用於血癌分析與臨床處理的細胞抗原及靶信號轉導蛋白的複合分布的製作方法

2023-09-16 09:15:55 4

專利名稱：用於血癌分析與臨床處理的細胞抗原及靶信號轉導蛋白的複合分布的製作方法
用於血癌分析與臨床處理的細胞抗原及靶信號轉導蛋白的複合分布
背景技術：
白血病是骨髓和血液中的一種惡性癌症。白血病表現為異常白細胞的過度增生，充滿骨 髓和/或外周血。這導致正常血細胞的生長減少和功能減弱。慢性淋巴細胞性白血病(CLL) 是人類罹患的四種主要類型白血病中的一種，其餘為急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓 性白血病(CML)和急性淋巴細胞性白血病(ALL)。
白血病患者經歷不同的臨床進程。白血病的治療很複雜並且取決於白血病類型。在白血 病患者中發現緩解期存在大量的臨床可變性，哪怕是在那些接受了一個療程治療的患者身上 也會發生。有的患者在沒有接受確切治療的情況下能夠存活很長時間，而有的患者接受攻擊 性治療後仍然迅速死亡。那些對治療有抗性的患者只能存活很短時間，不管抗性何時發生。 雖然目前已有各種的分期系統用於對付這種臨床多樣性，但是它們並不能精確地預測一個早 期或中期的患者是否經歷疾病的惰性期還是攻擊期。確切的說，因為這些系統考慮了疾病的 總體表現，包括血液水平和骨髓中淋巴細胞計數、淋巴結的大小及分布、脾的大小、貧血度 數以及患者血液中血小板數，它們只能通過當疾病發展到更進一步的狀態時採用有限的預測 結果來鑑別病人。
慢性淋巴細胞白血病(CLL)是美國和歐洲最常見的白血病，2004年美國新診斷的CLL 患者超過1萬人，其中大多數患者為40歲以上的男性。CLL表現為小淋巴細胞的克隆性增生， 大部分顯明與B-淋巴細胞亞型一致的表面標誌物CD5和CD19。在大多數病例中，疾病呈現 一種惰性狀態，患者在不接受確切治療的情況下仍能存活較長時間。此外，性別與CLL相關， 因為患者中男女比例約為2:1。在少數病例中，儘管接受攻擊性治療，但疾病仍呈現迅速發展 的情況頻繁發生在年輕患者身上。在大多數情況下，疾病呈現緩慢發展的狀態，並且在若干 年內都不會引起患者不舒適或者疼痛的感覺。
CLL表現為大量的癌性成熟淋巴細胞和變大的淋巴結。癌細胞淹沒了骨髓和淋巴結中的 正常細胞。患者發生貧血，而且血液中正常白細胞和血小板的數目減少，但是由於異常白細 胞的增殖導致血液總白細胞數增加。抗體的水平和活性也會下降。因此，患者的免疫系統受 損。CLL患者經常死於受損免疫系統帶來的後果如感染等，而不是CLL本身。
CLL的臨床階段的特徵有Rai分期系統(O-IV期)和Binet分期系統(A-C期)，其仍然 是CLL患者強大的預測者。這兩個系統都是基於相關淋巴組織的數量和貧血和/或血小板減
少的表現。總而言之，晚期患者具有明顯的不良預後和短期存活。Rai分期中IV期患者或者 Binet分期中C期患者平均存活時間為1.5到2年。
目前，仍沒有一個已知的針對B-CLL的治療，其能明顯延長患者的存活期望。因此，只 對歸為B-CLL高級階段的患者考慮進行攻擊性治療，包括化療、放療、手術、免疫治療或移 植。這些治療措施可能會讓患者產生生理和情緒上的嚴重代價，但是卻不能取得必要的好轉 結果；在某些病例中，B-CLL患者甚至死於這些治療的嚴酷性，而不是死於B-CLL的影響。 B-CLL早期的患者，因為具有較好的生理狀態，所以能接受攻擊性或者實驗性治療，只要狀 態維持穩定，他們通常不接受治療，原因有兩個第一，目前可用的治療並不能延長存活期； 第二，目前還不能為早期患者是否會好轉或者惡化提供可靠的指示。進一步說，疾病不可預 知的進程可以為臨床治療困難的結果提供解釋，因為一些早期病人甚至在不接受治療的情況 下將進入惰性期。
考慮到白血病患者臨床進程的多樣性以及緩解期的巨大可變性，用於預測個體疾病進程 的可靠的指示體系的需求變得重要，它可以幫助臨床工作者鑑定出將進入發展狀態的患者， 並讓他們能夠選擇在疾病的更早期接受攻擊性或實驗性治療。此外，臨床治療中，可以根據 患者預後情況，針對患者使用新藥或者實驗性治療手段，從而發現臨床治療中的更多相關結 果。
本發明滿足了這種需求並且帶來了相關的優點。

發明內容
本發明的目的在於提供一種為來自疑有腫瘤性轉化狀態的個體的樣品建立複合標誌物分 布的方法。本發明的複合標誌物分布可以用於鑑別個體的腫瘤性轉化狀態相關亞群的預後和 治療、以及預測個體的疾病進程，本發明的方法為罹患腫瘤性轉化狀態的個體提供用於選擇 治療方式的工具，包括用於確定危險人群的方法、預測復發風險增加的方法、預測發生繼發 性併發症風險增加的方法、為個體選擇治療方案的方法、預測個體對治療的反應的方法、確 定對個體治療效果的方法、確定個體的預後的方法。特別地，本發明的方法公開了一種建立 複合標誌物分布的方法，其可用作預後指示來預測個體的腫瘤性轉化狀態的進程是攻擊性還 是惰性，從而幫助臨床工作者處理病人和評估將要使用的治療形式。
在特別公開的實施方式中，本發明的目的在於建立用於白血病的複合標誌物分布，該白 血病選自由慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病 (CML)和急性淋巴細胞性白血病(ALL)所構成的組。公開的本方法所建立的複合標誌物
分布可以用在罹患白血病的個體臨床處理所有方面，包括例如，確定罹患白血病的個體為 白血病危險群體、預測罹患白血病的個體是否有復發的高風險、預測罹患白血病的個體是否 有發生繼發性併發症的高風險；這些本方法為罹患白血病的個體確定預後提供幫助、為罹患 白血病的個體選擇治療方案、為接受一項或多項白血病治療的個體監測疾病狀態。


圖1為用於顯示建立複合標誌物分布的樣品製備方法的示意圖。
圖2為由用於一例CLL樣品中ZAP-70分析的門控策略方案所獲得的流式細胞儀面板。
圖3為由用於CLL樣品中ZAP-70分析的門控策略所獲得的流式細胞儀面板。
圖4為描述一例CLL樣品中存在的細胞空間中ZAP-70表達情況的示意圖。(紅色B
細胞；綠色正常T細胞；紫色NK細胞)
圖5為描述一例AML樣品中mTOR激活S6情況的流式細胞儀面板。 圖6為外周血中動員幹細胞(CD34+)的複合分布示意圖。直方圖提供了與未處理樣品 (紅)相比，在用PMA (藍)、幹細胞因子(綠)、或IGF-1 (橙)激活後每個動員幹細胞、
正常粒細胞、正常單核細胞和正常淋巴細胞中三種信號轉導蛋白P-ERK、 P-S6和P-PKB/AKT
的反應情況比較。
圖7為單個AML患者的複合分布示意圖。等分血樣用PMA刺激，用或者不用特異性信
號轉導通路抑制劑(圖例見右下角)刺激，或用幹細胞因子刺激。反應結果用P-ERK對P-S6
的雙邊量散點圖檢測(右側面板)，紅色群表示AML胚細胞，藍色表示內在淋巴細胞，綠色
表示內在粒細胞。AML胚細胞(紅)、淋巴細胞(藍)和粒細胞(綠)通過使用左邊兩個框
中描述的CD34側向散射來鑑定。
圖8為CLL中ZAP-70表達的複合分布示意圖。綠色CD5陰性B細胞；藍色CD5+B
細胞；粉色T細胞(CD5+/CD3+);紫色NK細胞(CD5陰性/CD56+)。每一個獨立地被
換算成亞型產生次數的柱狀圖顯示出了重疊柱狀圖。
具體實施例方式
本發明的目的在於提供用於為從疑有腫瘤性轉化狀態的個體得到的樣品建立複合標誌物 分布的方法。本發明中的複合標誌物分布可用來鑑別個體的腫瘤性轉化狀態預後和治療相關 亞群、以及用來預測個體的臨床進程。本發明的方法為罹患腫瘤性轉化狀態的個體提供用於 臨床處理的工具，包括用於確定危險人群的方法、預測復發風險增加的方法、預測發生繼發 性併發症風險增加的方法、為個體選擇治療方案的方法、確定對個體治療效果的方法、確定
個體預後的方法。
某種意義上，本發明基於這樣一個發現明顯的細胞群相關標誌物的出現與一種或更多 選出的靶蛋白質相關聯，這樣就有可能製備一種複合標誌物分布，該分布根據不同樣品間的 內在細胞群的陽性和陰性比較而表現為一種定量檢測。
特別地，本發明的方法公開了一種建立複合標誌物分布的方法，該複合標誌物分布可作 為一種預後指示物，用來預測個體的腫瘤性轉化狀態的臨床進程是將具有攻擊性還是惰性， 從而幫助臨床工作人員處理患者並評估將要使用的治療形式。
在這裡公開的實施方式中，本發明的方法目的在於建立用於白血病的複合標誌物分布，
該白血病選自由慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白 血病(CML)、急性淋巴細胞性白血病(ALL)所構成的組。通過公開的方法而建立的複合標 志物分布可以用在罹患白血病的個體臨床處理的所有方面，包括比如，確定罹患白血病的 個體為白血病危險群體、預測罹患白血病的個體是否具有復發的高風險、預測罹患白血病的 個體是否具有發生繼發性併發症的高風險；這些方法為罹患白血病的個體確定預後提供幫助、 為罹患白血病的個體選擇治療方案、為接受一項或多項白血病治療的個體監測疾病狀態。
通過本發明的方法而建立的複合標誌物分布包括將生物樣品與一結合分子集發生反應， 其中該結合分子集包括兩組或兩組以上對明顯的細胞群相關標誌物具有特異性的結合分子。 標誌物的水平和標誌物的結合可以鑑別出樣品內部的正常細胞群和腫瘤性轉化細胞群，並且 可以用於通過檢測鑑別標誌物水平和標誌物結合情況來鑑別樣品內部的正常細胞群和腫瘤性 轉化細胞群的存在，所述結合情況可鑑別樣品內部正常細胞群和腫瘤性轉化細胞群。最終， 通過將每個正常細胞群和腫瘤性轉化細胞群的標誌物水平與靶蛋白的存在相關聯，本發明的 方法可以為從疑有腫瘤性轉化狀態的個體所得到的樣品建立複合標誌物分布。
本發明的方法建立的複合分布具有預料不到的優點，並且基於生物樣品中細胞標誌物的 存在，解決了疾病進程預測中遇到的各種困難。如此所說，本發明的靶蛋白可以通過參照樣 品中含有的、並且已知對所研究的細胞靶呈陰性和陽性的多種細胞群，來確定所研究的細胞 靶的半定量水平。如本方法所述，所研究的細胞靶的存在和水平分別與樣品中的多個陽性細 胞群相關聯，所述陽性細胞群為包含樣品中的細胞群、以及特徵為所研究的細胞靶水平可變 的細胞群。此外，本方法將所研究的細胞靶分子的存在和水平與樣品中一種或更多的已知呈 靶蛋白陰性的內在細胞群相關聯。因此，本發明的方法不是使用不相關的抗原來提供定量的 內參，而是把多個對所研究的細胞耙呈陽性的內在細胞群聯繫起來，並可用於根據個體的復 合分布來生成靶向治療策略。本發明的方法可以用來對樣品內具有陰性或陽性細胞群參照的
任何細胞耙進行定量。
在一個具體實施方式
中，本發明提供了一種為從疑有腫瘤性轉化狀態的個體身上獲得的 樣品建立複合標誌物分布的方法，其包括如下步驟使生物樣品與結合分子集進行反應的步 驟，其中所述結合分子集包括兩組或兩組以上的對獨特的細胞群相關標誌物具有特異性的結 合分子，並且其中標誌物水平和標誌物結合情況可鑑別樣品內部的正常細胞群和腫瘤性轉化 細胞群；通過檢測標誌物水平和標誌物結合情況來鑑別樣品內部的正常細胞群和腫瘤性轉化 細胞群的存在，其中所述標誌物水平和結合可鑑別樣品內部正常細胞群和腫瘤性轉化細胞群； 以及然後將每個正常細胞群和腫瘤性轉化細胞群的標誌物水平與靶蛋白的存在關聯起來，從 而建立複合標誌物分布。
在一個特別的具體實施方式
中，本發明的方法應用於一種進一步被定義為"血癌"的癌 症，該術語是指造血組織的惡性瘤，包括白血病、淋巴瘤和多種骨髓瘤。白血病包括急性骨 髓性白血病或急性髓細胞白血病(AML)、慢性骨髓性白血病或慢性髓細胞白血病(CML)、 慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性淋巴細胞性白血病(ALL)、毛細胞白血病(HCL)、胚 芽型骨髓增生異常症候群(MDS)或慢性骨髓性白血病(CML-BP)、和通過形態學、組織學 以及免疫學技術等本領域技術人員所定義的這些白血病的所有亞型。在本發明的一個特別具 體實施方式中，血癌選自由慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢 性骨髓性白血病(CML)和急性淋巴細胞性白血病(ALL)所構成的組。
最初白血病根據預期存活時間分為急性或慢性，但是現在根據細胞成熟度區分。急性白 血病主要由未成熟細胞(通常為胚細胞形式)組成，而慢性白血病含有更多的成熟細胞。急 性白血病表現為未成熟血細胞的快速生長。這種大量未成熟細胞的生長使骨髓不能產生健康 的血細胞。急性白血病進一步分為成淋巴細胞性(ALL)和髓細胞性(AML)類型，其可根 據法-美-英(FAB)分類法或免疫顯型法的形態學和細胞化學表現而進一步細分。將特異的T 細胞、B細胞和骨髓性抗原的單克隆抗體與流式細胞術結合起來，對於區分ALL和AML非 常有幫助，這種區分對治療至關重要。
急性白血病包括急性淋巴細胞性白血病(ALL)和急性骨髓性白血病(AML)。白血病 細胞在骨髓中聚集，取代正常的血液細胞，並且擴散至肝臟、脾臟、淋巴結、中樞神經系統、 腎臟以及性腺。因為這些細胞來自血液，因此它們可以滲透到任何一個器官和部位。ALL通 常浸染中樞神經系統，而急性單核細胞白血病會浸染齒齦，而AML可以包括在任何部位形 成的聚集體(粒細胞肉瘤或綠色瘤)。
慢性白血病分為慢性淋巴細胞性白血病(CLL)或慢性骨髓性白血病(CML)。 CLL包
括涉及淋巴結和其餘淋巴組織的外觀成熟淋巴細胞的克隆性擴張，與對骨髓的進展性滲透有 關並出現在外周血中。對CLL的傳統描述已經成為最常見的亞型，特別是B細胞的形式幾乎 在所有病例中可見。在2%到3%的病例中，類型表現為T細胞的克隆性擴張，而且此類型依 然具有亞型，特別是隨血球減少的大顆粒淋巴細胞。另外，其他慢性白血病的形式也被歸類 到CLL名下前淋巴細胞白血病，皮膚T細胞淋巴瘤的白血病樣階段(Sezary綜合症)，毛 細胞白血病，淋巴瘤白血病(惡性淋巴瘤發展階段的白血病樣改變)。這些典型CLL亞型的 分化通常很容易辨別。
在一個具體實施方式
中，本發明提供了一種方法，包括通過使生物樣品與結合分子集 反應，從而為來自疑似B細胞慢性淋巴細胞性白血病個體的樣本建立複合標誌物分布，其中 所述結合分子集含有兩組或者更多組對獨特的細胞群相關標誌物具有特異性的結合分子；接 著通過檢測標誌物水平和標誌物結合情況，來鑑別樣品內部的正常和腫瘤性轉化細胞群的存 在，其中標誌物結合情況可識別樣品內部的正常和腫瘤性轉化細胞群；並且使正常和腫瘤性 轉化細胞群的標誌物水平與ZAP-70的存在相關聯，從而為來自疑似B細胞慢性淋巴細胞性 白血病(B-CLL)個體的樣本建立複合標誌物分布。
B-CLL的特徵表現為CD5+細胞的克隆積累(Caligaris-Cappio， et al， J Exp Med 155: 623-8, 1982)。特異性細胞表面標誌物的表達可以區別出人類B細胞的亞型，該亞型在不同分化和 激活階段是不同的，並且具有生物學特性(Clark and Lane, Ann Rev Immunol 9:97-127,1991 )。 特別地，CD38和IgD表達的分析在辨別B細胞處於從幼稚到成熟細胞的各個分化階段中尤 其有用(Pascual, et al., J Exp Med 180:329-339， 1994; Zupo, et al.， Blood, 88:1365-1374, 1996)。
在另一個具體實施方式
中，本發明提供了一種方法，包括通過使生物樣品與結合分子
集反應，從而為來自疑似CML個體的樣本建立複合標誌物分布，其中所述結合分子集含有
兩組或者更多組對獨特的細胞群相關標誌物具有特異性的結合分子，其中標誌物水平和標誌
物結合情況可識別樣品內部的正常和腫瘤性轉化細胞群；接下來通過檢測標誌物水平和標誌 物結合情況，來鑑別樣品內部的正常和腫瘤性轉化細胞群的存在，其中標誌物水平和結合情 況可辨別樣品內部的正常和腫瘤性轉化細胞群；並且使正常細胞群和腫瘤性轉化細胞群標誌 物水平與至少一種靶蛋白的存在關聯起來，從而為來自疑似CML個體的樣本建立複合標誌 物分布。在該實施方式中，該耙蛋白可選自由活化磷酸化信號轉導蛋白、增殖標誌物和凋亡 標誌物所構成的組。
慢性骨髓性白血病(CML)是一種具有明顯不同於其他種類白血病的臨床和病理特徵的 白血病。普遍認為CML的病因是由於人9號染色體和22號染色體之間的特異性染色質易位。 易位後產生的異常染色體常常被叫做費城染色體(Darnell, J. et al., Molecular Cell Biology, 2nd Ed., W. H. Freeman and Co., New York(l990), p. 992)。 C-abl (ABL)基因， 一個據認為有關生 長調控的酪氨酸激酶，定位於人9號染色體的末梢臂上，而c-bcr(BCR)基因定位於22號 染色體。易位將ABL啟動子末梢包括編碼酪氨酸激酶結構域的元件的三個外顯子置於BCR 的第一或者第二外顯子的下遊(Chung, S. and Wong， P. M. C.， Oncogene, 10:1261-1268 (1995))。 人類9號和22號染色體間的易位產物是一個嵌合基因，BCR-ABL，其編碼一個融合蛋白， 取決於是否包含BCR的第二個外顯子，通常寫作pl85bCT-abl或者p210beMbl(Bartarm, C. R., et al., Nature, 306:277-280(1983))。 pl85bc>abl會導致急性白血病，典型的是成淋巴細胞性白血病； p210bCT—31)|通常導致CML，但是偶爾也能導致急性白血病。
CML涉及惡性多能幹細胞轉化導致的克隆性骨髓增生，臨床特徵為粒細胞的過度產生， 主要在骨髓，也可見於髓外組織，(比如脾臟、肝臟)。儘管粒細胞增殖佔主要地位，但腫瘤 性轉化克隆還涉及RBC、巨核細胞、單核細胞、甚至一些T和B細胞。正常幹細胞仍然存在， 而且可以在藥物抑制CML克隆後仍然會出現。骨髓富含細胞，但是20-30%的病人會發生骨 髓纖維變性，通常是在幾年後。對大多數病人而言，CML複製會進入一個加速階段，最終導 致胚細胞危機。在這時，胚細胞瘤會發展至髓外組織，包括骨、中樞神經系統CNS、淋巴結 和皮膚。
慢性髓性白血病(CML)表現出一個特別的病程，最初為慢性粒細胞增生症，然後總是 由於某個低分化顯型(即，疾病的胚細胞危象階段)的細胞克隆性擴增而進化為急性白血病。 CML是一個不穩定的疾病，最終進行到終末階段，表現為急性白血病。2004年，在美國， 這個致命的疾病影響了大約9730位患者。化療藥物例如羥基脲和白消安可以降低淋巴細胞載 量，但是不影響患者的生存期(例如大概4年)。所以，CML患者是骨髓移植(BMT)療法 的候選人。但是對於BMT生存患者而言，疾病復發仍然是一個主要的障礙(Apperley et al., 1988 Br. J. Haematol. 69, 239)。
在另一個具體實施方式
中，本發明提供了一種方法，包括通過使生物樣品與結合分子 集反應，從而為來自疑似AML個體的樣本建立複合標誌物分布，其中所述結合分子集含有 兩組或者更多組對獨特的細胞群相關標誌物具有特異性的結合分子，其中標誌物水平和標誌 物結合情況可識別樣品內部的正常和腫瘤性轉化細胞群接下來通過檢測標誌物水平和標誌 物結合情況，來鑑別樣品內部的正常和腫瘤性轉化細胞群的存在，其中標誌物水平和結合情 況可辨別樣品內部的正常和腫瘤性轉化細胞群；並且使正常和腫瘤性轉化細胞群標誌物水平 與至少一種耙蛋白的存在聯繫起來，從而為來自疑似急性髓性白血病(AML)個體的樣本建
立複合標誌物分布。在該實施方式中，該靶蛋白可選自由信號轉導蛋白、增殖標誌物和凋亡 標誌物所構成的組。
在另一個具體實施方式
中，本發明提供了一種方法，包括通過使生物樣品與結合分子 集反應，從而為來自疑似急性淋巴細胞白血病(ALL)個體的樣本建立複合標誌物分布，其 中所述結合分子集含有兩組或者更多組對獨特的細胞群相關標誌物具有特異性的結合分子， 其中標誌物水平和標誌物結合情況可識別樣品內部的正常和腫瘤性轉化細胞群；接下來通過 檢測標誌物水平和標誌物結合情況，來鑑別樣品內部的正常和腫瘤性轉化細胞群的存在，其 中標誌物水平和結合情況可辨別樣品內部的正常和腫瘤性轉化細胞群；並且使正常和腫瘤性 轉化細胞群標誌物水平與至少一種靶蛋白的存在聯繫起來，從而為來自疑似ALL個體的樣本 建立複合標誌物分布。在該實施方式中，該靶蛋白可選自由信號轉導蛋白、增殖標誌物和凋 亡標誌物所構成的組。
在這裡，術語"腫瘤性轉化狀態"指的是一種與細胞增殖有關的狀態，其特徵為正常控 制的缺失，該缺失會導致一種或者多種症狀，包括不可調節的生長，分化缺失，所在組織 侵襲，和轉移。像在這裡描述的那樣，當為來自疑有腫瘤性轉化狀態個體的樣本建立複合標 志物分布時，生物樣品與結合分子集反應，其中所述結合分子集含有兩組或者更多組對獨特 的細胞群相關標誌物具有特異性的結合分子，其中相關標誌物可鑑別樣品內部的正常和腫瘤 性轉化細胞群。
生物樣品最好直接採集於個體，特別是被懷疑有癌症的個體，並且接下去以合適的方式 為該樣品建立複合分布。在一個具體實施方式
中，生物液體可以是，例如，全血、外周血單 個核細胞(PBMCs)、骨髓穿刺物或者淋巴組織。合適的生物液體包括任何身體組織或體液。 在優選的實施方式中，身體組織可以是骨髓抽吸物、骨髓活檢切片、淋巴結穿刺物、淋巴結 切片、脾臟組織、細針穿刺物、皮膚活檢切片或者器官組織活檢切片，組織部分和脫落細胞。 其他實施方式包括的體液樣品是外周血、淋巴液、腹水、血漿和腦脊髓液。就急性白血病而 言，全血和骨髓穿刺物是特別合適的生物樣品。在一個生物樣品包含全血的實施方式中，提 供的樣品可以包括固定和滲透的白細胞和紅細胞的裂解液。可以理解的是，提供的包含很高 水平紅細胞的生物樣品可以通過處理來去除紅細胞，例如，通過低滲透壓裂解、去垢劑處理 和密度-梯度離心。
如同這裡描述的那樣，在本發明的方法中，生物樣品與結合分子集相接觸，其中所述結 合分子集含有兩組或者更多組對獨特的細胞群相關標誌物具有特異性的結合分子，其中相關 標誌物可辨別樣品內部的正常和腫瘤性轉化細胞群。這裡使用的術語"結合分子"指的是任
何可以通過足夠的親和力與抗原結合從而現示出選擇性結合活性的分子。結合分子的例子包 括抗體、抗體片段和抗體樣分子。抗體可以通過B細胞、雜交瘤產生，並且可以是嵌合抗體 或人源化抗體或其任何片段，例如，F(ab')2和Fab片段、以及單鏈或單一結構域抗體。
在實踐本發明方法中的有用結合分子可以是單鏈抗體，它由抗體的重鏈和輕鏈可變區通 過一個通常含有10至30個胺基酸、優選為15-25個胺基酸的連接肽進行共價結合。所以， 這樣一個結構不包括重、輕鏈的恆定區，而且據認為這個小肽間隔區相比完整恆定區具有較 弱的抗原性。在實踐本發明方法中的有用結合分子也可以是嵌合抗體，它是這樣一種抗體 重鏈或者輕鏈或兩者的恆定區皆來源於人，而重、輕鏈的可變區都不是人源性的，比如是鼠 源性的。在實踐本發明方法中的有用結合分子還可以是人源化抗體，它的高變區(CDRs)不 是人源性的，比如，是鼠源性的，而它的所有或者幾乎所有其他免疫球蛋白部分、特別是恆 定區和可變區的高度保守區域(特別是架構區域)，是人源性的。人源化抗體可以在挨著高變 區的架構區域保留一點來源於小鼠序列的胺基酸。高變區可以與任何架構區域相聯，最好是 鼠源性或者人源性的架構區域。合適的架構區域是眾所周知的，在現有技術中也有描述。所 有前面提到的結合分子都適於實踐本發明的方法。
本發明方法中使用的結合分子集合包含兩組或者更多組對獨特的細胞群相關標誌物具有 特異性的結合分子，所述標誌物可以辨別樣品內部的正常和腫瘤性轉化細胞群。這裡使用的 術語"細胞群相關標誌物"指的是這樣一種抗原，其單獨或者與一個或者幾個不同的抗原組 合在一起用於依靠被選擇性地結合於結合分子而辨別在生物樣品內部的一個或更多細胞群。 如本領域的技術人員理解的那樣，細胞群可以基於與獨特的標誌物，例如，展示在細胞表面 的細胞表面標誌物進行結合而被識別。對於急性白血病而言，細胞群相關標誌物包括，例如， CD45、 CD2,CD3、 CD7、 CDIO、 CDllb、 CD13、 CD14、 CD15、 CD19、 CD20、 CD33、 CD34、 CD56、 CD71、 CD117、 HLA-DR。取決於使用者，可以加入補充標誌物，例如，CDla、 cCD3、 CD4、 CD5、 CD8、 cCD22、 CD61、血型糖蛋白A和TdT。如同這裡描述的，對於來自於疑 似AML個體的生物樣品，對於建立複合分布有用的細胞群相關標誌物可以包括，例如，CD45、 CD33、 CD34、 CDllb、 CD13、 CD14、 CD15、 CD16、 MPL (髓過氧化物酶)、CD64、 CD117
(c-kit受體)。另夕卜，對於M6-M7型白血病，取決於使用者，可以加入標誌物例如CD41、 CD42、 CD61、 CD62P、 CD71、血型糖蛋白A、血紅素。應當理解，當樣品細胞性有限時， 幾乎沒有標誌物可以被分析。對於通過流式細胞術來鑑別和定量細胞群而言，CD分子是方便 的診斷標準物。流式細胞術是用於計數、檢査和分類懸浮在液流中的顯微微粒的技術。流式 細胞術程序開始於細胞或者組織的獲得，經過染色和洗滌，接下來通過在流式細胞儀上獲得
流體數據，並且以數據分析和報告結果而告終。
在實施這裡所說的方法時，所研究的細胞群包括不同種類的白細胞，特別是粒細胞，淋 巴細胞和單核細胞。有三種粒細胞中性粒細胞，嗜酸粒細胞和嗜鹼粒細胞。白細胞還包括 淋巴細胞，其包括B細胞、T細胞和自然殺傷細胞。自然殺傷細胞或"NK細胞"是健康個 體內包含2-15%外周血單核細胞的大顆粒淋巴細胞。雖然大多數NK細胞是CD3:TCR'、 CD16+、 CD56+，在這個群體中仍然有相當的表型和功能異質性(Trinchieri, Adv. Immunol., 47:187 (1989))。例如，人們發現CD56的表面密度限定了功能獨特的NK細胞群。CD56b喊tNK 細胞大部分是CD16+，其為無顆粒淋巴細胞，在細胞溶解效應功能方面有缺陷，其在對外源 性IL-2的反應上會劇烈增殖。CD56dim NK細胞是具有潛在的細胞溶解效應功能的CD16+ LGLs,其在對IL-2的反應上不增殖。因為一些T細胞同時表達CD16和CD56，這些分子本 身不能限定NK細胞群(Trinchieri，1989)。另外，因為在功能分化的NK細胞群上CD56的表 達較低，單克隆抗體與CD56的反應性不能可靠地用於將樣品中NK細胞的亞群與其他細胞 區分開來。除了能夠區分正常細胞群外，在本發明的方法中可以使用結合分子，以便鑑定樣 品內部的腫瘤性轉化細胞群。對於通過流式細胞術鑑別和定量細胞群而言，CD分子是方便的 診斷標準物。在本發明優選的實施方式中，細胞群相關標誌物表達水平，例如CD38+對於 B-CLL的表達，是通過使用流式細胞術決定的，該過程中，細胞被標記了連接有螢光染料或 者酶的單克隆抗體，雖然可見免疫螢光法或者其他方法也可以使用。在具體的實施方式中， 分析了生物樣品，用於分析細胞群相關性標誌物結合性的表面表達，例如，通過多色免疫熒 光，使用對某個特定細胞型相關群體具有特異性的結合分子集合進行分析。應當理解，結合 分子的任何結合性都可以進行選擇，所述結合性對於在生物樣品中鑑別特定細胞性相關群體 具有特異性。
如同這裡描述的那樣，對於來自於疑似CLL的個體的生物樣品，對於建立其複合分布， 有用的細胞群相關標誌物可以包括例如，用於鑑別T細胞的CD3，用於鑑別正常T細胞和 惡性B細胞的CD5，用於鑑別正常B細胞和惡性B細胞的CD19，用於鑑別正常NK細胞的 CD56，用於鑑別激活的B細胞或者濾泡外套層B細胞的CD23，用於鑑別細胞激活和分化的 CD38，作為細胞質B細胞系標誌物的CD79b，作為正常B細胞系標誌物並且是特徵性地在 B-CLL中呈陰性的FMC7。所以，對於鑑別B-CLL中細胞群有用的標誌物結合包括CD5陽 性與CD19陽性；CD5陽性與CD20陰性;CD3陽性或者CD56陽性;以及CD3陽性。
這個方法可以通過使用任何含有B-CLL細胞的組織而實現，所述組織包括但不局限於脾 髒、淋巴結、骨髓、淋巴液、外周血、來自於個體的全血樣品、或者經過處理並進行外周血單核細胞(PBMC)分離的全血樣品。
作為早期造血前體細胞的腫瘤性轉化結果，慢性髓性白血病(CML)的臨床特點表現為 外周血循環中未成熟和成熟的髓樣細胞積累，細胞遺傳學特點為費城染色體的出現。在CML 中可表達髓系抗原CD33、 CD13、 CDll、 CD45和它的同種型CD45RO，但不表達有助於分 辨CML與急性髓性白血病(AML)的CD45RA。因為CML細胞表達HLA-DR，它們可以與 正常骨髓前體相區別。在本發明涉及疑似CML個體的實施方式中，細胞群相關標誌物選自 下組用於鑑別未成熟或者"胚"細胞群的CD45、 CD34，用於鑑別正常和腫瘤性轉化髓樣 細胞的CDllb，用於鑑別正常和腫瘤性轉化髓樣細胞的CD13、 CD15，用於鑑別正常和腫瘤 性轉化B細胞的CD14、 CD33、 CD79a和b，用於鑑別惡性細胞CD22、 CDIO、 CD16、 Bcr/Abl， 和用於鑑別正常和腫瘤性轉化細胞群分化狀態的末端脫氧核苷酸酶轉移酶(TdT)。
如同這裡描述的，細胞群可以基於獨特的細胞群相關標誌物的結合而被辨別，所述標誌 物例如是表達展示在細胞表面的細胞表面標誌物。在本發明的方法中，正常和腫瘤性轉化的 內部細胞群的鑑別是基於細胞群相關性標誌物的表達和水平，之前進行使每個細胞群與至少 一種耙蛋白的存在相關聯的步驟。因此，最初的內部細胞群相關性標誌物結合情況用來鑑別 正常和腫瘤性轉化細胞群，隨後與至少一種靶蛋白的存在相聯繫。應當理解，基於生物樣品 內部的特定細胞群，可以選擇細胞群相關性標誌物的出現和表達水平的結合方式，這些結合 方式預期用於進一步與所研究的靶蛋白相關聯。應當進一步理解，當通過在樣品中外源性加 入或者摻入合適的參照細胞群而在樣品中不存在參照群體時，基於與內部細胞對照群體的比 較進行的染色定量的方法可以推廣至應用方面。
基於與B-CLL相關的實施方式的細胞群相關性標誌物表達和水平而鑑定的特定正常和腫 瘤性轉化內部細胞，可以包含這樣一個群體CD5陽性和CD19陽性；CD5陽性和CD20陰 性;CD3陽性和CD56陽性;CD3陽性。作為本發明原則的例子，正常的或者活性T細胞(CD3+) 和NK細胞(CD56+)對於ZAP-70蛋白表達呈陽性，而正常B細胞(CD19+/CD5-)和正常 粒細胞(通過單獨或者與CD45交聯後光散射特性而鑑定)對於ZAP-70蛋白表達呈陰性。這 些樣品內部的細胞群被用於確定B-CLL (腫瘤性轉化)群體中ZAP-70表達水平，還一起被 用來建立複合體系，該ZAP-70蛋白是通過相對於內部陽性和陰性細胞群呈CD19+/CD5+ (有 潛力與其他標誌物例如FCM7-偶聯)而鑑定的。
在針對CML的實施方式中，細胞群相關性標誌物可以鑑別細胞群，所述細胞群除了任 何正常淋巴細胞、單核細胞、或者粒細胞外，還包含淋巴顆粒細胞和另一種包含淋巴單核細 胞的細胞群。所以，本發明提供了一種方法，包括通過使生物樣品與結合分子集反應，從
而為來自疑似CML個體的樣本建立複合標誌物分布，其中所述結合分子集含有兩組或者更 多組對獨特的細胞群相關標誌物具有特異性的結合分子，其中標誌物水平和標誌物結合情況 可識別樣品內部的正常和腫瘤性轉化細胞群；接下來通過檢測標誌物水平和標誌物結合情況， 來鑑別樣品內部的正常和腫瘤性轉化細胞群的存在，其中標誌物水平和結合情況可辨別樣品 內部的正常和腫瘤性轉化細胞群；並且使正常和腫瘤性轉化細胞群標誌物水平與至少一種靶 蛋白的存在關聯起來，從而為來自疑似慢性髓性白血病(CML)個體的樣本建立複合標誌物 分布。在該實施方式中，該靶蛋白可選自由信號轉導蛋白、增殖標誌物和凋亡標誌物所構成 的組。
生物樣品經處理可以用於複合標誌物分布的建立，該建立方法使用本領域技術人員可選 的任何細胞準備方法和適合於樣品的染色處理。應當理解，準備和染色步驟一般包括RBC裂 解、染色、固定、滲透，這些步驟的次序可以有某些變化，只要所研究的細胞群相關性標誌 物仍然存在，允許進行這裡描述的細胞群鑑別，就可以採用上述準備和染色步驟。合適的準 備步驟已本領域技術人員所熟知，本文描述了，例如，使用低滲裂解對全血、骨髓、腹水等 進行紅細胞裂解(以獲得純化的WBC群)，或者使用密度梯度離心技術(例如Hyp叫ue/Fico11) 以獲得富含單核細胞的樣品。
所以，在本發明為來自於疑似腫瘤性轉化狀態個體的樣品建立複合標誌物分布的方法中， 使樣品首先與結合分子集反應，其中所述結合分子集含有兩組或者更多組對獨特的細胞群相 關標誌物具有特異性的結合分子，以辨別正常和腫瘤性轉化細胞群。如同上文所述，結合分 子集可以被使用者選擇，以便鑑別樣品內部的正常和腫瘤性轉化細胞群。 一旦正常和腫瘤性 轉化細胞群得到鑑別，還可以將該細胞群與靶蛋白的存在相關聯，從而建立複合標誌物分布。
這裡使用的術語"靶蛋白"指的是這樣一種蛋白，作為其在調節正常和腫瘤性轉化細胞 群的細胞反應、表現、功能中的作用，可以用於建立複合標誌物分布。在建立本發明的複合 標誌物分布中，通常會測量一種或者更多種靶蛋白對調節性刺激物的功能反應，比較樣品內 部的正常和腫瘤性轉化細胞群。本發明方法中有用的靶蛋白可以是，比如，信號分子，其介 導細胞代謝的相關效應、細胞生長、分化、凋亡，或者實現其他任何生理作用。相應地，靶 蛋白的調節狀態可以當其作為一個特異性或者合適的底物、分子轉接蛋白、或者信號途徑的 組分而提高一個生物反應時得到測量。為了建立本發明的複合標誌物分布，靶蛋白的調節狀 態例如磷酸化狀態，可以通過樣品內部的腫瘤性轉化和正常細胞群來測定。
這裡使用的術語"複合標誌物分布"，指的是比較生物樣品內部獨特的細胞群靶蛋白表 達水平矩陣，複合標誌物分布代表了生物樣品內量化的靶蛋白，該量化是基於腫瘤性轉化細
胞內的靶蛋白表達相對於對靶蛋白呈陽性的正常細胞群中靶蛋白染色水平的標準化。對靶蛋 白呈陽性的正常細胞群用作不同靶蛋白表達水平的陽性對照。 一種或者多種內部不表達靶蛋 白的正常細胞群可以作為陰性對照。在組織樣品中，外周血汙染可以導致足夠的用作內部陰 性對照的粒細胞。
在為來自於疑似AML或者CML的個體的樣品建立複合標誌物分布的方法中，靶蛋白可 以是信號轉導蛋白，例如，Abl、 CRKL、 Hck、 STAT1、 STAT3、 STAT5、 Flt3、 Akt/PKB、 ERK、 mTOR或S6。圖5顯示了描述在AML樣品中被mTOR激活的S6激活情況的流式細 胞術儀面板。另外，在為來自於疑似CML個體的樣品建立複合標誌物分布的方法中，靶蛋 白可以是增殖標誌物，例如周期蛋白Dl或者周期蛋白A2，以及是一個凋亡標誌，例如 cleaved-Caspase-3或者Bcl-XI。圖6顯示了一個通過比較在CD34+幹細胞至內參照群體(淋 巴細胞，粒細胞和單核細胞)內三種不同信號轉導蛋白P-ERK、 P-S6和P-PKB/AKT對三種 刺激的反應而建立外周血幹細胞中動員幹細胞的複合分布。圖7描述了根據AML患者樣本， 通過測定血液樣品中信號轉導靶蛋白P-ERK和P-S6的表達情況，並將在AML (紅色)胚細 胞中的表達與在內參照群淋巴細胞(藍色)和粒細胞(綠色)中的表達相比較，從而建立的 複合分布。
在本發明的特定實施方式中，B-CLL中ZAP-70的量化檢測可以通過相對於正常T和自 然殺傷細胞中的ZAP-70染色水平進行標準化而實現，這兩種細胞都是ZAP-70陽性。在本實 施方式中，其目的在於為罹患特定複合標誌物分布的個體建立複合標誌物分布，所述特定復 合標誌物分布是為來自疑似B-CLL個體的樣品建立的。本實施方式中，由於自然殺傷細胞相 比T細胞有更明亮的染色，正常T細胞和自然殺傷細胞提供了兩種不同亮度的陽性對照。在 本實施方式中，外周血和骨髓生物樣品中的粒細胞和正常B細胞是ZAP-70陰性的，可以作 為陰性對照。
在此公開的特定實施方式中，檢測靶蛋白用於可以和某個狀況相聯繫的修飾，比如磷酸 化狀態。細胞很大程度上依靠細胞外分子，該分子作為一種手段以便從其所處外界環境接受 刺激。這些細胞外信號對於正確調節不同的細胞過程比如分化、收縮、分泌、細胞分裂、接 觸抑制和代謝是必需的，還可以與異常的或者潛在有害的過程比如病毒-受體反應、炎症和細 胞轉化癌變相關聯。該過程的中心特點即信號轉導是某些蛋白的可逆磷酸化。磷酸化是一個 包括競爭性磷酸化和去磷酸化的動態過程，任意給定瞬間的磷酸化水平反映了此時催化這些 反應的蛋白酶和磷酸酶的相對活性。
所以，本發明的複合標誌物分布可以將靶蛋白的磷酸化或去磷酸化相關聯，而不僅僅是
它的表達，因為被調節的蛋白的構象變化改變它們的生物學特性。當蛋白磷酸化主要發生在 絲氨酸和蘇氨酸的胺基酸殘基時，酪氨酸殘基的磷酸化也會發生，很多人對此感興趣，因為 發現很多致癌基因產物和生長因子受體具有內源性蛋白酪氨酸酶活性。生長因子信號轉導、 細胞周期過程和腫瘤性轉化中的蛋白酪氨酸磷酸化的重要性現在己經全面確認了 (Cantley et al.， 1991, Cell 64:281-302; Hunter T.， 1991, Cell 64:249-270; Nurse, 1990, Nature 344:503-508; Schlessinger et al., 1992， Neuron 9:383-391; Ullrich et al., 1990， Cell 61:203-212)。正常生長控制 途徑的破壞導致癌發生，表明是由於組成一大組主要致癌蛋白的蛋白酪氨酸酶的激活或者過 度表達造成的。(Hunter, T.綜述，1991 ，Cell 64:249-270)。如同這裡揭示的，本發明中的複合標 志物分布可以將正常和腫瘤性轉化細胞群的靶蛋白磷酸化水平與靶蛋白的存在相關聯，從而 為來源於疑似腫瘤性轉化狀態的個體的樣品建立複合標誌物分布。
在優選的實施方式中，所有構成複合標誌物分布的細胞群都在生物樣品內。當針對生物 樣品時，這裡使用的術語"內部"是指所有的細胞群最初存在於樣品中，而不是在建立複合 標誌物分布之前加入或者"摻入"的方式。在沒有可以作為陰性對照的細胞群的情況下，通 過比較對靶蛋白呈陽性的正常細胞和腫瘤性轉化細胞的內部群體而建立對比矩陣，可以半定 量地確定足夠的靶蛋白水平，從而根據上面公開的方法建立複合標誌物分布。可更進一步想 到，可以將陽性或者陰性內部細胞參照群加入生物樣品，假如在樣品中不存在這些參照群的 話。
如上所述，本發明提供了一種方法，其包括通過使生物樣品與結合分子集反應，從而 為來自於疑似B細胞慢性淋巴細胞性白血病(B-CLL)個體的樣本建立複合標誌物分布，其 中所述結合分子集含有兩組或者更多組對獨特的細胞群相關標誌物具有特異性的結合分子； 並且通過檢測標誌物水平和標誌物結合情況，來鑑別樣品內部的正常和腫瘤性轉化細胞群的 存在，其中標誌物水平和結合情況可辨別樣品內部的正常和腫瘤性轉化細胞群；同時使正常 細胞群和腫瘤性轉化細胞群標誌物水平與ZAP-70的存在關聯起來，從而為來自於疑似B細 胞慢性淋巴細胞性白血病(B-CLL)個體的樣品建立複合標誌物分布。
通過相對於皆為ZAP-70陽性的正常T細胞和自然殺傷細胞的ZAP-70染色水平進行標準 化，可以實現B-CLL中ZAP-70的量化。這就提供了兩種不同亮度的陽性對照，其中自然殺 傷細胞相比T細胞有更深的染色。在本實施方式中，外周血和骨髓生物樣品中的粒細胞或正 常B細胞是ZAP-70陰性的，可以作為陰性對照。
在組織樣品中，外周血汙染可以提供足夠的粒細胞來作為內部陰性對照。當沒有粒細胞 時，其相對於正常T細胞的比例應足以進行半定量檢測。在CLL中可以實現該半定量檢測的
抗原的特異性組合體除了 ZAP-7之外是CD19、 CD5和CD56。其他抗體組合可以用於選擇相 關惡性細胞和正常細胞群體。除了上面提到的以外，還可以包括，而不限於CD3、 CD20、 CD23、 CD79a、 MCF7和免疫球蛋白輕鏈。這裡提出的方法可以通過藉助針對給定的表面或 者細胞內靶蛋白進行特異性染色的樣品來實施，其中正常細胞群對於相同靶蛋白既呈陽性又 呈陰性，或者有可進行細胞染色的特性，該正常細胞群可以存在並可以作為生物參照用於決 定所研究的細胞群對於相同的抗原或者標誌物是否是呈陽性。內部生物細胞群還可以用作對 照以確定所研究的細胞中抗體或者標誌物的半定量目水平。內部細胞群可以基於其他細胞性 質而進行挑選，包括但不局限於抗原檢測和散射光特徵。所需的特異性標誌物取決於本發明 方法的具體應用，本領域的技術人員可據此選擇。
根據以上描述的用於為特定血癌製備複合標誌物分布的實施方式可以延伸至診斷方法。 根據本發明的方法而建立的複合標誌物分布，通過與一個或者更多複合標誌物分布進行比較， 可以用於診斷罹患疑似腫瘤性轉化狀態的個體的腫瘤性轉化狀態，其中該比較可以用於預測 腫瘤性轉化狀態的臨床進程。
這裡使用的術語"預測臨床原因"意味著包含任何與狀況或者治療有關的因素的診斷和 預後，包括生存期，病程預後和治療反應的預後。
當用於複合標誌物分布內容中時，這裡使用的術語"參照"指的是一個已知與某個特定 參數相關的複合標誌物分布，該參數與來自於待測生物樣品的複合標誌物分布進行比較。一 個參照複合標誌物分布可以代表一種特定的腫瘤性轉化狀態、腫瘤性轉化狀態的一個階段， 或者可以代表一個已知的疾病過程，例如是攻擊性還是惰性病程。例如，用於本發明的診斷 方法的參照複合標誌物可以代表疑似患病個體的特定狀態。參照複合標誌物分布可以代表腫 瘤性轉化狀態的一個特定階段，或者可以代表已知的疾病過程，例如攻擊性進程。
在本發明診斷和預後方法的優選實施方式中，將一個個體的複合標誌物分布與一個以上 參照複合標誌物分布相比較。例如，在診斷應用中，可以將一個個體的複合標誌物分布與代 表臨床階段圖譜的兩個或者更多參照複合標誌物分布的集合相比較，以便能夠通過比較將個 體疾病階段進行細微分類。類似地，在預後應用中，可以將個體的複合標誌物分布與兩個或 更多代表圖譜的參照複合標誌物分布的集合相比較，該圖譜系列從非攻擊性至攻擊性、或者 從治療應答至不應答。
通過將用上述方法獲得的複合標誌物分布與一種或者多種參照複合標誌物分布進行比 較，根據本發明方法的複合標誌物分布可以用於診斷疑似患有血癌個體的血癌，其中該對照 分布可以用於預測血癌的臨床病程，所述血癌選自由慢淋巴細胞性白血病(CLL)、急性髓性
白血病(AML)、慢性髓系白血病(CML)和急性淋巴細胞性白血病(ALL)所構成的組。
在一個實施方式中，通過將複合分布與和一種或多種參照複合分布相比較，根據本發明 方法的複合標誌物分布可以用於診斷疑似患病個體的Ig-未突變B細胞慢性淋巴細胞性白血 病(CLL)，其中該比較可以預測Ig-未突變B細胞慢性淋巴細胞性白血病(CLL)的臨床病 程(Hamblinetal.， Blood 94: 1848-1854(1999))。本發明可以提供一種用於預測個體Ig-未突變 B細胞慢性淋巴細胞性白血病(CLL)的臨床病程的方法，包括提供來源於個體的生物樣 品；使生物樣品與結合分子集反應，其中所述結合分子集含有兩組或者更多組對獨特的細胞 群相關標誌物具有特異性的結合分子，其中標誌物水平和標誌物結合可以鑑別樣品內部的正 常和腫瘤性轉化細胞群；通過檢測標誌物水平和標誌物結合情況，來鑑別樣品內部的正常和 腫瘤性轉化細胞群的存在，其中標誌物水平和結合情況可辨別樣品內部的正常和腫瘤性轉化 細胞群；使正常細胞群和腫瘤性轉化細胞群的標誌物水平與ZAP-70的存在關聯起來，從而 為來源於疑似患有B細胞慢性淋巴細胞性白血病(B-CLL)的個體的樣品建立複合標誌物分 布，其中該複合分布代表ZAP-70的相對量化水平；將該複合分布與一種或多種參照複合分 布相比較，其中該比較可以用於預測Ig-未突變B細胞慢性淋巴細胞性白血病(CLL)的臨床 病程。
在另一個實施方式中，本發明可以提供一種預測個體Ig-未突變B細胞慢性淋巴細胞性白 血病(CLL)臨床過程的方法，包括提供來源於個體的生物樣品；使生物樣品與結合分子 集反應，其中所述結合分子集含有兩組或者更多組對獨特的細胞群相關標誌物具有特異性的 結合分子，其中標誌物水平和標誌物結合可以鑑別樣品內部的正常和腫瘤性轉化細胞群；通 過檢測標誌物水平和標誌物結合情況，來鑑別樣品內部的正常和腫瘤性轉化細胞群的存在， 其中標誌物水平和結合情況可辨別樣品內部的正常和腫瘤性轉化細胞群；使正常細胞群和腫 瘤性轉化細胞群的標誌物水平與一靶蛋白的存在關聯起來，從而為來源於疑似患有B細胞慢 性淋巴細胞性白血病(B-CLL)的個體的樣品建立複合標誌物分布，其中該靶蛋白選自由 ZAP-70、激活誘導的C型凝集素(AICL)和脂蛋白脂肪酶所構成的組，其中該複合分布代 表ZAP-70的相對量化水平；將該複合分布與一種或多種參照複合分布相比較，其中該比較 可以用於預測Ig-未突變B細胞慢性淋巴細胞性白血病(CLL)的臨床進程。
在一個實施方式中，通過將根據本發明方法的複合標誌物分布與一種或多種參照複合分 布相比較，可以提供一種用於診斷疑似患病個體的Ig-突變B細胞慢性淋巴細胞性白血病 (CLL)的方法，其中該比較可以用於預測Ig-突變B細胞慢性淋巴細胞性白血病(CLL)的 臨床過程。在另一個實施方式中，本發明可以提供一種預測個體Ig-突變B細胞慢性淋巴細胞
性白血病(CLL)臨床過程的方法，包括提供來源於個體的生物樣品；使生物樣品與結合 分子集反應，其中所述結合分子集含有兩組或者更多組對獨特的細胞群相關標誌物具有特異 性的結合分子，其中標誌物水平和標誌物結合可以鑑別樣品內部的正常和腫瘤性轉化細胞群； 通過檢測標誌物水平和標誌物結合情況，來鑑別樣品內部的正常和腫瘤性轉化細胞群的存在， 其中標誌物水平和結合情況可辨別樣品內部的正常和腫瘤性轉化細胞群；使正常細胞群和腫 瘤性轉化細胞群的標誌物水平與一靶蛋白的存在關聯起來，從而為來源於疑似患有B細胞慢 性淋巴細胞性白血病(B-CLL)的個體的樣品建立複合標誌物分布，其中該靶蛋白選自由 IM68532、 IM1286077和LCI15506所構成的組，其中該複合分布代表耙蛋白的相對量化水平； 將該複合分布與一種或多種參照複合分布相比較，其中該比較可以用於預測Ig-突變B細胞慢 性淋巴細胞性白血病(CLL)的臨床進程。
在另一個實施方式中，通過將根據本發明方法的複合標誌物分布與一種或多種參照複合 分布相比較，可以提供一種用於診斷疑似罹患CML個體的CML的方法，其中該比較可以用 於預測CML的臨床進程。通過將根據上述方法獲得的複合標誌物分布與一種或多種參照復 合分布相比較，可以提供一種用於診斷疑似罹患AML個體的AML的方法，其中該比較可以 用於預測AML的臨床進程。在再一個實施方式中，通過將根據上述方法獲得的複合標誌物 分布與一種或多種參照複合分布相比較，可以提供一種用於診斷疑似罹患ALL個體的ALL 的方法，其中該比較可以用於預測ALL的臨床進程。
在本發明的另一個實施方式中，製備用於特定血癌的複合標誌物分布的方法可以延伸至 預後方法。特別是，根據上述方法獲得的複合分布可以被用於為患有腫瘤性轉化狀態的個體 選擇合適的臨床處理和治療形式。
根據本發明方法的複合標誌物分布可以用於從無論治療與否都永遠不會發展至疾病較高 階段的個體中鑑別出預期對特定治療產生有效應答的個體。因此，本發明的複合體系可以用 於預測個體的臨床進展，儘管還是在疾病的常規階段，並且還可以幫助臨床醫生更好地評估 治療方法的選擇，而且通過較好地區分特定治療的效果，還會大大增強臨床研究價值。
通過將根據本發明方法的複合標誌物分布與一種或多種參照複合分布相比較，該複合標 志物分布可以用於預測疑似患有腫瘤性轉化狀態個體的任何腫瘤性轉化狀態的臨床進展，其 中該比較可以預測腫瘤性轉化狀態的臨床病程。通過將根據本發明方法的複合標誌物分布與 一種或多種參照複合分布相比較，該複合標誌物分布可以用於預測疑似患有血癌個體的血癌 的臨床進展，其中該比較可以預測血癌的臨床病程，所述血癌選自由慢淋巴細胞性白血病 (CLL)、急性髓性白血病(AML)、慢性髓系白血病(CML)和急性淋巴細胞性白血病(ALL)
所構成的組。
在一個實施方式中，通過將根據本發明方法的複合標誌物分布與一種或多種參照複合分 布相比較，該複合標誌物分布可以用於預測疑似患病個體的Ig-未突變B細胞慢性淋巴細胞性 白血病(CLL)的臨床進展，其中該比較可以預測Ig-未突變B細胞慢性淋巴細胞性白血病 (CLL)的臨床進程。因此，本發明可以提供一種預測個體Ig-未突變B細胞慢性淋巴細胞性 白血病(CLL)臨床進程的方法，其包括提供來源於個體的生物樣品；使生物樣品與結合 分子集反應，其中所述結合分子集含有兩組或者更多組對獨特的細胞群相關標誌物具有特異 性的結合分子，其中標誌物水平和標誌物結合可以鑑別樣品內部的正常和腫瘤性轉化細胞群； 通過檢測標誌物水平和標誌物結合情況，來鑑別樣品內部的正常和腫瘤性轉化細胞群的存在， 其中標誌物水平和結合情況可辨別樣品內部的正常和腫瘤性轉化細胞群；使正常細胞群和腫 瘤性轉化細胞群的標誌物水平與ZAP-70的存在關聯起來，從而為來源於疑似患有B細胞慢 性淋巴細胞性白血病(B-CLL)的個體的樣品建立複合標誌物分布，其中該複合分布代表 ZAP-70的相對量化水平；並且將該複合分布與一種或多種參照複合分布相比較，其中該比較 可以用於預測Ig-未突變B細胞慢性淋巴細胞性白血病(CLL)的臨床進程。
通過確定治療方案是否會帶來確實有效的作用或者是否值得冒相關的風險，根據本發明 方法的複合標誌物分布可用於幫助使用者為個體選擇一個攻擊性或試驗性治療方案。例如， 一些B-CLL病人死於治療和B-CLL的複合效應而不單是B-CLL。通過可以鑑別已經處於 B-CLL高級階段的B-CLL病人而不用依賴常規的Rai和Binet分級體系，根據本發明方法的 複合標誌物分布可用於幫助選擇更具攻擊性的治療方案，比如放療、化療、移植和免疫療法。
在另一個實施方式中，通過將根據本發明方法的複合標誌物分布與一種或多種參照複合 分布相比較，該複合標誌物分布可以用於預測疑似患有CML個體的CML的臨床進展，其中 該比較可以用於預測CML的臨床過程。在另一個實施方式中，通過將根據上述方法獲得的 複合標誌物分布與一種或多種參照複合分布相比較，該複合標誌物分布可以用於預測疑似患 有AML個體的AML的臨床進展，其中該比較可以用於預測AML的臨床過程。在再一個實 施方式中，通過將根據上述方法獲得的複合標誌物分布與一種或多種參照複合分布相比較， 該複合標誌物分布可以用於預測疑似患有CLL個體的CLL的臨床進展，其中該比較可以預 測CLL的臨床過程。
在又一個實施方式中，本發明的方法可以建立對監測患有血癌個體正在進行的治療有用 的複合分布。例如，對於CML病人，複合分布可以用於監測病人對格列衛(Gleevec)治療 的反應，而對於AML病人，則用於監測病人對抑制mTOR的雷帕黴素治療的反應。另外，
複合分布在藥物研發和分子耙向治療中也有作用。根據本文的公開，本領域技術人員應當理 解，本發明的方法對於建立的複合分布會有進一步的應用，比如包括，用於確定單個病人在 疾病的發生和/或發展階段不同信號轉導途徑的相對重要性，從而運用於個性化治療。
另一個方面，本發明還提供了一個試劑盒，其包含在本發明方法中有用的試劑，用於診 斷和檢測罹患腫瘤性轉化狀態例如白血病的個體的疾病階段。這裡指出的用於本發明方法的 材料期望適合於試劑盒製備。這樣的試劑盒可以包含攜帶工具，其劃分為可以緊密收容一種 或多種容器的限定空間，該容器著例如是藥瓶、試管和類似物，每樣容器都含有一個單獨的 用於本方法的組分。例如，容器之一可以包含有結合分子集，該結合分子集含有兩組或者更 多組對獨特的細胞群相關標誌物具有特異性的結合分子，該標誌物是或者可以被適合於診斷 和預後目的的標誌物所可檢測地標記。另外， 一個容器包含一種檢測靶蛋白的手段，它是或 者可以被適合於診斷和預後目的的標誌物所可檢測地標記。就診斷試劑盒而言，試劑盒還可 以有含有參照樣品、比較用的參照複合標誌物分布的圖標、緩衝液的容器和/或包含報告方法 的容器，該報告方法，例如，是結合於報告分子的生物素結合蛋白比如抗生物素蛋白或鏈黴 抗生物素蛋白，該報告分子例如是酶學或者螢光標記。如果需要，試劑盒還可以包括珠子， 其提供了用於證實系統組分完整性目的的外部對照。
除了化學原料，當然使用該試劑盒的說明書也包括在內，優選用於預後和診斷應用。說 明書可以寫在瓶子、試管和類似物上，或者寫在一張單獨的紙上，或者在容器的外部或內部。 說明書也可以是多媒體的形式，比如CD、電腦光碟、錄像等，其中標誌物的水平和標誌物的 結合可以鑑別樣品內部的正常細胞群與腫瘤性轉化細胞群。如果需要的話，該試劑盒可以包 括輔助性試劑，如酶抑制劑和/或信號發生試劑或系統。此外，其他的輔助試劑也可以包含在 該試劑盒內，比如，緩衝液、穩定劑以及類似物。
因此本發明提供了一種用於為來自疑有腫瘤性轉化狀態的個體的樣品建立複合標誌物分 布的試劑盒，該試劑盒包括有結合分子集，該結合分子集含有兩組或者更多組對獨特的細胞 群相關標誌物具有特異性的結合分子，該標誌物的水平和標誌物的結合可以鑑別樣品內部的 正常細胞群和腫瘤性轉化細胞群，並且結合分子對靶蛋白具有特異性，從而為來自疑有腫瘤 性轉化狀態的個體的樣品建立複合標誌物分布。腫瘤性轉化狀態可以進一步是血癌如白血病， 比如急性骨髓性白血病或急性髓細胞白血病(AML)、慢性骨髓性白血病或慢性髓細胞白 血病(CML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性淋巴細胞性白血病(ALL)、毛細胞白血 病(HCL)、骨髓增生異常症候群(MDS)或慢性骨髓性白血病(CML-BP)。
更具體的說，本發明提供了一種用於為來自疑有B-CLL狀態的個體的樣品建立複合標誌
物分布的試劑盒，該試劑盒包括有結合分子集，該結合分子集含有兩組或者更多組對獨特的 細胞群相關標誌物具有特異性的結合分子，該標誌物的水平和標誌物的結合可以鑑別樣品內 部的正常細胞群和腫瘤性轉化細胞群，並且結合分子對ZAP-70或者其他靶信號轉導蛋白(包 括但不限制於本文公開的靶蛋白)具有特異性，從而為從疑有B-CLL的個體所獲得的樣品建 立複合標誌物分布。
通過使用該試劑盒，可以為多種類型臨床樣品建立複合分布，該樣品可以包括全血(用 任一可用試劑或試劑盒處理，以固定和透化白細胞並溶解紅細胞)、骨髓、外周血單核細胞 (PBMC's)、腹水等。那些含有顯著水平紅細胞的生物樣品應該接受處理以移除紅細胞(低 滲溶解、清潔劑處理、密度梯度離心，等)，然後與細胞群標誌物反應，接著用適當的試劑(試 劑盒中提供)固定和透化白細胞。接著細胞群與表徵(細胞內)信號轉導、增殖、凋亡等的 標誌物反應，並通過適當的技術(如流式細胞術、影像分析、手工顯微鏡檢等)進行分析。
可以理解，那些不會實質性影響本發明的各種具體實施方式
的活性的修飾也包括在本發 明限定的範圍內。因此，以下實施例是為了說明但不是為了限制本發明。
實施例l 製備用於建立複合分布的樣品
本實施例顯示了用於為疑有B細胞慢性淋巴細胞性白血病(B-CLL)的個體建立複合分 布的樣品的製備過程。
概括地說，將混和有細胞表面標誌物CD5-FITC、 +CD3-ECD、 +CD56-PC5、 +CD19-PC7 的l(Hd試劑加入小管，並加入100nl全血。室溫孵育20min，加入64pl固定液(10%甲醛) 後室溫孵育10min。接著，加入lmL裂解/透化試劑(0.1% Triton X-IOO)，室溫孵育30min 後離心。用緩衝液(含有2%BSA的PBS)洗滌細胞兩次，用lOpl抗-ZAP-70-PE和90pl的 緩衝液重懸，室溫孵育30min，然後用緩衝液洗滌一次，用含有0.1%多聚甲醛的緩衝液重懸。 然後將樣品用流式細胞儀分析。圖1顯示了用於建立複合標誌物分布方法的樣品製備的示例 性模式圖。
實施例2 用於建立複合分布的樣品的分析
本實施例顯示了用流式細胞儀分析樣品以建立複合分布。
如圖2所示，採用ZAP-70門控/分析算法按如下方法建立複合分布第一閘門正常全血 樣品用於通過光散射鑑別淋巴細胞(藍色加綠色)，如左上方直方圖所示。如果需要的話，
CD45側向散射(線性刻度)可以用來為外周血中CD45-亮型淋巴細胞設門以進行CD4計數， 同時CD45側向散射(對數刻度)可以用來鑑定骨髓中胚細胞群以進行顯型。圖2中，CD19 相對CD5的直方圖鑑別了正常B細胞(紫色，左上象限)、正常T細胞(藍色，右下象限) 和正常外周血中的"前"B細胞(CD19+5+，右上象限)。B-CLL腫瘤性轉化細胞也落入右上 象限，但是與它們的正常細胞相比，B-CLL腫瘤性轉化細胞不表達ZAP-70。圖2的底部展示 了疊加的散點圖，綜合了複合分布並且展示了B-CLL細胞落入該直方圖(ZAP-70表達)，與 內源性正常B細胞(CD19+)、正常T細胞(CD5+3+)和NK細胞(CD56+)相關。圖3顯 示了用流式細胞儀由用於CLL樣品中ZAP-70分析的門控策略而得到的面板。圖4展示的圖 描述了一例CLL樣品中存在的細胞空間中ZAP-70的表達情況。(紅色B細胞；綠色正常
T細胞；紫色NK細胞)。
圖5展示了描述一例AML樣品中mTOR激活S6的流式細胞儀面板。 圖6為外周血中動員幹細胞(CD34+)的複合分布。直方圖提供了與未處理樣品(紅) 相比，在用PMA (藍)、幹細胞因子(綠)、或IGF-1 (橙)激活後每個動員幹細胞、正常粒 細胞、正常單核細胞和正常淋巴細胞中三種不同的信號傳導蛋白P-ERK、 P-S6和P-PKB/AKT 的反應情況比較。圖中顯示了體內首次處理以動員幹細胞(CD34+)的(人)全血樣品。左 邊的兩幅直方圖展示了 CD34+幹細胞(底部)和正常粒細胞、單核細胞和淋巴細胞(頂部) 如何被鑑別。在這些實驗中，單個供體的多份樣品用能刺激信號轉導通路的下述因子進行了 處理(體外)PMA (藍)、幹細胞因子(綠)、或IGF-1 (橙)，並與未處理樣品(紅)相對 比。右邊的組圖展示了三種不同的信號傳導蛋白P-ERK、 P-S6和P-PKB/AKT的反應(或缺 失)情況。這些結果將CD34+幹細胞的反應與內部參照細胞(淋巴細胞、粒細胞和單核細胞) 群相比較，並證實了 CD34+細胞對這三種刺激產生了反應。
圖7顯示了單個AML患者的複合分布。等分血樣用PMA刺激，用或者不用特異性信號 轉導通路抑制劑(圖例見右下角)刺激，或用幹細胞因子刺激。反應結果用P-ERK對P-S6 的雙邊量散點圖檢測(右側面板)，紅色群表示AML胚細胞，藍色表示內在淋巴細胞，綠色 表示內在粒細胞。AML胚細胞(紅)、淋巴細胞(藍)和粒細胞(綠)通過使用左邊兩個框 中描述的CD34側向散射來鑑定。P-ERK和P-S6在未處理(從頂部向下排列)、PMA處理、 PMA+U0126 (P-ERK抑制劑)、PMA+Rapamysin (mT0R〉S6抑制劑)、PMA+Ly294002 (PKB/AKT抑制劑)和幹細胞因子處理(底部)的全血樣品中的表達水平如圖所示。在所有 的P-表位直方圖中，長柱揭示了P-ERK和P-S6在未刺激樣品中的水平，即為"基礎"表達。 直方圖展示了不同的處理方式對AM1胚細胞(紅)相比淋巴細胞(藍)和粒細胞(綠)的效
果比較。
圖8顯示了CLL複合分布。樣品中的B細胞陰性峰和陽性峰表現一致，NK細胞陽性峰 的表達比ZAP70強陽性的樣品更高，與樣品的一致性較低。ZAP70+CLL具有0.2。/。"正常B 細胞"，但該罕見的結果與其餘樣品中陰性峰的現象相當。中度表達ZAP70的CLL和正常 的B細胞-S/N2.15之間存在明顯的位移。
在該申請的全文中，如括號內所示，引用了不同的著作。本申請中將所有這些出版物的
公開合併為參考，以便對本發明所屬領域中的現有技術作出更全面的描述。
雖然本發明已經用公開的具體實施方式
作出了描述，本領域的技術人員很容易領悟這些
具體的實施例和以上的研究細節只是用於說明本發明。在不違背本發明的宗旨的情況下，可
以對本發明作出各種的修飾。因此，本發明要求附後的權利。
權利要求
1. 一種為來自疑有腫瘤性轉化狀態的個體的樣品建立複合標誌物分布的方法，該方法包括以下步驟(a)使生物樣品與結合分子集反應，其中所述結合分子集含有兩組或更多組對獨特的細胞群相關標誌物具有特異性的結合分子，其中標誌物的水平和標誌物的結合可以鑑別樣品內部的正常細胞群和腫瘤性轉化細胞群；(b)通過檢測標誌物水平和標誌物結合情況，來鑑別樣品內部的正常細胞群和腫瘤性轉化細胞群的存在，所述標誌物水平和結合情況可鑑別樣品內部的正常和腫瘤性轉化細胞群；以及(c)將每個正常細胞群和腫瘤性轉化細胞群的標誌物水平與一靶蛋白的存在關聯起來，從而為來自疑有腫瘤性轉化狀態的個體的樣品建立複合標誌物分布。
2. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述靶蛋白為活化磷酸化信號轉導蛋白。
3. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，進一步包括確定靶蛋白修飾方式。
4. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述癌選自由慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、 急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴細胞性白血病(ALL) 所構成的組。
5. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述細胞群相關標誌物包括選自下組的細胞 表面標誌物CD3、 CD5、 CDIO、 CDllb、 CD13、 CD15、 CD14、 CD15、 CD16、 CD19、 CD22、 CD23、 CD56、 CD45、 CD33、 CD34、 CD15、 CD16、 MPL (髓過氧化物酶)、CD64、 CD79a、 CD79b禾卩CD117 (c-kit受體)。
6. 如權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述標誌物進一步包括K-和X-免疫球蛋白輕 鏈以用於檢測克隆性。
7. 如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述癌為B細胞慢性淋巴細胞性白血病 (B-CUJ 。
8. 如權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述靶蛋白選自由ZAP-70、激活誘導的C-型凝集素(AICL)、脂蛋白脂肪酶以及IM68532所構成的組。
9. 如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述B細胞慢性淋巴細胞性白血病(B-CLL) 是Ig-突變的B-CLL。
10. 如權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述細胞群相關標誌物選自由CD3、 CD5、 CD19、 CD23、 CD38、 CD56、 CD79b和ftnc7所構成的組。
11. 如權利要求10所述的方法，其特徵在於，所述細胞群相關標誌物可以鑑定包括白血 病B細胞的細胞群。
12. 如權利要求ll所述的方法，其特徵在於，所述白血病B細胞呈ZAP-70陽性。
13. 如權利要求10所述的方法，其特徵在於，所述的一種或多種細胞群包括ZAP-70陰 性細胞群。
14. 如權利要求10所述的方法，其特徵在於，所述的一種或多種細胞群包括正常B細胞。
15. 如權利要求13所述的方法，其特徵在於，所述ZAP-70陰性細胞群包括粒細胞。
16. —種用於預測個體Ig未突變B細胞慢性淋巴細胞性白血病(CLL)臨床進程的方法， 該方法包括以下步驟(a) 提供來自於該個體的生物樣品；(b) 使生物樣品與結合分子集反應，其中所述結合分子集含有兩組或更多組對獨特的細 胞群相關標誌物具有特異性的結合分子，其中標誌物的水平和標誌物的結合可以鑑別樣品內 部的正常細胞群和腫瘤性轉化細胞群；(c) 通過檢測標誌物水平和標誌物結合情況，來鑑別樣品內部的正常細胞群和腫瘤性轉 化細胞群的存在，所述標誌物水平和結合情況可鑑別樣品內部的正常和腫瘤性轉化細胞群；(d) 將每個正常細胞群和腫瘤性轉化細胞群的標誌物水平與至少一種信號轉導蛋白的存 在關聯起來，從而為來自疑有B細胞慢性淋巴細胞性白血病(B-CLL)的個體的樣品建立復 合標誌物分布，其中該複合分布代表了所述信號轉導蛋白水平的相對量化；以及(e) 將該複合分布與一種或多種參照複合分布相比較，其中該比較可以用於預測Ig未 突變的B細胞慢性淋巴細胞性白血病(CLL)的臨床進程。
17. —種為從疑有慢性骨髓性白血病(CML)的個體所獲得的樣品建立複合標誌物分布 的方法，該方法包括以下步驟(a) 使生物樣品與結合分子集反應，其中所述結合分子集含有兩組或更多組對獨特的細 胞群相關標誌物具有特異性的結合分子，其中標誌物的水平和標誌物的結合可以鑑別樣品內 部的正常細胞群和腫瘤性轉化細胞群；(b) 通過檢測標誌物水平和標誌物結合情況，來鑑別樣品內部的正常細胞群和腫瘤性轉 化細胞群的存在，其中標誌物水平和結合情況可鑑別樣品內部的正常和腫瘤性轉化細胞群； 以及(c) 將每個正常細胞群的和腫瘤性轉化細胞群的標誌物水平與至少一種靶蛋白的存在關 聯起來，從而為來自疑有慢性骨髓性白血病(CML)的個體的樣本建立複合標誌物分布，其 中所述靶蛋白選自由活化磷酸化信號轉導蛋白、增殖標誌物、分化標誌物和凋亡標誌物所構 成的組。
18. 如權利要求17所述的方法，其特徵在於，所述細胞群相關標誌物選自由CD45、CD34、 CDllb、 CD13、 CD15、 CD14、 CD33、 CD79a、 CD79b、 CD22、 CDIO、 CD16、 Bcr/Abl禾口 TdT所構成的組。
19. 如權利要求17所述的方法，其特徵在於，所述靶蛋白是活化磷酸化信號轉導蛋白。
20. 如權利要求19所述的方法，其特徵在於，所述活化磷酸化信號轉導蛋白選自由Abl、 CRKL、 Hck、 STAT1、 STAT3、 STAT5、 Akt/PKB以及S6所構成的組。
21. 如權利要求17所述的方法，其特徵在於，所述靶蛋白是增殖標誌物或凋亡標誌物。
22. 如權利要求21所述的方法，其特徵在於，所述靶蛋白是選自由細胞周期蛋白D1和 細胞周期蛋白A2所構成的組的增殖標誌物。
23. 如權利要求21所述的方法，其特徵在於，所述靶蛋白是選自由胱天蛋白酶-3和Bcl-Xl 所構成的組的凋亡標誌物。
24. —種為個體預測慢性骨髓性白血病(CML)的臨床進程的方法，該方法包括以下步驟(a) 提供來自於該個體的生物樣品；(b) 使生物樣品與結合分子集反應，其中所述結合分子集含有兩組或更多組對獨特的細 胞群相關標誌物具有特異性的結合分子，其中標誌物的水平和標誌物的結合可以鑑別樣品內 部的正常細胞群和腫瘤性轉化細胞群；(C)通過檢測標誌物水平和標誌物結合情況，來鑑別樣品內部的正常細胞群和腫瘤性轉 化細胞群的存在，其中所述標誌物水平和結合情況可鑑別樣品內部的正常和腫瘤性轉化細胞 群；(d) 將每個正常細胞群的和腫瘤性轉化細胞群的標誌物水平與至少一種靶蛋白的存在關 聯起來，從而為從疑有慢性骨髓性白血病(CML)的個體所獲得的樣品建立複合標誌物分布， 其中所述靶蛋白選自由活化磷酸化信號轉導蛋白、增殖標誌物和凋亡標誌物所構成的組；以 及(e) 將該複合分布與一種或多種參照複合分布相比較，其中該比較可以用於預測慢性骨 髓性白血病(CML)的臨床進程。
25. —種為從疑有急性骨髓性白血病(AML)的個體所獲得的樣品建立複合標誌物分布 的方法，該方法包括以下步驟(a) 使生物樣品與結合分子集反應，其中所述結合分子集含有兩組或更多組對獨特的細 胞群相關標誌物具有特異性的結合分子，其中標誌物的水平和標誌物的結合可以鑑別樣品內 部的正常細胞群和腫瘤性轉化細胞群；(b) 通過檢測標誌物水平和標誌物結合情況，來鑑別樣品內部的正常細胞群和腫瘤性轉 化細胞群的存在，其中所述標誌物水平和結合情況可鑑別樣品內部的正常和腫瘤性轉化細胞 群；以及(c) 將每個正常細胞群的和腫瘤性轉化細胞群的標誌物水平與至少一種靶蛋白的存在關 聯起來，從而為來自疑有急性骨髓性白血病(AML)的個體的樣品建立複合標誌物分布，其 中所述靶蛋白選自由活化磷酸化信號轉導蛋白、增殖標誌物和凋亡標誌物所構成的組。
26. 如權利要求25所述的方法，其特徵在於，所述細胞群相關標誌物選自由CD45、CD33、 CD34、 CDllb、 CD13、 CD14、 CD15、 CD16、 MPL (髓過氧化物酶)、CD64和CD117 (c-kit受體)所構成的組。
27. 如權利要求26所述的方法，其特徵在於，所述細胞群相關標誌物可以鑑別包含白血 病粒細胞或白血病單核細胞的細胞群。
28. 如權利要求25所述的方法，其特徵在於，所述靶蛋白是活化磷酸化信號轉導蛋白。
29. 如權利要求25所述的方法，其特徵在於，所述活化磷酸化信號轉導蛋白選自由Abl、 CRKL、 Hck、 STAT1、 STAT3、 STAT5、 Akt/PKB以及S6所構成的組。
30. 如權利要求48所述的方法，其特徵在於，所述靶蛋白是增殖標誌物或凋亡標誌物。
31. 如權利要求30所述的方法，其特徵在於，所述靶蛋白是選自由細胞周期蛋白D1和 細胞周期蛋白A2所構成的組的增殖標誌物。
32. 如權利要求30所述的方法，其特徵在於，所述的該靶蛋白是選自由胱天蛋白酶-3和 Bcl-Xl所構成的組的凋亡標誌物。
33. —種為個體預測急性骨髓性白血病(AML)的臨床進程的方法，該方法包括以下步驟(b) 使從該個體獲得的生物樣品與結合分子集反應，其中所述結合分子集含有兩組或更 多組對獨特的細胞群相關標誌物具有特異性的結合分子，其中標誌物的水平和標誌物的結合 可以鑑別樣品內部的正常細胞群和腫瘤性轉化細胞群；(c) 通過檢測標誌物水平和標誌物結合情況，來鑑別樣品內部的正常細胞群和腫瘤性轉 化細胞群的存在，其中所述標誌物水平和結合情況可鑑別樣品內部的正常和腫瘤性轉化細胞 群；(d) 將每個正常細胞群和腫瘤性轉化細胞群的標誌物水平與至少一種靶蛋白的存在關聯 起來，從而為從疑有急性骨髓性白血病(AML)的個體所獲得的樣品建立複合標誌物分布， 其中所述耙蛋白選自由活化磷酸化信號轉導蛋白、增殖標誌物和凋亡標誌物所構成的組；以 及(e) 將該複合分布與一種或多種參照複合分布相比較，其中該比較可以用於預測急性骨 髓性白血病(AML)的臨床過程。
34. —種試劑盒，用於建立如權利要求l所述的複合標誌物分布，該試劑盒包括(a) 結合分子集合，其中該結合分子集含有兩組或者更多組對獨特的細胞群相關標誌物 具有特異性的結合分子，其中該標誌物的水平和標誌物的結合可以鑑別樣品內部的正常細胞 群和腫瘤性轉化細胞群，以及(b) 至少一種對靶蛋白具有特異性的結合分子，用於為來自疑有腫瘤性轉化狀態的個體 的樣品建立複合標誌物分布。
35. 如權利要求34所述的試劑盒，其特徵在於，所述腫瘤性轉化狀態選自由白血病、淋 巴瘤和多種骨髓瘤所構成的組。
36. 如權利要求35所述的試劑盒，其特徵在於，所述白血病選自由慢性淋巴細胞性白血 病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)和急性淋巴細胞性白 血病(ALL)所構成的組。
37. 如權利要求34所述的試劑盒，其特徵在於，所述細胞群相關標誌物包括細胞表面標 志物。
38. 如權利要求37所述的方法，其特徵在於，所述細胞表面標誌物選自由CD3、 CD5、 CDIO、 CDllb、 CD13、 CD15、 CD14、 CD15、 CD16、 CD19、 CD22、 CD56、 CD45、 CD33、 CD34、 CD15、 CD16、 MPL (髓過氧化物酶)、CD64、 CD79a、 CD79b和CDU7 (c-kit受體)所構成的組。
全文摘要
本發明的目的在於提供一種為來自疑有腫瘤性轉化狀態的個體的樣品建立複合標誌物分布的方法。本發明的複合標誌物分布可以用於鑑別個體的腫瘤性轉化狀態相關亞群的預後和治療、以及預測個體的疾病進程。本發明的方法為罹患腫瘤性轉化狀態的個體提供用於選擇治療方式的工具，包括確定危險人群的方法、預測復發風險增加的方法、預測發生繼發性併發症風險增加的方法、為個體選擇治療方案的方法、確定對個體治療效果的方法、確定個體的預後的方法。特別地，本發明的方法公開了一種建立複合標誌物分布的方法，其可用作預後指示來預測個體腫瘤性轉化狀態的進程是攻擊性還是惰性，從而幫助臨床工作者處理病人和評估將要使用的治療形式。在特別公開的實施方式中，本發明的目的在於建立用於白血病的複合標誌物分布，該白血病選自由慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴細胞性白血病(CML)和急性骨髓性白血病(ALL)所構成的組。
文檔編號G01N33/53GK101389959SQ200680040388
公開日2009年3月18日 申請日期2006年11月2日 優先權日2005年11月4日
發明者戴維·赫德利, 文森特·T·尚奇, 斯坦利·沙克尼, 查爾斯·古爾斯比, 詹姆斯·雅克伯格 申請人:貝克曼考爾特公司;西北大學;健康網絡大學;西儲大學;阿勒格尼辛格研究所