重組人血小板生成素/幹細胞因子融合蛋白及其製備的製作方法

2023-06-30 18:32:01 1

專利名稱：重組人血小板生成素/幹細胞因子融合蛋白及其製備的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因工程製備多肽藥物技術領域。
二.技術背景血小板是參與凝血作用的關鍵成分，造血幹細胞首先經過逐步分化成為巨核系定向祖細胞，然後再分化為成熟的巨核細胞，最後裂解產生血小板。這一複雜的分化成熟過程受眾多造血因子調控，同時也受造血幹細胞與細胞外基質及周圍的骨髓細胞之間的相互作用影響。目前，一致認為血小板生成素(Thrombopoietin，TPO)是調節巨核細胞生成和增殖的最重要的細胞因子，它與IL-3，SCF共同作用，促使造血幹細胞分化為定向的巨核細胞，然後在TPO、IL-3、SCF、IL-6、IL-11等因子參與下發育成為成熟的巨核細胞[Rasko JE Inter.J.Biochem.Cell.Biol.1998，30657]。1994年後Bartley等先後克隆得到TPO的cDNA基因，為治療血小板缺乏症展示了希望[Bartley TD，et al.Cell，1994，77(7)1117]。天然的人TPO全長332個胺基酸，其N端的153個胺基酸有完全的TPO受體結合活性和生物活性，而C端部分包含有多個糖基化位點，主要與成熟TPO的分泌有關，同時也與TPO在人體內的半衰期有關。rhTPO雖然能快速提高體內血小板的水平，但是血小板穩定的時間不長，效果不理想。
人幹細胞因子(SCF)是促進造血幹/祖細胞存活的細胞因子，可以抑制造血幹細胞的凋亡[Domen J.，et al.J.Exp.Med.(2000)1921707-1718]。SCF能夠在多級造血水平上與包括TPO在內的其他細胞因子協同作用促進造血幹/祖細胞及各種血細胞的增殖和存活。SCF雖然不能單獨促進巨核細胞的生長或增殖，但是在TPO存在時，SCF有很強的協同作用，能有效的提高巨核細胞的增殖的速度和延長生存時間。
構建由不同造血細胞因子組成的融合蛋白可以改善使用單一細胞因子的不足。TPO/SCF融合蛋白除了能夠提高巨核細胞的增殖的速度和延長生存時間外，其SCF基團還可以充分發揮其促進造血幹細胞存活的功能，防止由於幹細胞或巨核細胞的前體細胞供應不足而導致血小板升高後又迅速下降。
三.

發明內容
本發明需要解決的問題是構建一種重組人血小板生成素/幹細胞因子(rhTPO/SCF)雙功能蛋白基因，並採用與穀胱甘肽硫轉移酶基因融合表達的方式在Sf9細胞中高效表達並分離純化重組蛋白，以達到可應用水平，使之成為一種性能比TPO更好的恢復血小板水平的藥物。
本發明的技術內容包括1.重組人血小板生成素/幹細胞因子雙功能融合蛋白基因的設計與構建。2.高效表達融合型GST-rhTPO/SCF的重組苜蓿夜蛾核型多角體病毒AcNPV-rhTPO/SCF的構建。3.rhTPO/SCF在Sf9細胞中的表達及分離純化和鑑定。
1.天然的TPO全長332個胺基酸，天然的分泌型可溶性SCF為165個胺基酸。我們設計的rhTPO/SCF雙功能蛋白基因是含有TPO的1-157位胺基酸、16個胺基酸的連接肽、SCF的1-145位胺基酸編碼序列和終止密碼的DNA片段。其DNA序列和胺基酸序列如下AGC CCG GCT CCT CCT GCT TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTA CTT CGT GAC TCC CAT 60Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His 20GTC CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA CCT GTC CTG 120Val Leu His Ser Arg Leu Ser Asn Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu 40CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC CAG ATG GAG GAG ACC AAG GCA 180Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Asn Met Glu Glu Thr Lys Ala 60CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA 240Asn Asp Ile Leu Gly Aal Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Asn 80CTG GGA CCC ACT TGC CTC TCA TCC CTC CTG GGG CAA CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC 300Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Asn Leu Ser Gly Asn Val Arg Leu Leu 100CTT GGG GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG ACC ACA GCT 360Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Asn Leu Pro Pro Asn Gly Arg Thr Thr Ala 120CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC CTG CTC CGA GGA AAG GTG CGT 420His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg 140TTC CTG ATG CTT GTA GGG GGG TCA ACA CTA TGT GTC AGG CGG GCC CCA CCC GGA GGA GGA 480Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Gly Gly Gly 160GGT TCC CCG GGC GGA TCC GGA GGA GGA GGC TCC GGC GGC GAA GGG ATC TGC AGG AAT CGT 540Gly Ser Pro Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Glu Gly Ile Cys Arg Asn Arg 180GTG ACT AAT AAT GTA AAA GAC GTC ACT AAA TTG GTG GCA AAT CTT CCA AAA GAC TAC ATG 600
Val Thr Asn Asn Val Lys Asp Val Thr Lys Leu Val Ala Asn Leu Pro Lys Asp Tyr Met 200ATA ACC CTC AAA TAT GTC CCC GGG ATG GAT GTT TTG CCA AGT CAT TGT TGG ATA AGC GAG 660Ile Thr Leu Lys Tyr Val Pro Gly Met Asp Val Leu Pro Ser His Cys Trp Ile Ser Glu 220ATG GTA GTA CAA TTG TCA GAC AGC TTG ACT GAT CTT CTG GAC AAG TTT TCA AAT ATT TCT 720Met Val Val Gln Leu Ser Asp Ser Leu Thr Asp Leu Leu Asp Lys Phe Ser Asn Ile Ser 240GAA GGC TTG AGT AAT TAT TCC ATC ATA GAC AAA CTT GTG AAT ATA GTG GAT GAC CTT GTG 780Glu Gly Leu Ser Asn Tyr Ser Ile Ile Asp Lys Leu Val Asn Ile Val Asp Asp Leu Val 260GAG TGC GTG AAA GAA AAC TCA TCT AAG GAT CTA AAA AAA TCA TTC AAG AGC CCA GAA CCC 840Glu Cys Val Lys Glu Asn Ser Ser Lys Asp Leu Lys Lys Ser Phe Lys Ser Pro Glu Pro 280AGG CTC TTT ACT CCT GAA GAA TTC TTT AGA ATT TTT AAT AGA TCC ATT GAT GCC TTC AAG 900Arg Leu Phe Thr Pro Glu Glu Phe Phe Arg Ile Phe Asn Arg Ser Ile Asp Ala Phe Lys 300GAC TTT GTA GTG GCA TCT GAA ACT AGT GAT TGT GTG GTT TCT TCA ACA TTA AGT TAG TAA 960Asp Phe Val Val Ala Ser Glu Thr Ser Asp Cys Val Val Ser Ser Thr Leu Ser 320rhTPO/SCF基因的構建流程如圖1所示，以pUC18-SCF為模板，用引物1，2經PCR法合成5』端帶BamHI酶切位點和部分連接肽(GSGGGGSGG)的編碼序列，3』端帶兩個連續終止密碼子和HindIII酶切位點的含有SCF第1-145位胺基酸編碼序列的基因片段，並將其克隆入pBluscript質粒載體的BamHI和HindIII位點之間，得到質粒pBluscript-3』SCF。然後以pUC18-TPO為模板，用引物3，4經PCR法，在pfu高溫聚合酶的催化下，合成5』端帶XbaI和BglII位點，3』端帶部分連接肽(GGGGSPG)的編碼序列，含有TPO的第1-157位胺基酸密碼子的基因片段，該片段的末端為平端，經XbaI酶切後，克隆入pBluscript-3』SCF的XbaI和BamHI位點之間(pBluscript-3』SCF先經BamHI酶切，Klenow補平，再用XbaI酶切)，得到pBluscript-TS。在該重組質粒中，TPO的第1-157位胺基酸的編碼序列與SCF的第1-145位胺基酸的編碼序列通過16個胺基酸(GGGGSPGGSGGGGSGG)的連接肽編碼區連接，從而獲得TPO/SCF雙功能蛋白基因，全長960bp。經測序證明，得到的基因序列與設計完全一致。(測序結果見附圖2，3)。
引物15』CCGGATCCGGAGGAGGAGGCTCCGGCGGCGAAGGGATCTGCAGGAATCGT 3』引物25』GGAAGCTTTTACTAACTTAATGTTGAAGAAAC 3』引物35』CCTCTAGATCTAGCCCGGCTCCTCCTGCT 3』引物45』CGCCCGGGGAACCTCCTCCTCCGGGTGGGGCCCGCCTGAC 3』1.pBluscript-TS經HindIII酶切，Klenow補平，BglII酶切後得到TPO/SCF基因片段，並克隆於杆狀病毒載體pAcSecG2T(PharMingen International)的BamHI和SmaI位點之間得到pAcSecG2T-TS。將上述重組轉移載體DNA與野生型苜蓿夜蛾核型多角體病毒DNA用脂質體介導法共轉染草地夜蛾細胞Sf9，經細胞內同源重組和4輪有限稀釋法純化並結合重組蛋白的體外活性測定，篩選出高效表達GST-rhTPO/SCF的重組病毒AcNPV-rhTPO/SCF。
2.將重組病毒以合適的感染複數(MOI)感染生長狀態良好的Sf9細胞，感染後48小時收集細胞，懸浮於1×PBS溶液，超聲破碎細胞，離心後，取上清液用於Glutathione Sephrose4B柱親和層析(Amersham Pharmacia Biotech Inc)，分離純化得到GST-TPO/SCF，最後經凝血酶切割和再次Glutathione Sephrose4B柱親和層析即可獲得重組人血小板生成素/幹細胞因子雙功能蛋白精品(圖4)。
本發明構建的rhTPO/SCF雙功能基因將一段截短的TPO基因(1-157位胺基酸)和一段截短的SCF單體基因(1-145位胺基酸)用一段16肽(GGGGSPGGSGGGGSGG)編碼序列以頭尾連接方式連接形成新型人血小板生成素/幹細胞因子雙功能融合蛋白基因。該基因在昆蟲細胞中表達的產物在保持TPO活性的同時，由於同時具有TPO受體和SCF受體的結合能力，能夠有效的促進造血幹細胞的存活，刺激造血幹細胞向巨核細胞的分化和增殖，改善單獨使用TPO時，血小板升高太快和血小板水平恢復後穩定時間短的問題。
構建的重組病毒按本發明所述方法感染單層Sf9細胞，收集細胞，細胞內累積的重組蛋白表達量約為0.5mg/L。
按本發明提供的分離純化方法從Sf9細胞中獲得的rhTPO/SCF，經SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色檢測，呈分子量約35KD的一條帶，純度大於90％。用於TF1細胞增殖實驗，測定其比活為2.0×105units/mg；用於Mo7e細胞增殖實驗，測定其比活為8.3×105units/mg。
四.


附圖1人血小板生成素/幹細胞因子基因的構建流程圖附圖2rhTPO/SCF基因的測序結果(3』端測序結果)附圖3rhTPO/SCF基因的測序結果(5』端測序結果)附圖4SDSPAGE電泳圖譜
a)Glutathione Sephrose4B親和柱層析洗脫峰b)Glutathione Sephrose4B親和柱層析洗脫峰經凝血酶切刻後的產物c)穀胱甘肽硫轉移酶d)rhTPO/SCFM.分子量標準蛋白五.具體實施方式
1.pUC18-SCF為模板，用引物1，2經PCR法合成SCF基因片段並將其克隆入pBluscript質粒載體，得到pBluscript-3』SCF質粒，然後以pUC18-TPO為模板，用引物3，4經PCR法合成TPO基因片段並將其克隆入pBluscript-3』SCF質粒載體，得到pBluscript-TS質粒。經測序證明，結果與設計序列完全一致。(流程見附圖1)2.將pBluscript-TS質粒酶切，得到TPO/SCF基因片段，並插入AcNPV轉移載體pAcSecG2T，得到重組轉移載體pAcSecG2T-TS。將pAcSecG2T-TS與AcNPV DNA共轉染Sf9，經篩選並結合測活選出不含野生型病毒的重組病毒AcNPV-rhTPO/SCF。
3.取倍增時間為21小時，活細胞佔90％，密度為6×105細胞/mL的單層Sf9細胞，按感染複數(MOI)＝10感染重組病毒1小時後，傾去病毒液，換成新鮮的培養基。27℃培養48小時後，離心收集細胞，懸浮於1×PBS，超聲破碎細胞後，12,000離心20分鐘。收集離心後的上清液以1mL/min流速上樣至2mL的Glutathione Sephrose4B層析柱，層析柱預先用1×PBS平衡。上樣後，先用1×PBS洗至基線，而後用洗脫液(pH8.0，50mM Tris-Cl，10mM還原型穀胱肽)以1mL/min的流速洗脫，收集洗脫峰10mL。洗脫液對蒸餾水透析並凍幹，凍幹後，溶於300μl×PBS，再加入5單位的凝血酶，22℃酶切16小時，再以1mL/min流速上樣至2mL的Glutathione Sephrose4B層析柱，收集穿過峰，對蒸餾水透析後凍幹，得到TPO/SCF雙功能蛋白精品。還原條件SDS-PAGE後經考馬斯亮藍染色檢測，rhTPO/SCF呈分子量約35KD的一條帶，純度大於90％。免疫印跡(Westenblotting)分析結果與其一致。
序列列表.txt重組人血小板生成素/幹細胞因子基因序列表110申請人的姓名或名稱南京大學120發明名稱重組人血小板生成素/幹細胞因子雙功能融合蛋白160序列表中序列的個數1210序列標識符1211序列的長度960212序列的類型DNA213生物體人(Homo sapiens)400核苷酸序列和胺基酸序列AGC CCG GCT CCT CCT GCT TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTA CTT CGT GAC TCC CAT 60Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His 201 6 11 16GTC CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA CCT GTC CTG 120Val Leu His Ser Arg Leu Ser Asn Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu 4021 26 31 36CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC CAG ATG GAG GAG ACC AAG GCA 180Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Asn Met Glu Glu Thr Lys Ala 6041 46 51 56CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA 240Asn Asp Ile Leu Gly Aal Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Asn 8061 66 71 76CTG GGA CCC ACT TGC CTC TCA TCC CTC CTG GGG CAA CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC 300Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Asn Leu Ser Gly Asn Val Arg Leu Leu 10081 86 91 96CTT GGG GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG ACC ACA GCT 360Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Asn Leu Pro Pro Asn Gly Arg Thr Thr Ala 120101 106 111 116CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC CTG CTC CGA GGA AAG GTG CGT 420His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg 140121 126 131 136TTC CTG ATG CTT GTA GGG GGG TCA ACA CTA TGT GTC AGG CGG GCC CCA CCC GGA GGA GGA 480Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Gly Gly Gly 160141 146 151 156GGT TCC CCG GGC GGA TCC GGA GGA GGA GGC TCC GGC GGC GAA GGG ATC TGC AGG AAT CGT 540Gly Ser Pro Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Glu Gly Ile Cys Arg Asn Arg 180161 166 171 176GTG ACT AAT AAT GTA AAA GAC GTC ACT AAA TTG GTG GCA AAT CTT CCA AAA GAC TAC ATG 600Val Thr Asn Asn Val Lys Asp Val Thr Lys Leu Val Ala Asn Leu Pro Lys Asp Tyr Met 200181 186 191 196ATA ACC CTC AAA TAT GTC CCC GGG ATG GAT GTT TTG CCA AGT CAT TGT TGG ATA AGC GAG 660Ile Thr Leu Lys Tyr Val Pro Gly Met Asp Val Leu Pro Ser His Cys Trp Ile Ser Glu 220201 206 211 216ATG GTA GTA CAA TTG TCA GAC AGC TTG ACT GAT CTT CTG GAC AAG TTT TCA AAT ATT TCT 720Met Val Val Gln Leu Ser Asp Ser Leu Thr Asp Leu Leu Asp Lys Phe Ser Asn Ile Ser 240221 226 231 236GAA GGC TTG AGT AAT TAT TCC ATC ATA GAC AAA CTT GTG AAT ATA GTG GAT GAC CTT GTG 780Glu Gly Leu Ser Asn Tyr Ser Ile Ile Asp Lys Leu Val Asn Ile Val Asp Asp Leu Val 260241 246 251 256GAG TGC GTG AAA GAA AAC TCA TCT AAG GAT CTA AAA AAA TCA TTC AAG AGC CCA GAA CCC 840Glu Cys Val Lys Glu Asn Ser Ser Lys Asp Leu Lys Lys Ser Phe Lys Ser Pro Glu Pro 280261 266 271 276AGG CTC TTT ACT CCT GAA GAA TTC TTT AGA ATT TTT AAT AGA TCC ATT GAT GCC TTC AAG 900Arg Leu Phe Thr Pro Glu Glu Phe Phe Arg Ile Phe Asn Arg Ser Ile Asp Ala Phe Lys 300281 286 291 296GAC TTT GTA GTG GCA TCT GAA ACT AGT GAT TGT GTG GTT TCT TCA ACA TTA AGT TAG TAA 960Asp Phe Val Val Ala Ser Glu Thr Ser Asp Cys Val Val Ser Ser Thr Leu Ser 320301 306 311 316胺基酸序列為Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His1611 16Val Leu His Ser Arg Leu Ser Asn Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu21 26 31 36Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Asn Met Glu Glu Thr Lys Ala41 46 51 56Asn Asp Ile Leu Gly Aal Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Asn61 66 71 76Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Asn Leu Ser Gly Asn Val Arg Leu Leu81 86 91 96Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Asn Leu Pro Pro Asn Gly Arg Thr Thr Ala101 106 111 116His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg121 126 131 136Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Gly Gly Gly141 146 151 156
序列列表.txtGly Ser Pro Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Glu Gly Ile Cys Arg Asn Arg161 166 171 176Val Thr Asn Asn Val Lys Asp Val Thr Lys Leu Val Ala Asn Leu Pro Lys Asp Tyr Met181 186 191 196Ile Thr Leu Lys Tyr Val Pro Gly Met Asp Val Leu Pro Ser His Cys Trp Ile Ser Glu201 206 211 216Met Val Val Gln Leu Ser Asp Ser Leu Thr Asp Leu Leu Asp Lys Phe Ser Asn Ile Ser221 226 231 236Glu Gly Leu Ser Asn Tyr Ser Ile Ile Asp Lys Leu Val Asn Ile Val Asp Asp Leu Val241 246 251 256Glu Cys Val Lys Glu Asn Ser Ser Lys Asp Leu Lys Lys Ser Phe Lys Ser Pro Glu Pro261 266 271 276Arg Leu Phe Thr Pro Glu Glu Phe Phe Arg Ile Phe Asn Arg Ser Ile Asp Ala Phe Lys281 286 291 296Asp Phe Val Val Ala Ser Glu Thr Ser Asp Cys Val Val Ser Ser Thr Leu Ser301 306 311 31權利要求
1.一種重組人血小板生成素/幹細胞因子雙功能融合蛋白基因，其特徵是設計並構建一個人血小板生成素的1-157位胺基酸的編碼區、16個胺基酸(GGGGSPGGSGGGGSGG)的連接肽編碼區、可溶性人幹細胞因子的1-145位胺基酸編碼區和終止密碼依次首尾相連接的DNA片段，重組人血小板生成素/幹細胞因子融合蛋白基因的核苷酸序列為agcccggctc ctcctgcttg tgacctccga gtcctcagta aactacttcg tgactcccat 60gtccttcaca gcagactgag ccagtgccca gaggttcacc ctttgcctac acctgtcctg 120ctgcctgctg tggactttag cttgggagaa tggaaaaccc agatggagga gaccaaggca 180caggacattc tgggagcagt gacccttctg ctggagggag tgatggcagc acggggacaa 240ctgggaccca cttgcctctc atccctcctg gggcaacttt ctggacaggt ccgtctcctc 300cttggggccc tgcagagcct ccttggaacc cagcttcctc cacagggcag gaccacagct 360cacaaggatc ccaatgccat cttcctgagc ttccaacacc tgctccgagg aaaggtgcgt 420ttcctgatgc ttgtaggggg gtcaacacta tgtgtcaggc gggccccacc cggaggagga480ggttccccgg gcggatccgg aggaggaggc tccggcggcg aagggatctg caggaatcgt540gtgactaata atgtaaaaga cgtcactaaa ttggtggcaa atcttccaaa agactacatg 600ataaccctca aatatgtccc cgggatggat gttttgccaa gtcattgttg gataagcgag 660atggtagtac aattgtcaga cagcttgact gatcttctgg acaagttttc aaatatttct 720gaaggcttga gtaattattc catcatagac aaacttgtga atatagtgga tgaccttgtg 780gagtgcgtga aagaaaactc atctaaggat ctaaaaaaat cattcaagag cccagaaccc 840aggctcttta ctcctgaaga attctttaga atttttaata gatccattga tgccttcaag 900gactttgtag tggcatctga aactagtgat tgtgtggttt cttcaacatt aagttagtaa 960
2.權利要求1所提供的基因構建了一種能在昆蟲Sf9中高效表達穀胱甘肽硫轉移酶一人血小板生成素/幹細胞因子融合蛋白的重組苜蓿夜蛾核型多角體病毒(AcNPV-rhTPO/SCF)，其特徵是將人血小板生成素/幹細胞因子融合蛋白基因克隆於杆狀病毒轉移載體pAcSecG2T的BamHI和SmaI位點之間，得到重組轉移載體pAcSecG2T-rhTPO/SCF，其中rhTPO/SCF基因上遊融合了帶凝血酶切割位點的穀胱甘肽硫轉移酶基因片段，整個融合基因處於AcNPV的多角體蛋白啟動子控制之下；將重組轉移載體DNA與野生型AcNPV DNA共轉染Sf9細胞，經4輪有限稀釋法純化並結合重組蛋白的體外活性測定，篩選出重組病毒AcNPV-rhTPO/SCF。
3.一種重組人血小板生成素/幹細胞因子融合蛋白的製備方法，其特徵是用權利要求2所構建的重組病毒感染貼壁培養的Sf9細胞，27℃表達48小時，細胞內表達的血小板生成素/幹細胞因子融合蛋白具有TF1細胞和Mo7e細胞增殖的生物活性；收集表達細胞，懸浮於1×PBS溶液，超聲破碎細胞，經離心後，取上清液用於Glutathione Sephrose4B柱親和層析，最後經凝血酶切割和再次層析即可獲得純度大於90％的重組人血小板生成素/幹細胞因子融合蛋白，SDS-PAGE分析後經考馬斯亮藍染色檢測，rhTPO/SCF呈分子量約35KD的一條帶，用於TF1細胞增殖實驗，測定其比活為2.0×105units/mg；用於Mo7e細胞增殖實驗，測定其比活為8.3×105units/mg。
4.根據權利要求3所述融合蛋白在製備治療放療、化療及骨髓移植病症引起的血小板低下症的藥物中的應用。
全文摘要
本發明屬於生物技術中的基因工程製備多肽藥物技術領域。其目的是構建一種血小板生成素/幹細胞因子雙功能融合蛋白基因，並在昆蟲細胞中高效表達和製備生物活性更高、副作用更小的重組血小板生成素/幹細胞因子雙功能蛋白(rhTPO/SCF)。rhTPO/SCF基因為依次含有TPO的1－157位胺基酸編碼序列、16個胺基酸的連接肽編碼序列和SCF的1－145位胺基酸編碼序列及終止密碼子的DNA片段。從感染重組病毒的貼壁培養Sf9細胞中製備的rhTPO/SCF用於TF1細胞增殖實驗，測定其比活為2.0×10
文檔編號C07K19/00GK1778929SQ20051009460
公開日2006年5月31日 申請日期2005年9月29日 優先權日2005年9月29日
發明者秦浚川, 臧宇輝, 朱潔, 袁達文 申請人:南京大學