劑包括分離的凝血因子。在另一個實施方案中，所述製劑基本上不含凝血因子II和凝血因子IIa(凝血酶原和凝血酶)和/或因子X或Xa。
本文所用的術語″分離的″指的是已經自合成凝血因子(例如PAI-1或PAI-1相關多肽的細胞中或天然存在它們的培養基(例如血漿或血液)中分離出來了的凝血因子，如PAI-1或PAI-1相關多肽。可以通過本領域中任意公知的方法從來源細胞中分離多肽，包括、但不限於從粘著細胞培養物中取出含有所需產物的細胞培養基、離心或過濾除去未粘著的細胞等。可以通過本領域中任意公知的方法從天然存在它們的培養基中分離所述多肽，包括、但不限於親和色譜法，諸如分別在抗因子VII或抗PAI-1抗體柱上進行的親和色譜法；疏水相互作用色譜法；離子交換色譜法；大小排阻色譜法；電泳法(例如製備型等電聚焦(IEF))；差示溶解度(例如硫酸銨沉澱)；或提取法等。
在本發明中，因子VII或因子VII有關多肽以及PAI-1或PAI-1相關多肽的″有效量″定義為一起足以預防或減少出血或失血以治癒、緩解疾病及其併發症或使其部分抑制的因子VII或因子VII有關多肽(例如FVIIa)和PAI-1或PAI-1相關多肽的用量。
術語″因子VIIa的活性″或″因子VIIa活性″包括產生凝血酶的能力；該術語還包括在沒有組織因子存在的情況下在活化的血小板表面上產生凝血酶的能力。
縮寫TF組織因子FVII 單鏈、未活化形式的因子VIIFVIIa 活化形式的因子VIIrFVIIa活化形式的重組因子VIITAFI 酶原、未活化形式的TAFIPAI-1 纖溶酶原激活物抑制劑化合物的製備優選通過例如Hagen等在《美國國家科學院學報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)832412-2416，1986或如歐洲專利EP 200.421(ZymoGenetics，Inc.)中所述的DNA重組技術製備適用於本發明的純化人因子VIIa。
還可以通過Broze和Majerus在《生物化學雜誌》(J.Biol.Chem.)255(4)1242-1247，1980以及Hedner和Kisiel在《臨床研究雜誌》(J.Clin.lnvest.)，711836-1841，1983中所述的方法生產因子VII。這些方法得到了因子VII，而沒有可檢測量的其它凝血因子。通過包括附加凝膠過濾作為最終的純化步驟甚至可以得到進一步純化的因子VII製品。然後通過已知方式，例如使用幾種不同的血漿蛋白、諸如PAI-1Ia、IXa或Xa將因子VII轉化成活化因子VIIa。另一方面，如Bjoern等(研究公開(Research Disclosure)，269，1986年9月，pp.564-565)所述，通過使因子VII通過離子交換色譜柱、諸如MonoQ(Pharmacia fine Chemicals)等使其活化。
可以通過修飾野生型因子VII或通過重組技術生產因子VII有關多肽。可以通過修飾編碼野生型因子VII的核酸序列來生產與野生型因子VII相比具有改變的胺基酸序列的因子VII有關多肽，其中所述的修飾步驟既可以通過改變胺基酸密碼子來進行，也可以通過經已知方式、例如通過定點誘變除去編碼天然因子VII的核酸上的某些胺基酸密碼子來進行。
本領域技術人員顯然可以在對因子VIIa或PAI-1-分子功能而言比較關鍵的區域的外部進行取代而仍然可以得到活性多肽。可以按照本領域中公知的方法、諸如定點誘變或丙氨酸掃描誘變鑑定對因子VII或因子VII有關多肽或者PAI-1或PAI-1相關多肽的活性所必需、因此優選不被取代的胺基酸殘基(例如，參見Cunningham和Wells，1989，《科學》(Science)2441081-1085)。在後一種技術中，在分子中每一個帶正電荷的殘基處引入突變，對所得突變體分子測試相應促凝劑的交聯活性，以鑑定對該分子的活性而言關鍵的胺基酸殘基。還可以通過分析諸如由核磁共振分析、結晶學或光親和標記這類技術測定的三維結構來確定底物-酶相互作用位點(例如，參見de Vos等，1992，《科學》(Science)255306-312；Smith等，1992，《分子生物學雜誌》(Journal of Molecular Biology)224899-904；Wlodaver等，1992，《FEBS通訊》(FEBS Letters)30959-64)。
可以通過定點誘變、使用本領域中公知的任意方法將突變導入核酸序列來更換核苷酸。特別有用的是使用超螺旋雙鏈DNA載體與感興趣插入物和兩個含有所需突變的合成引物的方法。各自與所述載體的相反鏈互補的寡核苷酸引物通過Pfu DNA聚合酶在溫度循環過程中延伸。在摻入引物時，生成含有交錯切口的突變質粒。在溫度循環後，用對甲基化和半甲基化DNA具有特異性的Dpnl處理產物以便消化親代DNA模板並選擇含有突變的合成DNA。還可以使用本領域中已知用於產生、鑑定和分離變體的其它方法，諸如例如基因改組法或噬菌體展示技術。
可以通過本領域中任意公知的方法從來源細胞中分離多肽，包括、但不限於從粘著細胞培養物中取出含有所需產物的細胞培養基；離心或過濾以除去未粘著的細胞等。
任選地，可以進一步純化因子VII或因子VII有關多肽。可以使用本領域中任意公知的方法進行純化，包括、但不限於親和色譜法，諸如在抗-因子VII抗體柱上進行的親和色譜法(例如，參見Wakabayashi等《生物化學雜誌》(J.Biol.Chem.)26111097，1986；和Thim等《生物化學》(Biochem.)277785，1988)；疏水相互作用色譜法；離子交換色譜法；大小排阻色譜法；電泳法(例如製備型等電聚焦(IEF))；差示溶解度(例如硫酸銨沉澱)；或提取法等。一般參見Scopes，《蛋白質純化》(Protein Puri-fication)，Springer-Verlag，NewYork，1982；和《蛋白質純化》(Protein Purification)，J.C.Janson和Lars Ryden編輯，VCH Publishers，New York，1989。純化後，該製品中優選含有低於約10％重量、更優選低於約5％重量、最優選低於約1％重量的來源於宿主細胞的非因子VII或因子VII有關多肽。
可以通過蛋白水解切割，使用PAI-1Ia或其它具有胰蛋白酶樣特異性的蛋白酶(諸如因子IXa、激肽釋放酶、因子Xa和凝血酶)使因子VII或因子VII有關多肽活化。例如，參見Osterud等《生物化學》(Biochem.)112853(1972)；Thomas，美國專利US4,456,591；和Hedner等《臨床研究雜誌》(J.Clin.Invest.)711836(1983)。或者，可以通過使因子VII或因子VII有關多肽通過離子交換色譜柱，諸如MonoQ(Pharmacia)等而使其活化。然後如下所述配製並給予所得的活化因子VII或因子VII有關多肽。
例如，可以按照已知方法從血小板或內皮細胞中分離用於本發明的PAI-1；不過，優選使用重組PAI-1以避免使用有疾病傳播危險的血液或組織衍生產物。分離PAI-1和製備重組PAI-1的方法在本領域中是公知的；例如，參見Pannekoek等《歐洲分子生物學協會雜誌》(JOURNAL EMBO J.)5(10)，2539-2544(1986)；Gils等《生物化學與生物物理學學報》(Biochim Bio-phys Acta.)1998Sep 8；1387(1-2)291-7；Sui等《生物化學雜誌》(Biochem J.)1998 Apr 15；331(Pt2)409-15；Gins-burg等《臨床研究雜誌》(J.Clin.Invest.)，第78卷，pp.1673-1680(1986)；或美國專利US 6,303,338和US6,103,498。可以通過如上所述的定點誘變生產PAI-1變體。
可以通過修飾野生型PAI-1或通過重組技術生產PAI-1相關多肽。可以通過修飾編碼野生型PAI-1的核酸序列來生產與野生型PAI-1相比具有改變的胺基酸序列的PAI-1相關多肽，其中所述的修飾的步驟既可以通過改變胺基酸密碼子來進行，也可以通過已知方式、例如上文詳述的定點誘變除去編碼天然PAI-1的核酸上的某些胺基酸密碼子來進行。可以通過本領域中任意公知的方法從來源細胞中分離多肽，包括、但不限於從粘著細胞培養物中取出含有所需產物的細胞培養基；離心或過濾以除去未粘著的細胞等。任選地，可以進一步純化PAI-1或PAI-1相關多肽。可以使用本領域中任意公知的方法進行純化，包括、但不限於上文中詳述的親和色譜法，諸如在抗-PAI-1抗體柱上進行的親和色譜法；疏水相互作用色譜法；離子交換色譜法；大小排阻色譜法；電泳法(例如製備型等電點聚焦(IEF))；差示溶解度(例如硫酸銨沉澱)；或提取法等。純化後，該製品中優選含有低於約10％重量、更優選低於約5％重量、最優選低於約1％重量的來源於宿主細胞的非-PAI-1或PAI-1相關多肽。然後可以如下所述配製並給予所得的活化PAI-1或PAI-1相關多肽。
正如本領域技術人員可以理解的，優選使用與受試者同源的PAI-1多肽和因子VII多肽，以便減少誘導免疫反應的危險。本發明還包括這類PAI-1多肽和因子VII多肽在獸醫中的應用。
藥物組合物和使用方法本發明的製劑可以用於治療任何因子VII反應性症候群，諸如，例如出血疾病，包括、但不限於因凝血因子VIII、IX、XI或VII水平降低、凝血因子抑制劑、血小板功能缺陷(例如格蘭茲曼血小板機能不全和伯-索症候群)導致的症候群；血小板減少；馮維勒布蘭德病；和諸如因凝固蛋白稀釋、纖維蛋白溶解增加和因出血和/或輸血造成血小板數量降低(例如在已經進行了手術或發生創傷的多次輸血的患者中)所導致的凝血病。包括本發明因子VII或因子VII有關多肽的製劑和PAI-1或PAI-1相關多肽的製劑的藥物組合物主要用於預防和/或治療用非腸道給藥。優選經非腸道給予該藥物組合物，即通過靜脈內、皮下、或肌內給藥，最優選靜脈內給藥。還可以通過連續或搏動輸注給藥。
本發明的藥物組合物或製劑包括因子VII或因子VII有關多肽和PAI-1或PAI-1相關多肽，可以將它們配製成單一單位劑型或組成部分試劑盒形式，優選溶於藥物上可接受的載體、優選含水載體或稀釋劑中。簡單的說，通過將因子VII或因子VII有關多肽、或者PAI-1、或者因子VII或因子VII有關多肽和PAI-1的組合(優選純化形式)與合適的佐劑和合適的載體或稀釋劑混合來製備適用於本發明的藥物組合物。可以使用各種含水載體，諸如水、緩衝水、0.4％鹽水、0.3％甘氨酸等。還可以使用非水載體配製本發明的製劑，例如配製成凝膠或脂質體形式來轉運或靶向至損傷部位。脂質體製劑一般描述在例如美國專利US 4,837,028、US4,501,728和US4,975,282中。可以通過常規的眾所周知的滅菌技術該這些組合物滅菌。可將所得水溶液包裝應用，或在無菌條件下過濾並凍幹，在給藥前將凍幹製劑與無菌水溶液混合。
這些組合物可以含有藥物上可接受的輔助物質或佐劑，包括、但不限於pH調節劑和緩衝劑和/或張力調節劑，諸如例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣等。
製劑可以進一步包括一種或多種稀釋劑、乳化劑、防腐劑、緩衝劑、賦形劑等，且可以將它們製成諸如液體、粉末、乳劑、控釋等劑型。本領域技術人員可以適宜方式並按照接受的實踐配製本發明的組合物，諸如公開在《Remington氏藥物科學》(Remington′sPharmaceutical Sciences)Gennaro編輯，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990中的那些方式。因此，可以將靜脈內輸注用的典型藥物組合物製成含有250ml無菌林格液和10mg製劑的形式。
可以給予含有本發明製劑的組合物用於預防和/或治療性療法。在治療應用中，對已經患有如上所述疾病的受試者給予組合物，其用量足以治癒、緩解或部分抑制疾病及其併發症的臨床表現。將足以達到該目的的用量定義為″治療有效量″。用於每一目的的有效量取決於疾病或損傷的嚴重程度以及受試者的體重和一般狀況。應理解可以使用常規實驗、通過構建數值矩陣並測試該矩陣中的不同點來確定適宜劑量。
例如，可以通過噴霧、灌注、雙氣囊導管、斯滕特固定模、摻入血管移植物或斯滕特固定模、用於塗敷氣囊導管的水凝膠或其它充分建立的方法來局部投遞本發明的製劑，諸如局部施用。在任何情況下，所述的藥物組合物均應提供足以有效治療所述疾病的製劑用量。
因子VII或因子VII有關多肽、PAI-1或PAI-1相關多肽、或者因子VII或因子VII有關多肽與PAI-1或PAI-1相關多肽的組合在這些製劑中的濃度可以廣泛改變，即從低於約0.5％重量、通常為或至少約為1％重量至多達15或20％重量，主要根據流體體積、粘度等、並按照所選擇的特定給藥方式來選擇。優選通過注射或輸注方式給藥，特別是注射。因此，將因子VII或因子VII有關多肽和PAI-1或PAI-1相關多肽製成適合於靜脈內給藥的形式，諸如這樣一種製劑，即在一種劑型中既含有因子VII或因子VII有關多肽又含有PAI-1或PAI-1相關多肽的溶解的凍乾粉製劑或液體製劑，或者在一種劑型中含有因子VII或因子VII有關多肽的溶解的凍乾粉或液體製劑、而在另一種劑型中含有PAI-1或PAI-1相關多肽的溶解的凍乾粉或液體製劑。
應理解因子VII或因子VII有關多肽的量和PAI-1或PAI-1相關多肽的量共同構成治療出血發作的總計有效量。
必須注意本發明的物質一般可以用於嚴重的疾病或損傷狀態，即威脅生命或對生命有潛在威脅的情況。在這類情況中，由於已將異物減小到最低限度和在人體內總體缺乏對因子VIIa和PAI-1的免疫原性，能夠由參與治療的臨床醫師給予實質上過量的這些組合物，並且有可能這樣做比較理想。
在預防應用中，對易感或是處於疾病情況或損傷危險中的受試者給予含有因子VII或因子VII有關多肽的製劑和PAI-1或PAI-1相關多肽的製劑的組合物以增強受試者自身的凝血能力。將這類用量定義為″預防有效劑量″。應理解因子VII或因子VII有關多肽的量和PAI-1或PAI-1相關多肽的量共同構成預防出血發作的總計有效量。
可以使用由參與治療的臨床醫師選擇的劑量水平和方案對所述組合物進行單一或多次給藥。可以每天或每周將所述組合物給予一次或多次。這類藥物組合物的有效量為對出血發作提供臨床顯著作用的用量。這類用量部分取決於所治療的特定疾病、受試者的年齡、體重和一般健康情況以及對本領域技術人員顯而易見的其它因素。
一般在預計出血前或開始出血時給予單劑量的本發明組合物。然而，也可以反覆(分多次劑量)、優選以2-4-6-12小時的間隔給予本發明的組合物，這取決於給予的劑量和受試者的狀況。
為了用於與計劃幹預相關的治療，一般在進行幹預前的約24小時內給予因子VII或因子VII有關多肽和PAI-1或PAI-1相關多肽，且此後持續7天或7天以上。可以如本文所述通過各種途徑將其作為促凝劑給藥。
組合物可以是包括適宜濃度的因子VII或因子VII有關多肽的製劑和PAI-1或PAI-1相關多肽的製劑二者的單一製劑形式(單一劑型)。該組合物還可以是組成部分試劑盒形式，其中包括因子VII或因子VII有關多肽製品的製劑的第一單位劑型和包括PAI-1或PAI-1相關多肽製品的製劑的第二單位劑型。在這種情況中，應依次、優選彼此間隔不到約15分鐘內、例如10分鐘內或優選在5分鐘內或更優選彼此在2分鐘內給予因子VII或因子VII有關多肽和PAI-1或PAI-1相關多肽。可以首先給予兩種單位劑型中的任一種。
所述的試劑盒至少包括兩種獨立的藥物組合物。該試劑盒包括用於包含各獨立組合物的容器用具，諸如分開的小瓶或分開的小箔包。該試劑盒一般包括用於給予獨立成分的說明書。當優選以不同劑型給予各獨立成分、以不同劑量間隔給予獨立成分時或當開據處方的臨床醫師需要確定組合中的各成分時，試劑盒劑型是特別有利的。
按照本發明給予的因子VII或因子VII有關多肽的量和PAI-1或PAI-1相關多肽的量可以在約1∶100-約100∶1(w/w)的比例之間改變。因此因子VII與PAI-1之比可以為例如約1∶100或1∶90或1∶80或1∶70或1∶60或1∶50或1∶40或1∶30或1∶20或1∶10或1∶5或1∶2或1∶1或2∶1或5∶1或10∶1或20∶1或30.1或40∶1或50∶1或60∶1或70∶1或80∶1或90∶1或100∶1或約1∶90-約1∶1或約1∶80-約1∶2或約1∶70-約1∶5或約1∶60-約1∶10或約1∶50-約1∶25或約1∶40-約1∶30或約90∶1-約1∶1或約80∶1-約2∶1或約70∶1-約5∶1或約60∶1-約10∶1或約50∶1-約25∶1或約40∶1-約30∶1。
就70-kg受試者而言，作為負荷和維持劑量因子VII或因子VII有關多肽的劑量相當於約0.05mg-約500mg/天野生型因子VII的範圍，例如約1mg-約200mg/天或例如約5mg-約175mg/天，這取決於受試者的體重、疾病和疾病的嚴重程度。
就70-kg受試者而言，作為負荷和維持劑量PAI-1或PAI-1相關多肽的劑量相當於約0.05mg-約500mg/天野生型PAI-1的範圍，例如約1mg-約200mg/天或例如約1mg-約175mg/天，這取決於受試者的體重、疾病和疾病的嚴重程度。
因子VII或因子VII有關多肽與PAI-1或PAI-1相關多肽的組合在體外凝塊硬度和纖維蛋白溶解時間試驗中表現出協同作用。此外，因子VII或因子VII有關多肽與PAI-1或PAI-1相關多肽的組合在形成穩定的血纖蛋白凝塊、增加半數凝塊溶解時間、增加凝塊強度和增加耐纖維蛋白溶解能力的方面均表現出協同作用。
組合物可以是包括適宜濃度的因子VII或因子VII有關多肽和PAI-1或PAI-1相關多肽的單一製劑形式。該組合物還可以是由包括因子VII或因子VII有關多肽的第一單位劑型和包括PAI-1或PAI-1相關多肽的第二單位劑型組成的試劑盒形式。在這種情況中，應依次、優選彼此間隔約1-2小時內、例如彼此間隔30分鐘內或優選在10分鐘內或更優選彼此間隔5分鐘內給予因子VII或因子VII有關多肽和PAI-1或PAI-1相關多肽。可以首先給予兩種單位劑型中的任一種。
由於本發明涉及出血發作的預防或治療方法，或者聯合給予多種活性組分(可以單獨給予)的凝血療法，所以本發明還涉及以試劑盒形式組合各獨立的藥物組合物。該試劑盒至少包括兩種獨立的藥物組合物。該試劑盒包括用於包含獨立組合物的容器用具，諸如分開的小瓶或分開的小箔包。該試劑盒一般包括用於給予各獨立成分的說明書。當優選以不同劑型給予各獨立成分、以不同劑量間隔給予各獨立成分時或當開據處方的臨床醫師需要滴定組合中的各成分時，試劑盒劑型是特別有利的。
試驗因子VIIa活性試驗可以進行測試因子VIIa活性、由此選擇適宜因子VIIa變體的合適試驗作為簡單的體外前期試驗體外水解試驗可以測試天然(野生型)因子VIIa和因子VIIa變體(下文統稱為″因子VIIa″)的比活性。還可以平行測試它們以便直接比較其比活性。該試驗在微量滴定板(MaxiSorp，Nunc，Denmark)上進行。將終濃度為1mM的顯色底物D-Ile-Pro-Arg-P-nitroanilide(S-2288，Chromogenix，Sweden)加入到溶於含有0.1M NaCl、5mMCaCl2和1mg/ml牛血清清蛋白的50mM Hepes(pH 7.4)的因子VIIa(終濃度100nM)中。在SpectraMaxTM340平板讀數器(Molecular Devices，USA)上連續測定405nm處的吸光度。將在20分鐘保溫過程中顯示的吸光度減去不含酶的空白孔中的吸光度後得到的值用於計算變體與野生型因子VIIa的活性之比比值＝(因子VIIa變體的A405nm)/(因子VIIa野生型的A405nm)。
基於上述結果，可以鑑定具有與天然因子VIIa相當或更高的活性的因子VIIa變體，諸如例如所述變體活性與天然因子VII(野生型FVII)活性之比約為1.0上下的變體。
還可以使用濃度適宜在100-1000nM的諸如因子X這樣的生理底物測定因子VIIa或因子VIIa變體的活性，其中在添加適當的顯色底物(例如S-2765)後測定產生的因子Xa。此外，可以在生理溫度下進行活性試驗。
體外蛋白水解試驗可以平行測試天然(野生型)因子VIIa和因子VIIa變體(下文統稱為″因子VIIa″)以便直接比較其比活性。該試驗在微量滴定板(MaxiSorp，Nunc，Denmark)上進行。將因子VIIa(10nM)和因子X(0.8μM)在含有0.1M NaCl、5mMCaCl2和1mg/ml牛血清清蛋白的100μl 50mM Hepes(pH 7.4)中保溫15分鐘。然後通過添加含有0.1M NaCl、20mM EDTA和1mg/ml牛血清清蛋白的50μl 50mM Hepes(pH7.4)終止因子X裂解。通過添加終濃度為0.5mM的顯色底物Z-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide(S-2765，Chromogenix，Sweden)測定產生的因子Xa的量。在SpectraMaxTM340平板讀數器(Molecular De-vices，USA)上連續測定405nm處的吸光度。將在10分鐘保溫過程中顯示的吸光度減去不含FVIIa的空白孔中的吸光度後的值用於計算變體與野生型因子VIIa之間的蛋白水解活性之比比值＝(因子VIIa變體的A405nm)/(因子VIIa野生型的A405nm)。
基於上述結果，可以鑑定出具有與天然因子VIIa相當或更高的活性的因子VIIa變體，諸如例如所述變體活性與天然因子VII(野生型FVII)活性之比約為1.0上下的變體。
凝血酶產生試驗可以用包括所有相關凝血因子和生理濃度下的抑制劑和活化血小板的試驗測定因子VII或因子VII有關多肽或者PAI-1或PAI-1相關多肽(例如變體)產生凝血酶的能力(如Monroe等在(1997)《英國血液學雜誌》(Brit.J.Haematol.)99，542-547中第543頁上所述，將該文獻引入本文作為參考)。
PAI-1活性試驗例如，可以用如Chandler等《臨床化學》(Clinical Chemistry)，35(5)787-793(1989)所述的體外試驗作為簡單試驗或本領域中公知的其它試驗(所述的″PAI-1試驗″)進行測試PAI-1活性、由此提供合適本發明所用的PAI-1變體的篩選方式的合適試驗。
通過下列實施例進一步解釋本發明，不過，這些實施例並不用來限定保護範圍。上述描述和下面的實施例中所公開的特徵既可以單獨也可以以其任意組合方式成為以不同形式實現本發明的材料。
實施例實施例1通過聯用凝血因子VIIa和PAI-1來改善止血凝塊的穩定性方法凝塊溶解試驗將用含有Innovin(Dade Behring，稀釋2000-倍)、rFVIIa(Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark；不同濃度)和t-PA(American Diagnostics，8nM)的緩衝液(20mM HEPES，150mM NaCl，5mMCaCl，pH7.4)稀釋10-倍的正常人血漿加入到96-孔ELISA平板上，並在室溫下在一段時間內測定650nm處的濁度。在指明處，則包括純化人PAI-1(American Diagnostica，不同濃度)。
旋轉血栓彈性描記法(roTEG)用加入了5nM t-PA的檸檬酸鹽化正常人血漿或因子VIII缺乏血漿(George King Bio-Medical，Inc.#0800)進行各項測定，並分析單獨添加1nM FVIIa或者加入1nMFVIIa與30nM PAI-1組合的效果。通過在20mM HEPES、150mMNaCl、pH 7.4緩衝液中添加Innovin(稀釋2000-倍的終濃度，DadeBehring#526945)和鈣(終濃度15mM)啟動凝血。
結果
凝塊溶解試驗添加FVII-a導致凝塊溶解時間以劑量依賴性方式延長(附圖1)。這種作用在10nM FVIIa下最佳。在有10nM FVIIa存在的情況下，添加PAI-1導致凝塊溶解時間進一步延長(附圖2)。這種效果是劑量依賴性的，且在10nM PAI-1下達到最佳。
血栓彈性圖將roTEG測定值用於分析FVIIa與PAI-1的組合對最大凝塊硬度(MCF)以及凝塊對t-PA介導的溶解的耐受性所產生的效果。用正常和缺乏FVIII的人血漿進行測定。在添加FVIIa/PAI-1前，在正常和血友病血漿中的MCF分別為25mm和4mm，而半數凝塊溶解時間分別為12.3分鐘和14.3(附圖3和4)。在正常人血漿中，添加PAI-1(30nM)不會改變MCF，但會將半數凝塊溶解時間延長至16.1分鐘(附圖3)。在血友病血漿中，單獨添加PAI-1時將MCF增加至5mm並將半數凝塊溶解時間延長至32.4分鐘(附圖4)。添加FVIIa(1nM)防止了凝塊發生t-PA-介導的溶解(半數凝塊溶解時間16.7min)，而對正常血漿中的MCF沒有任何顯著影響(附圖3)，而向血友病血漿中添加FVIIa防止了凝塊發生溶解(半數凝塊溶解時間21.3min)且MCF值顯著增加(15mm)(附圖4)。然而，在正常和血友病血漿中一起添加FVIIa與PAI-1二者分別使半數凝塊溶解時間增加至29.8分鐘和45分鐘，並使MCF值分別增加至27.4mm和16.9mm。
結論這些結果表明，向血漿中添加FVIIa和PAI-1可以協同方式改善凝塊的機械強度和對纖維蛋白溶解的耐受性。
權利要求
1.一種藥物組合物，其中包括因子VII或因子VII有關多肽和PAI-1或PAI-1相關多肽。
2.權利要求1的組合物，其中所述的因子VII或因子VII有關多肽是因子VII有關多肽。
3.權利要求1的組合物，其中所述的因子VII有關多肽是因子VII胺基酸序列變體。
4.權利要求2或3的組合物，其中當用如本說明書中所述的″體外水解試驗″測定時，所述的因子VII有關多肽的活性與天然人因子VIIa(野生型FVIIa)的活性之比至少約為1.25。
5.權利要求1的組合物，其中所述的因子VII或因子VII有關多肽是因子VII。
6.權利要求5的組合物，其中所述的因子VII是人因子VII。
7.權利要求6的組合物，其中所述的因子VII是重組人因子VII。
8.權利要求1-7中任意一項的組合物，其中所述的因子VII或因子VII有關多肽是其活化形式。
9.權利要求8的組合物，其中所述的因子VII是重組人因子VIIa。
10.權利要求1-9中任意一項的組合物，其中所述的PAI-1或PAI-1相關多肽是PAI-1相關多肽。
11.權利要求10的組合物，其中所述的PAI-1相關多肽是PAI-1胺基酸序列變體。
12.權利要求10或11的組合物，其中當用如本說明書中所述的″PAI-1試驗″測定時，所述的PAI-1相關多肽的活性與天然人PAI-1(野生型PAI-1)的活性之比至少約為1.25。
13.權利要求1-9中任意一項的組合物，其中所述的PAI-1或PAI-1相關多肽是PAI-1多肽。
14.權利要求13的組合物，其中所述的PAI-1是人PAI-1。
15.權利要求14的組合物，其中所述的PAI-1是重組人PAI-1。
16.權利要求15的組合物，其中所述的PAI-1是活化構象形式。
17.權利要求1-16中任意一項的組合物，其中所述的因子VII或因子VII有關多肽和PAI-1或PAI-1相關多肽存在的比例按重量計為約100∶1-約1∶100(w/w因子VIIPAI-1)。
18.權利要求1-17中任意一項的組合物，其中該組合物中進一步包括適合於注射或輸注、特別是注射的藥物上可接受的賦形劑。
19.含有用於治療出血發作的組成部分的試劑盒，包括f)第一單位劑型形式的有效量的因子VII或因子VII有關多肽和藥物上可接受載體的製劑；g)第二單位劑型形式的有效量的PAI-1或PAI-1相關多肽和藥物上可接受載體的製劑；和h)用於包含所述第一和第二劑型的容器用具。
20.權利要求19的試劑盒，其中所述的因子VII或因子VII有關多肽是因子VII有關多肽。
21.權利要求20的試劑盒，其中所述的因子VII有關多肽是因子VII胺基酸序列變體。
22.權利要求20或21的試劑盒，其中當用如本說明書中所述的″體外水解試驗″測定時，所述的因子VII有關多肽的活性與天然人因子VIIa(野生型FVIIa)的活性之比至少約為1.25。
23.權利要求19的試劑盒，其中所述的因子VII或因子VII有關多肽是因子VII。
24.權利要求23的試劑盒，其中所述的因子VII是人因子VII。
25.權利要求24的試劑盒，其中所述的因子VII多肽是重組人因子VII。
26.權利要求19-25中任意一項的試劑盒，其中所述的因子VII或因子VII有關多肽是其活化形式。
27.權利要求26的試劑盒，其中所述的因子VII是重組人因子VIIa。
28.權利要求19-27中任意一項的試劑盒，其中所述的PAI-1或PAI-1相關多肽是PAI-1相關多肽。
29.權利要求28的試劑盒，其中所述的PAI-1相關多肽是PAI-1胺基酸序列變體。
30.權利要求28或29的試劑盒，其中當用如本說明書中所述的″PAI-1試驗″測定時，所述的PAI-1相關多肽的活性與天然人PAI-1(野生型PAI-1)的活性之比至少約為1.25。
31.權利要求19-27中任意一項的試劑盒，其中所述的PAI-1或PAI-1相關多肽是PAI-1。
32.權利要求31的試劑盒，其中所述的PAI-1是人PAI-1。
33.權利要求32的試劑盒，其中所述的PAI-1是重組人PAI-1。
34.權利要求33的試劑盒，其中所述的PAI-1是活化構象形式。
35.權利要求19-34中任意一項的試劑盒，其中所述的因子VII或因子VII有關多肽和PAI-1或PAI-1相關多肽存在的比例按重量計為約100∶1-約1∶100(w/w因子VIIPAI-1)。
36.因子VII或因子VII有關多肽和PAI-1或PAI-1相關多肽的組合在製備用於治療出血發作的藥物中的應用。
37.權利要求1-18中任意一項的組合物在製備用於治療出血發作的藥物中的應用。
38.權利要求36或37的應用，其中所述的藥物用於減少凝固時間。
39.權利要求36或37的應用，其中所述的藥物用於延長凝塊溶解時間。
40.權利要求36或37的應用，其中所述的藥物用於增加凝塊強度。
41.權利要求36-40中任意一項的應用，其中將所述的藥物配製成注射或輸注、特別是注射用藥劑。
42.權利要求36-41中任意一項的應用，其中所述的出血發作是因創傷或手術或者血小板計數或活性下降所導致的。
43.權利要求36-42中任意一項的應用，其中所述的藥物是單一劑型。
44.權利要求36-42中任意一項的應用，其中將所述的藥物製備成含有因子VII或因子VII有關多肽的製劑的第一單位劑型和含有PAI-1或PAI-1相關多肽的製劑的第二單位劑型的形式。
45.受試者內出血發作的治療方法，該方法包括根據受試者需要對其給予第一用量的因子VII或因子VII有關多肽的製劑和第二用量的PAI-1或PAI-1相關多肽的製劑，其中所述的第一用量和第二用量一起可有效地治療出血。
46.減少受試者內凝固時間的方法，該方法包括根據受試者需要對其給予第一用量的因子VII或因子VII有關多肽的製劑和第二用量的PAI-1或PAI-1相關多肽的製劑，其中所述的第一用量和第二用量一起可有效地減少凝固時間。
47.增強受試者內止血的方法，該方法包括根據受試者需要對其給予第一用量的因子VII或因子VII有關多肽的製劑和第二用量的PAI-1或PAI-1相關多肽的製劑，其中所述的第一用量和第二用量一起可有效增強止血。
48.延長受試者內凝塊溶解時間的方法，該方法包括根據受試者需要對其給予第一用量的因子VII或因子VII有關多肽的製劑和第二用量的PAI-1或PAI-1相關多肽的製劑，其中所述的第一用量和第二用量一起可有效延長凝塊溶解時間。
49.增加受試者內凝塊強度的方法，該方法包括根據受試者需要對其給予第一用量的因子VII或因子VII有關多肽的製劑和第二用量的PAI-1或PAI-1相關多肽的製劑，其中所述的第一用量和第二用量一起可有效增加凝塊強度。
50.權利要求45-49中任意一項的方法，其中以單一劑型形式給予因子VII或因子VII有關多肽和PAI-1或PAI-1相關多肽。
51.權利要求45-49中任意一項的方法，其中以含有因子VII或因子VII有關多肽的製劑的第一劑型和含有PAI-1或PAI-1相關多肽的製劑的第二劑型的形式給予所述的因子VII或因子VII有關多肽和PAI-1或PAI-1相關多肽。
52.權利要求51的方法，其中給予第一劑型與給予第二劑型之間的時間間隔不超過15分鐘。
53.含有用於出血發作的治療用品的試劑盒，包括a)單一單位劑型的有效量的因子VII或因子VII有關多肽和有效量的PAI-1或PAI-1相關多肽以及藥物上可接受載體；和b)用於包含所述單一單位劑型的容器用具。
全文摘要
本發明涉及包括因子VII或因子VII有關多肽和PAI－1或PAI－1相關多肽的組合物及其在治療出血發作中的應用。
文檔編號A61P17/02GK1596122SQ02823677
公開日2005年3月16日 申請日期2002年11月5日 優先權日2001年11月9日
發明者R·羅伊克耶爾 申請人:諾和諾德醫療保健公司