一種預防慢性心力衰竭的中藥及其製備方法與流程
2023-09-19 08:06:50
本發明涉及中藥製劑及製法，具體涉及一種以中草藥為原料製成的防治慢性心力衰竭(中醫心衰病)的中藥製劑及其製備方法與應用。
背景技術：
心力衰竭簡稱心衰，是指由於心臟的收縮功能和(或)舒張功能發生障礙，不能將靜脈回心血量充分排出心臟，導致靜脈系統血液淤積，動脈系統血液灌注不足，從而引起心臟循環障礙症候群。而慢性心力衰竭(chf)則是持續存在的心力衰竭狀態，可以穩定、惡化或失代償，是一種自行進展(self-perpetuating)、不斷惡化的疾病。慢性心力衰竭(慢性心衰)並不是一個獨立的疾病，而是各種心血管疾病發展的終末階段。歐洲心臟病協會(esc)《急、慢性心力衰竭診斷和治療指南》指出，心力衰竭是一種臨床症候群，其特徵是存在由於心臟結構和/或功能異常，引起靜息或負荷時心輸出量減少和/或心內壓力增高，從而導致的典型症狀(如呼吸困難、踝部水腫和疲乏)，也可伴有體徵(如頸靜脈壓升高、肺部囉音和外周水腫)。其作為一種進展性的臨床症候群，病情複雜、預後不良，有著極高的病死率。
慢性心力衰竭是由於神經體液激素和心臟重構造成的惡性循環的病理生理過程,最終導致死亡。而心肌重塑是則心臟應對壓力負荷、維持心臟正常輸出的所做出的適應性反應，其涉及心肌細胞的凋亡和肥大、血管新生及細胞外基質相關改變的多個病理生理過程。在神經內分泌系統的代償機制啟動後，短期內病理性心肌肥厚為代償性反應,可以維持心輸出量,平衡室壁壓力,消除初始刺激的影響，同時心肌的成纖維細胞在損傷區域合成分泌大量以膠原為主的細胞外基質，取代損傷的心肌組織，使心功能維持在相對正常範圍；然而在系統長期被激活後，心肌肥厚使心功能失代償，已受損的心肌細胞再次受到了損傷，同時細胞外基質的過度沉積引起了心肌纖維化，心室基本組成成份受損，使得心室順應性降低，導致心臟的收縮舒張功能遭到嚴重的破壞，致使心肌細胞凋亡、心肌擴張，最終造成心力衰竭。
在治療慢性心衰方面，西醫將使用血管緊張素轉換酶抑制劑(acei)、β受體阻斷劑及醛固酮拮抗劑作為基本治療手段，即所謂的「金三角」。目前的治療方法可控制心力衰竭的症狀，但患者出院後發生猝死的可能仍未得到有效的解決，猝死的發生難以預測。故而，西醫在治療慢性心力衰竭雖有一定的優勢和效果，但同時也存在一定的局限性。如左室射血分數正常的老年心衰患者，β受體阻滯劑無法降低其死亡率和(或)再住院率；血流動力學不穩定的患者,靜脈使用β受體阻滯劑會增加心源性休克風險，增加病死率。acei可引起刺激性的乾咳和致命性喉頭水腫。醛固酮拮抗劑螺內酯的使用會導致高血鉀，男性乳腺增生，性功能減退等。
祖國醫學雖無與慢性心力衰竭相應的病名，但根據慢性心衰的臨床表現，可將其歸屬於肺脹、心悸、水腫等範疇，並與痰飲、血瘀等內生之邪壅積心肺脈絡相關，正如張仲景所說「咳逆倚息短氣不得臥，其形為腫」。中醫在治療慢性心衰方面，遵循古理，順其藥性，吸取西醫之治療方法。二十世紀五十年代到八十年代末，現代醫學治療所有類型心力衰竭均採用三大法寶「強心、利尿、擴血管」。而中醫界多數採用的「溫陽、利水、活血」等治療方法可謂是異途同歸，與這三大法寶為一對孿生姐妹。益氣溫陽藥有強心作用、利水滲溼法也有利尿作用、活血化瘀藥多數具有擴張血管作用。可見中西醫治療心衰，雖然方法，藥物不同，但歸根結底是有著某種共性的。中醫界在那個時期也有過研發萬年青、北五加皮、附子等強心藥的經歷。對衰竭心臟要求加大其作功、能象正常心臟一樣；現在看來，這種療法猶如「累馬加鞭」，可加快奔跑但不能持久。此類藥物雖可迅速提高心臟輸出量，但從慢性心衰的病理發展角度而言，對於慢性心衰患者的長期預後及心臟重塑的改善方面的效果並不是十分理想。西醫的「強心、利尿、擴血管」與中醫的「(益氣)溫陽、利水、活血」更適合用於急性心衰或失代償的慢性心衰的治療。這與慢性心力衰竭強調以修復病損心肌為治療目的的新的治療策略格格不入。
技術實現要素：
本發明提供一種療效顯著，副作用小的預防慢性心力衰竭的中藥及其製備方法，解決現有西藥的毒副作用大，成本高昂等技術問題。
本發明採用以下技術方案：
一種預防慢性心力衰竭的中藥，其特徵在於：由以下重量份數的原料藥製成：淫羊藿15-25份、黃芪15-25份、玉竹5-15份、麥冬5-15份、蘇木5-15份、澤蘭5-15份、葶藶子5-15份、澤瀉5-15份。根據以上所述的預防心力衰竭的中藥，其特徵在於：由以下重量份數的原料藥製成：淫羊藿20份、黃芪20份、玉竹10份、麥冬10份、蘇木10份、澤蘭10份、葶藶子10份、澤瀉10份。
根據以上所述的預防慢性心力衰竭的中藥，其特徵在於：所述黃芪為生黃芪、玉竹為炒玉竹、葶藶子為炒葶藶子。
如以上所述的預防慢性心力衰竭的中藥，其特徵在於製備方法包括以下步驟：
a：按所述組份的質量份數比稱取淫羊藿、黃芪、蘇木、澤蘭、澤瀉，經乙醇回流提取，過濾，回收乙醇，濃縮得醇提濃縮液；
b：按所述組份的質量份數比稱取玉竹、麥冬、葶藶子，與步驟a中經體積濃度為60％的乙醇回流提取後的藥渣合併，經水煎煮，過濾，濃縮，冷卻，加乙醇，醇沉得水提醇沉濃縮液，將水提醇沉濃縮液與步驟a的醇提濃縮液合併，濃縮、烘乾後製成浸膏乾粉；
c：將步驟b中的浸膏乾粉進行溼法制粒，乾燥，加輔料製備成片劑、膠囊劑或顆粒劑。
如製備方法中所述的所述的預防心力衰竭的中藥，其特徵在於：製備方法步驟a中所加乙醇量是原料藥重量的12倍量，乙醇的體積濃度為60％，分2次回流提取，每次加乙醇量是原料藥重量的6倍量，每次回流2小時，合併提取液，過濾，濾液減壓濃縮回收乙醇，得醇提濃縮液。
如製備方法中所述的預防慢性心力衰竭的中藥，其特徵在於：製備方法步驟b中加水的總量是原料藥重量的20倍，煎煮2次，每次1.5小時，每次加水量是原料藥重量的10倍，合併兩次水煎液，過濾，將濾液減壓濃縮至60℃時測相對密度為1g/ml，冷卻，加乙醇至含醇量達50％，攪拌均勻，放置48小時後離心，棄去沉澱，離心速度為4800轉/分，回收離心液，與步驟b中醇提濃縮液合併，減壓濃縮後在70℃條件下進行真空乾燥，得浸膏乾粉。
技術方案所述預防心力衰竭的中藥在製備預防慢性心力衰竭的藥物中的應用。
如技術方案所述預防心力衰竭的中藥在製備預防慢性心力衰竭的藥物中的應用，其特徵在於：所述心力衰竭為陰陽兩虛、心脈瘀滯型心力衰竭。
有益效果：申請者通過長期臨床實踐認為，慢性心力衰竭的病程較長，在疾病發展過程中必然存在陰損及陽、陽損及陰的病理機制。「陽氣根於陰，陰氣根於陽；無陰則陽無以生，無陽則陰無以化；全陰則陽氣不極，全陽則陰氣不窮」(《瘍醫大全·卷一·四氣調神大論篇》)，心陰心陽互根互用，密不可分。因此，在心力衰竭的病程中，心陽虧虛必始終伴隨著心陰(體)的虧損，只是隨虛損程度而表現各異。故而，在研究慢性心衰病機時，應以「陰陽兩虛」立論。陰陽兼顧之法，臨床見效看似稍慢，實是更有利於患者心之陽氣的緩緩恢復，對慢性心衰的遠期愈後大有裨益。申請者認為慢性心力衰竭的核心病機為「陰陽兩虛、心脈瘀滯」，益陰助陽活血是其根本治療大法，在此基礎上申請者組方擇藥立本發明實施例4製備的黃羊健心飲(本發明實施例4製備的黃羊健心飲)，該方藥緊緊圍繞「阻斷心肌重塑」這一心衰治療的靶目標，通過修復病損心肌，逆轉心肌重塑，糾正心臟耗竭不支狀態，達到改善患者的生活質量，降低心衰病死率的和再住院率的要求。
「陰中求陽」理論始於《黃帝內經》。《素問·陰陽應象大論》云：「陽化氣，陰成形」。陽化之氣概為有形之陰精所化無形之氣，陰成之形皆為無形之陽氣凝聚所成之有形之精，前者維持推動臟腑生理功能，後者溫潤濡養五臟六腑之根本。明代張景嶽提出「善補陽者,必於陰中求陽,則陽得陰助而生化無窮」。其理論對後世影響頗深，對近現代一些重大疾病的治療亦有切實的指導意義。如慢性心力衰竭，其治療及預後難度頗大，治療方式也難有突破性進展。但近年來，有多位學者在探索從中醫論治慢性心力衰竭修復性治療策略時，將「陰中求陽」理論應用於慢性心力衰竭的防治，值得關注及推廣。如中國中醫科學院史大卓主張在補陽基礎上也應稍佐天冬、麥冬、生地黃等養陰藥物，使陽氣內守以貫血脈。江蘇省中醫院李七一治療心力衰竭時主張補陰配陽，宜少火不宜壯火，務使陰陽二氣能夠互根互濟、互生互化。遼寧中醫藥大學張豔在治療心力衰竭的基礎方強心通脈湯中加入麥冬、生地黃養陰清熱，以奏益氣養陰、補氣救脫、清熱安神之功。這些都是「陰中求陽」理論在臨證中的具體運用。「陰中求陽」之法，更有利於心力衰竭患者心之陽氣的緩緩恢復，這種徐徐圖之的方法，切合中醫治療的整體觀及陰陽觀，「孤陰不生，獨陽不長」，「陰陽平秘，精神乃治」。
本產品方劑配伍圍繞「益陰助陽活血」治則，補陽配陰、陰陽兼顧，使溫陽藥更持久有效地發揮改善心功能的作用，旨在對受損心體進行修復，使肥大病損的心肌細胞得到修復，陽氣得復，從而更好地發揮心主血脈功能，達到改善患者的生活質量，降低慢性心衰病死率的和再住院率的目的。使得慢性心衰在臨床治療中除了「金三角」方案外又多了一種中藥的防治手段。
本發明的中藥製劑經臨床及實驗研究表明，其在逆轉心室重塑，降低左室壓力，改善心室功能等方面具有良好的療效，可進一步改善患者的心功能，提高左室射血分數，降低患者nt-probnp水平，從而提高慢性心力衰竭患者的生活質量。採用天然植物，在研究中並沒有發現明顯的毒副作用，安全性高，本品做成可以做成藥學上的片劑、膠囊劑或顆粒劑。
本發明中淫羊藿，《本草綱目》中稱其有「益精氣、堅筋骨、補腰膝、強心力」之功效。淫羊藿藥性辛溫平和，實踐中發現其「助陽而不傷陰，溫柔而不剛燥」，作為補腎壯陽藥的一種取其「補腎以強心」之功用，補腎則腎氣有根自然上通於心；黃芪，性微溫、補上焦元氣，補而不膩，與淫羊藿相合，益氣助陽，共為君藥。麥冬，養陰生津，潤肺清心；玉竹，滋陰寧心。麥冬、玉竹相伍滋補心陰，共為臣藥。方中以滋陰之玉竹、麥冬與溫陽益氣藥淫羊藿、黃芪相配伍，一來「陰中求陽」，使所顧之陽氣得陰液之助而生化無窮，又可防心火過亢；而淫羊藿、黃芪得玉竹、麥冬之助，可使回歸之陽氣得所依附以防其耗散；心陰與心陽，互根互用，協調平衡，則心氣衝和暢達。澤蘭，活血化瘀，行水消腫。蘇木，「補心散瘀」(《醫林纂要》)。蘇木、澤蘭活血通脈，尤為心衰血瘀而設，共為佐藥。葶藶子，苦降辛散，「故能破滯開結，定逆止喘，利水消腫」(《本草正義》)。澤瀉，性能瀉水，與葶藶相配利水消腫之功尤強，二者相合為使。由此可見，方中諸藥，補瀉同施、寒溫並用、攻守有序，體現出陰陽並補、氣血並調、標本並治的特點，與心衰陰陽兩虛、心脈瘀滯之病機絲絲相扣。也符合現代醫學關於慢性心衰的修復性治療策略。
具體實施方式
實施例1：
取淫羊藿15g、黃芪25g、玉竹5g、麥冬15g、蘇木5g、澤蘭15g、葶藶子5g、澤瀉15g，黃芪為生黃芪、玉竹為炒玉竹、葶藶子為炒葶藶子。
a：稱取淫羊藿、黃芪、蘇木、澤蘭、澤瀉，經乙醇回流提取，所加乙醇量是原料藥重量的12倍量，乙醇的體積濃度為60％，分2次回流提取，每次加乙醇量是原料藥重量的6倍量，每次回流2小時，合併提取液，過濾，濾液減壓濃縮回收乙醇，得醇提濃縮液；
b：稱取玉竹、麥冬、葶藶子，與步驟a中經體積濃度為60％的乙醇回流提取後的藥渣合併，經水煎煮，加水的總量是原料藥重量的20倍，煎煮2次，每次1.5小時，每次加水量是原料藥重量的10倍，合併兩次水煎液，過濾，將濾液減壓濃縮至60℃時測相對密度為1g/ml，冷卻，加乙醇至含醇量達50％，攪拌均勻，放置48小時後離心，棄去沉澱，離心速度為4800轉/分，回收離心液，與步驟b中醇提濃縮液合併，減壓濃縮後在70℃條件下進行真空乾燥，得浸膏乾粉；
c：將步驟b中的浸膏乾粉進行溼法制粒，乾燥，加澱粉製備成片劑。
實施例2：
取淫羊藿25g、黃芪15g、玉竹15g、麥冬5g、蘇木15g、澤蘭5g、葶藶子15g、澤瀉5g，黃芪為生黃芪、玉竹為炒玉竹、葶藶子為炒葶藶子。
a：稱取淫羊藿、黃芪、蘇木、澤蘭、澤瀉，經乙醇回流提取，所加乙醇量是原料藥重量的12倍量，乙醇的體積濃度為60％，分2次回流提取，每次加乙醇量是原料藥重量的6倍量，每次回流2小時，合併提取液，過濾，濾液減壓濃縮回收乙醇，得醇提濃縮液；
b：稱取玉竹、麥冬、葶藶子，與步驟a中經體積濃度為60％的乙醇回流提取後的藥渣合併，經水煎煮，加水的總量是原料藥重量的20倍，煎煮2次，每次1.5小時，每次加水量是原料藥重量的10倍，合併兩次水煎液，過濾，將濾液減壓濃縮至60℃時測相對密度為1g/ml，冷卻，加乙醇至含醇量達50％，攪拌均勻，放置48小時後離心，棄去沉澱，離心速度為4800轉/分，回收離心液，與步驟b中醇提濃縮液合併，減壓濃縮後在70℃條件下進行真空乾燥，得浸膏乾粉；
c：將步驟b中的浸膏乾粉進行溼法制粒，乾燥，加糊精製備成顆粒劑。
實施例3：
取淫羊藿20g、黃芪20g、玉竹10g、麥冬10g、蘇木10g、澤蘭10g、葶藶子10g、澤瀉10g，黃芪為生黃芪、玉竹為炒玉竹、葶藶子為炒葶藶子。
a：稱取淫羊藿、黃芪、蘇木、澤蘭、澤瀉，經乙醇回流提取，所加乙醇量是原料藥重量的12倍量，乙醇的體積濃度為60％，分2次回流提取，每次加乙醇量是原料藥重量的6倍量，每次回流2小時，合併提取液，過濾，濾液減壓濃縮回收乙醇，得醇提濃縮液；
b：稱取玉竹、麥冬、葶藶子，與步驟a中經體積濃度為60％的乙醇回流提取後的藥渣合併，經水煎煮，加水的總量是原料藥重量的20倍，煎煮2次，每次1.5小時，每次加水量是原料藥重量的10倍，合併兩次水煎液，過濾，將濾液減壓濃縮至60℃時測相對密度為1g/ml，冷卻，加乙醇至含醇量達50％，攪拌均勻，放置48小時後離心，棄去沉澱，離心速度為4800轉/分，回收離心液，與步驟b中醇提濃縮液合併，減壓濃縮後在70℃條件下進行真空乾燥，得浸膏乾粉；
c：將步驟b中的浸膏乾粉進行溼法制粒，乾燥，加澱粉製備成膠囊劑。
實施例4：
取淫羊藿20g、黃芪20g、玉竹10g、麥冬10g、蘇木10g、澤蘭10g、葶藶子10g、澤瀉10g，黃芪為生黃芪、玉竹為炒玉竹、葶藶子為炒葶藶子。
a：稱取淫羊藿、黃芪、蘇木、澤蘭、澤瀉，經乙醇回流提取，所加乙醇量是原料藥重量的12倍量，乙醇的體積濃度為60％，分2次回流提取，每次加乙醇量是原料藥重量的6倍量，每次回流2小時，合併提取液，過濾，濾液減壓濃縮回收乙醇，得醇提濃縮液；
b：稱取玉竹、麥冬、葶藶子，與步驟a中經體積濃度為60％的乙醇回流提取後的藥渣合併，經水煎煮，加水的總量是原料藥重量的20倍，煎煮2次，每次1.5小時，每次加水量是原料藥重量的10倍，合併兩次水煎液，過濾，將濾液減壓濃縮至60℃時測相對密度為1g/ml，冷卻，加乙醇至含醇量達50％，攪拌均勻，放置48小時後離心，棄去沉澱，離心速度為4800轉/分，回收離心液，與步驟b中醇提濃縮液合併，加蔗糖製備成口服液，命名為黃羊健心飲。
實施例5：臨床研究
黃羊健心飲採用益陰助陽活血法，系我們在臨床上治療心衰病人的基本法則，關於本發明治療臨床上慢性心衰病人，我們已進行了反覆多年的驗證。同時，已具體完成的臨床研究及實驗研究驗證了本方防治慢性心衰的科學內涵。
5.1診斷標準：
5.1.1心力衰竭診斷標準：依據陳灝珠主譯《臨床心臟病學》第233頁診斷標準制定。主要標準：夜間陣發性呼吸困難或端坐呼吸；勞累時呼吸困難和咳嗽；頸靜脈擴張；溼哆音；心臟肥大；急性肺水腫；第三心音奔馬律；靜脈壓升高(>16cmh20)(2.1kpa)；胸水。次要標準:踝部水腫；夜間咳嗽；肝腫大；肺活量比最大值降低1/3；心動過速(心率)12obpm)。主要或次要標準:治療5天內體重下降)4.5kg；確診必須同時具有以上2項主要標準或者具有1項主要和2項次要標準。
5.1.2中醫陰陽兩虛、心脈瘀滯證的辨證標準
主症：①心悸②氣喘；次症：①倦怠乏力、畏寒肢冷、口唇青紫、舌質淡、舌體胖大或有齒痕、脈沉細、沉遲；②胸部悶痛、面晦、兩顴黯紅、汗出膚粘、舌質暗紅或紫暗或有瘀斑、脈細數無力或結代；③面浮肢腫、小便短少、頸脈怒張、咳吐泡沫白痰或帶血、舌苔白滑；④胸部憋氣、夜間不能平臥、口乾、煩燥不安。＊需具備主症並同時具備次症兩項以上者(包括兩項)，符合中醫診斷標準。
5.1.3、排除標準：①急性心功能不全。②心功能ⅰ級或ⅳ級者。③伴有心源性休克，或致命性心律失常、ⅱ度ⅱ型以上房室傳導阻滯、心肌梗塞的患者，心力衰竭合併未控制的感染及有其它影響心衰療效判定的。④合併有肝、腎和造血系統、內分泌系統等嚴重原發疾病，精神病者等。⑤妊娠或哺乳期婦女，對本藥過敏者。⑥一個月內曾應用其他試驗藥品者。
5.2實驗分組：選擇80例慢性心力衰竭(陰陽兩虛、心脈瘀滯證)患者，隨機分為治療組40例與對照組40例。兩組均予西醫標準治療，治療組加服本發明實施例4製備的黃羊健心飲。治療四周後，系統觀察並比較兩組患者治療前後及兩組之間心功能的臨床療效；中醫證候積分及心衰總積分(lee氏心衰計分)；血流動力學指標(lvedd、lvesd、lvef)；6min步行距離(6mwd)；nt-probnp；明尼蘇達心衰生活質量評分等。
5.3結果：
5.3.1心功能療效比較
表1顯示治療組患者心功能改善的總有效率為87.5％，對照組總有效率為60.0％，兩組經卡方檢驗比較(p0.05)。治療後，兩組心衰總積分顯著降低(p<0.01)，且治療組低於對照組(p0.05)，具有可比性；治療組治療前後自身對比，對照組治療前後自身對比，差異均有統計學意義(p<0.01)；兩組治療後中醫證候總積分比較，差異有統計學意義，治療組優於對照組(p<0.05)。
表3兩組患者中醫證候總積分比較
與本組治療前比較#p<0.01△與對照組治療後比較p0.05)。組內比較，治療組經治療後lvedd值較治療前下降(p0.05)；組內比較，治療組經治療後lvesd值較治療前下降(p0.05)；組內比較，兩組患者經治療後lvef值均較本組治療前增加(p<0.05)，差別有統計學意義。組間比較，治療組治療前後lvef值改善幅度優於對照組，差別有著性(p<0.05)。具體見表4。
表4兩組患者治療前後心臟超聲結果比較
*與本組治療前比較，p<0.05；#與本組治療前比較，p＜0.01；△與對照組治療後比較p0.05)。組內比較，治療組經治療後6mwd值較治療前增加(p<0.01)，差別有統計學意義。對照組治療後6mwd值較治療前增加，有顯著性差異(p<0.05)；組間比較，治療組治療前後6mwd值改善幅度優於對照組，差別有著性(p<0.05)。
表5兩組患者6分鐘步行距離(m)比較
*與本組治療前比較，p<0.05；#與本組治療前比較，p＜0.01；△與對照組治療後比較p0.05)。組內比較，兩組患者經治療後血漿nt-probnp值較治療前下降(p<0.05)，差別有統計學意義。治療後組間比較，治療組治療後血漿nt-probnp水平下降幅度明顯優於對照組(p<0.05)，差別有顯著性。
表6兩組患者治療前後血漿nt-probnp水平比較
*與本組治療前比較，p<0.05；△與對照組治療後比較p<0.05
5.3.7兩組患者生活質量評分比較
表7顯示兩組患者分別進行治療前與治療後生活質量比較,兩組治療後較治療前生活質量評分均減低(p<0.01)，表明兩組的治療對生活質量的影響有顯著差異；治療組生活質量評分的降低幅度優於對照組(p<0.05)，差異有顯著性。
表7兩組患者生活質量評分比較
*與本組治療前比較，p<0.05；#與本組治療前比較，p＜0.01；△與對照組治療後比較p<0.05
研究表明標準和優化抗心力衰竭治療的基礎之上聯合使用本發明實施例4製備的黃羊健心飲口服，可進一步改善慢性心力衰竭患者的心功能，降低心衰總積分及中醫證候總積分，提高左室射血分數，改善患者6min步行距離，提高患者的生活質量，降低患者血漿nt-probnp水平。本研究揭示，本發明實施例4製備的黃羊健心飲可能是通過修復受損衰竭的心肌細胞，逆轉心室重塑，降低左室壓力，改善心室功能，從而使血漿nt-probnp水平下降，使患者生活質量和活動能力得到提高。
實施例6：本發明實驗研究
通過建立慢性心力衰竭的動物模型，進行在體及體外實驗，從整體-細胞-分子多個水平上闡明本發明實施例4製備的黃羊健心飲改善心衰的作用機理。
6.1實驗動物：
實驗用成年雄性sd大鼠，spf級，均為雄性，體質量(270±20)g,共計80隻。由上海思捷實驗動物有限公司提供，許可證號碼：scxk(滬)2013-0006
6.2實驗器械：
千分之一電子天平(ar2202cn，奧豪斯儀器上海有限公司製造)；
萬分之一電子天平(cpa225d，賽多利斯科學儀器北京有限公司)；
超聲波清洗器(kq-500型，崑山市超聲儀器有限公司)；
電熱鼓風乾燥箱(gzx-9240mbe，上海博迅實業有限公司醫療設備廠)；
臺式冷凍離心機(microcl21r)；
tanon5500全自動化學發光成像分析系統(上海天能科技有限公司)；
ts-3d脫色搖床；bio-radpowerpacbasicpowersupply；
microcl21r微量臺式冷凍離心機(thermofisherscientific)。
彩色超聲監測儀(型號：vevo2100)
bl-420s生物技能實驗系統(成都泰盟軟體有限公司)
6.3實驗過程：
6.3.1慢性心力衰竭的模型建立
採用改良的異丙腎上腺素(iso)皮下注射建立sd大鼠心力衰竭模型，取體質量(270±20)g的雄性sd大鼠80隻，將大鼠按體重順序編號，隨機分為2組：正常組(ns)10隻，模型組(iso)組70隻。ns組皮下注射生理鹽水0.25ml，iso組皮下注射iso(170mg/kg，共兩次，間隔24h)。
6.3.2分組及給藥
造模完成後，同室常規飼養4周後，行心臟彩超檢測，剔除左室射血分數(lvef)＞50％的iso組大鼠，lvef＜50％的大鼠即為造模成功的心衰大鼠。在造模期間，死亡8隻sd大鼠，2隻sd大鼠lvef＞50％，被剔除。最後餘60隻造模成功的sd大鼠，將合格的心衰大鼠隨機均分到5組，每組12隻：心衰模型組(ns10ml·kg-1·d-1)、美託洛爾組(琥珀酸美託洛爾7.6mg·kg-1·d-1)、益陰助陽低劑量組(生藥4.17g·kg-1·d-1)、益陰助陽中劑量組(生藥8.33g·kg-1·d-1)和益陰助陽高劑量組(生藥16.6g·kg-1·d-1)；分別灌胃給藥8周。在給藥治療的第一、二周，心衰模型組死亡3隻，低劑量治療組及中劑量治療組各死亡2隻，從第三周開始，sd大鼠生命體徵趨於穩定，無死亡。故而，在8周治療結束時，各組sd大鼠存活情況：正常組n＝10，心衰模型組n＝9、美託洛爾組n＝12、益陰助陽低劑量組n＝10、益陰助陽中劑量組n＝10、益陰助陽高劑量組n＝12。再次行心臟彩超檢測，觀察各項指標。
6.3.3心臟彩超檢測
將大鼠氣體麻醉(氧氣+異氟烷麻醉)，4％誘導，1-1.5％維持；固定於仰臥位，剔除胸毛，採用visualsonicsvevo2100超聲心動圖檢測設備(探頭頻率：21mhz)，以二維成像模式在左室短軸切面位於乳頭肌水平測量相關指標，測定值均為5個心動周期測定的均值。
6.3.4血流動力學檢測
各組大鼠按設定藥物劑量灌胃給藥8周後，腹腔注射麻醉，仰臥位固定四肢，切開頸部，分離右頸總動脈約1.5cm，結紮遠心端，再經頸總動脈插入充滿肝素生理鹽水的導管，導管上連接壓力換能器，將導管插入左室腔。測量各組大鼠左心室收縮壓(lvsp)、左心室舒張末期壓(lvedp)、左心室內壓最大上升和下降速率(+dp/dtmax和-dp/dtmax)，所有信息由bl-420s生物機能檢測系統記錄並採用bl-newcentury軟體進行分析。檢測結束頸動脈放血處死所有動物，所取血液37℃水浴靜置2小時後，離心(3000rpm15min)，取上清，用於神經內分泌指標檢測。取大鼠心臟，冰生理鹽水衝洗，濾紙吸乾，沉重。在剪去右心室游離壁，保留左心室及室間隔，稱取左心室重量(lvm)，並計算左心室重量指數lvm(lvm/bw)。剪取的心臟左室部分凍存與-80℃冰箱，待提取蛋白及rna以檢測其他指標。動物實驗的相關規程嚴格按照實驗動物使用和操作指南(中國科學技術部2006年頒布)以及本院制定的相關倫理規則，旨在減輕動物所受痛苦並減少動物的使用數量。
6.3.5病理分析
心臟標本於10％的福馬林中固定24h(4℃)常規取材、脫水、石蠟包埋，沿左室長軸線每隔1mm橫斷面切取數張4μm厚的切片，做he和masson染色。
(1)固定：4％多聚甲醛固定心臟。
(2)脫水和包埋：石蠟包埋切片部分實驗送南京醫科大學病理實驗室具體操作。
(3)he染色：將空白片於60℃烘箱烘烤30分鐘，後放在50℃二甲苯ⅰ中浸泡30分鐘，再於二甲苯ⅱ中浸泡10分鐘，充分脫蠟。逐級經無水乙醇，95％乙醇溶液，85％乙醇溶液，75％乙醇溶液，50％乙醇溶液，直至蒸餾水以及pbs浸泡，每次浸泡3分鐘。取各組樣本各一片，浸泡於蘇木精(hematoxylin)中3分鐘，流水衝洗未結合的染料。再浸泡於伊紅(eosin)中3分鐘，流水衝洗未結合的染料。在標本上滴加中性樹脂封片，封片鏡檢，記錄實驗結果。
(4)masson染色：石蠟切片脫蠟至水；依次自來水和蒸餾水洗；用regaud蘇木精染液或weigert蘇木精液染核5-10min；充分水洗；蒸餾水洗；用masson麗春紅酸性復紅液5-10min；以2％冰醋酸水溶液浸洗片刻；1％磷鉬酸水溶液分化3-5min；不經水洗,直接用苯胺藍或光綠液染5min；以0.2％冰醋酸水溶液浸洗片刻；95％酒精、無水酒精、二甲苯透明、中性樹膠封固。
光學顯微鏡下觀察心臟的下列病變：①心肌纖維有無肥大、變性、壞死，間質有無充血、水腫、炎細胞浸潤、結締組織增生；②心內膜、心外膜有無充血、水腫、炎細胞浸潤。
6.3.6神經內分泌細胞因子檢測
取大鼠血清，進行羥脯氨酸、肌酸激酶(ck)、去甲腎上腺素(ne)、醛固酮(ald)、大鼠腦鈉素(bnp)、大鼠鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶2(camk2)、大鼠內皮素1(et-1)、大鼠血管緊張素ⅱ(angⅱ)水平的測定，具體操作按試劑盒說明進行。
6.3.7rt-pcr法檢測細胞因子和轉錄因子mrna水平的變化
6.3.7.1心肌組織總rna的提取：向各不同組的心臟中加入trizol(500-100mg組織加入1mltrizol)，渦旋混勻，室溫靜置5min後，離心(12000rpm5min)，棄沉澱；按300μl氯仿/mltrizol加入氯仿，用力振蕩試管15s後，室溫靜置10min，離心(12000g15min)，吸取上層水相，移至離心管中後，按0.5ml異丙醇/mltrizol加入異丙醇，混勻，室溫靜置10min，離心(14800g10min)後，棄上清；按1ml75％乙醇/mltrizol加入75％乙醇，渦旋振蕩充分混勻樣品、懸浮沉澱後，離心(14800g5min)後，儘量棄上清，室溫乾燥10min；用適量(50μl)的depc處理水溶解rna樣品後，分裝，凍存。
6.3.7.2rna濃度的計算：各組吸取1μlrna,thermo公司的rna濃度測定軟體。於260nm，280nm讀相取應的吸光度值od值。od260，280分別代表核酸，蛋白質的吸光度值。od260/280的值用來顯示rna的質量，一般1.8-2.0之間質量較好，小於1.8說明有蛋白質等有機物汙染，大於2.2的說明rna被水解成了單核苷酸。rna的濃度值＝1μl/(od260)×稀釋倍數計算。
6.3.7.3配置逆轉錄體系
6.3.7.4配製逆轉錄反應液
6.3.7.5結果分析：real-timepcr定量分析軟體自動生成擴增動力曲線和融解曲線。在擴增動力曲線中,ct值代表擴增產物的螢光信號達到設定的閾值時所經過的擴增循環次數,模板dna量越多,螢光達到域值的循環數越少,即ct值越小；δδct＝(ct目的-ct內參)處理組-(ct目的-ct內參)對照組
6.3.8「本發明」含藥血清製備
sd大鼠50隻，分5組，每組10隻，分別口服美託洛爾、「本發明」低劑量、「本發明」中劑量、「本發明」高劑量及生理鹽水。給藥3天後，腹主動脈取血，離心，製備含藥血清。
6.3.9sd大鼠乳鼠原代心肌細胞提取
出生1天的sd大鼠的乳鼠，放入75％的乙醇中醉死，取心臟後，將心臟放入d-hanks中清洗，剪去上1/3，放入15ml的離心管中，加入2ml的d-hank清洗後棄上清，將心臟剪碎為1mm3的小塊；向離心管中加入6ml消化液，37℃水浴箱消化5min，棄上清；再向離心管中加入5ml消化液，37℃水浴箱消化10min,每隔2min振蕩、吹打；將上清吸出移至新的離心管中，並加入2mlimdm終止消化；再次向餘下的沉澱中再次加入5ml消化液，37℃水浴箱消化10min，如此重複兩邊。將三次收集的上清過濾至新的離心管中離心(1500rpm10min)，棄上清。向沉澱中加入8mld-hanks後吹打均勻，再次離心(1500rpm10min)，棄上清。加入10mlimdm吹打均勻，移至培養瓶中，培養24h後給藥培養。
6.3.10異丙腎上腺素誘導心肌細胞損傷模型的建立及實驗分組
從正常大鼠乳鼠心肌利用酶消化和差速貼壁方法分離得到原代心肌細胞，體外培養後，用對心肌細胞有害的異丙腎上腺素(iso)，造成體外心衰模型，正常組心肌細胞不加異丙腎上腺素(iso)。
實驗共分六組：①正常組②模型組③美託洛爾組④「本發明」低劑量組⑤「本發明」中劑量組⑥「本發明」高劑量組。實驗結束後,鏡下觀察細胞形態,收集心肌細胞及培養上清液用於指標測定。各組設8孔,重複3次。
6.3.11免疫印跡法(westernblot)分析不同處理組心肌細胞抗凋亡蛋白的表達變化
免疫印跡法(westernblot)檢測分析β1受體mrna表達的變化。
利用westernblotting方法，分析本發明對損傷模型原代心肌細胞pka及磷酸化的pka變化
利用westernblotting方法，分析本發明對損傷模型原代心肌細胞creb的磷酸化程度、creb、pka的rsubunit和pka的csubunit的表達的影響
考察「本發明」對心肌細胞非經典的β1ar-ca2+-camkⅱ信號通路的影響
考察「本發明」在bcl-2及bax凋亡抗體的表達
6.3.12本發明在抗凋亡方面作用的表達
hochest-pi雙染考察凋亡作業
應用流式細胞儀檢測細胞群凋亡情況
6.4實驗結果：
6.4.1考察異丙腎上腺素致心衰大鼠的超聲心動圖形態參數、血流動力學、組織形態
學及神經內分泌細胞因子的相關指標
在建立sd大鼠心衰模型後，各組大鼠血流動力學、組織形態學及神經內分泌細胞因子相關指標受到了不同程度的損傷，在給予對症治療後，各指標都得到了不同程度的改善。
對異丙腎上腺素致心衰大鼠的超聲心動圖形態參數的影響
表8.各組大鼠超聲心動圖形態參數比較a
#與正常組比較，p＜0.05；##與正常組比較，p＜0.01；*與模型組比較，p＜0.05；**與模型組比較，p＜0.01
如表8所示，在第8周治療末，各組大鼠行超聲心動圖檢查，模型組大鼠在注射異丙腎上腺素造模後出現明顯的心衰表現，左室舒張末期內徑(lvdd)、左室收縮末期內徑(lvds)水平顯著上升，在給予「本發明實施例4製備的黃羊健心飲」治療後，lvdd及lvds得到不同程度的改善；左室舒張末期室間隔厚度(lvsd)、左室收縮末期室間隔厚度(lvss)水平顯著下降，在給予「本發明實施例4製備的黃羊健心飲」治療後，lvsd及lvss得到不同程度的改善。
表9.各組大鼠超聲心動圖形態參數比較b
#與正常組比較，p＜0.05；##與正常組比較，p＜0.01；*與模型組比較，p＜0.05；**與模型組比較，p＜0.01
如表9所示，在第8周治療末，各組大鼠行超聲心動圖檢查，模型組大鼠在注射異丙腎上腺素造模後出現明顯的心衰表現，左室舒張末期後壁厚度(lvpwd)、左室收縮末期後壁厚度(lvpws)、左心室射血分數(ef)及左室短軸縮短率(fs)的水平顯著下降，在給予「本發明實施例4製備的黃羊健心飲」治療後，lvpwd、lvpws、ef及fs得到不同程度的改善。
6.4.2對異丙腎上腺素致心衰大鼠的血流動力學的影響
如表10-1、10-2所示，在第8周治療末，模型組大鼠在注射異丙腎上腺素造模後出現明顯的心衰表現，左心室末期舒張壓(lvedp)的水平顯著上升；左心室末期收縮壓(lvsp)、左心室壓力最大上升速率(+dp/dtmax)及左心室壓力最大下降速率(-dp/dtmax)的水平明顯下降；心率(hr)與正常組相比，模型組心率變化，統計學無顯著性差異(p＞0.05)。給予「本發明實施例4製備的黃羊健心飲」治療後，上述指標得到了不同程度的改善。lvsp從模型組的93.33±15.85恢復到「本發明實施例4製備的黃羊健心飲」高劑量的118.63±22.94；lvedp從模型組的25.82±7.14恢復到了「本發明實施例4製備的黃羊健心飲」高劑量的15.76±7.00；-dp/dtmax從模型組的-2400.34±526.14恢復到了「本發明實施例4製備的黃羊健心飲」高劑量的-3495.13±553.87；+dp/dtmax從模型組的2664.83±571.65恢復到了「本發明實施例4製備的黃羊健心飲」高劑量的3462.74±463.01
表10-1.六組大鼠心臟功能指標數據1
表10-2.六組大鼠心臟功能指標數據2
#與正常組比較，p＜0.05；##與正常組比較，p＜0.01；*與模型組比較，p＜0.05；**與模型組比較，p＜0.01
6.4.3對心衰大鼠的心肌組織病理變化的影響
masson染色結果顯示，正常組未見膠原組織明顯增生。模型組心肌細胞周圍膠原組織明顯增多，部分心肌組織被膠原組織取代，出現心肌纖維化，左心室心肌間質纖維膠原明顯增多、增粗。各治療組心肌細胞周圍膠原組織含量和纖維化程度較模型組明顯減弱。
he染色結果顯示，正常組心肌細胞排列整齊，心肌纖維呈短柱狀，可見橫紋。心肌細胞核呈卵圓形、較大，著色較淺，位於肌纖維中央，未見心肌細胞肥大現象。模型組可見肌纖維及間質發生凋亡或壞死，心肌纖維增粗、拉長，胞核著色深，細胞排列疏鬆，橫紋不清楚或消失，局部組織纖維化，間質內有炎性細胞浸潤等。在予以「本發明」不同劑量給藥治療後，其心肌細胞肥大、細胞變性及炎細胞浸潤等症狀較模型組得到了不同程度的改善，並呈一定劑量依賴關係。
6.4.4對異丙腎上腺素致心衰大鼠的彩超結果的影響
各組大鼠給藥8周後，超聲心動圖結果顯示，模型組大鼠左心腔擴大，射血分數降低，而本發明組對心臟擴大及功能下降均有保護作用。
6.4.5本發明對異丙腎上腺素致心衰大鼠血清中神經內分泌因子的影響
如表11-1、11-2所示，與正常組相比，模型組的ne、ald、bnp、et-1、angⅱ、camk2、ck、羥脯氨酸水平均顯著升高。與模型組相比，給予「本發明」治療組的大鼠，其血清中的na/ne、ald、bnp、et-1、angⅱ、camk2、ck、羥脯氨酸水平均顯著下降。
表11-1.各組大鼠血清中各指標的含量1
#與正常組比較，p＜0.05；##與正常組比較，p＜0.01；*與模型組比較，p＜0.05；**與模型組比較，p＜0.01
表11-2.各組大鼠血清中各指標的含量2
#與正常組比較，p＜0.05；##與正常組比較，p＜0.01；*與模型組比較，p＜0.05；**與模型組比較，p＜0.01
6.4.6考察異丙腎上腺素致心衰大鼠的mmp-2&mmp-9及對心肌β1受體mrna水平的變化
通過pcr技術，驗證了本發明實施例4製備的黃羊健心飲(本發明實施例4製備的黃羊健心飲)的療效。與正常組相比，模型組心肌組織mmp-2及mmp-9的mrna表達水平現明顯升高(p<0.01)、心肌組織β1受體的mrna表達水平明顯降低(p<0.05)；通過給藥治療，心肌損傷後的mmp-2及mmp-9的mrna表達水平、心肌損傷後的β1受體的mrna表達水平得到了不同程度的改善。
6.4.7考察對異丙腎上腺素致心衰大鼠心肌細胞凋亡及心肌細胞經典的β1ar-camp-pka-creb信號通路以及非經典的β1ar-ca2+-camkⅱ信號通路的影響
通過應用免疫印跡法(westernblot)檢測β1ar、心肌細胞內的pka、creb的磷酸化程度、creb、pka的rsubunit和pka的csubunit、camkii及相關凋亡蛋白bcl-2、bak及bax的蛋白表達。
異丙腎上腺素誘導大鼠原代心肌細胞損傷後，與正常組相比，模型組心肌細胞表面心肌表面β1受體的mrna表達水平、心肌細胞內的pka磷酸化活性及心肌細胞的bcl-2的表達降低，心肌細胞內的creb磷酸化程度、心肌細胞內的camkii表達、心肌細胞的bak表達及心肌細胞的bax的表達顯著增高。在給藥治療後，各項指標的表達都得到了不同程度的改善。而對creb、pka的rsubunit和pka的csubunit的表達無影響。
經異丙腎上腺素誘導，大鼠原代心肌細胞損傷後，與正常組相比，模型組心肌細胞內的creb磷酸化程度顯著增強，而美託洛爾組及本發明實施例4製備的黃羊健心飲含藥血清高劑量組均可顯著降低心肌細胞損傷後creb的磷酸化程度，而對creb、pka的rsubunit和pka的csubunit的表達無影響。
治療結束後，各組大鼠原代心肌細胞總蛋白提取後，與正常組相比，模型組心肌細胞的bcl-2表達顯著降低；與模型組比較，美託洛爾組及「本發明」低中高劑量組均可增強bcl-2的表達，並呈劑量依賴性。與正常組相比，模型組心肌細胞的bak表達顯著增高；與模型組比較，美託洛爾組及「本發明」中高劑量組均可降低bak的表達。與正常組相比，模型組心肌細胞的bax表達顯著增高；與模型組比較，美託洛爾組及「本發明」中高劑量組均可降低bax的表達。
6.4.8考察「本發明實施例4製備的黃羊健心飲」及方中四種主要活性成分對心肌細胞凋亡的影響
應用流式細胞儀檢測細胞周期，annexin-v/pi雙染法、westernblot法及hochest-pi雙染法考察凋亡相關指標。所有結果表明，經異丙腎上腺素誘導損傷的原代心肌細胞，在給予藥物治療後，抗凋亡的表達增強。
正常組未見凋亡細胞，模型組凋亡細胞為20.2％。與模型組比較，美託洛爾陽性藥對照組及本發明實施例4製備的黃羊健心飲含藥血清組凋亡率都有不同程度的下降。
綜上所述，臨床研究及實驗研究結果一致，雙雙印證了本發明實施例4製備的黃羊健心飲在治療慢性心衰中的療效。同時，全方標本兼治，從多途徑、多環節、多靶點治療心功能不全，體現了中藥在治療慢性心衰方面的綜合優勢，與現代心力衰竭的修復性治療理念相吻合。