產生流感病毒粒子的線性表達構建體的製作方法

2023-09-19 23:23:40

專利名稱：產生流感病毒粒子的線性表達構建體的製作方法
產生流感病毒粒子的線性表達構建體 本發明領域涉及表達病毒(優選流感病毒)RNA節段的新線性表達構建體，其不含 任何擴增和/或選擇序列，含有插在RNA聚合酶II (polll)啟動子和聚腺苷酸化信號之間 的RNA聚合酶I (poll)啟動子和poll終止信號。本發明還涉及該表達構建體製備病毒粒 子的用途。背景負鏈RNA病毒是一組動物病毒，其中有數種重要的對人致病的病原體，包括流感 病毒，麻疹病毒，風疹病毒，狂犬病病毒，呼吸道合胞病毒，伊波拉病毒(Ebola)和漢坦病毒 (hantaviruse) 0這些RNA病毒的基因組可以是單分子的或分節段的單鏈負(-)鏈。這些 病毒都必需滿足兩點基因組RNA必需有效拷貝成病毒RNA，後者可摻入子代病毒粒子，轉 錄成mRNA，再翻譯成病毒蛋白。真核宿主細胞通常不具有複製RNA模板或從負鏈RNA模板 翻譯出多肽的機制。因此，負鏈RNA病毒編碼並攜帶RNA依賴型RNA聚合酶，以催化合成新 的基因組RNA裝配到子代中，並催化合成mRNA再翻譯成病毒蛋白。為傳播病毒，病毒基因組RNA需包裹到病毒粒子中。在RNA病毒內，子代病毒粒子 裝配過程以及裝配期間發生的蛋白/蛋白相互作用都是相似的。病毒粒子的形成確保在單 個宿主內或在不同宿主生物之間將RNA基因組從一個宿主細胞有效傳播到另一個。含有單鏈負鏈RNA基因組的包膜病毒分為有非分節段基因組的病毒(副粘病毒 科、彈狀病毒科(Rhabdoviridae)、黃病毒科(Filoviridae)和Borna病病毒，披膜病毒科 (Togaviridae))，或有分節段基因組的病毒(正粘病毒科、布尼亞病毒科(Bunyaviridae) 和沙粒病毒科(Arenaviridae))。正粘病毒科包括，甲、乙、和丙型流感病毒，以及Thogoto 禾口 Dhori 病毒禾口傳染性娃貧血病毒(infectious salmon anemia virus)。流感病毒體由包容負鏈RNA基因組的內部核糖核蛋白核心(螺旋型核衣殼)、以 及被內側基質蛋白(Ml)分隔的外部脂蛋白包膜組成。甲型流感病毒分節段的基因組由8 個線性負鏈單鏈RNA分子組成，其編碼11種(有些甲流病毒株編碼10種)多肽，包括 RNA依賴型RNA聚合酶蛋白(PB2，PB1和PA)和核蛋白(NP)，它們形成核衣殼；基質膜蛋白 (M1，M2)；兩種表面糖蛋白，它們從含脂質的包膜表面向外突出血凝素(HA)和神經氨酸酶 (NA)；非結構蛋白(NSl)和核轉運蛋白(NEP)。更多的甲流株也編碼11種被認為有凋亡前 (proapoptotic)特性的蛋白(PB1-F2)。基因組的轉錄和複製發生在核中，裝配通過從胞質膜出芽而發生。混合感染期間， 多個病毒可以重配基因。流感病毒通過HA吸附至細胞膜糖蛋白和糖脂中的唾液酸化寡糖。 內吞病毒體之後，HA在細胞的內體中發生構象改變，這有利於膜融合，從而觸發脫殼。核衣 殼遷移到核中，在那裡，病毒mRNA貝轉錄。病毒mRNA通過一種獨特機制進行轉錄，在該機 制中，病毒內切核酸酶從細胞性異源mRNA切下帶帽5'-端，再以其為引物，通過病毒轉錄 酶轉錄病毒RNA模板。轉錄止於距離模板末端15-22個鹼基的位置，在這裡，oligo (U)序列 作為信號導致添加Poly(A)尾。在如此產生的8種病毒RNA分子中，6種為單順反子信息， 被直接翻譯成代表HA，NA, NP和病毒聚合酶蛋白，PB2，PBl和PA的蛋白。另兩個轉錄物進 行剪接，每個都產生兩種mRNA，它們按不同的讀框進行翻譯，產生Ml，M2，NSl和NEP。換而言之，這8種病毒RNA節段編碼11種蛋白9種結構蛋白和2種非結構蛋白(NSl和最近鑑 別出的PB1-F2)。針對流感病毒尤其高致病性禽流感病毒製備流行株疫苗(modernvaccine)，靠的 是反遺傳學(reverse genetics)的應用，其允許從DNA產生流感病毒。反遺傳系統在構建 負鏈RNA流感病毒方面的第一個進展涉及，與體外重建的核糖核蛋白(RNP)複合物混合的 單個病毒基因的轉染，以及隨後與流感病毒輔助病毒一起感染。RNP複合物是這樣製得的， 將合成的RNA轉錄物與來自流感病毒的純化NP和聚合酶蛋白(PB1，PB2和PA)混合，用輔助 病毒作為病毒蛋白和其它vRNA的胞內來源(Luytjes et al.，1989，Cell，59，1107-1113)。Neumann 等(1994，Virology，202，477-479)從鼠 RNA 聚合酶 I 啟動子應答型質粒 表達RNA，成功地在流感病毒感染的細胞中實現了病毒模型RNA的RNP形成。Pleschka等(1996，J. Virol.，4188-4192)描述了一種方法，其從基於質粒的表達 載體重建了 RNP複合物。病毒RNA樣轉錄物從含有截短型人聚合酶I (poll)啟動子和經自 催化切割產生3'端的核酶序列的質粒來表達。這種由poll驅動的質粒與應答polll並表 達PB1，PB2, PA和NP蛋白的質粒一起轉染到人293細胞中。但轉染效率極低，每次轉染約 10個轉染的病毒粒子。此外，這種基於質粒的策略依賴於輔助病毒的幫助。在WO 01/04333中，分節段的負鏈RNA病毒用一組12個表達基因組VRNA節段和 RNP蛋白的表達質粒來構建。WO 01/04333中所述的載體是基於眾所周知的pUC19或pUC18 質粒。根據該說明書的描述，此系統需要8種質粒來表達所有8種流感病毒節段，並另外有 4個質粒來表達核蛋白和表達RNA依賴型RNA聚合酶(PB1，PB2, PA和NP)的亞單位。WO 00/60050涵蓋一組載體，其中至少兩種載體包含與連接轉錄終止序列的流感 病毒節段cDNA(ΡΑ, PBl, PB2, HA, NP, ΝΑ, M)可操作相連的啟動子，還有至少兩種載體包含與 流感病毒節段DNA(PA，PBl, PB2, NP)可操作相連的啟動子。使用大量不同載體，是想避免 將病毒RNA合成所需的8種RNA聚合酶I轉錄盒組合在一個質粒上。WO 01/83794描述了環狀表達質粒，其包含插入在RNA聚合酶II(polII)啟動子和 聚腺苷酸化信號之間的RNA聚合酶I (poll)啟動子和poll終止信號。術語「載體」在本申 請中是指一種質粒，其通常是雙鏈DNA的自含分子，能接受額外的外來DNA，並可容易地導 入合適的宿主細胞。病毒性疾病的地區流行(Epidemics)和全球大流行(pandemics)仍奪去人的生 命，並對全球經濟造成影響。流感在全球導致上百萬的失業人口和門診量，成百上千的住 院病例(Couch 1993, Ann. NY. Acad. Sci 685 ;803，)，上萬的過多死亡例(Collins&Lehmann 1953 Public Health Monographs 213 1 ；Glezen 1982 Am. J. Public Health 77:712)以 及上億歐元的健康護理費用(Williams et al. 1988，Ann. Intern. Med. 108 :616)。當健康 成人得到免疫後，當前的疫苗在70-90%的病例中阻止臨床疾病。該水平在65歲以上年齡 組中降至30-70%，在65歲以上的療養院(nursing homes)人群中降得更低(Strategic Perspective 2001 :The Antiviral Market. Datamonitor. ρ· 59)。病毒頻繁改變抗原性也 造成大量死亡病例，因為即使是每年的預防接種也不能保證保護作用。因此，美國的死亡病 例從 1976/77 年的 16，363 例到 1998/99 年增至 4 倍(Wall Street Journal,Flu-related deaths in US despite vaccineresearches. January 7,2003)。尤其當病毒性疾病爆發大流行時，最重要的就是提供預防接種或在疾病爆發後立即治療。鑑於對病毒性疾病提供有效保護和治療的緊迫需求，仍非常需要開發經濟、快速 且有效的表達系統用於病毒生產，以克服現有表達系統的缺點和困難。發明簡述本發明人意外發現，使用不含任何常規基於質粒的細菌擴增和/或選擇序列、但 將病毒基因克隆到有RNA聚合酶I (poll)啟動子和poll終止信號的表達盒中、插在RNA聚 合酶II(polII)啟動子和聚腺苷酸化信號之間得到的線性表達構建體，提供高度經濟化且 有效的快速拯救病毒粒子的工具。與已知技術所用的質粒相反，無需在細菌細胞中進行克 隆的步驟。因此，病毒粒子轉染和表達所需時間可大大縮短，優選縮短至少數周至數日。例如，本發明的線性表達構建體可用於開發抗RNA病毒，尤其是抗流感病毒野生 株、突變株、或重配株的疫苗。這為流感流行或大流行時需要快速產生任何病毒疫苗提供了 工具。需要時，線性表達構建體可以用短接頭序列環化。還可以提供一些方法，用線性表 達構建體產生病毒粒子，或者，將完整病毒的一些病毒性基因節段通過環化表達構建體來 表達，且至少一種所述基因節段通過本發明的線性表達構建體來表達。附1示線性雙向表達構建體的產生。a)片段Fl，F2和F3分別通過PCR擴增來生 成。b)片段F4用寡核苷酸P4和P6通過重疊PCR來生成。發明詳述如背景部分已述，目前使用的分節段RNA病毒的反遺傳拯救系統仍需要轉染大量 的不同質粒，和/或仍需要在細菌細胞中亞克隆病毒基因並隨後擴增以得到足量質粒。對 每個克隆，都需測序質粒DNA並從細菌中純化，而後僅能再用於轉染動物細胞。此方法耗 時、成本高，且難以自動化。本發明提供新的線性表達盒，其不含任何常規基於質粒的細菌擴增和/或選擇序 列，但將病毒基因克隆到有RNA聚合酶I (poll)啟動子和poll終止信號的表達盒中，插在 RNA聚合酶II(polII)啟動子和聚腺苷酸化信號之間，其可用於表達病毒粒子。「表達盒」是指一種編碼表達產物的DNA編碼序列或節段(segment)，所述表達產 物在指定的限制性位點插入該表達構建體。所述表達盒限制性位點被開發出來是為了確保 將所述表達盒插入正確的讀框中。本發明構建體允許將cDNA轉錄成mRNA和全長負鏈(有義)vRNA(雙向轉 錄(bidirectional transcription))，或轉錄成mRNA和全長正鏈(有義)cRNA (單向 (unidirectional)轉錄)。在單向轉錄時，將基因置於poll啟動子和polll啟動子下遊。polll啟動子產生 帶帽的正義鏈病毒mRNA，poll啟動子產生不帶帽的正義鏈病毒cRNA。在雙向轉錄時，將 基因置於polll啟動子上遊、poll啟動子下遊。polll啟動子轉錄產生帶帽的正義鏈病毒 mRNA, poll啟動子轉錄產生不帶帽的負義鏈vRNA。本發明人意外發現，這種創新的線性表達構建體可有效用於轉染細胞和表達完整 病毒粒子，儘管本領域常有文獻說，用線性片段轉染動物細胞，可因細胞的內切核酸酶降解 作用導致這些片段解體(van der Aa et al. 2005，JGene Med. 7 :208_17)，或導致被轉染的細胞的凋亡增加(Yao et al. 2001, J BiolChem. 276 :2905_13)。所述線性表達構建體不含細菌細胞擴增質粒所需的任何選擇或擴增序列。也不含 ori (複製起始)序列或抗生素抗性基因或任何其它選擇標記。根據本發明的具體實施方案，所述線性表達構建體可在構建體的N端和/或C端 包含額外的保護序列。例如，這些保護序列可以是WO 00/56914所述肽核酸序列(PNA)。這 些PNA是核酸類似物，其中完整的脫氧核糖磷酸骨架被換成化學性質完全不同、但結構類 似、含2-氨基乙基甘氨酸單元的聚醯胺(肽)骨架。已發現，PNA 「鉗(clamp)」增加穩定 性，在該結構中，兩個相同的PNA序列通過含3個8-氨基_3，6-二氧辛酸(dioxaoctanoic acid)單元的柔性發卡接頭相連。當PNA與互補同型嘌呤(homopurine)或同型嘧啶 (homopyrimidine)DNA靶序列混合時，可形成非常穩定的PNA-DNA-PNA三體(Bentin et al. ，1996， Biochemistry，35，8863-8869， Egholm et al. ，1995， Nucleic Acids Res. ，23， 217-222，Nielsen et al.，Science,1991，254，1497—1500，Demidov et al.，Proc. Natl. 八0&(1.5(^.，1995，92，2637-2641)。有證據表明，它們耐受核酸酶和蛋白酶消化(Demi do ν et al.，Biochem. Pharm.，1994，48，1010-1013)。為了提供抗細胞核酸酶的保護作用，保護序列可以是長度至少20個核酸的任何 核酸序列，優選至少50個核酸，更優選至少100個核酸。這些核酸可用核酸酶消化，從而保 護表達構建體的核心序列，或推遲其降解，所述核心序列是，啟動子序列、病毒序列、和終止 序列。線性表達構建體可包含至少一個插在poll啟動子和終止信號之間的病毒性基因 節段。術語「病毒基因」在本發明中是指，編碼或對應於具體胺基酸序列的DNA或cDNA 序列或RT-PCR擴增產物。術語「基因」還包括，全長基因和其片段、以及包含天然基因序列 的修飾的衍生物。這些修飾可以是，缺失，取代或插入核苷酸，導致胺基酸修飾，以及沉默突 變，其中一或多個核苷酸的改變未導致該位置編碼的胺基酸的變化。修飾還可包括功能保 守的突變，其中指定胺基酸殘基的改變不引起多肽整體構象和功能的變化。這包括各種突 變體，序列保守變體和功能保守的RNA病毒基因節段，優選負鏈RNA病毒基因節段。修飾可 通過隨機誘變技術或通過定點誘變技術來引入，如基於PCR的序列修飾。RNA病毒一或多個 單獨基因節段的修飾可允許開發減毒病毒或複製缺陷病毒。根據本發明，術語「複製缺陷」是指，用本領域熟知的血凝試驗、TCID50試驗或空斑 試驗測得，幹擾素感受態(interferon competent)宿主細胞中的複製速率比野生型流感病 毒至少低5 %，優選低1 %，優選低0.1%。本發明的表達構建體可用於表達分節段的和非分節段的RNA基因組。非分節段的 病毒的例子有彈狀病毒科或副粘病毒科的病毒。根據本發明，表達構建體可優選用於表達分節段的RNA病毒。例如，將對應於目標 病毒基因組中每一基因的病毒cDNA插入本發明的線性表達構建體，得到一組覆蓋整個病 毒基因組的線性表達構建體。為擴增這些表達構建體，可以用本領域已知的PCR技術，避免耗時的在細菌宿主 細胞中的克隆、擴增、測序和純化。根據優選實施方案，所述病毒節段來自正粘病毒科、布尼 亞病毒科和沙粒病毒科的病毒。更優選地，它們來自甲、乙、和丙型流感病毒，以及Thogoto和Dhori病毒，和傳染性鮭貧血病毒。在流感病毒的例子中，病毒基因節段可選自PA，PB1， ΡΒ2,ΗΑ, ΝΑ, NP,M或NS基因或其一部分。可選地，病毒NS基因節段可編碼非功能型NSl蛋 白。這可以是在NS基因中的任何修飾，即取代、插入或缺失核酸。優選NS基因的修飾消除 或減弱NS基因產物拮抗細胞IFN應答的能力。幹擾素拮抗活性降低或缺失的流感病毒的 例子詳見US 6，669，943或US 6，468，544，它們引入本文做參考。在優選實施方案中，可提供重配病毒(reassortant viruses)，其中每個病毒節段 可選自特定病毒株，例如H1N1、H3N2、甚至H5W或任何被鑑定為與當季流感最相關的季節 株。重配病毒因此可在允許宿主細胞有效生產的背景下攜帶所需抗原特性。例如，重配的流 感病毒將真正的兩次爆發之間(interpandemic)的病毒的表面糖蛋白，血凝素(HA)和/或 神經氨酸酶(NA)，的基因與5或6或7個編碼減毒主毒株的其它蛋白的RNA節段組合(6Λ 組合)，或7/1重配體或5/3重配體，分別含不同來源的M基因。這些重配病毒然後可作為毒種，用於產生病毒體，以製備疫苗。術語「病毒體」是指病毒粒子，其在轉染或與本發明表達系統共轉染的宿主細胞 中、或從所述宿主細胞首次產生時是具有充分感染性的。這種系統然後產生vRNA和病毒蛋 白(來自病毒RNA翻譯)，由此導致裝配感染性病毒粒子。本發明的線性表達構建體也可組合成至少兩個表達構建體的組合。例如，可提供 一組共8個線性表達構建體，其中每一個都含有流感病毒PA，PBl，PB2, HA, NA, NP, M和NS 中的一個病毒基因節段或其一部分。可選地，線性表達構建體可以用接頭和/或重疊序列環化。用於環化的各種不同 系統都是可能的，象使用帶有GGGG延伸的5' oligo和帶有CCCC序列的3' oligo。可選 地，在有dATP和dTTP存在的情況下經T4DNA聚合酶處理(以產生粘端)，可以使線性表達 構建體經由連接作用而環化。本發明還提供含有至少一個本發明的線性表達構建體的宿主細胞。在本發明範圍 內，術語〃細胞〃或「宿主細胞」是指培養的表達病毒的單個細胞、組織、器官、昆蟲細胞、禽 細胞、哺乳動物細胞、雜交瘤細胞、原代細胞、傳代細胞系、和/或遺傳改造的細胞，如重組 細胞。例如是，BSC-I細胞，LLC-MK細胞，CV-I細胞，CHO細胞，COS細胞，鼠細胞，人細胞， HeLa細胞，293細胞，Vero細胞，MDBK細胞，MDCK細胞，MDOK細胞，CRFK細胞，RAF細胞，TCMK 細胞，LLC-PK細胞，PK15細胞，W1-38細胞，MRC-5細胞，T-FLY細胞，BHK細胞，SP2/0細胞， NSO, PerC6(人視網膜細胞)，雞胚細胞或其衍生物，含胚的卵細胞，含胚的雞卵細胞或其衍 生物。優選細胞系是Vero細胞系。除了眾所周知的將cDNA序列引入表達系統的方法，本發明還提供了另一種簡易 構建線性表達構建體的方法，其中，病毒節段與互補序列一起提供，所述互補序列與poll 啟動子和poll終止子序列重疊。在該例中，三種不同片段組合，退火併經PCR擴增。應用本發明的線性表達構建體，則無需在細菌細胞中進行質粒的轉化和擴增。分 別包含流感病毒基因組的至少一個節段或其一部分的所述多個線性片段可直接用於轉染 宿主細胞。這些線性表達構建體的應用提供了用本發明表達構建體轉染和表達病毒粒子的 系統，其僅需較少天數就能收穫完整病毒粒子。總之，從流感病毒分離物開始，可以在收穫 病毒的數小時至最多2-3天後進行轉染。相反，根據現有技術克隆質粒，不測序的情況下至 少需要4-5天。轉染可在第5天進行。但對於每個「新」節段，都不得不測試數個細菌克隆，
7以便優化利用正確質粒的機會。如果每種病毒分離物的序列都是已知的，對每個節段的數 個克隆進行測序又將整個過程推遲大約1天。如此一來，轉染最早將在第6天進行。在事 先不知道序列信息的情況下，全面測序將給寡核苷酸合成過程再加2-3天。根據另一實施方案，本發明涉及產生線性表達構建體的方法，其中，將包含病毒節 段、和同源於poll啟動子的序列、和同源於poll終止子的序列的DNA片段，包含保護序列、 pol I啟動子序列、poly A信號序列和互補於所述病毒節段的至少5個(優選至少10個， 優選至少12個)核苷酸的重疊序列的DNA片段，包含保護序列、CMV啟動子、pol I終止子 序列和互補於所述病毒節段的至少5個(優選至少10個，優選至少12個)核苷酸的重疊 序列的DNA片段，都通過重疊PCR融合在一起，並用標準純化方法進行純化。根據另一方法，包含病毒節段、和同源於poll啟動子的序列、和同源於pol I終止 子的序列的DNA片段可額外包含至少5核苷酸，它們被引入該片段，是作為含Poll終止子 和CMV啟動子以及Poll啟動子和poly A信號的兩個片段的互補序列，這些片段通過PCR 技術融合在一起。兩種用於擴增病毒節段的寡核苷酸都可被設計成，包含與含CMV啟動子和Poll終 止子的DNA片段互補、以及與含Poll啟動子和poly A信號的DNA片段互補的序列(見圖 1的F2，F3)。如此，病毒基因節段(見

圖1的Fl)與含CMV啟動子和Poll終止子的DNA片 段、以及病毒基因節段與含Poll啟動子和poly A信號的DNA片段之間的重疊區的長度增 加，這有利於第二個PCR步驟，該步驟中，病毒基因節段與含CMV啟動子和Poll終止子的 DNA片段、以及含Poll啟動子和poly A信號的DNA片段融合。本發明還涉及產生負鏈病毒粒子的方法，包括在允許產生病毒蛋白和vRNA或 cRNA的條件下培養宿主細胞。例如，含有全部的病毒基因節段的線性表達構建體可用於轉 染宿主細胞。然後在培養基中維持細胞，可從培養上清液中分離並純化得到病毒粒子。可選地，可包括第二個純化步驟以增加表達構建體的純度，降低轉染至宿主細胞 中的毒性。商購PCR清潔試劑盒(cleaning kit)通常依賴DNA與矽化膜(silicamembrane) 在高鹽條件下的結合。本發明人意外發現，經商購純化試劑盒一步純化的PCR片段轉染至 Vero細胞中表現出高毒性，可阻止病毒拯救(rescue)。當PCR產物再經歷一個依賴於陰離 子交換樹脂的純化步驟後，其純度增加，能以更高效率進行病毒拯救。可選地，進行基於陰 離子交換樹脂的單個純化步驟。根據具體實施方案，Taq聚合酶和校正聚合酶(如Pfu聚合酶)的混合物可用於 所有PCR擴增步驟。如此一來，可將PCR衍生的突變減至最少。此外，消除了將額外的胸苷 鹼基摻入含CMV啟動子和Poll終止子的DNA片段、以及病毒基因節段和含Poll啟動子和 poly A信號的DNA片段的需求。本發明涵蓋產生流感病毒粒子的方法，其中至少一種線性表達構建體被直接轉染 到宿主細胞中，所述宿主細胞在表達流感病毒的條件下培養，收集病毒粒子並純化。進一步地，本發明涵蓋一種方法，其中可選將病毒粒子在減毒或滅活後與可藥用 載體和/或佐劑一起摻入藥物組合物中，作為治療或預防藥物。優選的，用所述病毒粒子產 生用於治療性或預防性處理傳染病(therapeutic orprophylyactic treatment)的藥物制
8劑，如疫苗製劑。引入方法包括但不限於，肌肉內，腹腔內(intraperitoneal)，靜脈內，鼻內，硬膜 外(印idural)或口腔途徑。優選鼻內引入。在優選實施方案中，可能希望將藥物製劑經任 何合適途徑進入肺。肺給藥也可以採用例如吸入器或噴霧器(nebulizer)，或將其與霧化劑 (aerosolizing agent) 一起吸入。藥物製劑也可通過控釋系統如泵來運送。本發明的藥物可包含治療有效量的複製缺陷病毒和可藥用載體。「可藥用」是指， 由管理部門如FDA或EMEA批准。術語「載體」是指，稀釋劑、輔助劑、賦形劑或運載劑，它們 與所述製劑一起施用。鹽水溶液，葡萄糖(dextrose)和甘油溶液(作為載液)或賦形劑 象葡萄糖(glucose)，乳糖，蔗糖，或本領域已知可用於藥物製劑的其它賦形劑都可以使用。 此外，也可以包括穩定劑，以增加藥物的貨架期。優選地，提供即用型(ready-to-use)輸注 液。可選地，可將所述製劑配製成粉末，臨用前再溶於合適的水溶液中。本發明藥物製劑治療具體疾病的有效量取決於該疾病的特性，可通過標準臨床技 術來確定。此外，可選採用體外實驗幫助鑑定最佳劑量範圍。配製劑中的精確用量取決於 給藥途徑和疾病嚴重性，應根據醫生的判斷和每個患者的環境來決定。但合適的給藥劑量 範圍通常最多Slogs (104-5X IO6Pfu)複製缺陷病毒，可以給藥一次，或有間隔地給藥多次， 次數根據需要來定。包含104-5X IO6Pfu複製缺陷的減毒病毒的本發明藥物製劑可經鼻內、氣管內、肌 肉內或皮下給藥。有效劑量可從體外或動物模型測試系統獲得的劑量應答曲線外推得出。根據本發明，術語「疫苗」是一種製劑，當給予受試者後，可激發抗RNA病毒的保護 性免疫力。它是指含有病毒，滅活病毒，減毒病毒，拆分的(split)病毒或病毒蛋白，象表面 抗原之類，能用於在受試者中誘導保護性免疫力的製劑。疫苗都給予保護性劑量，這是單獨 或與一或多種已知增加免疫原性的佐劑一起給藥、足以導致保護性免疫應答的疫苗量。參考下列實施例將更全面理解以上描述。但這些實施例僅代表實施本發明一或多 個實施方案的方法，不應將它們理解為限制本發明的範圍。
實施例實施例1 製備線性H3N2HA表達構建體經Vero細胞培養的甲流H3N2病毒的HA節段用寡核苷酸Pl和P2(圖Ia的Fl)進 行 PCR擴增。隨後，將來自 pHW2000 (Hoffmann et al. 2000, ProcNatl Acad Sci U S Α. 97 6108-13)的兩個DNA片段(圖1的F2和F3)與HAPCR產物通過重疊PCR進行融合(見圖 lb)。第一個DNA片段(F2)含CMV啟動子和Poll終止子，第二個(F3)含人Poll啟動子和 BGH polyA信號。為有利於產生重疊PCR產物，用於HA擴增的寡核苷酸在其5』端延伸，使 Pl包含與Poll終止子互補的序列，使P2包含與Poll啟動子互補的序列(見圖la)。同樣 地，用於產生片段Fl和F2的引物P3和P5在其5』端延伸，以包含與HA的5』和3』端互補 的序列(見圖la)。片段F2和F3包含來自pHW2000骨架的保護序列。這些序列不直接參 與mRNA和vRNA轉錄，但減少外切核酸酶對雙向表達盒的降解。病毒RNA從Vero細胞培養的甲流H3N2病毒用Qiagen ViralAmp試劑盒提取，按 文獻(Hoffmann et al. 2001，Arch Virol. 146 :2275_89)所述用 Unil2 寡核苷酸進行逆轉
9錄。HA節段用表1所示寡核苷酸、以及Pfu Turbo DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶的混合物 進行擴增。表1
Pl5 』 -CGAAGTTGGGGGGG] GCAAAA GCA GGGGA TAA TTCTA TTAA C-3 『 (SEQ ID No. 1)P25 』 -GCCGCCGGGTTATL4 GTA GAAACAA GGGTGTTTTTAA TTAA TGC-3 『 (SEQ ID No. 2)對應於H3序列的核苷酸用粗斜體表示，同源於Poll終止子(Pl)和Poll啟動子 (P2)的核苷酸用標準大寫字母表示。HA F4PCR產物用Qiaquick PCR純化試劑盒(Qiagen)純化。PCR片段F2和F3從 PHW2000質粒DNA進行擴增，分別使用引物對P3+P4和P5+P6 (見表2和圖la)，並用到Pfu Turbo DNA聚合酶與Taq DNA聚合酶的混合物。PCR產物F2和F3用QIAquick PCR純化試 劑盒(Qiagen)進行純化。表2:
P35,-CCTGCTTTTGCTCCCCCCCAAC τCGGAGG C-3, (SEQ ID No. 3)P45『-GGGGTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATAC-3 『 (SEQ ID No. 4)P55'-CCTTGTTTCTACTAATAACCCGGCGGCCCAAAATGC-3『 (SEQ ID No. 5)P65『-CCCCTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGTTC3 『 (SEQ ID No. 6)對應於H3序列的P3和P5核苷酸用粗斜體表示，互補於pHW2000的核苷酸用標準 大寫字母表示。對於P4和P6，除了 5』端4個核苷酸以外的所有核苷酸都對應於PHW2000。為產生含HA的全長PCR產物(F4)，將CMV啟動子、Poll終止子、Poll啟動子和 BGH polyA信號、片段F1、F2和F3組合在一起，用引物P4和P6、以及Pfu Turbo DNA聚合 酶與Taq DNA聚合酶的混合物，通過重疊PCR選行擴增。圖1顯示線性雙向表達構建體的產生。圖la)示分別經PCR擴增產生的片段F1， F2和F3。片段Fl含各自的病毒節段，並包含與Poll啟動子和Poll終止子互補的延伸序 列。片段F2含CMV啟動子和Poll終止子、以及與各自病毒節段互補的延伸序列。片段F3 含Poll啟動子和BGH聚腺苷酸化信號、以及與各自病毒節段互補的延伸序列。用於PCR擴 增Fl片段的寡核苷酸Pl和P2都與各自病毒節段互補。Pl包含與Poll終止子互補的5』 延伸序列，P2包含與Poll啟動子互補的5』延伸序列。寡核苷酸P3和P4用於PCR擴增F2 片段，其中P3包含與各自病毒節段互補的5』延伸序列。寡核苷酸P5和P6用於PCR擴增 F3片段，其中P5包含與各自病毒節段互補的5』延伸序列。保護序列都來自PHW2000骨架， 不含有直接參與mRNA或vRNA轉錄的序列。
10
實施例2 用線性HA表達構建體拯救甲流病毒甲流H3N2病毒的6種分離物在MDCK細胞上培養。HA節段用PCR擴增(圖1的 Fl)，在瓊脂糖凝膠電泳上用Qiaex II試劑盒(Qiagen)純化。按實施例1所述，將片段F2 和F3與Fl融合，產生全長表達構建體F4。經瓊脂糖凝膠電泳純化後，片段F4經PCR再擴 增，產生足量DNA用於轉染。最後，用F4HA DNA片段和7個質粒(pHW2000衍生物)在Vero 細胞上進行病毒拯救，所述質粒含有適應了 Vero的甲流Hmi delNSl病毒株(GHBOl)的剩 餘節段。圖Ib顯示了用寡核苷酸P4和P6經重疊PCR產生的片段F4。F4HA DNA片段的產生類似於實施例1描述的過程。對每一種病毒分離物，總量 10-20yg 的F4HA DNA 首先用 Qiaquick 試劑盒(Qiagen)純化，然後用 Qiagen Endofree 質 粒試劑盒純化。當PCR產物僅用PCR純化試劑盒(Qiaquick，Qiagen)在單個步驟中純化時，轉染 Vero細胞後觀察到高毒性，導致阻止病毒拯救。Vero細胞在含10%胎牛血清和1 % Glutamax-I添加物的DMEM/F12培養基中37°C 予以維持。為產生病毒，針對PHW2000的公開序列(Hoffmarmet al.，見上文)產生7種衍 生物，它們包含來自GHBOl的節段PA，PBl，PB2, ΝΑ, M，NP和delNSl，將它們以及編碼甲流 病毒 PR8NS 1 的蛋白表達質粒(pCAGGS-NSl (SAM) ； (Salvatore et al. 2002，J Virol. 76 1206-12))與各自F4HA DNA片段一起用於共轉染Vero細胞。轉染後，為支持病毒複製，將 Vero細胞在不含血清的培養基(Opti-Pro ；Invitrogen)中含5μ g/ml胰蛋白酶的條件下 進行培養。轉染的3-4天後，觀察到50-100% CPE，將拯救的病毒凍存，或進一步在Vero細 胞上擴增。因此，用一個被線性PCR產物替換的雙向表達質粒來拯救甲流病毒是可行的。實施例3 從線性表達構建體完全拯救甲流病毒針對適應了 Vero細胞的甲流HlNl delNSl病毒(GHBOl)，通過PCR擴增產生8種 線性表達構建體(F4)。用8種含GHBOl節段的pHW2000衍生物作為PCR模板。針對每種節 段產生足量F4片段，再用於在Vero細胞上進行病毒拯救。針對8種節段，通過直接PCR擴增每一種節段的完整雙向表達盒，產生F4DNA片 段，所述表達盒包含各自的流感病毒節段，用相應的PHW2000衍生物作為模板。PCR擴增用 寡核苷酸P4和P6 (見表3)、以及Pfu DNATurbo聚合酶與Taq DNA聚合酶的混合物進行。表 3
權利要求
線性表達構建體，不含任何擴增和/或選擇序列，含RNA聚合酶I(polI)啟動子和polI終止信號，它們插在RNA聚合酶II(polII)啟動子和聚腺苷酸化信號之間。
2.權利要求1的線性表達構建體，在所述構建體的N-端和/或C-端含有額外的保護 序列。
3.權利要求1或2的線性表達構建體，其中所述保護序列可以是不直接參與病毒RNA 轉錄的任何序列。
4.權利要求1-3之一的線性表達構建體，有至少一個病毒基因節段插在poll啟動子和 poll終止信號之間。
5.權利要求4的線性表達構建體，其中所述病毒節段來自甲、乙、或丙型流感病毒。
6.權利要求4或5的線性表達構建體，其中所述病毒基因節段選自流感病毒的PA， PBl, PB2, HA, NA, NP, M, NS基因節段或其一部分。
7.權利要求4-6之一的線性表達構建體，其中所述病毒NS基因節段表達非功能型NSl 蛋白。
8.權利要求4-7之一的線性表達構建體，其中所述病毒基因節段是所述節段的cDNA拷 貝或RT-PCR擴增產物。
9.一組線性表達構建體，含有至少兩個按照權利要求1-8之一所述的表達構建體。
10.權利要求9的一組線性表達構建體，有8個構建體，每個構建體含有至少一個流感 病毒基因節段或其一部分，所述節段是指PA，PBl，PB2, HA, NA, NP, M和NS基因節段。
11.宿主細胞，含有至少一個按照權利要求1-10之一所述的線性表達構建體。
12.產生權利要求1-8之一的線性表達構建體的方法，其中，將包含病毒節段、和同源 於pol I啟動子的序列、和同源於pol I終止子的序列的DNA片段，包含保護序列、pol I啟 動子序列、poly A信號序列和互補於所述病毒節段的至少5個核苷酸的重疊序列的DNA片 段，包含保護序列、CMV啟動子、pol I終止子序列和互補於所述病毒節段的至少5個核苷酸 的重疊序列的DNA片段，都通過重疊PCR融合在一起，並純化。
13.產生負鏈RNA病毒體的方法，包括，在允許產生病毒蛋白和vRNA或cRNA的條件下， 培養權利要求11的宿主細胞。
14.產生流感病毒粒子的方法，其中將至少一種線性表達構建體直接轉染動物宿主細 胞，並且，在表達流感病毒的條件下培養所述宿主細胞，收集病毒粒子，並純化。
15.權利要求12或13的方法，包括至少兩個純化步驟。
16.權利要求12-14之一的方法，其中所述病毒粒子任選在減毒或滅活後，與可藥用載 體一起摻入藥物組合物中。
17.權利要求1-8之一的表達構建體產生的病毒粒子的用途，是用於製備治療性處理 或預防性處理傳染病的醫學製劑。
18.對受試者進行預防接種使之抵抗負鏈RNA病毒感染的方法，包括對該受試者鼻內 或胃腸外施用保護劑量的藥物組合物，所述藥物組合物含有根據權利要求14製得的流感 病毒粒子。
全文摘要
本發明提供了不含任何常規擴增和/或選擇序列的線性表達構建體，其包含RNA聚合酶I(polI)啟動子和polI終止信號，它們插入在RNA聚合酶II(polII)啟動子和聚腺苷酸化信號之間，用於表達病毒RNA節段，優選流感病毒。本發明的構建體可用於有效快速製備病毒粒子，尤其是製備用於治療流行性疾病和/或大流行疾病的疫苗配製劑。
文檔編號C12N15/86GK101952427SQ200880022354
公開日2011年1月19日 申請日期2008年6月26日 優先權日2007年6月27日
發明者克裡斯琴·斯特爾, 安德雷傑·埃戈羅夫, 託馬斯·馬斯特, 麥可·伯格曼, 馬庫斯·沃爾謝克 申請人:阿維爾綠山生物技術研究發展貿易股份公司