一種使用Sepharose4FF凝膠對細菌多糖進行純化的方法

2023-09-21 11:48:55 4

專利名稱：一種使用Sepharose 4FF凝膠對細菌多糖進行純化的方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，更具體地，涉及細菌多糖的純化方法。
背景技術：
細菌莢膜多糖是細菌重要的保護性抗原，接種這些多糖，可以使2歲以上的群體獲得免疫保護。
在細菌發酵培養過程中，除了產生莢膜多糖之外，還產生大量的蛋白質、核酸、內毒素等成分，疫苗中這些成分的含量超過一定標準時，接種後可能導致較嚴重的副反應。世界衛生組織(WHO)發布的細菌多糖疫苗規程以及《中國藥典》多糖疫苗的標準均對莢膜多糖中的蛋白質含量、核酸含量和內毒素含量有嚴格的要求。
細菌多糖的傳統純化工藝為採用冷酚萃取去除蛋白，然後用超濾或透析去除酚，用分級乙醇沉澱法去除核酸，並使用超速離心去除內毒素。這一工藝步驟繁多，每一個工藝過程均涉及眾多工藝參數，故工藝波動性較大，給製品質量控制帶來不利的因素，同時苯酚的大量使用給企業環保帶來了巨大壓力。
Sepharose 4FF凝膠在病毒、核酸純化中得到應用，但是使用Sepharose 4FF凝膠對細菌多糖進行純化目前尚無文獻報導。

發明內容
本發明克服了現有技術的缺陷，提供了一種獲得高純度細菌多糖的條件溫和、操作簡便、易於控制、無環保問題的純化工藝。
本發明的技術方案及步驟(1)採用生物反應器對細菌進行發酵培養；(2)於對數生長後期殺菌，離心收集上清液；(3)製備粗製多糖；
(4)對粗製多糖進行預處理，用截留分子量10～100kD的超濾膜超濾濃縮至多糖濃度為2～50mg/ml；(5)以2～15％柱體積上樣於Sepharose 4FF凝膠柱，以含0.02～1.0mol/L氯化鈉或氯化鈣的洗脫液洗脫，收集Kd0.5之前的組分；(6)洗脫液加入乙醇至終濃度50-90％沉澱多糖，離心收集多糖沉澱；(7)沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；(8)經冷凍乾燥，獲得高純度的精製多糖。
其中的細菌可以為以下任一種b型流感嗜血桿菌、A群腦膜炎球菌、C群腦膜炎球菌、W135群腦膜炎球菌、Y群腦膜炎球菌、傷寒沙門氏菌、A群鏈球菌、B群鏈球菌、肺炎鏈球菌1型、肺炎鏈球菌2型、肺炎鏈球菌3型、肺炎鏈球菌4型、肺炎鏈球菌5型、肺炎鏈球菌6B型、肺炎鏈球菌7F型、肺炎鏈球菌8型、肺炎鏈球菌9N型、肺炎鏈球菌9V型、肺炎鏈球菌10A型、肺炎鏈球菌11A型、肺炎鏈球菌12F型、肺炎鏈球菌14型、肺炎鏈球茵15B型、肺炎鏈球菌17F型、肺炎鏈球菌18C型、肺炎鏈球菌19A型、肺炎鏈球菌19F型、肺炎鏈球菌20型、肺炎鏈球菌22F型、肺炎鏈球菌23F型、肺炎鏈球菌33F型；洗脫液可以含有0.2～1.0mol/L的氯化鈉或氯化鈣；所用的超濾膜截留分子量可以為50～100kD，上樣的多糖濃度可以為20～50mg/ml，上樣量可以為10％～15％；收集Kd0.5之前的組分，然後採取乙醇沉澱法沉澱細菌多糖；所獲得的多糖適合製備細菌多糖疫苗及多糖蛋白結合疫苗。
本發明的有益效果是由於細菌多糖的免疫原性與細菌多糖的分子量密切相關，分子量大的多糖免疫原性較好，同時，細菌多糖中存在的蛋白質、核酸、內毒素雜質對於細菌多糖用於製備疫苗帶來不利影響，通過採用Sepharose 4FF凝膠對細菌多糖進行純化，獲得了蛋白質、核酸、內毒素含量低的高純度的細菌多糖，所獲得的多糖適合製備細菌多糖疫苗及多糖蛋白結合疫苗，並提高了所製備疫苗臨床使用的安全性和有效性。
具體實施例方式實施例1
採用生物反應器對b型流感嗜血桿菌進行發酵培養；於對數生長後期殺菌後，離心收集上清液；在上清液中加入十六烷基三甲基溴化銨至終濃度0.1％，室溫靜置12小時後，4000rpm離心15分鐘，收集沉澱；沉澱中加入1mol/LCaCl2溶液，攪拌3小時後，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌後的多糖經冷凍乾燥，獲得b型流感嗜血桿菌粗製多糖。
10克粗糖按50mg/ml溶解於注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提2次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時，10000g離心1小時去除沉澱。上清液用10kD超濾膜超濾去除乙醇並濃縮至2mg/ml，上樣於Sepharose 4FF柱，每次上樣36ml(柱體積的2％)。0.02mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度50％，置4℃靜置12小時，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次。洗滌的經多糖冷凍乾燥，獲得480mg精製b型流感嗜血桿菌多糖。
各項檢定指標如下蛋白含量 0.15％核酸含量 0.18％核糖含量 38.8％磷含量 8.1％KD小於0.5的分子回收95.2％鑑別試驗 與b型流感嗜血桿菌特異抗血清產生沉澱線內毒素含量 10EU/微克多糖實施例2採用生物反應器對A群腦膜炎球菌進行發酵培養；於對數生長後期殺菌後，離心收集上清液；在上清液中加入十六烷基三甲基溴化銨至終濃度0.1％，室溫靜置12小時後，離心收集沉澱；沉澱中加入lmol/L CaCl2溶液，攪拌3小時後，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度75％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌後的多糖經冷凍乾燥，獲得A群腦膜炎球菌粗製多糖。
40克粗糖按10mg/ml溶解於注射用水，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提2次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時，10000g離心1小時去除沉澱。上清液用100kD超濾膜超濾去除乙醇並濃縮至濃度50mg/ml，上樣於Sepharose 4FF柱，上樣270毫升(15％柱體積)。用1.0mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度90％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌兩次。洗滌的多糖經冷凍乾燥，獲得7280mg精製A群腦膜炎球菌多糖。
各項檢定指標如下蛋白含量 0.14％核酸含量 0.21％O-乙醯基含量 2.5mmol/g磷含量 8.52％KD小於0.5的分子回收96.4％鑑別試驗 與A群腦膜炎球菌特異抗血清產生沉澱線內毒素含量 5EU/微克多糖實施例3採用生物反應器對C群腦膜炎球菌進行發酵培養；於對數生長後期殺菌後，離心收集上清液；在上清液中加入十六烷基三甲基溴化銨至終濃度0.1％，室溫靜置12小時後，離心收集沉澱；沉澱中加入1mol/L CaCl2溶液，攪拌3小時後，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度75％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌後的多糖經冷凍乾燥，獲得C群腦膜炎球菌粗製多糖。
20克粗糖按10mg/ml溶解於注射用水，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提2次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時，10000g離心1小時去除沉澱。上清液用50kD超濾膜超濾去除乙醇並濃縮至濃度20mg/ml，上樣於Sepharose 4FF柱，上樣180毫升(10％柱體積)。用0.2mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度75％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌兩次。洗滌的多糖經冷凍乾燥，獲得1865mg精製C群腦膜炎球菌多糖。
各項檢定指標如下蛋白含量 0.18％核酸含量 0.24％O-乙醯基含量 2.1mmol/g唾液酸含量 850mg/gKD小於0.5的分子回收97.2％鑑別試驗 與C群腦膜炎球菌特異抗血清產生沉澱線內毒素含量 2EU/微克多糖實施例4採用生物反應器對W135群腦膜炎球菌進行發酵培養；於對數生長後期殺菌後，離心收集上清液；在上清液中加入十六烷基三甲基溴化銨至終濃度0.1％，室溫靜置12小時後，離心收集沉澱；沉澱中加入1mol/L CaCl2溶液，攪拌3小時後，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度75％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌後的多糖經冷凍乾燥，獲得W135群腦膜炎球菌粗製多糖。
20克粗糖按10mg/ml溶解於注射用水，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提2次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時，10000g離心1小時去除沉澱。上清液用30kD超濾膜超濾去除乙醇並濃縮至濃度10mg/ml，上樣於Sepharose 4FF柱，上樣90毫升(5％柱體積)。用0.02mol/L氯化鈣溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌兩次。洗滌的多糖經冷凍乾燥，獲得650mg精製W135群腦膜炎球菌多糖。
各項檢定指標如下蛋白含量0.15％核酸含量0.22％O-乙醯基含量0.61mmol/g唾液酸含量 608mg/gKD小於0.5的分子回收 97.6％鑑別試驗與W135群腦膜炎球菌特異抗血清產生沉澱線內毒素含量 20EU/微克多糖實施例5採用生物反應器對Y群腦膜炎球菌進行發酵培養；於對數生長後期用甲醛殺菌後，離心收集上清液；在上清液中加入十六烷基三甲基溴化銨至終濃度0.1％，室溫靜置12小時後，離心收集沉澱；沉澱中加入1mol/LCaCl2溶液，攪拌3小時後，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度75％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌後的多糖經真空冷凍乾燥，獲得Y群腦膜炎球菌粗製多糖。
25克粗糖按20mg/ml溶解於注射用水，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時，10000g離心1小時去除沉澱。上清液用50kD超濾膜超濾去除乙醇並濃縮至濃度50mg/ml，上樣於Sepharose 4FF柱，上樣54毫升(柱體積的3％)。用1.0mol/L氯化鈣溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度75％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次。洗滌的多糖經冷凍乾燥，獲得1760mg精製Y群腦膜炎球菌多糖。
各項檢定指標如下蛋白含量 0.15％核酸含量 0.18％O-乙醯基含量 0.62mmol/g唾液酸含量 596mg/gKD小於0.5的分子回收97.8％鑑別試驗 與Y群腦膜炎球菌特異抗血清產生沉澱線內毒素含量 16EU/微克多糖實施例6採用生物反應器對傷寒沙門氏菌進行發酵；於對數生長後期用甲醛殺菌後，離心收集上清液；在上清液中加入十六烷基三甲基溴化銨至終濃度0.1％，室溫靜置12小時後，離心收集沉澱；沉澱中加入1mol/LCaCl2溶液，攪拌3小時後，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度75％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌後的多糖經冷凍乾燥，獲得傷寒Vi粗製多糖；
15克粗糖按15mg/ml溶解於注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時，10000g離心1小時去除沉澱。上清液用30kD超濾膜超濾去除乙醇並濃縮至20mg/ml，上樣於Sepharose 4FF柱，上樣72毫升(柱體積的4％)。用0.2mol/L氯化鈣溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度70％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次。洗滌的多糖經冷凍乾燥，獲得1050mg精製傷寒Vi多糖。
各項檢定指標如下蛋白含量0.16％核酸含量0.18％O-乙醯基含量3.08mmol/gKD小於0.25的分子回收75.2％鑑別試驗與傷寒Vi特異血清形成沉澱線，與傷寒O血清不形成沉澱線內毒素含量 10EU/微克多糖實施例7採用生物反應器對A群鏈球菌進行發酵；於對數生長期後期用甲醛殺菌後，離心收集菌體；按照菌體溼重每100克加入0.5mol/L NaOH500毫升，攪拌下提取2小時，加入醋酸中和至pH7.0，4000rpm離心30分鐘收集上清。用50kD超濾膜超濾，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌後的多糖經冷凍乾燥，獲得A群鏈球菌粗製多糖。
將15g粗糖按15mg/ml溶解於注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提2次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時，10000g離心1小時去除沉澱。上清液用50kD超濾膜超濾去除乙醇並濃縮至40mg/ml，上樣於Sepharose 4FF柱，上樣108毫升(柱體積的6％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度90％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經洗滌的多糖經冷凍乾燥，獲得1750mg精製A群鏈球菌多糖。
各項檢定指標如下蛋白含量 0.14％核酸含量 0.15％鑑別試驗 與A群鏈球菌特異性抗血清產生沉澱線內毒素含量 0.05EU/微克多糖實施例8採用生物反應器對B群鏈球菌進行發酵；於對數生長期後期用甲醛殺菌後，離心收集菌體；按照菌體溼重每100克加入0.5mol/L NaOH500毫升，攪拌下提取2小時，加入醋酸中和至pH7.0，4000rpm離心30分鐘收集上清。用50kD超濾膜超濾，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌後的多糖經冷凍乾燥，獲得B群鏈球菌粗製多糖。
將25g粗糖按15mg/ml溶解於注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提2次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時，10000g離心1小時去除沉澱。上清液用30kD超濾膜超濾去除乙醇並濃縮至30mg/ml，上樣於Sepharose 4FF柱，上樣90毫升(柱體積的5％)。用0.3mol/L氯化鈣溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度90％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經洗滌的多糖經冷凍乾燥，獲得850mg精製B群鏈球菌多糖。
各項檢定指標如下蛋白含量 0.16％核酸含量 0.20％鑑別試驗 與B群鏈球菌特異性抗血清產生沉澱線內毒素含量 0.05EU/微克多糖實施例9採用生物反應器對肺炎鏈球菌1型進行發酵；於對數生長期後期用脫氧膽酸鈉殺菌後，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌後的多糖經冷凍乾燥，獲得肺炎鏈球菌1型粗製多糖。
將25g粗糖按15mg/ml溶解於注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時，10000g離心1小時去除沉澱。上清液用30kD超濾膜超濾去除乙醇並濃縮至25mg/ml，上樣於Sepharose 4FF柱，上樣180毫升(柱體積的10％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經洗滌的多糖經冷凍乾燥，獲得1650mg精製肺炎鏈球菌1型多糖。
各項檢定指標如下蛋白含量 0.14％核酸含量 0.16％糖醛酸含量 50.3％KD 0.05磷含量 0.1％總氮含量 4.5％鑑別試驗 與肺炎鏈球菌1型抗血清產生特異沉澱線內毒素含量 0.025EU/微克多糖實施例10採用生物反應器對肺炎鏈球菌2型進行發酵；於對數生長期後期用脫氧膽酸鈉殺菌後，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌後的多糖經冷凍乾燥，獲得肺炎鏈球菌2型粗製多糖。
將25g粗糖按15mg/ml溶解於注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時，10000g離心1小時去除沉澱。上清液用30kD超濾膜超濾去除乙醇並濃縮至20mg/ml，上樣於Sepharose 4FF柱，上樣180毫升(柱體積的10％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經洗滌的多糖經冷凍乾燥，獲得1650mg精製肺炎鏈球菌2型多糖。
各項檢定指標如下蛋白含量 0.21％核酸含量 0.19％糖醛酸含量 18.6％甲基戊糖含量 42.3％KD 0.05磷含量 0.1％總氮含量 0.2％鑑別試驗 與肺炎鏈球菌2型抗血清產生特異沉澱線內毒素含量 0.025EU/微克多糖實施例11採用生物反應器對肺炎鏈球菌3型進行發酵；於對數生長期後期用脫氧膽酸鈉殺菌後，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌後的多糖經冷凍乾燥，獲得肺炎鏈球菌3型粗製多糖。
將30g粗糖按20mg/ml溶解於注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時，10000g離心1小時去除沉澱。上清液用30kD超濾膜超濾去除乙醇並濃縮至25mg/ml，上樣於Sepharose 4FF柱，上樣180毫升(柱體積的10％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經洗滌的多糖經冷凍乾燥，獲得1850mg精製肺炎鏈球菌3型多糖。
各項檢定指標如下蛋白含量 0.17％核酸含量 0.18％糖醛酸含量 45.3％KD 0.05磷含量 0.1％總氮含量 0.1％鑑別試驗 與肺炎鏈球菌3型抗血清產生特異沉澱線內毒素含量 0.025EU/微克多糖實施例12採用生物反應器對肺炎鏈球菌4型進行發酵；於對數生長期後期用脫氧膽酸鈉殺菌後，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌後的多糖經冷凍乾燥，獲得肺炎鏈球菌4型粗製多糖。
將15g粗糖按15mg/ml溶解於注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時，10000g離心1小時去除沉澱。上清液用30kD超濾膜超濾去除乙醇並濃縮至25mg/ml，上樣於Sepharose 4FF柱，上樣90毫升(柱體積的5％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經洗滌的多糖經冷凍乾燥，獲得1250mg精製肺炎鏈球菌4型多糖。
各項檢定指標如下蛋白含量 0.23％核酸含量 0.21％氨基己糖含量 45.6％KD 0.05磷含量 0.1％總氮含量 5.1％鑑別試驗 與肺炎鏈球菌4型抗血清產生特異沉澱線內毒素含量 0.025EU/微克多糖實施例13採用生物反應器對肺炎鏈球菌5型進行發酵；於對數生長期後期用脫氧膽酸鈉殺菌後，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌後的多糖經冷凍乾燥，獲得肺炎鏈球菌5型粗製多糖。
將25g粗糖按15mg/ml溶解於注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時，10000g離心1小時去除沉澱。上清液用30kD超濾膜超濾去除乙醇並濃縮至25mg/ml，上樣於Sepharose 4FF柱，上樣180毫升(柱體積的10％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經洗滌的多糖經冷凍乾燥，獲得1020mg精製肺炎鏈球菌5型多糖。
各項檢定指標如下蛋白含量 0.16％核酸含量 0.23％糖醛酸含量 14.2％氨基己糖含量 23.5％KD 0.35磷含量 0.3％總氮含量 4.2％鑑別試驗 與肺炎鏈球菌5型抗血清產生特異沉澱線內毒素含量 0.025EU/微克多糖實施例14採用生物反應器對肺炎鏈球菌6B型進行發酵；於對數生長期後期用脫氧膽酸鈉殺菌後，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌後的多糖經冷凍乾燥，獲得肺炎鏈球菌6B型粗製多糖。
將20g粗糖按20mg/ml溶解於注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時，10000g離心1小時去除沉澱。上清液用30kD超濾膜超濾去除乙醇並濃縮至40mg/ml，上樣於Sepharose 4FF柱，上樣54毫升(柱體積的3％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經洗滌的多糖經冷凍乾燥，獲得1350mg精製肺炎鏈球菌6B型多糖。
各項檢定指標如下蛋白含量 0.21％核酸含量 0.19％甲基戊糖含量 21.3％KD 0.35磷含量 4.1％總氮含量 0.3％鑑別試驗 與肺炎鏈球菌6B型抗血清產生特異沉澱線內毒素含量 0.025EU/微克多糖實施例15採用生物反應器對肺炎鏈球菌7F型進行發酵；於對數生長期後期用脫氧膽酸鈉殺菌後，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌後的多糖經冷凍乾燥，獲得肺炎鏈球菌7F型粗製多糖。
將30g粗糖按20mg/ml溶解於注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時，10000g離心1小時去除沉澱。上清液用30kD超濾膜超濾去除乙醇並濃縮至25mg/ml，上樣於Sepharose 4FF柱，上樣180毫升(柱體積的10％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經洗滌的多糖經冷凍乾燥，獲得2250mg精製肺炎鏈球菌7F型多糖。
各項檢定指標如下蛋白含量 0.18％核酸含量 0.15％甲基戊糖含量 15.6％KD 0.05磷含量 0.1％總氮含量 2.7％鑑別試驗 與肺炎鏈球菌7F型抗血清產生特異沉澱線內毒素含量 0.025EU/微克多糖實施例16採用生物反應器對肺炎鏈球菌8型進行發酵；於對數生長期後期用脫氧膽酸鈉殺菌後，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌後的多糖經冷凍乾燥，獲得肺炎鏈球菌8型粗製多糖。
將25g粗糖按15mg/ml溶解於注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時，10000g離心1小時去除沉澱。上清液用50kD超濾膜超濾去除乙醇並濃縮至25mg/ml，上樣於Sepharose 4FF柱，上樣90毫升(柱體積的5％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經洗滌的多糖經冷凍乾燥，獲得1750mg精製肺炎鏈球菌8型多糖。
各項檢定指標如下蛋白含量 0.21％核酸含量 0.24％糖醛酸含量 38.6％KD 0磷含量 0.1％總氮含量 0.1％鑑別試驗 與肺炎鏈球菌8型抗血清產生特異沉澱線內毒素含量 0.025EU/微克多糖實施例17採用生物反應器對肺炎鏈球菌9N型進行發酵；於對數生長期後期用脫氧膽酸鈉殺菌後，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌後的多糖經冷凍乾燥，獲得肺炎鏈球菌9N型粗製多糖。
將25g粗糖按15mg/ml溶解於注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時，10000g離心1小時去除沉澱。上清液用30kD超濾膜超濾去除乙醇並濃縮至25mg/ml，上樣於Sepharose 4FF柱，上樣180毫升(柱體積的10％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經洗滌的多糖經冷凍乾燥，獲得1320mg精製肺炎鏈球菌9N型多糖。
各項檢定指標如下蛋白含量 0.15％核酸含量 0.17％糖醛酸含量 25.3％氨基己糖含量 31.5％KD 0.05磷含量 0.1％總氮含量 3.3％鑑別試驗 與肺炎鏈球菌9N型抗血清產生特異沉澱線內毒素含量 0.025EU/微克多糖實施例18採用生物反應器對肺炎鏈球菌9V型進行發酵；於對數生長期後期用脫氧膽酸鈉殺菌後，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌後的多糖經冷凍乾燥，獲得肺炎鏈球菌9V型粗製多糖。
將30g粗糖按15mg/ml溶解於注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時，10000g離心1小時去除沉澱。上清液用30kD超濾膜超濾去除乙醇並濃縮至20mg/ml，上樣於Sepharose 4FF柱，上樣180毫升(柱體積的10％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經洗滌的多糖經冷凍乾燥，獲得1550mg精製肺炎鏈球菌9V型多糖。
各項檢定指標如下蛋白含量 0.21％核酸含量 0.20％糖醛酸含量 18.6％甲基戊糖含量 16.2％KD 0.25磷含量 0.1％總氮含量 1.6％鑑別試驗 與肺炎鏈球菌9V型抗血清產生特異沉澱線內毒素含量 0.025EU/微克多糖實施例19採用生物反應器對肺炎鏈球菌10A型進行發酵；於對數生長期後期用脫氧膽酸鈉殺菌後，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌後的多糖經冷凍乾燥，獲得肺炎鏈球菌10A型粗製多糖。
將30g粗糖按20mg/ml溶解於注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時，10000g離心1小時去除沉澱。上清液用30kD超濾膜超濾去除乙醇並濃縮至25mg/ml，上樣於Sepharose 4FF柱，上樣180毫升(柱體積的10％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經洗滌的多糖經冷凍乾燥，獲得1730mg精製肺炎鏈球菌10A型多糖。
各項檢定指標如下蛋白含量 0.22％核酸含量 0.18％氨基己糖含量 15.8％KD 0.35磷含量 2.7％總氮含量 1.9％鑑別試驗 與肺炎鏈球菌10A型抗血清產生特異沉澱線內毒素含量 0.025EU/微克多糖實施例20採用生物反應器對肺炎鏈球菌11A型進行發酵；於對數生長期後期用脫氧膽酸鈉殺菌後，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌後的多糖經冷凍乾燥，獲得肺炎鏈球菌11A型粗製多糖。
將25g粗糖按15mg/ml溶解於注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時，10000g離心1小時去除沉澱。上清液用30kD超濾膜超濾去除乙醇並濃縮至25mg/ml，上樣於Sepharose 4FF柱，上樣90毫升(柱體積的5％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經洗滌的多糖經冷凍乾燥，獲得1560mg精製肺炎鏈球菌11A型多糖。
各項檢定指標如下蛋白含量 0.20％核酸含量 0.21％KD 0.15磷含量 3.8％總氮含量 0.2％鑑別試驗 與肺炎鏈球菌11A型抗血清產生特異沉澱線內毒素含量 0.025EU/微克多糖實施例21採用生物反應器對肺炎鏈球菌12F型進行發酵；於對數生長期後期用脫氧膽酸鈉殺菌後，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌後的多糖經冷凍乾燥，獲得肺炎鏈球菌12F型粗製多糖。
將25g粗糖按15mg/ml溶解於注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時，10000g離心1小時去除沉澱。上清液用30kD超濾膜超濾去除乙醇並濃縮至25mg/ml，上樣於Sepharose 4FF柱，上樣180毫升(柱體積的10％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經洗滌的多糖經冷凍乾燥，獲得1220mg精製肺炎鏈球菌12F型多糖。
各項檢定指標如下蛋白含量 0.16％核酸含量 0.17％氨基己糖含量 28.5％KD 0.10磷含量 0.1％總氮含量 4.1％鑑別試驗 與肺炎鏈球菌12F型抗血清產生特異沉澱線內毒素含量 0.025EU/微克多糖實施例22採用生物反應器對肺炎鏈球菌14型進行發酵；於對數生長期後期用脫氧膽酸鈉殺菌後，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌後的多糖經冷凍乾燥，獲得肺炎鏈球菌14型粗製多糖。
將40g粗糖按20mg/ml溶解於注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時，10000g離心1小時去除沉澱。上清液用30kD超濾膜超濾去除乙醇並濃縮至30mg/ml，上樣於Sepharose 4FF柱，上樣180毫升(柱體積的10％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經洗滌的多糖經冷凍乾燥，獲得2350mg精製肺炎鏈球菌14型多糖。
各項檢定指標如下蛋白含量 0.18％核酸含量 0.19％氨基己糖含量 22.3％KD 0.15磷含量 0.1％總氮含量 3.1％鑑別試驗 與肺炎鏈球菌14型抗血清產生特異沉澱線內毒素含量 0.025EU/微克多糖實施例23採用生物反應器對肺炎鏈球菌15B型進行發酵；於對數生長期後期用脫氧膽酸鈉殺菌後，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌後的多糖經冷凍乾燥，獲得肺炎鏈球菌15B型粗製多糖。
將30g粗糖按20mg/ml溶解於注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時，10000g離心1小時去除沉澱。上清液用30kD超濾膜超濾去除乙醇並濃縮至25mg/ml，上樣於Sepharose 4FF柱，上樣180毫升(柱體積的10％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經洗滌的多糖經冷凍乾燥，獲得2150mg精製肺炎鏈球菌15B型多糖。
各項檢定指標如下蛋白含量 0.18％核酸含量 0.17％氨基己糖含量 17.6％KD 0.30磷含量 3.2％總氮含量 2.1％鑑別試驗 與肺炎鏈球菌15B型抗血清產生特異沉澱線內毒素含量 0.025EU/微克多糖實施例24採用生物反應器對肺炎鏈球菌17F型進行發酵；於對數生長期後期用脫氧膽酸鈉殺菌後，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌後的多糖經冷凍乾燥，獲得肺炎鏈球菌17F型粗製多糖。
將25g粗糖按15mg/ml溶解於注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時，10000g離心1小時去除沉澱。上清液用50kD超濾膜超濾去除乙醇並濃縮至25mg/ml，上樣於Sepharose 4FF柱，上樣90毫升(柱體積的5％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經洗滌的多糖經冷凍乾燥，獲得1350mg精製肺炎鏈球菌17F型多糖。
各項檢定指標如下蛋白含量 0.21％核酸含量 0.22％甲基戊糖含量 23.6％KD 0.25磷含量 0.2％總氮含量 0.3％鑑別試驗 與肺炎鏈球菌17F型抗血清產生特異沉澱線內毒素含量 0.025EU/微克多糖實施例25採用生物反應器對肺炎鏈球菌18C型進行發酵；於對數生長期後期用脫氧膽酸鈉殺菌後，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌後的多糖經冷凍乾燥，獲得肺炎鏈球菌18C型粗製多糖。
將25g粗糖按15mg/ml溶解於注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時，10000g離心1小時去除沉澱。上清液用50kD超濾膜超濾去除乙醇並濃縮至25mg/ml，上樣於Sepharose 4FF柱，上樣90毫升(柱體積的5％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經洗滌的多糖經冷凍乾燥，獲得1750mg精製肺炎鏈球菌18C型多糖。
各項檢定指標如下蛋白含量 0.18％核酸含量 0.23％甲基戊糖含量 16.8％KD 0磷含量 3.6％總氮含量 0.1％鑑別試驗 與肺炎鏈球菌18C型抗血清產生特異沉澱線內毒素含量 0.025EU/微克多糖實施例26採用生物反應器對肺炎鏈球菌19A型進行發酵；於對數生長期後期用脫氧膽酸鈉殺菌後，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌後的多糖經冷凍乾燥，獲得肺炎鏈球菌19A型粗製多糖。
將30g粗糖按20mg/ml溶解於注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時，10000g離心1小時去除沉澱。上清液用50kD超濾膜超濾去除乙醇並濃縮至25mg/ml，上樣於Sepharose 4FF柱，上樣90毫升(柱體積的5％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經洗滌的多糖經冷凍乾燥，獲得1850mg精製肺炎鏈球菌19A型多糖。
各項檢定指標如下蛋白含量 0.15％核酸含量 0.18％氨基己糖含量 14.8％甲基戊糖含量 24.5％KD 0.15磷含量 5.6％總氮含量 1.5％鑑別試驗 與肺炎鏈球菌19A型抗血清產生特異沉澱線內毒素含量 0.025EU/微克多糖實施例27採用生物反應器對肺炎鏈球菌19F型進行發酵；於對數生長期後期用脫氧膽酸鈉殺菌後，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌後的多糖經冷凍乾燥，獲得肺炎鏈球菌19F型粗製多糖。
將25g粗糖按15mg/ml溶解於注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提2次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時，10000g離心1小時去除沉澱。上清液用50kD超濾膜超濾去除乙醇並濃縮至40mg/ml，上樣於Sepharose 4FF柱，上樣72毫升(柱體積的4％)。用0.1mol/L氯化鈣溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經洗滌的多糖經冷凍乾燥，獲得1350mg精製肺炎鏈球菌19F型多糖。
各項檢定指標如下蛋白含量 0.20％核酸含量 0.21％氨基己糖含量 14.3％甲基戊糖含量 25.3％KD 0.05磷含量 4.3％總氮含量 2.3％鑑別試驗 與肺炎鏈球菌19F抗血清產生特異沉澱線內毒素含量 0.025EU/微克多糖實施例28採用生物反應器對肺炎鏈球菌20型進行發酵；於對數生長期後期用脫氧膽酸鈉殺菌後，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌後的多糖經冷凍乾燥，獲得肺炎鏈球菌20型粗製多糖。
將25g粗糖按20mg/ml溶解於注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時，10000g離心1小時去除沉澱。上清液用50kD超濾膜超濾去除乙醇並濃縮至25mg/ml，上樣於Sepharose 4FF柱，上樣90毫升(柱體積的5％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經洗滌的多糖經冷凍乾燥，獲得1550mg精製肺炎鏈球菌20型多糖。
各項檢定指標如下蛋白含量 0.17％核酸含量 0.19％氨基己糖含量 15.6％KD 0.35磷含量 2.6％總氮含量 1.6％鑑別試驗 與肺炎鏈球菌20型抗血清產生特異沉澱線內毒素含量 0.025EU/微克多糖實施例29採用生物反應器對肺炎鏈球菌22F型進行發酵；於對數生長期後期用脫氧膽酸鈉殺菌後，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌後的多糖經冷凍乾燥，獲得肺炎鏈球菌22F型粗製多糖。
將30g粗糖按15mg/ml溶解於注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時，10000g離心1小時去除沉澱。上清液用50kD超濾膜超濾去除乙醇並濃縮至30mg/ml，上樣於Sepharose 4FF柱，上樣90毫升(柱體積的5％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經洗滌的多糖經冷凍乾燥，獲得1750mg精製肺炎鏈球菌22F型多糖。
各項檢定指標如下蛋白含量 0.19％核酸含量 0.16％糖醛酸含量 17.8％甲基戊糖含量 27.6％KD 0.30磷含量 0.1％總氮含量 0.2％鑑別試驗 與肺炎鏈球菌22F型抗血清產生特異沉澱線內毒素含量 0.025EU/微克多糖實施例30採用生物反應器對肺炎鏈球菌23F型進行發酵；於對數生長期後期用脫氧膽酸鈉殺菌後，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌後的多糖經冷凍乾燥，獲得肺炎鏈球菌23F型粗製多糖。
將25g粗糖按15mg/ml溶解於注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提2次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時，10000g離心1小時去除沉澱。上清液用50kD超濾膜超濾去除乙醇並濃縮至40mg/ml，上樣於Sepharose 4FF柱，上樣90毫升(柱體積的5％)。用0.1mol/L氯化鈣溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經洗滌的多糖經冷凍乾燥，獲得2350mg精製肺炎鏈球菌23F型多糖。
各項檢定指標如下
蛋白含量 0.16％核酸含量 0.21％甲基戊糖含量 42.6％KD 0磷含量 3.7％總氮含量 0.1％鑑別試驗 與肺炎鏈球菌23F抗血清產生特異沉澱線內毒素含量 0.025EU/微克多糖實施例31採用生物反應器對肺炎鏈球菌33F型進行發酵；於對數生長期後期用脫氧膽酸鈉殺菌後，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌後的多糖經冷凍乾燥，獲得肺炎鏈球菌33F型粗製多糖。
將30g粗糖按15mg/ml溶解於注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時，10000g離心1小時去除沉澱。上清液用50kD超濾膜超濾去除乙醇並濃縮至25mg/ml，上樣於Sepharose 4FF柱，上樣90毫升(柱體積的5％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度70％，離心收集多糖沉澱；多糖沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經洗滌的多糖經冷凍乾燥，獲得1850mg精製肺炎鏈球菌33F型多糖。
各項檢定指標如下蛋白含量 0.22％核酸含量 0.18％KD 0.25磷含量 0.2％總氮含量 0.1％鑑別試驗 與肺炎鏈球菌33F抗血清產生特異沉澱線內毒素含量 0.025EU/微克多糖本發明與現有技術的比較

從上表可以看出，本發明純化獲得的細菌多糖的蛋白含量、核酸含量、內毒素含量均優於現有技術，說明本發明是一種獲得高純度細菌多糖的新方法，本發明純化獲得的細菌多糖適合於製備疫苗。
權利要求
1.一種使用Sepharose 4FF凝膠對細菌多糖進行純化的方法，具體步驟是(1)採用生物反應器對細菌進行發酵培養；(2)於對數生長後期殺菌，離心收集上清液；(3)製備粗製多糖；(4)對粗製多糖進行預處理，用截留分子量10～100kD的超濾膜超濾濃縮至多糖濃度為2～50mg/ml；(5)以2～15％柱體積上樣於Sepharose 4FF凝膠柱，以含0.02～1.0mol/L氯化鈉或氯化鈣的洗脫液洗脫，收集Kd0.5之前的組分；(6)洗脫液加入乙醇至終濃度50-90％沉澱多糖，離心收集多糖沉澱；(7)沉澱分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；(8)經冷凍乾燥，獲得高純度的精製多糖。
2.根據權利要求1所述的使用Sepharose 4FF凝膠對細菌多糖進行純化的方法，其特徵是所述細菌為以下任一種b型流感嗜血桿菌、A群腦膜炎球菌、C群腦膜炎球菌、W135群腦膜炎球菌、Y群腦膜炎球菌、傷寒沙門氏菌、A群鏈球菌、B群鏈球菌、肺炎鏈球菌1型、肺炎鏈球菌2型、肺炎鏈球菌3型、肺炎鏈球菌4型、肺炎鏈球菌5型、肺炎鏈球菌6B型、肺炎鏈球菌7F型、肺炎鏈球菌8型、肺炎鏈球菌9N型、肺炎鏈球菌9V型、肺炎鏈球菌10A型、肺炎鏈球菌11A型、肺炎鏈球菌12F型、肺炎鏈球菌14型、肺炎鏈球菌15B型、肺炎鏈球菌17F型、肺炎鏈球菌18C型、肺炎鏈球菌19A型、肺炎鏈球菌19F型、肺炎鏈球菌20型、肺炎鏈球菌22F型、肺炎鏈球菌23F型、肺炎鏈球菌33F型。
3.根據權利要求1所述的使用Sepharose 4FF凝膠對細菌多糖進行純化的方法，其特徵是所述超濾膜截留分子量為50～100kD。
4.根據權利要求1所述的使用Sepharose 4FF凝膠對細菌多糖進行純化的方法，其特徵是所述洗脫液含有0.20～1.0mol/L的氯化鈉或氯化鈣。
5.根據權利要求1所述的使用Sepharose 4FF凝膠對細菌多糖進行純化的方法，其特徵是所述上樣的多糖濃度為20～50mg/ml，上樣量10％～15％。
全文摘要
本發明一種使用Sepharose 4FF凝膠對細菌多糖進行純化的方法，屬於生物技術領域，其步驟為在對細菌多糖進行預處理後，使用Sepharose 4FF凝膠對細菌多糖進行純化，收集Kd 0.5之前的組分，可獲得純度高，內毒素含量低的細菌多糖。本發明獲得的純度高、內毒素含量低的細菌多糖適合於製備細菌多糖疫苗及細菌多糖結合疫苗。
文檔編號C12R1/21GK1970779SQ20061004887
公開日2007年5月30日 申請日期2006年12月6日 優先權日2006年12月6日
發明者黃鎮, 向左雲 申請人:雲南沃森生物技術有限公司