多色螢光分析裝置的製作方法

2023-09-18 15:18:45 4

本發明涉及多色螢光分析裝置。

背景技術：

例如在生物學試驗中，已知有對使用螢光色素所標記的大量微小的dna片段統一地照射激發光，並檢測上述螢光色素所發出的螢光來解讀各dna片段的鹼基序列的分析裝置(例如，參照非專利文獻1)。

上述分析裝置在被稱為流動池的反應容器中以高密度配置dna片段，將使用聚合酶鏈式反應(pcr：polymerasechainreaction)由不同的螢光色素標識出的4種鹼基中與dna片段的鹼基互補的鹼基放入上述dna片段中，通過激發光的照射來識別上述螢光色素，由此確定鹼基，通過重複該操作來解讀鹼基序列。

另外，與此相關，示出了如下方法(例如，參照非專利文獻2)：使用微粒子(dna微球)作為承載dna片段的載體，在上述微粒子上進行了pcr後，將該微粒子散開在玻璃基板上進行固定，並在上述玻璃基板上進行酶反應(連接)，放入帶有螢光色素的基質來進行螢光檢測，由此獲得各dna片段的序列信息。

使用像這些這樣的分析裝置等，可以並行地分析大量dna片段，因此可以期待提高解讀鹼基序列的速度。

現有技術文獻

專利文獻

非專利文獻1:d.r.bentleyetal.,accuratewholehumangenomesequencingusingreversibleterminatorchemistry,nature456,53-59,(2008)

非專利文獻2:science2005,vol.309,p.1728-1732

技術實現要素：

發明要解決的課題

然而，在像上述dna的鹼基序列的解讀為代表那樣的、對包含不同的螢光色素的試樣進行螢光分析時，在以往的分析裝置中，一邊按照每個要測定的螢光色素切換透射該螢光色素所發出的螢光的濾光片一邊進行分析，因此在分析時花費該切換所需的時間量，在分析迅速化方面不能說一定符合了現在的要求。

本發明是根據以上那樣的情況而完成的，其目的是提供一種可以迅速並且可靠地對從具有不同螢光波長的多種螢光色素所發出的螢光進行識別的多色螢光分析裝置。

用於解決課題的手段

本發明涉及：

(1)一種多色螢光分析裝置，其檢測通過激發光的照射而從試樣所包含的具有不同螢光波長的多種螢光色素所發出的螢光，其特徵在於，該多色螢光分析裝置具備：激發用的光源；照射光學部，其具有透射互不相同的多個激發波長帶的光的激發濾光片，並經由所述激發濾光片將從所述光源發出的光作為激發光來照射到所述試樣；螢光聚光部，其具有螢光濾光片，該螢光濾光片透射通過所述激發光的照射而從所述試樣發出的螢光的至少一部分，並透射不包含所述激發波長帶的多個透射波長帶的光；以及二維檢測器，其具有使透射過所述螢光濾光片的光中的預定波長的光透射的多種透射濾光片，並對每一個所述透射濾光片檢測透射過該透射濾光片的光的強度，使用所述二維檢測器同時檢測由所述多種螢光色素中的至少2種螢光色素所發出的光，並根據所述檢測出的光的強度來識別所述螢光色素的種類，

(2)根據(1)所述的多色螢光分析裝置，透射濾光片的種類有4種，

(3)根據(1)所述的多色螢光分析裝置，透射濾光片的種類有2種，

(4)一種多色螢光分析裝置，其檢測通過激發光的照射而從試樣所包含的具有不同螢光波長的多種螢光色素所發出的螢光，其特徵在於，該多色螢光分析裝置具備：激發用的光源；照射光學部，其具有透射互不相同的多個激發波長帶的光並且能夠進行切換的多個激發濾光片，並經由所述激發濾光片將從所述光源發出的光作為激發光來照射到所述試樣；螢光聚光部，其具有螢光濾光片，該螢光濾光片透射通過所述激發光的照射而從所述試樣發出的螢光的至少一部分，並透射不包含所述激發波長帶的多個透射波長帶的光；以及二維檢測器，其具有使透射過所述螢光濾光片的光中的預定波長的光透射的多種透射濾光片，並對每一個所述透射濾光片檢測透射過該透射濾光片的光的強度，使用所述二維檢測器同時檢測由所述多種螢光色素中的至少2種螢光色素所發出的光，並根據所述檢測出的光的強度來識別所述螢光色素的種類，

(5)根據(4)所述的多色螢光分析裝置，透射濾光片的種類有4種，

(6)根據(4)所述的多色螢光分析裝置，透射濾光片的種類有2種，

(7)一種多色螢光分析裝置，其檢測通過激發光的照射而從試樣所包含的具有不同螢光波長的多種螢光色素所發出的螢光，其特徵在於，該多色螢光分析裝置具備：激發用的多個光源；照射光學部，其具有針對每一個所述光源而設置的、透射互不相同的多個激發波長帶的光的激發濾光片，並經由所述激發濾光片將從所述光源發出的光作為激發光來照射到所述試樣；螢光聚光部，其具有螢光濾光片，該螢光濾光片透射通過所述激發光的照射而從所述試樣發出的螢光的至少一部分，並透射不包含所述激發波長帶的多個透射波長帶的光；以及二維檢測器，其具有使透射過所述螢光濾光片的光中的預定波長的光透射的多種透射濾光片，並對每一個所述透射濾光片檢測透射過該透射濾光片的光的強度，點亮所述多個光源中的某個並使用所述二維檢測器來同時檢測由所述多種螢光色素中的至少2種螢光色素所發出的光，並根據所述檢測出的光的強度來識別所述螢光色素的種類，

(8)根據(7)所述的多色螢光分析裝置，透射濾光片的種類有4種，

(9)根據(7)所述的多色螢光分析裝置，透射濾光片的種類有2種，

(10)一種多色螢光分析裝置，其檢測通過激發光的照射而從試樣所包含的具有不同螢光波長的多種螢光色素所發出的螢光，其特徵在於，該多色螢光分析裝置具備：激發用的光源；照射光學部，其具有透射互不相同的多個激發波長帶的光的激發濾光片，並經由所述激發濾光片將從所述光源發出的光作為激發光來照射到所述試樣；螢光聚光部，其具有螢光濾光片，該螢光濾光片透射通過所述激發光的照射而從所述試樣發出的螢光的至少一部分，並透射不包含所述激發波長帶的多個透射波長帶的光；分離部，其將透射過所述螢光濾光片的光按照各波長以預定比率分為兩部分；第1二維檢測器，其具有透射通過所述分離部被分為兩部分的一部分光中的預定波長的光的多種第1透射濾光片，並對每一個所述第1透射濾光片檢測透射過該第1透射濾光片的光的強度；以及第2二維檢測器，其具有透射通過所述分離部被分為兩部分的另一部分光中的預定波長的光的多種第2透射濾光片，並對每一個所述第2透射濾光片檢測透射過該第2透射濾光片的光的強度，使用所述第1二維檢測器以及第2二維檢測器同時檢測由所述多種螢光色素中的至少2種螢光色素所發出的光，並根據所述檢測出的光的強度來識別所述螢光色素的種類，

(11)根據(10)所述的多色螢光分析裝置，第1透射濾光片以及第2透射濾光片的種類分別有4種，

(12)根據(10)所述的多色螢光分析裝置，第1透射濾光片以及第2透射濾光片的種類分別有2種，

(13)根據(10)～(12)的任一項所述的多色螢光分析裝置，分離部具有對透射過螢光濾光片的光的一部分進行透射並反射剩餘部分的二向色鏡，透射過所述二向色鏡的光的透射率在預定的波長範圍中實質上從0％變化到100％，

(14)根據(1)～(13)的任一項所述的多色螢光分析裝置，照射到試樣的激發光由至少2個激發波長帶組成，

(15)根據(1)～(14)的任一項所述的多色螢光分析裝置，照射到試樣的激發光由至少3個激發波長帶組成，以及

(16)根據(1)～(15)的任一項所述的多色螢光分析裝置，該多色螢光分析裝置具備：數據處理部，其根據使用二維檢測器檢測出的光的強度來識別二種以上的螢光色素。

發明效果

本發明可以提供一種可以迅速並且可靠地對從具有不同的螢光波長的多種螢光色素所發出的螢光進行識別的多色螢光分析裝置。因此，該多色螢光分析裝置可以適當地使用於通過螢光色素標識出的dna、rna等的生物相關物質等的螢光分析。

附圖說明

圖1是表示本發明的第1實施方式的多色螢光分析裝置的概要立體圖。

圖2是分解表示圖1的多色螢光分析裝置中的流動池的一個例子的概要立體圖。

圖3是表示圖1的多色螢光分析裝置中的輸送單元的一個例子的概要立體圖。

圖4是表示圖1的多色螢光分析裝置中的送液單元的一個例子的概要立體圖。

圖5是表示圖1的多色螢光分析裝置中的光學單元的一個例子的概要主視圖。

圖6是表示圖1的多色螢光分析裝置中的二維檢測器的透射濾光片的配置的概要圖。

圖7a是表示圖1的多色螢光分析裝置的波長特性的一個例子的概要圖，(a)表示照射到試樣的激發光的波長特性(傳播率)、(b)表示各螢光色素的吸收波譜、(c)表示由激發光的照射所產生的各螢光色素的吸收波譜、(d)表示各螢光色素的螢光波譜。

圖7b是表示圖1的多色螢光分析裝置的波長特性的一個例子的概要圖，(e)表示基於分色鏡以及螢光濾光片的波長特性(透射率)、(f)表示在螢光濾光片中透射的各螢光色素的螢光波譜、(g)表示各種透射濾光片每一個的波長特性(透射率)、(h)表示各螢光色素中的每一個透射濾光片的強度比。

圖8是表示在圖1的多色螢光分析裝置的二維圖像傳感器上成像的dna微球圖像的一個例子的概要圖。

圖9是表示本發明的第2實施方式的多色螢光分析裝置中的波長特性的概要圖，(a)表示透射濾光片的波長特性(透射率)、(b)表示各螢光色素中的每一個透射濾光片的強度比。

圖10是在第2實施方式中表示在二維圖像傳感器上成像的dna微球圖像的一個例子的概要圖。

圖11是表示本發明的第3實施方式的多色螢光分析裝置的光學單元的一個例子的概要主視圖。

圖12是表示圖11的多色螢光分析裝置的波長特性的概要圖，(a1)表示將第1激發濾光片與分色鏡重疊後的波長特性(傳播率)、(a2)表示將第2激發濾光片與分色鏡重疊後的波長特性(傳播率)、(b)表示將分色鏡與螢光濾光片重疊後的波長特性(透射率)、(c1)表示在使用第1激發濾光片時的各螢光色素中的每一個透射濾光片的強度比、(c2)表示在使用第2激發濾光片時的各螢光色素中的每一個透射濾光片的強度比。

圖13是表示本發明的第4實施方式的多色螢光分析裝置中的光學單元的一個例子的概要主視圖。

圖14是表示本發明的第5實施方式的多色螢光分析裝置中的光學單元的一個例子的概要主視圖。

圖15是表示第5實施方式中的波長特性的概要圖，(a)表示將激發濾光片與分色鏡重疊後的波長特性(傳播率)、(b)表示分離部的波長特性(透射率)。

圖16是用於說明使用了圖1的多色螢光分析裝置的鹼基序列決定過程的一個例子的流程圖。

具體實施方式

本發明的多色螢光分析裝置，檢測通過激發光的照射而從試樣所包含的具有不同的螢光波長的多種螢光色素所發出的螢光，該多色螢光分析裝置的特徵在於，其根據由後述的二維檢測器所檢測出的光的強度來識別螢光色素的種類。

以下，根據附圖來說明本發明的多色螢光分析裝置，但是本發明並不僅限定於該附圖中記載的實施方式。此外，在以下所示的各實施方式中，針對以下例子進行說明：試樣是承載作為分析對象的被放大了的克隆dna片段的微粒子(以下稱為「dna微球」)，該多色螢光分析裝置用於上述dna片段的鹼基序列的解讀(識別a(腺嘌呤)、g(鳥嘌呤)、c(胞嘧啶)以及t(胸腺嘧啶)的各鹼基的dna測序儀)。

此外，用於識別上述各鹼基的4種螢光色素(第1～第4螢光色素)只要是可以識別這些鹼基即可，沒有特別的限定。在本說明書的第1～第5實施方式中，使用第1螢光色素(最大吸收波長：490nm、最大螢光波長：515nm)、第2螢光色素(最大吸收波長：555nm、最大螢光波長：565nm)、第3螢光色素(最大吸收波長：595nm、最大螢光波長：615nm)以及第4螢光色素(最大吸收波長：650nm、最大螢光波長：665nm)來作為上述4種螢光色素。

另外，在第2～第5實施方式中，流動池、試劑保管庫、輸送單元、送液單元以及數據處理單元與以下所示的第1實施方式相同，因此省略在第2～第5實施方式中的圖示以及其詳細的說明。

[第1實施方式]

圖1是表示本發明的第1實施方式的多色螢光分析裝置的概要立體圖。多色螢光分析裝置11如圖1所示，大致具備流動池100、試劑保管庫200、輸送單元300、送液單元400、光學單元501和數據處理單元600。

流動池100如圖2所示，由上部基板101、下部基板103、夾在上部基板101與下部基板103之間的內層部102組成。

上部基板101是在其內側板面上實施了用於吸附dna微球的表面處理的光透射性基板。在這裡，光透射性基板意味著具有可以透射激發光以及dna微球所發出的螢光等的光的性質的基板。一般地，被放入dna、rna等生物相關物質中的螢光色素所發出的螢光大多為可視光，因此當該多色螢光分析裝置11用於生物相關物質時，優選的是上部基板101對於可視光具有光透射性。作為上部基板101的材質，例如列舉有玻璃、丙烯樹脂、聚環丙烯樹脂等。另外，在上部基板101中設置了注入試劑等的注入口104和排出使用後的試劑等的排出口105。

試劑保管庫200是保管在dna測序儀中使用的試劑等的單元。在試劑保管庫200中通常具備多個保管容器201，並在各保管容器201的每一個中保管試劑等。

輸送單元300是輸送流動池100的單元。輸送單元300如圖3所示，具備在x軸方向可動的線性致動器301、與上述線性致動器301連接並在與上述x軸方向正交的y軸方向可動的線性致動器302以及與上述線性致動器301連結的流動池固定臺303。在流動池固定臺303中具備固定流動池100的單元(未圖示)。另外，在流動池固定臺303中具備用於對流動池100進行溫度調整的溫度調整單元(未圖示)。

送液單元400是將試劑等提供到流動池100內的單元。送液單元400如圖4所示，具備在水平面內的x軸方向可動的線性致動器401、與線性致動器401連接並在與上述x軸方向正交的水平面內的y軸方向可動的線性致動器402、與線性致動器401連結並在垂直方向(z軸方向)可動的線性致動器403、分注噴嘴405以及連結分注噴嘴405與線性致動器403的滑動器404。

分注噴嘴405是管狀的部件。該分注噴嘴405經由配管連接到注射器(未圖示)。通過驅動上述線性致動器401、402、403可以3維地移動分注噴嘴405，由此可以操作上述注射器的柱塞(未圖示)從保管容器201吸入試劑，並且經由注入口104(參照圖2)將試劑注入(提供)到流動池100內。

光學單元501是向包含螢光色素的試樣照射激發光，並對獲得的光進行分光來檢測螢光的單元。光學單元501如圖5所示，具備光源510、照射光學部520、螢光聚光部530以及二維檢測部550。

光源510是激發用的光源。該光源510發出用於生成激發光的光。作為光源510，優選是白色光源。由此在整個可視光區域能夠可靠地獲得具有期望的波長帶的激發光。作為光源510，優選是氙短弧燈以及白色led燈。由於這些光源在可視光區域中具有良好的連續波譜，因此適合作為用於產生多個激發波長帶的光的光源。

照射光學部520具有透射互不相同的多個激發波長帶的光的激發濾光片，並經由激發濾光片將從光源所發出的光作為激發光來照射到試樣s。照射光學部520具備準直透鏡523、激發濾光片524、分色鏡540以及物鏡527。

準直透鏡523是將從光源510所發出的光調整為準直光(平行光)的透鏡。激發濾光片524是透射從光源510所發出的光中互不相同的多個激發波長帶的光的濾光片。作為激發濾光片524，從可靠地嚴加區別透射波長區域的觀點出發，優選在光透射性玻璃上形成電介質多層膜。分色鏡540是反射激發光並透射螢光的鏡片。分色鏡540由玻璃等的光透射性基板和波長選擇透射膜形成，其中波長選擇透射膜形成在該基板上，由反射預定的波長區域的光並透射其他的波長區域的光的電介質多層膜構成。物鏡527是使透射了激發濾光片524的激發光在試樣s的測定部位進行聚光的透鏡。

此外，圖7a(a)示出了使用激發濾光片524以及分色鏡540來照射到試樣s的激發光的波長特性(傳播率)。

螢光聚光部530具有螢光濾光片，其透射通過激發光的照射而從試樣發出的螢光的至少一部分，並透射不包含所述激發波長帶的多個透射波長帶的光。該螢光聚光部530具備物鏡527和螢光濾光片531。

物鏡527是使從試樣s發出的光進行聚光的透鏡。此外，通過使用上述分色鏡540可以共用照射光學部520中的物鏡527以及螢光聚光部530中的物鏡527，因此在本實施方式中在照射光學部520和螢光聚光部530中可以使用同一個物鏡。

螢光濾光片531是對從試樣s發出的螢光的至少一部分進行透射並且對不包含激發波長帶的多個透射波長帶的光進行透射的濾光片。也就是說，螢光濾光片531的透射波長帶被設定為不透射激發光的反射光那樣的波長帶。從試樣s所發出的光包含通過上述激發光的照射從試樣s所包含的螢光色素所發出的螢光和通過試樣s反射的激發光的反射光。因此，以去除激發光的反射光為目的而使用螢光濾光片531，以使螢光色素所發出的微弱的螢光不被具有比該螢光的強度大得多的強度的激發光的反射光所埋沒，來可靠地檢測上述螢光。作為螢光濾光片531，從可靠地嚴加區別透射波長區域的觀點出發，優選的是在光透射性玻璃上形成電介質多層膜。通過螢光濾光片531的透射，去除了激發光等光後的光被發送至後述的二維檢測部550。

二維檢測部550檢測從試樣s所發出的螢光。二維檢測部550具備鏡筒透鏡552和二維檢測器554。

鏡筒透鏡552是使透射過螢光濾光片531的光進行聚光，並將該聚光後的光成像於後述的二維檢測器554的二維圖像傳感器(未圖示)上的透鏡。

二維檢測器554具有使透射過螢光濾光片的光中的預定波長的光透射的多種透射濾光片，並對每一個透射濾光片檢測透射過該透射濾光片的光的強度。該二維檢測器554是將透射過螢光濾光片531的光分為互不相同的多個波長帶來進行檢測的單片式照相機。二維檢測器554具備多種透射濾光片556和二維圖像傳感器。

各透射濾光片556是使透射過螢光濾光片531的光中的預定波長的光透射的濾光片。在本實施方式中，透射濾光片556的種類由透射波長帶不同的4種構成。上述4種透射濾光片如圖6所示，是r濾光片(主要透射紅色區域的光的濾光片)556a、g濾光片(主要透射綠色區域的光的濾光片)556b、b濾光片(主要透射藍色區域的光的濾光片)556c以及ir濾光片(主要透射近紅外區域的光的濾光片)556d。這4種透射濾光片是以r濾光片556a、g濾光片556b、b濾光片556c以及ir濾光片556d逐一排列的塊為一個單位，並在平面方向上重複配置該單位。此外，從提高空間解析度的觀點出發，各透射濾光片556，以對應於後述的二維圖像傳感器的各檢測元件(測定入射的光的強度的元件，未圖示)的方式，對於一個檢測元件設置一個。二維圖像傳感器是對每一個透射濾光片556檢測透射過該透射濾光片556的預定波長的光的強度的傳感器。在二維圖像傳感器中以格子狀地配置大量檢測元件，並對每一個檢測元件檢測光的強度。作為二維圖像傳感器，例如可以採用單色ccd、cmos傳感器等。

在像這樣的光學單元501中，使用準直透鏡523對從光源510所發出的光進行聚光，並將聚光後的光中的特定波長帶的光作為激發光來對激發濾光片524進行透射，再使用分色鏡540對透射過激發濾光片524的激發光中的特定波長帶的光進行反射，並由物鏡527在捕獲dna微球(試樣s)的區域中進行聚光。在這裡，透射過激發濾光片524並且使用分色鏡540進行反射的波長帶包含為了激發dna片段所包含的全部的多種螢光色素所需的多個波長帶。

從通過對試樣s照射激發光被激發的多種螢光色素所發出的螢光，使用物鏡527被聚光，並穿過透射特定的波長帶的分色鏡540和透射預定的波長帶的光的螢光濾光片531，通過鏡筒透鏡552成像於二維檢測器554的二維圖像傳感器上。使用各種透射濾光片556對成像的螢光進行分光，通過對每一個透射濾光片556所設置的檢測元件來測定分光後的光的強度。此外，在分色鏡540和螢光濾光片531中進行透射的波長帶包含從dna片段所包含的多種螢光色素髮出的螢光的全部波長帶或者其中的一部分。

數據處理單元600是具有數據處理部(未圖示)的單元，數據處理部根據使用二維檢測器554檢測出的光的強度識別二種以上的螢光色素。該數據處理單元600將檢測出的螢光作為二維圖像數據進行取得，並且解析該二維圖像數據來識別各試樣s所包含的螢光色素。作為數據處理單元600，例如可以採用可以解析上述二維圖像數據的個人計算機等。

如此，通過該多色螢光分析裝置11具備上述數據處理部，可以解析檢測出的螢光的二維圖像數據，可以識別試樣s中所包含的螢光色素。

接下來，在第1實施方式中，對識別試樣s中所包含的螢光色素的方法進行說明。此外，在以下的說明中，為了方便，設光學元件以外的特性(例如，光源510的波譜、二維檢測器554中的各檢測元件的分光靈敏度等的特性)在作為對象的波長範圍中是一樣的。

從光源510所發出的白色光經由準直透鏡523、激發濾光片524、分色鏡540以及物鏡527，作為激發光照射到試樣s(dna微球)。該照射的激發光的波長特性(傳播率)是將激發濾光片524的波長特性(透射率)與分色鏡540的波長特性(反射率)相乘後得出的，例如是圖7a(a)所示那樣。

在這裡，作為檢測對象的4種螢光色素(第1～第4螢光色素)具有的標準化吸收波譜為圖7a(b)所示的特性。因此，針對上述4種螢光色素的每一個，從上述照射光學部520向試樣s照射包含螢光色素的吸收波譜的至少一部分的激發光，以便可以激發全部的螢光色素。

通過激發光的照射，試樣s中所包含的各螢光色素所呈現的標準化吸收波譜為圖7a(c)所示的特性。該圖7a(c)所示的吸收波譜重疊了圖7a(a)所示的傳播率與圖7a(b)所示的吸收波譜。此外，根據使用波長對圖7a(c)所示的吸收波譜的曲線進行積分而得的值(用曲線包圍的面積)，可以預估各螢光色素所吸收的激發光的能量的程度。

在這裡，上述4種螢光色素所發出的標準化螢光波譜為圖7a(d)所示的特性。

從試樣s所發出的光經由物鏡527、分色鏡540、螢光濾光片531以及鏡筒透鏡552入射至二維檢測器554。在從該試樣s所發出的光中，除了螢光色素所發出的螢光，還包含激發光通過試樣s等所反射出的反射光(以下也簡單地稱為「反射光」)。該反射光如上所述，與螢光相比強度非常大，因此要在入射至二維檢測部550之前去除，以便不會妨礙通過二維檢測部550進行的螢光的檢測。

在這裡，圖7b(e)表示重疊了分色鏡540的波長特性(透射率)與螢光濾光片531的波長特性(透射率)的波長特性(透射率)。螢光聚光部530的透射波長特性是與圖7a(a)所示的照射光學部520的激發光的波長特性相反的特性、即被設計為在照射光學部520中的激發光的傳播率為大約100％的波長帶中該螢光聚光部530中的透射率為大約0％。由此，可以從試樣s所發出的光中去除反射光，並可以防止反射光被二維檢測部550取入來可靠地識別螢光。

圖7b(f)表示重疊了圖7a(d)所示的螢光波譜與圖7b(e)所示的波長特性(透射率)的圖。該圖7b(f)所示的標準化螢光波譜實際上示出了在穿過螢光聚光部530之後到達二維檢測部550的每一個螢光色素的螢光波譜。如該圖7b(f)所示，在到達二維檢測部550的光中，幾乎不包含圖7a(c)所示的激發光。

穿過螢光聚光部530的光被取入二維檢測部550，在透射濾光片556中被分光後通過二維圖像傳感器來測定分光後的強度。圖7b(g)示出了4種透射濾光片(r濾光片556a、g濾光片556b、b濾光片556c、ir濾光片556d)的每一個的透射特性。

在本實施方式中，由於設置了上述4種透射濾光片556，因此通過上述4種透射濾光片556對從各螢光色素髮出的4種螢光分別進行分光，並通過檢測元件同時測定該分光後的光的各強度。此外，在上述數據處理部中，根據上述所測定出的螢光同時識別4種螢光色素。如此，透射濾光片556的種類為4種，因此根據使用這4種透射濾光片556檢測出的光的強度的比率，可以可靠地識別螢光色素的種類。

在這裡，使用各檢測元件檢測的各螢光色素所發出的螢光的強度比率被預估為圖7b(h)所示的表中的值。該值是分別重疊圖7b(f)所示的螢光波譜與圖7b(g)所示的各種透射濾光片的每一個的波長特性(透射率)，並根據所獲得的波譜的積分值計算出的。此外，來自第1以及第2螢光色素的光都是在g濾光片556b中檢測出的成分最強，但是由於在b濾光片556c與r濾光片556a中的成分的強度比率不同，因此可以進行這些螢光色素的判別。另外，來自第3以及第4螢光色素的光都是在r濾光片556a中檢測出的成分最強，但是由於在ir濾光片556d中的強度比率不同，因此可以進行這些螢光色素的判別。

此外，在這裡，為了說明本發明的內容，針對使用了特定的螢光色素等的一個例子進行了說明，但是通過優化所使用的螢光色素、光學元件類的特性，也可以獲得更合適的條件。例如，dna微球(試樣s)所發出的螢光具有空間上的強度分布。因此，優選的是放大成像倍率(相對於檢測元件的大小，放大二維圖像傳感器上的dna微球圖像的大小)，以便將其影響減輕至可以忽視的程度。

圖8是表示在圖1的多色螢光分析裝置11的二維圖像傳感器上所成像的dna微球圖像i1的一個例子的概要圖。該圖示出了光學單元501的成像倍率為約20倍、二維圖像傳感器的檢測元件的尺寸為3μm、dna微球的投影尺寸為直徑0.9μm的例子(其中，在該圖中不考慮光學系統的像差、成像能力的影響等)。在該例的情況下，在二維圖像傳感器上的6×6像素的區域中顯示出dna微球圖像i1。在螢光的測定時，提取逐一包含該區域內的幾乎中央的r、g、b、ir的各透射濾光片556的區域a。如果此時區域a中的空間上的螢光強度分布相對於上述強度比率充分小的話，則可以根據使用區域a內的各檢測元件所獲得的強度比率來識別螢光色素。在該例子中，如圖7b(h)所示，由於在螢光色素間的每一個檢測元件的強度比率的差為幾十％左右，因此只要空間上的螢光強度分布在10％以內，就可以識別各螢光色素。

如此，該多色螢光分析裝置11具備：照射光學部520，其具有透射互不相同的多個激發波長帶的光的激發濾光片524；螢光聚光部530，其具有透射不包含激發波長帶的多個透射波長帶的光的螢光濾光片531；以及二維檢測器554，其具有透射預定波長的光的多種透射濾光片，並對每一個透射濾光片檢測透射過該透射濾光片的光的強度，該多色螢光分析裝置11使用二維檢測器554來同時檢測從多種螢光色素中的至少2種螢光色素所發出的光，因此可以迅速並且可靠地對從具有不同的螢光波長的多種螢光色素所發出的螢光進行識別。因此，該多色螢光分析裝置11可以適用於使用螢光色素所標識出的dna、rna等生物相關物質等的螢光分析。以下，針對使用了該多色螢光分析裝置11的dna鹼基序列的分析方法進行說明。

使用了該多色螢光分析裝置11的dna鹼基序列的分析方法並沒有特別地限定，可以將例如利用了階段性連接法的dna序列的分析方法(sequencingbyoligonucleotideligationanddetection)列舉為一個例子。階段性連接法是指使與流動池內的dna微球進行了耦合的單鏈dna按順序地與在遺傳模板中使用螢光色素來螢光標識出的探針進行耦合，並且每2個鹼基地決定序列的方法。

作為由連接酶所進行的酶反應，包含與dna片段的靶序列相對應的螢光色素的低聚核苷酸進行耦合，引起鏈式反應。上述鏈式反應結束後，對螢光色素照射激發光，通過光學單元501進行螢光的檢測。之後，切斷螢光色素，再次進行鏈式反應，並檢測對應下一個序列的螢光。

如上，通過重複鏈式反應、螢光的檢測以及螢光色素的切斷，來一個個地決定對應於各螢光色素的鹼基，並最終解讀為dna片段的鹼基序列。通過該方法，在1個周期中可以解讀幾十～幾百bp的鹼基，運行1次可以解析幾十gb的數據。在像這樣的階段性連接法中，通過對使用螢光色素進行了螢光標識的低聚核苷酸重複雜化，可以對流動池100中的多個dna片段進行平行地測序。

接下來，針對上述鏈式反應等中的鹼基序列決定過程的1個周期進行詳細描述。圖16是用於說明使用了圖1的多色螢光分析裝置11的鹼基序列決定過程的一個例子的流程圖。在決定鹼基序列時，首先將送液單元400的分注噴嘴405插入設置在試劑保管庫200中的保管容器201中，並吸入保管容器201中的試劑(步驟s1)。接著，驅動送液單元400以及輸送單元300，在使分注噴嘴405與流動池100的注入口104連通著的狀態下將試劑注入流動池100內(步驟s2)。

在這裡，在需要進行溫度調節時，一邊使用裝入輸送單元300的流動池固定臺303中的溫度調節裝置(未圖示)進行溫度調節一邊進行反應，並進行等待直到反應結束(步驟s3)。另外，在需要多個反應工序時，在重複該反應工序後，使流動池100內的dna片段與螢光色素進行耦合，並設為可以進行螢光檢測的狀態。

接著，驅動輸送單元300使流動池固定臺303上的流動池100移動到光學單元501的物鏡527的正下方，並進行流動池100內的試樣s的螢光檢測(步驟s4)。此外，在上述螢光檢測時，在固定了dna片段的上部基板101的面積較大的情況下，針對通過光學單元501可以檢測的區域，一邊驅動輸送單元300來一點點地移動流動池固定臺303，一邊進行2維掃描來按順序地對上部基板101上的預定的範圍的試樣s進行螢光檢測。接著，將在光學單元501中檢測出的螢光的二維圖像數據作為電信號發送至數據處理單元600，並在數據處理單元600中進行解析來識別螢光色素，由此來決定與識別出的螢光色素相對應的鹼基。

如此在進行了1個周期量的螢光檢測後，執行下一個周期，通過進行重複，一個個地決定對應於螢光色素的鹼基，並解讀dna片段的鹼基序列。

[第2實施方式]

第2實施方式所涉及的多色螢光分析裝置12大致具備流動池100、試劑保管庫200、輸送單元300、送液單元400、光學單元502以及數據處理單元600。該多色螢光分析裝置12的光學單元502中的透射濾光片557的種類與第1實施方式不同。此外，針對光學單元502，對於與上述實施方式相同的部分賦予相同的符號來省略其詳細的說明。

圖9(a)是表示本發明的第2實施方式的多色螢光分析裝置中的透射濾光片的波長特性(透射率)的概要圖。在本實施方式中，如圖9(a)所示，透射濾光片557的種類由2種(一種是g』濾光片，另一種是r』濾光片(參照圖10))構成，g』濾光片在大致450nm～650nm的範圍中具有透射區域，r』濾光片在大致575nm～750nm的範圍中具有透射區域。

在這裡，使用與上述g』濾光片以及r』濾光片相對應的各檢測元件來檢測的各螢光色素所發出的螢光的強度比率是分別將圖7a(d)的螢光波譜與圖9(a)所示的各種透射濾光片557的每一個的透射率進行重疊，使用獲得的波譜的積分值而計算出的。圖9(b)表示其結果。如該圖9(b)所示，對於每一個螢光色素，使用上述g』濾光片和r』濾光片所檢測的信號強度的比率是不同的，因此根據該比率可以進行螢光色素的判別。

圖10是表示在第2實施方式中在二維圖像傳感器上成像的dna微球圖像i2的一個例子的概要圖。該圖示出了光學單元502的成像倍率為約13.3倍、二維圖像傳感器的檢測元件的尺寸為3微米、dna微球的投影尺寸為直徑0.9μm的例子(其中，在該圖中不考慮光學系統的像差、成像能力的影響等)。這種情況下，例如，可以如以下(1)～(3)的過程所示那樣識別螢光色素。(1)在二維圖像傳感器中，從顯示出dna微球的區域中提取強度最強的位置的濾光片(g』濾光片或r』濾光片)。例如，在圖10中，提取g』濾光片557a。

(2)通過與在上述(1)中提取出的濾光片相鄰的其他種類的檢測元件(圖10中的r』濾光片557b、557c、557d以及557e)的強度的平均或特殊的近似計算方法，來預估(1)的位置的上述其他種類的檢測元件(r』濾光片)的強度。

(3)對在上述(2)中所獲得的其他種類的檢測元件(r』濾光片)的強度與在上述(1)中所提取出的濾光片(g』濾光片557a)的比率進行計算，將獲得的比率與圖9(b)中記載的g』濾光片與r』濾光片之間的比率進行對照來識別與dna微球耦合的螢光色素。

如此，透射濾光片557的種類為2種，因此與上述透射濾光片556的種類為4種的情況相比，可以減少分配給一個dna微球的檢測元件的數量。其結果，該多色螢光分析裝置12可以縮小成像倍率來增加一次可以檢測的區域，並可以增加可測定的試樣s的數量來提高鹼基序列解讀的吞吐量。

[第3實施方式]

第3實施方式所涉及的多色螢光分析裝置13大致具備流動池100、試劑保管庫200、輸送單元300、送液單元400、光學單元503以及數據處理單元600。該多色螢光分析裝置13的光學單元503中的激發濾光片525以及透射濾光片557與第1實施方式不同。此外，針對光學單元503，對於與上述實施方式相同的部分賦予相同的符號來省略其詳細的說明。

本實施方式的多色螢光分析裝置13的光學單元503具備照射光學部，其具有透射互不相同的多個激發波長帶的光並且可以進行切換的多個激發濾光片，並經由激發濾光片將從光源所發出的光作為激發光來照射到試樣。

圖11是表示本發明的第3實施方式的多色螢光分析裝置的光學單元的一個例子的概要主視圖。多色螢光分析裝置13的激發濾光片525如圖11所示，由第1激發濾光片525a和第2激發濾光片525b構成。

另外，在本實施方式中，分色鏡540具有以下特性：對第1激發濾光片525a以及第2激發濾光片525b所透射的波長帶的全部或一部分進行反射，並且對螢光濾光片531所透射的波長帶的全部或一部分進行透射。

此外，圖12(a1)示出了使用第1激發濾光片525a以及分色鏡540來照射到試樣s的激發光的波長特性(傳播率)，圖12(a2)示出了使用第2激發濾光片525b以及分色鏡540來照射到試樣s的激發光的波長特性(傳播率)。另外，圖12(b)示出了將分色鏡540與螢光濾光片531進行重疊而得的波長特性(透射率)。

接下來，在第3實施方式中，針對識別試樣s中所包含的螢光色素的方法進行說明。此外，在以下的說明中，設分色鏡540以100％的效率對第1以及第2激發濾光片525a、525b所透射的波長帶的光進行反射，並且以100％的概率對螢光濾光片531所透射的波長帶的光進行透射。另外，為了方便，設光學元件以外的特性(例如，光源510的波譜、二維檢測器554中的各檢測元件的分光靈敏度等特性)在作為對象的波長範圍中是一樣的。

首先，如果以將第1激發濾光片525a插入光軸的狀態進行螢光測定的話，則主要激發第1螢光色素和第3螢光色素，在二維檢測器554中，通過圖12(c1)所示的信號比率(強度比率)來檢測來自各個螢光色素的螢光。此外，第2螢光色素以及第4螢光色素也發出一些螢光，但是由於強度弱，因此通過基於由二維圖像傳感器(照相機)所檢測的信號強度的過濾功能，被排除在解析的對象外。

接著，如果以將第2激發濾光片525b插入光軸的狀態進行螢光測定的話，則主要激發第2螢光色素和第4螢光色素，在二維檢測器554中，通過圖12(c2)所示的信號比率(強度比率)來檢測來自各個螢光色素的螢光。此外，第1螢光色素以及第3螢光色素也發出一些螢光，但是由於強度弱，因此通過基於由二維圖像傳感器(照相機)所檢測的信號強度的過濾功能，被排除在解析的對象外。

此時，根據使用第1激發濾光片525a所獲得的g』濾光片以及r』濾光片中的強度比率來判別第1螢光色素和第3螢光色素，並同時識別該第1以及第3螢光色素。另一方面，根據使用第2激發濾光片525b所獲得的g』濾光片以及r』濾光片(參照圖10)中的強度比率來判別第2螢光色素和第4螢光色素，並同時識別該第2以及第4螢光色素。如上所述，可以識別各試樣s中的第1～第4螢光色素，可以進行dna片段的鹼基序列的解讀。

如此，由於照射光學部521具有透射互不相同的多個激發波長帶的光並且可以切換的多個激發濾光片525，因此可以減少使用一個激發濾光片(分別是第1激發濾光片525a以及第2激發濾光片525b)同時檢測的螢光色素的數量，相應地可以提高顏色分離性能，並可以更加可靠地識別螢光色素。

[第4實施方式]

第4實施方式所涉及的多色螢光分析裝置14大致具備流動池100、試劑保管庫200、輸送單元300、送液單元400、光學單元504以及數據處理單元600。該多色螢光分析裝置14的光學單元504中的光源以及激發濾光片與第1實施方式不同。此外，針對光學單元504，對於與上述實施方式相同的部分賦予相同的符號來省略其詳細的說明。

本實施方式的多色螢光分析裝置14的光學單元504具備：激發用的多個光源；以及照射光學部，其具有針對每一個光源設置的、透射互不相同的多個激發波長帶的光的激發濾光片，並經由激發濾光片將從光源發出的光作為激發光來照射到試樣。

圖13是表示本發明的第4實施方式的多色螢光分析裝置14中的光學單元的一個例子的概要主視圖。如圖13所示，多色螢光分析裝置14的照射光學部522具備第1光源510a、第1準直透鏡523a、第1激發濾光片526a、第2光源510b、第2準直透鏡523b、第2激發濾光片526b以及激發用分色鏡528。

第1以及第2光源510a、510b分別是與第1實施方式的光源510相同的結構。另外，第1以及第2準直透鏡523a、523b分別是與第1實施方式的準直透鏡523相同的結構。

第1激發濾光片526a是對激發第1螢光色素以及第3螢光色素的波長帶的光進行透射的濾光片。第2激發濾光片526b是對激發第2螢光色素以及第4螢光色素的波長帶的光進行透射的濾光片。該第1以及第2激發濾光片526a、526b針對波長具有互不相同的波長特性。

激發用分色鏡528是對透射過第1激發濾光片526a的激發光進行透射並且對透射過第2激發濾光片526b的激發光進行反射的鏡片。通過該激發用分色鏡528，可以使從第1光源510a發出的光的光軸與從第2光源510b發出的光的光軸一致。

此外，使用第1光源510a以及第2光源510b來照射到試樣s的激發光的波長特性(傳播率)分別與圖12(a1)以及圖12(a2)相同。

此外，本實施方式的多色螢光分析裝置14交替切換地點亮第1光源510a和第2光源510b，通過點亮第1光源510a來同時識別第1螢光色素以及第3螢光色素，並且通過點亮第2光源510b來同時識別第2螢光色素以及第4螢光色素(分開進行第1以及第3螢光色素的識別與第2以及第4螢光色素的識別)。

如此，照射光學部522具有激發用的多個光源510a、510b和針對每一個光源而設置的、透射互不相同的多個激發波長帶的光的激發濾光片526a、526b，通過具備該照射光學部522，可以與上述第3實施方式同樣地通過提高顏色分離性能來更可靠地識別螢光色素，而且由於激發濾光片526a、526b沒有機械性的切換，因此可以避免由於機械性的動作導致產生裝置的故障，並能夠期待延長該裝置的壽命。

[第5實施方式]

第5實施方式所涉及的多色螢光分析裝置15大致具備流動池100、試劑保管庫200、輸送單元300、送液單元400、光學單元505以及數據處理單元600。對於該多色螢光分析裝置15，光學單元505中的分離部以及二維檢測部與第1實施方式不同。此外，針對光學單元505，對於與上述實施方式相同的部分賦予相同的符號來省略其詳細的說明。

圖14是表示第5實施方式的多色螢光分析裝置15中的光學單元的一個例子的概要主視圖。如圖14所示，該多色螢光分析裝置15的光學單元505具備分離部560，其將透射過螢光濾光片531的光按照各波長以預定比率分為兩部分。具體而言，分離部560具有二向色鏡，其對透射過螢光濾光片531的光的一部分進行透射並且反射剩餘部分。在本實施方式中，上述二向色鏡由分離用分色鏡561構成。該分離用分色鏡561具有其透射率(反射率)在預定的波長範圍中實際上從0％變化到100％的特性。

圖15(a)示出了使用激發濾光片524以及分色鏡540來照射到試樣s的激發光的波長特性(傳播率)。另外，圖15(b)是表示分離部560的波長特性(透射率)的概要圖。分離用分色鏡561的波長特性例如相對於在圖15(b)中由實線t1所示的將分色鏡540與螢光濾光片531重疊而得的波長特性(透射率)，具有該圖中由虛線t2所示的波長特性。

此外，由圖15(b)的虛線t2所示的波長特性是分離用分色鏡561的透射率，透射率0％意味著反射率100％，透射率100％意味著反射率0％。也就是說，透射率與反射率具有如下式(1)所表示的關係。

反射率(％)＝100-透射率(％)(1)

由此，在使用了具有圖15(b)所示的波長特性的分離用分色鏡561時，第1以及第3螢光色素所發出的螢光主要在分離用分色鏡561進行透射而被第1二維檢測部551a檢測，並且第2以及第4螢光色素所發出的螢光主要由分離用分色鏡561進行反射而被第2二維檢測部551b檢測。

如此，分離部560是上述二向色鏡，在該二向色鏡中透射的光的透射率在預定的波長範圍中實際上從0％變化到100％，由此可以平均分配透射過螢光濾光片531的光，並更可靠地識別螢光色素。

另外，如圖14所示，該多色螢光分析裝置15的光學單元505具備第1二維檢測部551a和第2二維檢測部551b，第1二維檢測部551a具有第1鏡筒透鏡553a和第1二維檢測器559a，第2二維檢測部551b具有第2鏡筒透鏡553b和第2二維檢測器559b。

第1鏡筒透鏡553a使通過分離用分色鏡561透射後的光聚光，並使該光在後述的第1二維檢測器559a的二維圖像傳感器上成像。第1二維檢測器559a具有使在分離部560被分為兩部分的其中一部分光中的預定波長的光進行透射的多種第1透射濾光片，並對每一個第1透射濾光片檢測預定波長的光的強度。由此，根據第1以及第3螢光色素所發出的螢光同時識別這些螢光色素。此外，第1二維檢測器559a與上述第2實施方式的設備相同，因此省略其詳細的說明。

第2鏡筒透鏡553b使在分離用分色鏡561中反射後的光聚光，並使該光在後述的第2二維檢測器559b的二維圖像傳感器上成像。第2二維檢測器559b具有使在分離部560中被分為兩部分的另一部分光中的預定波長的光進行透射的多種第2透射濾光片，並對每一個第2透射濾光片檢測預定波長的光的強度。由此，根據第2以及第4螢光色素所發出的螢光同時識別這些螢光色素。此外，第2二維檢測器559b與上述第2實施方式的設備相同，因此省略其詳細的說明。

如此，由於具備將透射過螢光濾光片531的光按照各波長以預定比率分為兩部分的分離部560，可以減少每一臺二維檢測器所檢測的螢光色素的種類的數量，由此可以提高顏色分離性能，並能夠更可靠地識別螢光色素。

此外，本發明並不限定於上述實施方式的結構，預想包含根據請求專利保護的範圍所示的、與請求專利保護的範圍相同的意思以及範圍內的全部變更。

例如，在上述第1～第5實施方式中，針對具備流動池100、試劑保管庫200、輸送單元300、送液單元400、光學單元501～505以及數據處理單元600的多色螢光分析裝置11～15進行了說明，但是該多色螢光分析裝置11～15隻要能夠檢測通過激發光的照射而從試樣所包含的具有不同的螢光波長的多種螢光色素所發出的螢光，則不特別限定。例如，即使不具備流動池100、試劑保管庫200、輸送單元300、送液單元400等，也在本發明所預想的範圍內。

另外，在上述實施方式中，針對照射到試樣s的激發光的激發波長帶的數量為特定數量的多色螢光分析裝置11～15進行了說明，但是只要不影響本發明的效果，也可以是照射上述特定數量以外的數量的激發波長帶的激發光的多色螢光分析裝置。作為照射到試樣s的激發光，優選至少由2個激發波長帶組成，更優選的是至少由3個激發波長帶組成。由此，可以同時檢測多色螢光。

另外，在上述實施方式中，針對透射濾光片的種類的數量為特定數量(例如，在第1實施方式中具備4種透射濾光片，在第2實施方式中具備2種透射濾光片)的多色螢光分析裝置11～15進行了說明，但是只要不影響本發明的效果，也可以是具備上述特定數量以外的種類的數量的透射濾光片的多色螢光分析裝置。由此，可以適當地選擇螢光色素的識別中的可靠性與激發光每一次照射的可測定試樣數(吞吐量)之間的平衡。

產業上的可利用性

本發明可以提供一種可以迅速並且可靠地對從具有不同的螢光波長的多種螢光色素所發出的螢光進行識別的多色螢光分析裝置。因此，該多色螢光分析裝置能夠適用於使用螢光色素所標識出的dna、rna等生物相關物質等的螢光分析。

符號說明

s試樣；

11～15多色螢光分析裝置；

100流動池；

200試劑保管庫；

300輸送單元；

400送液單元；

501～505光學單元；

600數據處理單元；

510光源；

520～522照射光學部；

524激發濾光片；

526a第1激發濾光片；

526b第2激發濾光片；

530螢光聚光部；

531螢光濾光片；

540分色鏡；

550二維檢測部；

554、555二維檢測器；

556、557透射濾光片；

559a第1二維檢測器；

559b第2二維檢測器；

560分離部。