抗體的製作方法

2023-09-19 21:45:50 3

專利名稱：抗體的製作方法
技術領域：
本發明涉及抗體。
具體地說，本發明涉及識別疾病相關分子(DAM)的抗體。
更具體地講，本發明涉及這些抗體在與DAM相關疾病的診斷和治療中的體外和體內/離體應用。
背景技術：
在某些疾病狀態下，細胞代謝的紊亂可以影響一種或多種DAM的表達水平。在某些情況下，這種細胞紊亂可能導致所述DMA表達水平的改變。因此，在宿主生物中，每種致病因子或疾病狀態都可能與一種在免疫識別和/或致病因子或疾病狀態的消除和/或控制中可能是關鍵性的DAM相關。這樣，所述DAM可能能夠不僅用作疾病狀態診斷的標記，而且能夠用作所述疾病全貌(disease profile)準確的病期分類的標記，使得可以設計合適的療法。
已經充分表徵的DAM的一個具體實例包括腫瘤相關抗原(TAA)。已經在人類和動物腫瘤中鑑定出許多癌胚抗原或腫瘤相關抗原(TAA)，並對其進行了表徵。
這些TAA包括癌胚抗原(CEA)、TAG72、c-erB2、(糖基化不足的)MUC-1和p53、上皮糖蛋白-2抗原(EGP-2；也稱為EGP40、Ep-CAM、KSA、CO17-1A或GA733-2)和5T4抗原。一般而言，TAA是在胎兒發育期間表達而在成體細胞中被負調節的抗原，因而在成體內通常不存在或僅以非常低水平存在。然而，在腫瘤發生期間，已經觀察到腫瘤細胞重新開始表達TAA。因而，認為惡性腫瘤細胞與其非惡性對應物的區別在於重新開始表達TAA。因此，已有建議將TAA(i)應用於腫瘤疾病的體外和/或體內/離體診斷，(ii)應用於癌的成象和/或免疫療法，和(iii)用作腫瘤相關疾病進程的指標。
為了建立針對特定疾病的體液免疫應答和/或細胞免疫應答，宿主免疫系統必須與DAM接觸。除識別外來抗原外，T細胞通常需要額外的刺激，以完全被激活。現在更加明顯的是，原初T細胞被帶有抗原的靶細胞的激活需要兩種信號。一種信號是抗原特異性信號，通過T細胞受體來傳遞，而第二種信號是引起淋巴因子產生的不依賴抗原的信號或共同刺激信號。這些額外的信號通過T細胞上與專門的抗原呈遞細胞(APC)(例如樹突細胞和巨噬細胞)上存在、但在其它細胞上不存在的配體(例如B7和CD40)相互作用的其它受體(例如CD28和CD40L)來傳遞。這些共同刺激配體通常被稱為共同刺激分子。
作為實例，B7家族(即B7.1、B7.2和可能的B7.3)代表最新發現的但卻重要的一組共同刺激分子。B7.1和B7.2都是Ig基因超家族的成員。如果T淋巴細胞遇到單獨的抗原而無B7的共同刺激，則它將反應為或者無反應性，或者細胞凋亡(程序性細胞死亡)。如果提供所述共同刺激信號，則它將反應為針對所述靶抗原的克隆擴充。認為無共同刺激時不發生針對給定抗原的免疫應答的顯著放大(June等(Immunology Today 15321-331，1994)；Chen等(Immunology Today14483-486)；Townsend等(Science 259368-370))。Freeman等(J.Immunol.1432714-2722，1989)。Azuma等(Nature 36676-79，1993)。因此，已經假定，刺激對免疫原性差的患病細胞的免疫識別的一種方法可能是增強抗原呈遞和在所述DAM存在下共同刺激淋巴細胞。
作為實例，已經表明，例如癌症、已建立的腫瘤的疾病狀態雖然事實上它們共同表達DAM，但它們的免疫原性差。已經表明，用或者單獨或者與細胞因子結合的編碼B7-1和B7-2的基因轉染，在動物模型中增強了針對實驗性腫瘤的免疫的產生(例如Leong等1997 Int.J.Cancer 71476-482；Zitvogel等1996 Eur.J.Immunol.261335-1341；Cayeux等1997 J.Immunol.1582834-2841)。然而，在將這些結果轉譯為對人類癌症的實際治療時，有許多重大的問題需要解決。在這些研究中的一個主要問題一直是為達到功效需要將B7基因體內傳遞至大量的腫瘤細胞。第二個問題一直是將B7的表達選擇性地靶向腫瘤細胞，以避免不當的針對其它細胞類型的免疫細胞的激活。在WO98/55607中論述了這些問題的某些解決方法，其中使用腫瘤相互作用蛋白(TIP)例如腫瘤結合蛋白(TBP)將共同刺激分子選擇性地靶向腫瘤細胞。
已經用重組DNA技術來產生識別DAM的抗體(Hoogenboom等(1998 Immunotechnology 41-20；和Winter 1998 FEBS Lett 45892-94)。最近，非常關注應用抗體基因文庫來產生抗體，例如單鏈抗體(ScFv Ab)。眾所周知，在某些情況下，不用完整抗體，而使用ScFv Ab有許多優點。所述片段的大小更小，使得可以快速清除，並且可能導致改進腫瘤與非腫瘤的比率。然而，許多研究不能產生高特異性的ScFvAb。此外，完整的IgG被認為是供治療Mab用比ScFv Ab更好的形式，因為認為它們的血清半壽期延長(參見Vaughan等1998，Nature Biotech16535-539)。
本發明力圖提供針對DAM產生的、可用於治療與DAM相關疾病狀態的ScFv Ab。
本發明的概述方面本發明提供一種能夠識別一種DAM並且在與DAM相關疾病中具有治療效應的ScFv Ab(ScFv Ab)。這種ScFv Ab可以作為肽(合成或基因表達的)或作為「裸DNA」(例如在質粒中)直接給予，或者可以通過傳遞載體例如包含編碼所述ScFv Ab的核苷酸序列的病毒載體給予。對於某些病例而言，這種ScFv Ab可能比與分泌型共同刺激分子(SCM)例如B7或IgG融合的ScFv Ab的功效更強。在例如癌的疾病的治療方面，使用ScFv Ab作為治療劑並不是一種顯而易見的選擇，尤其是因為人們可能預計包含與ScFv融合的SCM的融合蛋白的表現可能比單獨的ScFv要好。
本發明由於以下原因是有利的(i)它提供了一種能夠識別DAM的ScFv Ab。對於某些病例而言，其治療效應比與SCM例如B7或免疫球蛋白例如IgG融合的ScFvAb的治療效應更強。
(ii)它提供了可應用於以下方面的高親和性ScFv Ab(a)體外和體內/離體診斷和治療；(b)表達DAM的細胞的成象和治療；(c)當將所述ScFv Ab單獨使用或與合適的診斷上和/或治療上有用的因子聯合使用時，預防和/或治療不同的人類疾病例如癌；(d)有關與分離和/或純化與所述ScFv Ab特異性結合的DAM的研究；和(e)提供用於進一步合理治療性ScFv Ab設計的構件和篩選能夠與靶DAM結合的ScFv Ab和/或篩選能夠與靶ScFv Ab結合的DAM。本發明的詳述方面在所附的權利要求書和以下描述及附圖中，介紹了本發明的其它方面。這些方面在獨立小節標題下介紹。然而，應該理解，每一小節下的內容不一定限於該特定的小節標題。ScFv抗體一方面，本發明提供識別DAM的重組ScFv Ab。
本文所用的術語「ScFv Ab」是指能夠識別DAM抗原、具有一個輕鏈可變區(vL)和一個重鏈可變區(VH)的抗體。所述VH配偶體區和VL配偶體區通常通過柔性寡肽/肽接頭連接/結合。所述VH配偶體區和VL配偶體區可以以VH後接VL或VL後接VH的順序連接。通常，所述序列可以通過一個接頭序列，以VH-接頭-VL或VL-接頭-VH的順序連接。本文所用的該術語包括蛋白酶解的或重組製備的ScFv Ab分子的多個部分的片段，該片段能夠選擇性地與DAM反應或識別DAM。這類蛋白酶解和/或重組片段的非限制性實例包括嵌合ScFv抗體，所述嵌合ScFv抗體對於本發明而言可以是指具有由得自除人類免疫球蛋白基因以外的哺乳動物免疫球蛋白基因的核苷酸序列編碼的重鏈和輕鏈可變區(VH和VL)中任一個或兩者的ScFv Ab以及具有由得自人類免疫球蛋白基因的核苷酸序列編碼的重鏈和輕鏈之一或兩者的ScFv Ab。所述ScFv Ab可以與另一個實體(例如另一ScFv Ab)共價或非共價連接，形成具有兩個或多個結合部位的抗體。例如，一個ScFvAb可以與DAM例如5T4結合，而第二個ScFv Ab可以與免疫增強分子結合。
按照本發明，提及的術語「ScFv Ab」包括但不限於提及所述肽本身以及作為融合蛋白一部分的所述肽以及編碼所述肽的核苷酸序列和/或編碼所述融合蛋白的核苷酸序列。所述肽本身和/或融合蛋白可以是合成肽。或者，所述肽和/或融合蛋白可以是基因表達/重組肽/融合蛋白。對於某些應用而言，術語「ScFv Ab」是指肽本身。術語「ScFv Ab」也包括具有分泌前導(L)序列的ScFv Ab，在本文中，這種ScFv Ab被稱為LScFv。
本文所用的術語「可變區」是指輕鏈(VL)和輕鏈(VH)的可變區，含有結合識別特異性以所述ScFv Ab對DAM的總體親和性的決定簇。每對輕鏈(VL)和重鏈(VH)的可變區參與抗原識別並形成抗原結合部位。輕鏈和重鏈的所述區具有相同的總體結構，每個區具有由三個互補性決定區(CDR)連接的四個構架(FR)區，構架區的序列相對保守。FR區維持可變區的結構完整性。CDR是可變區中介導抗原(例如DAM)結合的多肽區段。
最好是，本發明ScFv Ab對5T4抗原的親和性(KD)為約5×10-10至約10×10-10。
最好是，本發明ScFv Ab對5T4抗原的親和性(KD)為約6×10-10至約9×10-10。
最好是，本發明ScFv Ab對5T4抗原的親和性(KD)為約7×10-10至約8×10-10。
最好是，本發明ScFv Ab對於5T4抗原的親和性(KD)為約7.9×10-10。所述ScFv Ab的KD用BIAevaluation軟體(Pharmacia)測定。
本文所用的術語「解離速率」是指ScFv Ab與抗原解離的速率(Koff)。在本發明的正文中，它用BIAevaluation軟體(Pharmacia)測定。由於解離速率反映Fab片段對抗原(例如DAM)的親和性，因而理想的是解離速率低。
本文所用的術語「親和性」根據ScFv Ab與DAM抗原的解離速率(Koff)來定義。解離速率越低，則ScFv Ab對抗原(例如DAM)的親和性越高。DAM本文所用的術語「DAM」可以包括但不限於生物反應調節物，包括但不限於免疫調節劑、細胞因子、生長因子、細胞表面受體、激素、循環分子、炎性細胞因子和致病因子(例如病毒、細菌、寄生蟲或酵母)。這些生物反應調節物的實例包括但不限於ApoE、Apo-SAA、BDNF、心臟營養蛋白(Cardiotrophin)-1、EGF、ENA-78、Eotaxin、Eotaxin-2、Exodus-2、酸性FGF(FGF-acidic)、鹼性FGF、成纖維細胞生長因子-10(Marshall 1998 Nature Biotechnology 16129)、FLT3配體(Kimura等(1997)Fractalkine(CX3C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-β1、胰島素、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(72a.a.)、IL-8(77a.a)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18(IGIF)、抑制素α、抑制素β、IP-10、角質形成細胞生長因子-2(KGF-2)、KGF、Leptin、LIF、 Lymphotactin、繆氏抑制物質、單核細胞集落抑制因子、單核細胞引誘蛋白(Marshall1998出處同上)、M-CSF、MDC(67a.a.)、MDC(69a.a.)、MCP-1(MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC(67a.a.)、MDC(69a.a.)、MIG、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4、骨髓祖細胞抑制因子-1(MPIF-1)、NAP-2、Neurturin、神經生長因子、β-NGF、NT-3、NT-4、制癌蛋白M、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDF1α、SDF1β、SCF、SCGF、幹細胞生長因子(SCF)、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-β2、TGF-β3、腫瘤壞死因子(TNF)、TNF-α、TNF-β、TNIL-1、TPO、VEGF、GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β和GRO-γ。
致病因子的實例可以包括但不限於病毒、細菌以及寄生蟲和酵母。作為實例，致病病毒包括但不限於人免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、單純皰疹病毒、人乳頭瘤病毒、馬腦炎病毒、肝炎病毒、貓白血病病毒、犬瘟熱病毒和狂犬病病毒、流感病毒、痘病毒、禽痘病毒(FPV)、金絲雀痘病毒、昆蟲痘病毒、缺乏DNA複製酶的痘苗病毒、甲病毒屬、腺病毒、皰疹病毒、委內瑞拉馬腦炎病毒(VEE)。致病細菌的實例可以包括但不限於衣原體屬(Chlamydia)、分枝桿菌屬(Mycobacteria)、惡性瘧原蟲(Plasmodium Falciparum)、軍團菌屬(Legioniella)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrheae)、白喉棒桿菌(Corynebacteriumdiphtheriae)、破傷風梭菌(Clostridium tetani)、霍亂弧菌(Vibriocholerae)、單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、產氣莢膜梭菌(Clostridium perfrngens)、大腸桿菌(Escherichia coli)、鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)和鼠傷寒沙門氏菌。致病寄生蟲的實例包括但不限於錐蟲屬(Trypanosoma)、克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)、利什曼原蟲屬(Leishmania)、杜氏利什曼原蟲(Leishmania donovani)、熱帶利什曼原蟲(L.tropica)、墨西哥利什曼原蟲(L.mexicana)、巴西利什曼原蟲(L.Braziliensis)、賈第鞭毛蟲屬(Giardia)、蘭氏賈第鞭毛蟲(Giardia lamblia)、毛滴蟲屬(Trichomonas)、內阿米巴屬(Entamoeba)、耐格裡原蟲屬(Naegleria)、棘阿米巴屬(Acanthamoeba)、Acanthamoeba castellanii、A.culbertsoni和其它物種瘧原蟲屬、弓形蟲屬(Toxoplasma)、鼠弓形蟲(Toxoplasma gondii)、隱孢子蟲屬(Crytosporidium)、微小隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum)、等孢子球蟲屬(Isospora)、貝氏等孢子球蟲(Isospora belli)、耐格裡原蟲屬、福氏耐格裡原蟲(Naegleria fowleri)、小袋纖毛蟲屬(Balantidiurn)、結腸小袋纖毛蟲(Balantidium coli)、巴貝蟲屬(Babesia)、血吸蟲屬(Schistosoma)、Toxiplasma和犬弓蛔蟲(Toxocara canis)。致病酵母的實例包括麴黴屬(Aspergillus)和侵襲性念珠菌屬(Candida)。在一個優選實施方案中，所述致病微生物是胞內生物。
所述DAM最好是胞內致病因子。
所述DAM最好是疾病相關細胞表面分子(DACSM)。
按照本發明，所述DACSM可以包括但不限於粘著蛋白的受體，例如生長因子受體。生長因子受體的實例包括但不限於ApoE、Apo-SAA、BDNF、心臟營養蛋白-1、EGF、ENA-78、Eotaxin、Eotaxin-2、Exodus-2、酸性FGF、鹼性FGF、成纖維細胞生長因子-10(Marshall 1998Nature Biotechnology 16129)、FLT3配體(Kimura等(1997)Fractalkine(CX3C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-β1、胰島素、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(72a.a.)、IL-8(77a.a)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18(IGIF)、抑制素α、抑制素β、IP-10、角質形成細胞生長因子-2(KGF-2)、KGF、Leptin、LIF、Lymphotactin、繆氏抑制物質、單核細胞集落抑制因子、單核細胞引誘蛋白(Marshall 1998出處同上)、M-CSF、MDC(67a.a.)、MDC(69a.a.)、MCP-1(MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC(67a.a.)、MDC(69a.a.)、MIG、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4、骨髓祖細胞抑制因子-1(MPIF-1)、NAP-2、Neurturin、神經生長因子、β-NGF、NT-3、NT-4、制癌蛋白M、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDF1α、SDF1β、SCF、SCGF、幹細胞生長因子(SCF)、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-β2、TGF-β3、腫瘤壞死因子(TNF)、TNF-α、TNF-β、TNIL-1、TPO、VEGF、GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-λ、HCC1、1-309。生長因子受體的非竭盡一覽表可以在Molecular Biology and Biotechnology(RA Meyers編著1995 VCH Publishers Inc)的第392-297頁上找到；纖溶酶原激活物；金屬蛋白酶(例如膠原蛋白酶)、粘蛋白；糖蛋白；其組織分布有限的抗原；和/或在腫瘤細胞生長、遷移或轉移中起作用的細胞表面分子(例如5T4抗原、腫瘤特異性糖部分或癌胚抗原)。術語DACSM也可以包括抗原決定簇。抗原決定簇本文所用的術語「抗原決定簇」是指與疾病或障礙相關的任何抗原。作為實例，所述抗原決定簇也可以來源於與在生物中無限制增殖並因此可能導致病理性生長的患病細胞(例如腫瘤細胞)相關的致病因子。在Davis，B.D.等(Microbiology，第3版，Harper International Edition)中描述了這類致病因子的實例。所述抗原決定簇可以是抗原和/或抗原上的優勢免疫表位。作為實例，所述抗原決定簇可以包括可作為宿主免疫系統的靶並且誘發導致腫瘤破壞的應答的腫瘤相關抗原(TAA)。TAA術語「腫瘤相關抗原(TAA)」在本文用來指任何TAA或其抗原性肽。所述抗原是由腫瘤自身或與腫瘤相關的細胞(例如實質細胞或相關血管系統的細胞)表達的抗原。術語「腫瘤相關抗原(TAA)」包括使所述腫瘤細胞區別於其正常細胞對應物、在其中可能以微量存在的抗原。
TAA的實例包括但不限於MART-1(T細胞所識別的黑素瘤抗原-1)、MAGE-1、MAGE-3、5T4、gp100、癌胚抗原(CEA)、前列腺特異性抗原(PSS)、粘蛋白(MUC-1)、酪氨酸酶。特別優選的TAA是細胞表面分子，因為它們定位以供免疫系統的組分識別，並且是治療(例如治療和/或免疫療法)極好的靶。本發明決不限於編碼以上所列TAA的抗原決定簇。通過本領域已知的方法，例如在美國專利第4,514,506號中公開的方法，可以鑑定、分離和克隆其它TAA。5T4 TAATAA 5T4(參見WO89/07947)已經被廣泛地表徵。它是一種在癌中廣泛表達、但在正常成體組織中表達模式高度有限的72kDa糖蛋白。它看來在結腸直腸癌和胃癌中與轉移密切相關。人5T4的完整核酸序列是已知的(Myers等，1994 J Biol Chem 1699319-24)。共同刺激分子為了對DAM應答，淋巴細胞需要至少兩種不同的信號來激活其效應子功能(Bretscher和Cohn 1970 Science 1691042-1049；Crabtree1989 Science 243355-361)。初級信號對於抗原是特異性的。在分離中對初級信號的刺激通常導致所述淋巴細胞的細胞凋亡(程序性細胞死亡)，或導致建立持續無應答性或無反應性狀態(Weiss等，參見上文)。為了達到對淋巴細胞的激活，需要輔助信號，輔助信號可能通過細胞因子或抗原呈遞細胞(APC)上存在的細胞表面共同刺激配體來傳遞。
現在已鑑定出許多這類共同刺激分子，包括粘著分子、LFA-3、ICAM-1、ICAM-2。APC上存在的主要共同刺激分子是B7家族成員，包括B7-1(CD80)、B7-2(CD86)和B7-3。這些分子是淋巴細胞上共同刺激受體包括CD28(WO92/00092)的配體，CD28也許是靜息T細胞最為重要的共同刺激受體。糖蛋白B7家族的不同成員可能精細地將不同信號傳遞至T細胞(Nunes等1996 J.Biol.Chem.2711591-1598)。
在本發明的一個實施方案中，使用一種ScFv Ab，所述ScFv Ab包含一個對DAM(例如腫瘤抗原)具有結合親和性的分泌型共同刺激分子(「SCM」)。ScFv Ab的來源本發明的ScFv Ab可由任何合適的來源(無論是天然的還是非天然的)獲得或產生，或者它可以是合成ScFv Ab、半合成ScFv Ab、模擬物、衍生化ScFv Ab、重組ScFv Ab、發酵優化的ScFv Ab、融合蛋白或等同物、突變體和其衍生物，只要它保留本發明ScFv Ab的所需DNA結合特異性即可。這些包括具有DAM結合特異性的ScFv Ab，所述ScFv Ab可以具有胺基酸取代，或者可以具有與胺基酸官能團連接的糖或其它分子。
術語「模擬物」涉及具有與本發明的ScFv Ab相同的結合特異性的任何化學製劑，它可以是肽、多肽、抗體或其它有機化學物質。
本文所用的術語「衍生物」或「衍生化的」包括對ScFv Ab的化學修飾。作為這類修飾的例證可以是氫被烷基、醯基或氨基取代。最好是，所述ScFv Ab包括已經通過重組DNA技術製備或通過化學合成技術產生或其組合而製備或產生的ScFv Ab的至少一個部分。
所述ScFv Ab最好利用化學合成技術來製備。化學合成方法採用化學方法來完全或部分合成所述ScFv Ab的胺基酸序列，可以產生本發明的ScFv Ab或其變異體、同源物、衍生物、片段或模擬物。例如，可以通過固相技術合成肽，將其從樹脂上切下，並通過製備性高效液相色譜純化(例如Creighton(1983)Proteins Structures AndMolecular Principles，WH Freeman and Co.，New York NY)。所述合成肽的組成可以通過胺基酸分析或測序加以證實(例如Edman降解法；Creighton，參見上文)。
採用各種固相技術，進行所述ScFv Ab或其變異體、同源物、衍生物、片段或模擬物的直接合成(Poberge JY等(1995)Science 269202-204)，可以例如採用ABI 43 1A肽合成儀(Perkin Elmer)，按照生產商提供的說明，完成自動合成。另外，可以在直接合成期間對可得自所述ScFv Ab或其任何部分的胺基酸序列加以改變和/或採用化學方法將其與得自其它亞基的序列或其任何部分組合，產生變異型ScFvAb。
在本發明的一個替代實施方案中，採用本領域眾所周知的化學方法，可以完全或部分合成所述ScFv Ab或其變異體、同源物、衍生物、片段或模擬物的編碼序列(參見Caruthers MH等(1980)Nuc.Acids ResSymp Ser 215-23，Horn T等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 225-232)。
本發明的ScFv Ab最好包含SEQ ID No 1中所示的胺基酸序列(參見

圖1)。
本發明的ScFvAb最好包含SEQ ID No 3中所示的胺基酸序列(參見圖2)。
本發明的ScFvAb最好包含SEQ ID No 4中所示的胺基酸序列(參見圖6)。胺基酸序列本文所用的術語「胺基酸序列」是指肽序列、多肽序列、蛋白質序列或其部分。
所述ScFv Ab最好是分離的ScFv Ab和/或純化的和/或非天然的ScFv Ab。
本發明的ScFv Ab可以是基本上分離的形式。人們會理解，所述蛋白質可以與不幹擾所述ScFv Ab計劃目的的載體或稀釋劑混合，並且仍被認為是基本上分離的。本發明的ScFv Ab也可以是基本上純化的形式，在這種情況下，它一般在製劑中包含所述ScFv Ab，其中在所述製劑中超過90％(例如95％、98％或99％)的所述ScFv Ab是包含SEQ ID No 1或SEQ ID No 3或SEQ ID No 4的肽、或其變異體、同源物、衍生物或片段。胺基酸序列的變異體/同源物/衍生物本發明的優選胺基酸序列示於SEQ ID No 1或SEQ ID No 3或SEQ ID No 4中，它們是可得自本發明ScFv Ab的序列，但也包括得自任何來源的同源序列，例如相關的病毒/細菌蛋白、細胞同源物和合成肽以及其變異體或衍生物。
本發明也首次提供完整的犬5T4胺基酸序列和核酸序列(圖26和SEQ ID No 14和15)。因此，本發明也提供i)一種犬5T4多肽或其變異體、同源物、片段或衍生物，所述多肽具有SEQ ID No 14中所示的胺基酸序列；和ii)能夠編碼這種犬5T4多肽的核苷酸序列或其變異體、同源物、片段或衍生物，所述核苷酸序列最好具有SEQ ID No 15所示的序列。
因此，本發明包括本文介紹的胺基酸序列的變異體、同源物或衍生物、以及編碼這些胺基酸序列的核苷酸序列的變異體、同源物或衍生物。
在本發明的正文中，用同源序列來包括在胺基酸水平上在至少例如本文序列表中SEQ ID No 1或SEQ ID No 3或SEQ ID No 4或SEQID No 14所示的胺基酸序列範圍內有至少75％、85％或90％相同、優選至少95％或98％相同的胺基酸序列。具體地說，同源性應該通常根據所述序列中已知對於結合特異性而言必需的區(例如各位置的胺基酸)來考慮，而不是根據非必需的相鄰序列來考慮。雖然同源性也可以根據相似性(即具有相似化學特性/功能的胺基酸殘基)來考慮，但在本發明的正文中，最好是根據序列同一性來表示同源性。
同源性比較可以藉助眼睛來進行，或更通常藉助於容易獲得的序列比較程序來進行。這些市售的電腦程式可以計算出兩個或更多個序列之間的同源性百分率。
同源性百分率可以在連續序列範圍內進行計算，即將一個序列與另一序列對齊，並且將一個序列中的每個胺基酸直接與另一序列中的相應胺基酸進行比較，每次比較一個殘基。這稱為「沒有空位的(ungapped)」比對。通常，這種沒有空位的比對僅在相對短數目的殘基範圍內進行。
雖然這是一種非常簡單而一致的方法，但它不能考慮例如在其它情況下相同的一對序列中，一個插入或缺失將引起隨後的胺基酸殘基不能對齊，從而當進行全序列比對時，潛在地導致同源性百分率大大降低。因此，大多數的序列比較方法設計產生最佳比對，最佳比對考慮到可能的插入和缺失，而對整體同源性分值不會處以過高的罰分。通過在序列比對中插入「空位」以嘗試使局部同源性最大化，來達到這一點。
然而，這些更為複雜的方法為在序列比對中發生的每個空位指定「空位處罰」，使得對於相同數目的相同胺基酸而言，具有儘可能少的空位、反映出兩個比較序列之間較高相關性的序列比對將獲得比具有許多空位的序列比對有更高的分值。「Affine空位罰分」通常用來對存在一個空位處以相對高的罰分，而對該空位的每個後續殘基的罰分較低。這是最常用的空位打分系統。不用說，高空位處罰會產生具有較少空位的最佳序列比對。大多數的序列比對程序允許對空位處罰進行修改。然而，當使用這類軟體進行序列比較時，最好使用默認值。例如，當使用GCG Wisconsin Bestfit軟體包(參見下文)時，胺基酸序列的默認空位處罰為一個空位為-12，而每個空位延伸為-4。
因此，最大同源性百分率的計算首先需要考慮空位處罰，產生最佳比對。用於進行這種序列比對的合適電腦程式是GCG WisconsinBestfit軟體包(University of Wisconsin，U.S.A.；Devereux等，1984，Nucleic Acids Research 12∶387)。可以進行序列比較的其它軟體的實例包括但不限於BLAST軟體包(參見Ausubel等，1999，出處同上-第18章)、FASTA(Atschul等，1990，J.Mol.Biol.，403-410)和GENEWORKS比較工具程序組。BLAST和FASTA都可用於脫機和在線搜索(參見Ausubel等，1999，出處同上，第7-58頁至第7-60頁)。然而，最好是使用GCG Bestfit程序。一種稱為BLAST 2 Sequences的新工具可用來比較蛋白質和核苷酸序列(參見FEMS Microbiol Lett 1999 174(2)247-50；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1)187-8和[email protected])。
雖然可以根據同一性測量最終的同源性百分率，但序列比對過程本身通常不基於全或無成對比較。而是，通常用繪製的相似性分值矩陣，該分值矩陣根據化學相似性或進化距離，為每個成對比較指定分值。常用的這種矩陣的一個實例是BLOSUM62矩陣-BLAST程序組的默認矩陣。GCG Wisconsin程序一般或者使用公共默認值，或者使用用戶符號比較表(如果供應的話)(有關進一步的細節，參見用戶手冊)。最好使用GCG軟體包的公共默認值，或在其它軟體的情況下，使用默認矩陣，例如BLOSUM62。
一旦軟體產生了最佳比對，則有可能計算出同源性百分率，最好是序列同一性百分率。軟體通常將此作為序列比較的一部分來進行，並且產生數字結果。
與本發明氫基酸序列相關的術語「變異體」或「衍生物」包括所述序列中的一個(或多個)胺基酸的任何取代、變異、修飾、取代、缺失或添加，條件是所得胺基酸序列具有結合特異性，最好具有與本文序列表的SEQ ID No 1或SEQ ID No 3或SEQ ID No 4或SEQ ID No 14中所示胺基酸序列至少相同的結合特異性。
可以對本文序列表的SEQ ID No 1或SEQ ID No 3或SEQ ID No 4或SEQ ID No 14進行修飾，以用於本發明。通常，進行維持所述序列的結合特異性的修飾。可以進行例如1個、2個或3個至10個或20個取代的胺基酸取代，條件是所述經修飾的序列保留所需的結合特異性。胺基酸取代可以包括利用非天然存在的類似物。
本發明的ScFv Ab也可以具有產生沉默改變並且產生功能等同的ScFv Ab的胺基酸殘基的缺失、添加或取代。可以根據所述殘基在極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親性質方面的相似性，進行有意的胺基酸取代，只要保留所述ScFv Ab的結合特異性即可。例如，帶負電的胺基酸包括天冬氨酸和穀氨酸；帶正電的胺基酸包括賴氨酸和精氨酸；而其不帶電極性頭基團具有相似親水性值的胺基酸包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。這些也適用於犬5T4序列。
可以例如按照下表，進行保守取代。第二欄同一框中的胺基酸、最好是第三欄同一行中的胺基酸可以相互取代
最好是，利用重組技術製備所述分離的ScFv Ab和/或純化的ScFvAb和/或非天然ScFv Ab和/或5T4序列。
關於犬5T4序列的片段，所述片段最好包含SEQ ID No 14中所示胺基酸1-182和/或297-420中的至少一個、優選其中某些、最優選全部。核苷酸序列技術人員會理解，由於遺傳密碼的簡併性，許多不同的核苷酸序列可以編碼本發明的同一ScFv Ab。另外，人們會理解，技術人員可以利用常規技術，製備不影響由本發明核苷酸序列編碼的ScFv Ab的核苷酸取代，以反映出待表達本發明ScFv Ab的任何特定宿主生物的密碼子選擇。
與本發明的SEQ ID No 5(參見圖1)或SEQ ID No 7(參見圖2)或SEQ ID No 8(參見圖6)中所示核苷酸序列有關的術語「變異體」、「同源物」或「衍生物」，包括所述序列中一個(或多個)核酸的任何取代、變異、修飾、取代、缺失或添加，條件是所得核苷酸序列編碼具有結合特異性的ScFv Ab，最好是具有與本發明序列表的SEQ ID No 5或SEQ ID No 7或SEQ ID No 8中所示核苷酸序列至少相同的結合特異性的ScFv Ab。
與本發明的SEQ ID No 15(參見圖26)中所示核苷酸序列有關的術語「變異體」、「同源物」或「衍生物」，包括所述序列中一個(或多個)核酸的任何取代、變異、修飾、取代、缺失或添加，條件是所得核苷酸序列編碼犬5T4多肽、最好是本發明序列表的SEQ ID No 14中所示多肽。
如上所述，就序列同源性而言，優選與本文序列表中所示序列具有至少75％同源性，更優選具有至少85％同源性，更優選具有至少90％同源性。更優選具有至少95％同源性，更優選具有至少98％同源性。核苷酸同源性比較可以如上所述進行。一種優選的序列比較程序是以上所述的GCG Wisconsin Bestfit程序。默認打分矩陣對於每個相同核苷酸的匹配值為10，而每個錯配為-9。對於每個核苷酸而言，默認空位產生罰分為-50，而默認空位延伸罰分為-3。
本發明也包括能夠選擇性地與本文所述序列的任何變異體、片段或衍生物雜交的核苷酸序列或與任何上述序列互補的序列。核苷酸序列最好長至少15個核苷酸，更優選長至少20個、30個、40個或50個核苷酸。
就犬5T4序列的片段而言，所述片段優選包含SEQ ID No 15中所示核酸1-546和/或890-1263中的至少一個、優選某些、最優選全部。雜交本文所用的術語「雜交」將包括「一條核酸鏈通過鹼基配對與互補鏈結合的過程」以及在聚合酶鏈式反應(PCR)技術中進行的擴增過程。
本發明的能夠選擇性地與本文所述核苷酸序列或其互補序列雜交的核苷酸序列，在至少20個、優選至少25個或30個、例如至少40個、60個或100個或更多個連續核苷酸的區內與本文所述相應的核苷酸序列的同源性一般至少為75％、優選至少為85％或90％，更優選至少為95％或98％。優選的本發明核苷酸序列將包含與本發明序列表的SEQ ID No 5或SEQ ID No 7或SEQ ID No 8或SEQ ID No 15中所示核苷酸序列同源的區域，所述同源區域與本發明序列表的SEQ ID No 5或SEQ ID No 7或SEQ ID No 8中所示核苷酸序列的同源性優選至少為80％或90％，更優選至少為95％。
術語「選擇性地雜交」是指用作探針的核苷酸序列在發現本發明的靶核苷酸序列可與所述探針以顯著高於本底的水平雜交的條件下使用。本底雜交的發生可能是由於在例如待篩選的cDNA文庫或基因組DNA文庫中存在的其它核苷酸序列所致。在這一事件中，本底意味著通過所述探針和所述文庫的非特異性DNA成員之間的相互作用而產生的信號水平，其強度是用靶DNA觀測到的特異性相互作用的強度的10分之一，最好是100分之一。相互作用的強度可以例如通過用32P對所述探針進行放射性標記來測量。
雜交條件基於所述核酸結合複合物的解鏈溫度(Tm)，如Berger和Kimmel(1987，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods inEnzymology，第152卷，Academic Press，San Diego CA)中所述，並且提供在下文解釋的限定的「嚴格性」。
最高嚴格性通常發生在約Tm-5℃(比所述探針Tm低5℃)；高嚴格性發生在低於Tm約5℃至10℃；中等嚴格性發生在低於Tm約10℃至20℃；而低嚴格性發生在低於Tm約20℃至25℃。正如本領域技術人員會理解的，可以用最高嚴格性雜交來鑑定或檢測相同的核苷酸序列，而可以用中等(或低)嚴格性雜交來鑑定或檢測相似或相關的多核苷酸序列。
在一個優選方面，本發明包括可以在嚴格條件下(例如65℃和0.1×SSC{1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M檸檬酸三鈉pH7.0})與本發明的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。當本發明的核苷酸序列是雙鏈時，則本發明包括或者單獨或者組合的所述雙鏈體的兩條鏈。當所述核苷酸序列是單鏈時，人們會理解，該核苷酸序列的互補序列也包括在本發明的範圍內。
可以以多種方式，獲得與本發明序列並非100％同源、但屬於本發明範圍內的核苷酸序列。本文所述序列的其它變異體可以例如通過探測由各種各樣來源製備的DNA文庫來獲得。另外，可以獲得其它病毒/細菌或細胞同源物、特別是在哺乳動物細胞(例如大鼠、小鼠、牛和靈長類細胞)中發現的細胞同源物，這類同源物及其片段一般將能夠與本文序列表中所示序列選擇性地雜交。通過探測由其它動物物種製備的cDNA文庫或基因組文庫，以及在中等嚴格性至高嚴格性條件下用包含本發明序列表的SEQ ID No 5或SEQ ID No 7或SEQ ID No 8或SEQ ID No 15中所示核苷酸序列的全部或其部分的探針來探測這類文庫，可以獲得這類序列。相似的考慮適用於獲得本發明胺基酸序列和/或核苷酸序列的物種同源物和等位基因變異體。
也可以利用簡併PCR獲得變異體和株系/物種同源物，簡併PCR所利用的引物設計用以靶向所述變異體和同源物內編碼本發明序列中保守胺基酸序列的序列。通過對來自幾種變異體/同源物的胺基酸序列進行序列比對，可以預測保守序列。序列比對可以用本領域已知的計算機軟體來進行。例如，廣泛使用GCG Wisconsin PileUp程序。用於簡併PCR的引物將含有一個或多個簡併位置，並且將在低於用針對已知序列的單一序列引物克隆序列所用的嚴格性條件下使用。
或者，通過對已表徵序列例如本發明序列表的SEQ ID No 5或SEQ ID No 7或SEQ ID No 8或SEQ ID No 15中所示核苷酸序列進行定點誘變，可以獲得這類核苷酸序列。這在例如需要對序列進行沉默密碼子改變以對於表達所述核苷酸序列的特定宿主細胞優化密碼子偏好時可能是有用的。為了導入限制性酶識別位點，或為了改變由所述核苷酸序列編碼的ScFv Ab的結合特異性，可能需要其它的序列改變。
可以利用本發明的核苷酸序列產生引物(例如PCR引物、用於可變擴增反應的引物)、探針(例如採用放射性或非放射性標記通過常規方法用揭示性標記來標記的探針)，或可以將所述核苷酸序列克隆到載體中。這類引物、探針和其它片段的長度至少為15個核苷酸，優選至少20個核苷酸，例如至少25個、30個或40個核苷酸，本文所用的術語本發明的核苷酸序列也包括這些引物、探針和其它片段。
按照本發明的核苷酸序列(例如DNA多核苷酸和探針)可以重組產生、合成產生，或通過本領域技術人員可利用的任何方法來產生。也可以通過標準技術將其克隆。
一般而言，通過合成方法產生引物，包括分步製備所需的核酸序列，每次一個核苷酸。採用自動化技術完成這一步的技術是本領域容易獲得的。
較長的核苷酸序列一般採用重組方法產生，例如採用PCR(聚合酶鏈式反應)克隆技術。這將包括製備鄰接需要克隆的打靶序列中一個區的一對引物(例如約15-30個核苷酸)，使所述引物與得自動物細胞或人類細胞的mRNA或cDNA接觸，在引起擴增所需區的條件下進行聚合酶鏈式反應(PCR)，分離所擴增的片段(例如通過在瓊脂糖凝膠上純化反應混合物)，並且回收所擴增的DNA。可以設計所述引物，以使其含有合適的限制性酶識別位點，使得可以將所擴增的DNA克隆到合適的克隆載體中。
由於遺傳密碼固有的簡併性，可以運用編碼基本相同或功能上等同的胺基酸序列的其它DNA序列，來克隆和表達所述ScFv Ab。正如本領域技術人員會理解的，可能最好產生具有非天然存在的密碼子的編碼所述ScFv Ab的核苷酸序列。可以選擇特定原核宿主或真核宿主優選的密碼子(Murray E等(1989)Nuc Acids Res 17477-508)，例如以增加所述ScFv Ab的表達速率，或產生具有所需特性的重組RNA轉錄物，所述所需特性例如為半壽期比由天然存在的序列產生的轉錄物的半壽期長。
在本發明的一個實施方案中，所述ScFv Ab是一種重組ScFv Ab。
所述重組ScFv Ab最好是用遺傳載體來製備。載體正如本領域眾所周知的，載體是一種工具，允許或促進一種實體從一種環境轉移到另一種環境。按照本發明，並且作為實例，重組DNA技術中所用的某些載體允許實體例如DNA區段(例如異源DNA區段，例如異源cDNA區段)轉移到宿主和/或靶細胞中，以複製包含本發明核苷酸序列的載體和/或表達本發明核苷酸序列所編碼的本發明蛋白。重組DNA技術中所用的載體的實例包括但不限於質粒、染色體、人工染色體或病毒。
術語「載體」包括表達載體和/或轉化載體。
術語「表達載體」是指能夠體內或體外/離體表達的構建體。
術語「轉化載體」是指能夠從一個物種被轉移到另一個物種的構建體。「裸DNA」可以將包含編碼本發明ScFv Ab的核苷酸序列、用於影響病毒感染的載體作為「裸核酸構建體」直接給予，所述構建體最好還包含與宿主細胞基因組同源的側翼序列。
本文所用的術語「裸DNA」是指包含編碼本發明ScFv Ab的核苷酸序列以及控制其產生的短啟動子區的質粒。它稱為「裸」DNA，是因為所述質粒不載於任何傳遞載體中。當這樣一種DNA質粒進入宿主細胞例如真核細胞中時，它所編碼的蛋白質(例如所述ScFv Ab)則可以在所述細胞中被轉錄和翻譯。非病毒傳遞或者，可以採用本領域已知的各種各樣的非病毒技術，例如轉染、轉化、電穿孔和基因槍轉化，將包含本發明核苷酸序列的載體導入合適宿主細胞中。
本文所用的術語「轉染」是指採用非病毒載體傳遞基因至靶哺乳動物細胞的過程。
轉染方法通常包括電穿孔、DNA基因槍、脂質介導的轉染、壓縮(compacted)DNA介導的轉染、脂質體、免疫脂質體、脂質轉染、陽離子試劑介導的轉染、陽離子面式兩親物(CFA)(Nature Biotechnology1996 14；556)、多價陽離子例如精胺、陽離子脂質或聚賴氨酸、1，2-雙(油醯氧基)-3-(三甲基銨基)丙烷(DOTAP)-膽固醇複合物(Wolff和Trubetskoy 1998 Nature Biotechnology 16421)和它們的組合。
通過幾種已知的轉染技術，例如包括利用轉染劑的轉染法，增強哺乳動物細胞對裸核酸構建體的攝取。這些試劑的實例包括陽離子試劑(例如磷酸鈣和DEAE-葡聚糖)和脂質轉染劑(例如lipofectamTM和transfectamTM)。通常，將核酸構建體與轉染劑混合，產生組合物。病毒載體或者，可以運用各種各樣的本領域已知的病毒技術，例如用重組病毒載體(例如逆轉錄病毒、單純皰疹病毒和腺病毒)感染，可以將包含本發明核苷酸序列的載體導入合適的宿主細胞中。
所述載體最好是一種重組病毒載體。合適的重組病毒載體包括但不限於腺病毒載體、腺相關病毒(AAV)載體、皰疹病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、杆狀病毒載體、痘病毒載體或細小病毒載體(參見Kestler等1999 Human Gene Ther 10(10)1619-32)。就病毒載體而論，通過病毒感染靶細胞，介導基因傳遞。逆轉錄病毒載體逆轉錄病毒的實例包括但不限於鼠類白血病病毒(murineleukemia virus)(MLV)、人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus)(HIV)、馬傳染性貧血病病毒(equine infectious anaemia virus)(ELAV)、小鼠乳腺瘤病毒(mouse mammary tumour virus)(MMTV)、勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma viaus)(RSV)、弗吉納米肉瘤病毒(Fujinami sarcomavirus)(FuSV)、莫洛尼鼠類白血病病毒(Moloney murine leukemia virus)(Mo-MLV)、FBR鼠類骨肉瘤病毒(FBR murine osteosarcoma virus)(FBRMSV)、莫洛尼鼠類肉瘤病毒(Moloney murine sarcoma virus)(Mo-MSV)、艾貝爾遜鼠類白血病病毒(Abelson murine leukemia virus)(A-MLV)、禽髓細胞瘤病病毒-29(Avian myelocytomatosis virus-29)(MC29)和禽成紅細胞增生病毒(Avian erythroblastosis virus)(AEV)。
按照本發明使用的優選載體是重組病毒載體，特別是重組逆轉錄病毒載體(RRV)，例如慢病毒載體。
術語「重組逆轉錄病毒載體」(RRV)是指具有足夠逆轉錄病毒遺傳信息以允許在包裝組分存在下將RNA基因組包裝到能夠感染靶細胞的病毒粒子中的載體。對靶細胞的感染包括逆轉錄和整合到靶細胞基因組中。RRV攜帶將由所述載體傳遞至靶細胞的非病毒編碼序列。RRV不能在最終的靶細胞中獨立地複製產生感染性逆轉錄病毒粒子。通常所述RRV缺乏功能性gag-pol和/或env基因和/或複製所必需的其它基因。本發明的載體可以構成為斷裂-內含子載體。斷裂內含子載體在PCT專利申請WO99/15683中有描述。
在Coffin等(「Retroviruses」1997 Cold Spring Harbour LaboratoryPress編著JM Coffin，SM Hughes，HE Varmus，第758-763頁)中可以找到逆轉錄病毒的詳細一覽表。慢病毒載體慢病毒可以分為靈長類和非靈長類兩個組。靈長類慢病毒的實例包括但不限於人免疫缺陷病毒(HIv)-人自身免疫缺陷症候群(AIDS)的病原體以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。非靈長類慢病毒組包括原型「慢病毒(slow virus)」維納斯/梅迪病毒(visna/maedi virus)(VMS)以及相關的山羊關節炎-腦炎病毒(caprine arthritis-encephalitis virus)(CAEV)、馬傳染性貧血病病毒(equine infectious anaemia virus)(EIAV)和新近描述的貓免疫缺陷病毒(feline immunodeficiency virus)(FIV)和牛免疫缺陷病毒(bovine immunodeficiency virus)(BIV)。
慢病毒科和其它類型的逆轉錄病毒之間的區別在於慢病毒有既可感染分裂中的細胞又可感染不分裂細胞的能力(Lewis等1992 EMBO.J 113053-3058；Lewis和Emerman 1994 J.Virol.68510-516)。相反，其它逆轉錄病毒例如MLV不能感染不分裂的細胞，例如構成例如肌肉、腦、肺和肝組織的那些細胞。腺病毒在本發明的一個實施方案中，可以將腺病毒的特徵與逆轉錄病毒/慢病毒的遺傳穩定性結合在一起，這可以用來轉導靶細胞，使其成為能夠穩定感染相鄰細胞的瞬時逆轉錄病毒生產細胞。可以將已被工程改造以表達本發明ScFv Ab的這類逆轉錄病毒生產細胞植入生物(例如動物或人類)體內，用於治療疾病例如癌症。痘病毒按照本發明使用的優選載體是重組痘病毒載體，例如禽痘病毒(FPV)、昆蟲痘病毒、痘苗病毒例如NYVAC、金絲雀痘病毒、MVA或其它非複製型病毒載體系統，諸如在例如WO95/30018中描述的那些病毒載體系統。雜種病毒載體在另一廣義方面，本發明提供一種用於體內傳遞編碼本發明ScFvAb的核苷酸序列的雜種病毒載體系統，該系統包含一種或多種第一病毒載體，所述第一病毒載體編碼第二病毒載體，所述第一載體能夠感染第一靶細胞並能夠在所述細胞中表達所述第二病毒載體，所述第二載體能夠轉導第二靶細胞。
所述第一載體最好可得自或基於腺病毒載體和/或所述第二病毒載體可得自或基於逆轉錄病毒載體，最好是慢病毒載體。定向載體術語「定向載體」是指其感染/轉染/轉導細胞或在宿主和/或靶細胞中表達的能力被限於宿主生物中的某些細胞類型的載體，所述某些細胞類型通常為具有共同或相似表型的細胞。複製型載體可以將編碼本發明ScFv Ab的核苷酸序列加入到重組複製型載體中。可以用所述載體在匹配的宿主細胞中複製所述核苷酸序列。因而在本發明的一個實施方案中，本發明提供一種製備本發明ScFv Ab的方法，所述方法包括將本發明的核苷酸序列導入一種複製型載體中，將所述載體導入匹配的宿主細胞中，並讓所述宿主細胞在引起所述載體複製的條件下生長。可以從所述宿主細胞中回收所述載體。表達載體最好將插入到載體中的本發明的核苷酸序列與能夠保證宿主細胞表達所述編碼序列(例如本發明ScFv Ab的編碼序列)的控制序列有效連接，即所述載體是一種表達載體。根據所用的序列和/或載體，由重組宿主細胞產生的ScFv Ab可以被分泌出或可以包含在細胞內。正如本領域技術人員會理解的，可以設計含有所述ScFv Ab編碼序列的表達載體，使其具有指導所述ScFv Ab編碼序列穿過特定的原核或真核細胞膜分泌的信號序列。體外表達可以如下所述，將本發明的載體轉化或轉染到合適的宿主細胞和/或靶細胞中，以保證本發明的ScFv Ab表達。這種方法可以包括在保證表達載體表達編碼所述ScFv Ab的編碼序列的條件下培養用所述載體轉化的宿主細胞和/或靶細胞，並任選地回收所表達的ScFv Ab。所述載體可以是例如配有複製起點、任選的用於表達所述多核苷酸的啟動子和任選的所述啟動子調節基因的質粒或病毒載體。所述載體可以含有一種或多種選擇標記基因，例如就細菌質粒而言的氨苄青黴素抗性基因或就哺乳動物載體而言的新黴素抗性基因。本發明ScFv Ab的表達可以是組成型的，使得它們可以被持續產生，或可以是誘導型的，這需要刺激物來起始表達。在誘導型表達的情況下，需要時例如通過添加誘導物(例如地塞米松或IPTG)至培養基中，可以起始ScFv Ab的產生。ScFv Ab構建體融合蛋白本發明的ScFv Ab也可以作為融合蛋白來產生，例如以便於提取和純化。融合蛋白配偶體的實例包括穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA結合結構域和/或轉錄激活結構域)和β-半乳糖苷酶。融合蛋白配偶體的其它實例包括但不限於包含一種可使ScFv Ab蛋白增溶或有利於ScFv Ab蛋白的產生和純化的抗原性輔蛋白融合的重組ScFv Ab蛋白，所述輔蛋白例如GST、β-半乳糖苷酶或相對大的輔蛋白流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)的脂蛋白D。或者，所述融合蛋白可以包含一種載體蛋白，例如牛血清白蛋白(BSA)或匙孔血藍蛋白(KLH)。在本發明的某些實施方案中，所述標記序列是六組氨酸肽，六組氨酸肽在pQE載體(Qiagen Inc)中提供，並且在Gentz等(1989PNAS 86821-824)中有描述。這類融合蛋白在酵母培養物中可容易地表達(如Mitchell等1993 Yeast 5715-723中所述)並且容易通過親和層析純化。
其它重組構建可以將所述ScFv Ab編碼序列加至編碼有利於可溶性蛋白純化的多肽結構域的核苷酸序列(Kroll DJ等(1993)DNA CellBiol12441-53)。這種純化促進結構域包括但不限於金屬螯合肽例如便於在固定化金屬上純化的組氨酸-色氨酸模塊(Porath J(1992)ProteinExpr Purif 3-.263281)、便於在固定化免疫球蛋白上純化的A蛋白結構域、以及在FLAGS延伸/親和純化系統中利用的結構域(ImmunexCorp，Seattle，WA)。
也可以方便地在所述融合蛋白配偶體和感興趣的蛋白序列之間包括一個蛋白酶解位點，以便於除去融合蛋白序列。作為實例，也可以對融合蛋白進行工程改造，使其含有位於編碼所述ScFv Ab的核苷酸序列和所述異源蛋白序列之間的一個切割位點，使得可以切割所述ScFv Ab並從所述異源部分純化出。在純化結構域和所述ScFv Ab之間包括一個可切割接頭序列例如因子XA或腸激酶(Invitrogen，SanDiego，CA)，也可以用來促進純化。所述融合蛋白最好不妨礙包含本發明所述胺基酸序列的ScFv Ab的結合特異性。
在一個優選實施方案中，所述融合蛋白包含或編碼一種分泌型共同刺激分子(SCM)。SCM融合蛋白本發明的分泌型共同刺激分子(SCM)可以是一種工程融合蛋白，它包含可供從哺乳動物細胞中分泌的一個信號肽和至少一個用作免疫系統細胞的共同刺激信號的另一結構域。也可以想像利用含有不同共同刺激結構域的SCM組合。通過在待治療個體的自體細胞中表達SCM編碼基因，可以產生包含所述SCM的ScFv Ab，因而由所述宿主細胞加入到所述蛋白質中的任何翻譯後修飾都是真正的，並且提供具有完全功能性的蛋白和合適的藥代動力學。
WO-A-02/00092描述多種截短形式的B7-1，所述截短形式的B7-1是通過將翻譯終止密碼子置於跨膜結構域之前而衍生的，並且從哺乳動物細胞中分泌。在這種特定情況下，使用來自製癌蛋白M基因的異源信號肽。WO-A92/00092也描述含有與免疫球蛋白Fc區融合的B7-1的胞外結構域的融合蛋白。這類分子可以與T細胞上的CD28結合，並且可以用來刺激T細胞增殖。然而，這種刺激僅以中等程度發生，除非將所述B7或B7衍生物固定化於固相表面。
Gerstmayer等(1997 J.Immunol.1584584-4590)描述了一種B7-2融合物，在所述融合物中B7-2與對ErbB2特異性的ScFv融合，後接一個myc附加表位和聚組氨酸標誌，所述融合物在酵母巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中表達時被分泌。這種分子保留了對抗原的結合以及對用PMA和IL-2預先刺激的T細胞的共同刺激增殖。然而，這種分子的糖基化屬於酵母類型，這有可能在人體內導致不當的藥代動力學。
按照本發明，可以使用任何合適的共同刺激結構域。作為實例，共同刺激結構域可以選自細胞表面糖蛋白B7家族(包括B7-1、B7-2和B7-3)或其它共同刺激細胞表面糖蛋白(例如但不限於共同刺激受體-配體分子，包括CD2/LFA-3、LFA-1/ICAM-1和ICAM-3)的胞外部分。研究已經表明，單核細胞對T細胞的共同刺激依賴於兩種受體配體途徑CD2/LFA-3和LFA-1/ICAM-1中的每一種(Van Seventer等1991 Eur JImmunol 211711-1718)。另外，已經表明，第三種LFA-1反受體ICAM-3是靜息和活化T淋巴細胞的共同刺激分子(Hernandez-Caselles等1993Eur J Immunol 232799-2806)。
其它可能的共同刺激分子可以包括名為SLAM的新型糖蛋白受體，該受體已經被鑑定出，當被佔用時，以不依賴CD28的方式增強T細胞擴充，並誘導Th0/Th1細胞因子產生分布型(Cocks等1995 Nature376260-263)。
CD6是一種細胞表面糖蛋白，也已經表明它作為T細胞上的共同刺激和粘著受體起作用。已經描述了四種CD6同種型(CD6a、b、c、d)(Kobarg等1997 Eur J Immunol 272971-2980)。也已經提出了極晚期抗原(VLA-4)整聯蛋白在人記憶B細胞活化中的作用(Silvy等1997 EurJ Immunol 272757-2764)。內皮細胞也提供獨特的影響活化CD4+T細胞表型的共同刺激信號(Karmann等1996 Eur J Immunol 26610-617)。已經描述了脂多糖活化的B細胞表面存在的一種B3蛋白，該蛋白可以為靜息T細胞提供共同刺激，導致主要釋放白介素-4(IL-4)和IL-5以及可忽略量的IL-2和幹擾素λ(Vinay等1995 J Biol Chem 27023429-23436)。T細胞和腫瘤細胞上的一種新型共同刺激T細胞抗原(A6H)的共同表達已經提示一種與這些細胞共同特性有關的可能的功能(Labuda等1995 Int Immunol 71425-1432)。
在本發明的一個優選實施方案中，所述共同刺激結構域是B7-1或B7-2的一部分，更優選是B7-1或B7-2的完整胞外部分。
在一個優選實施方案中，通過表達一種編碼融合蛋白的新基因，所述融合蛋白含有一個或多個所述DAM結合結構域和一個或多個所述共同刺激結構域，來生成本發明的ScFv Ab。在本發明的正文中，所述共同刺激結構域與所述ScFv融合。可以將所述結構域以以下順序(N末端至C末端)放置抗原結合結構域後接共同刺激結構域；或共同刺激結構域後接抗原結合結構域。共同刺激結構域最好置於N末端，後接抗原結合結構域。在N末端包括一個信號肽，所述信號肽可以例如是所述共同刺激胞外結構域的天然信號肽。所述不同的結構域可以被額外的序列隔開，所述額外序列可能是由於在所述新基因中包含便利的限制性酶切位點而產生，以有利於其構建，或者用作所述結構域之間的肽間隔區，或用作柔性肽接頭或提供另外的功能。所述結構域最好被一個柔性接頭隔開。
可以用兩種或更多種編碼不同SCM的不同基因來達到改善的共同刺激或共同刺激原初T細胞並且誘導記憶反應。例如，可以將含B7-1胞外結構域的SCM的編碼基因與含B7-2胞外結構域的SCM的編碼基因一起給予。ScFv抗體產生的定量雖然標記基因表達的存在/缺乏可以提示也存在所述核苷酸序列和/或其ScFv Ab，但其存在和表達可以通過常規方法來證實。例如，如果將編碼所述ScFv Ab的核苷酸序列插入標記基因序列中，則根據所述標記基因功能的缺乏，可以鑑定出含有所述ScFv Ab編碼區的重組細胞。或者，可以將標記基因與編碼ScFv Ab的核苷酸序列串連置於單一啟動子的控制之下。對誘導或選擇應答而表達所述標記基因，也表明所述ScFv Ab的表達。
定量測定特定分子表達的其它方法包括放射性標記(Melby PC等1993 J Immunol Methods 159235-44)或生物素化(Duplaa C等1993 AnalBiochem 229-36)核苷酸、共同擴增一種控制核酸、和可內推實驗結果的標準曲線。通過以ELISA形式進行所述測定，其中感興趣的ScFv Ab以各種稀釋度存在，可以加速對多種樣品的定量，並且分光光度或量熱反應可提供快速定量。宿主細胞/靶細胞可以用包含本發明核苷酸序列的宿主細胞和/或靶細胞來在體外、體內和離體條件下表達本發明的ScFv Ab。
術語「宿主細胞和/或靶細胞」包括可來源於載體能夠轉染或轉導的合適生物的任何細胞。宿主細胞和/或靶細胞的實例可以包括但不限於能夠在體外、體內和離體條件下表達本發明ScFv Ab的細胞。這類細胞的實例包括但不限於巨噬細胞、內皮細胞或它們的組合。其它實例包括呼吸道上皮細胞、肝細胞、肌細胞、心肌細胞、滑膜細胞、初級乳腺上皮細胞和有絲分裂後終末分化的非複製型細胞例如巨噬細胞和/或神經元。
在一個優選實施方案中，所述細胞是一種哺乳動物細胞。
在一個高度優選的實施方案中，所述細胞是一種人類細胞。
術語「生物」包括任何合適的生物。在一個優選實施方案中，所述生物是哺乳動物。在一個高度優選的實施方案中，所述生物是人類。
雖然本發明的ScFv Ab可以採用原核細胞作為宿主細胞來生產，但最好使用真核細胞，例如酵母細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞，特別是哺乳動物細胞。合適的宿主細胞包括細菌例如大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞系和其它真核細胞系，例如昆蟲Sf9細胞。
本發明也提供一種用一種或多種本發明的核苷酸序列轉化宿主細胞和/或靶細胞的方法。
術語「轉化細胞」是指具有經修飾遺傳結構的宿主細胞和/或靶細胞。對於本發明而言，如果已經將按照本發明的載體導入細胞，則所述細胞具有經修飾的遺傳結構。
可以在允許本發明的ScFv Ab表達的合適條件下培養宿主細胞和/或靶細胞。
本發明也提供一種方法，所述方法包括將轉化宿主細胞即已經用一種或多種按照本發明的核苷酸序列轉化了的細胞在適合於表達由所述核苷酸序列編碼的ScFv Ab的條件下培養。
本發明也提供一種方法，所述方法包括將轉化宿主細胞即已經用一種或多種按照本發明的核苷酸序列或其衍生物、同源物、變異體或片段轉化了的細胞在適合於表達由所述核苷酸序列編碼的ScFv Ab的條件下培養；然後從所述轉化宿主細胞培養物中回收所述ScFv Ab。
通過各種各樣的本領域已知的技術，包括酶裂解、化學裂解和/或滲透壓裂解和物理破碎，可以從宿主細胞中提取本發明的ScFv Ab。所述ScFv Ab可以用本身已知的方法來純化和分離。體外/體內/離體表達的調節本發明也包括體外/體內/離體調節本發明的ScFv Ab編碼核苷酸序列的基因療法。例如，通過給予與本發明的ScFv Ab編碼核苷酸序列結合的化合物、或與本發明的ScFv Ab編碼核苷酸序列相關的控制區、或其相應RNA轉錄物，以改變轉錄或翻譯的速率，可以完成表達的調節。控制序列與本發明的ScFv Ab編碼序列有效連接的控制序列包括啟動子/增強子以及其它表達調節信號。可以選擇這些控制序列，以使其與設計在其中應用所述表達載體的宿主細胞和/或靶細胞相匹配。例如通過添加其它轉錄調節元件以使由控制序列所指導的轉錄水平對轉錄調節物的應答更強，可以對所述控制序列進行修飾。有效連接的術語「有效連接的」是指所述組分的關係使其以其計劃的方式起作用。與編碼序列「有效連接的」調節序列的連接方式，使得在與所述控制序列相匹配的條件下達到所述編碼序列的表達。
本發明的核苷酸序列最好與轉錄單位有效連接。
本文所述的術語「轉錄單位」是含有編碼序列和用來達到那些編碼序列獨立於任何其它編碼序列表達的信號的核酸區。因而，每個轉錄單位一般包含至少一個啟動子、一個任選的增強子和一個聚腺苷酸化信號。啟動子術語啟動子是本領域眾所周知的，並且以本領域通常的含義使用，例如作為RNA聚合酶結合部位。該術語包括大小和複雜性的範圍從基本啟動子至包括上遊元件和增強子的啟動子的核酸區。
所述啟動子通常選自在哺乳動物細胞中有功能的啟動子，雖然可以可以使用原核啟動子和在其它真核細胞中有功能的啟動子。所述啟動子通常來源於病毒或真核基因的啟動子序列。例如，它可以是來源於將發生表達的細胞的基因組的啟動子。對於真核啟動子，它們可以是以普遍存在的方式起作用的啟動子(例如α-肌動蛋白、β-肌動蛋白、微管蛋白的啟動子)，或者可以是以組織特異性方式起作用的啟動子(例如丙酮酸激酶基因的啟動子)。低氫型啟動子/增強子所述增強子和/或啟動子可以在低氧或局部缺氧環境或低葡萄糖環境中優先有活性，使得所述ScFv Ab編碼核苷酸序列優先在感興趣的特定組織中表達，例如優先在腫瘤、關節炎性關節或局部缺氧的其它部位的環境中表達。因而，可以減輕或消除所述ScFv Ab編碼核苷酸序列對待治療個體的任何顯著的生物學效應或有害效應。提供受調節表達的增強子元件或其它元件可以以多拷貝存在。同樣，或另外，所述增強子和/或啟動子可以優先在一個或多個特定細胞類型中有活性，所述特定細胞類型例如為一種或多種巨噬細胞、內皮細胞或它們的組合。其它實例可以包括但不限於呼吸道上皮細胞、肝細胞、肌細胞、心肌細胞、滑膜細胞、初級乳腺上皮細胞和有絲分裂後終末分化的非複製型細胞，例如巨噬細胞和/或神經元。組織特異性啟動子本發明的啟動子可以是組織特異性啟動子。合適的組織限制型啟動子/增強子的實例是在腫瘤細胞中活性高的那些啟動子，例如來自MUC1基因、CEA基因或5T4抗原基因的啟動子/增強子。時序限制型啟動子/增強子的實例是對局部缺氧和/或低氧應答的那些啟動子/增強子，例如低氧效應元件或grp78或grp94基因的啟動子/增強子。甲胎蛋白(AFP)啟動子也是一種腫瘤特異性啟動子。一種優選的啟動子-增強子組合是人巨細胞病毒(hCMV)主要立即早期(MIE)啟動子/增強子組合。
本發明的啟動子最好是組織特異性的。亦即它們能夠驅動ScFvAb編碼核苷酸序列在一種組織中轉錄，而在其它組織類型中基本上保持「沉默」。
術語「組織特異性」是指這樣的啟動子，所述啟動子的活性被限於單一的組織類型，但是雖然如此，它也可表現出選擇性，因為它們可以在一類組織中有活性，而在另一類組織中活性較低或沉默。本發明啟動子的一個理想的特徵是，它們在缺乏被激活的低氧調節型增強子元件的情況下，甚至在靶組織中，也具有相對低的活性。達到這一點的一種方法是運用「沉默子」元件，所述元件在缺乏低氧的情況下抑制所選定啟動子的活性。
術語「低氧」是指特定器官或組織接受的氧供應不足的條件。
所述ScFv Ab編碼核苷酸序列在特定啟動子控制之下的表達水平，可以通過操作所述啟動子區來加以調節。例如，啟動子區內的不同結構域可能具有不同的基因調節活性。通常採用具有缺失特定區的所述啟動子的不同變異體的載體構建體，來評估這些不同區的作用(亦即缺失分析)。這種方法可以用來鑑定例如能夠提供組織特異性的最小區或提供低氧敏感性的最小區。
多種上述組織特異性啟動子在實施本發明中可能特別有利。在大多數情況下，這些啟動子可以作為便利的適合於在選定載體中克隆的限制性消化片段來分離。或者，可以用聚合酶鏈式反應來分離啟動子片段。通過在引物的5』端加入限制性位點，可以便於擴增片段的克隆。誘導型啟動子本發明的啟動子也可以是對特定刺激物應答的啟動子，例如結合類固醇激素受體的啟動子。也可以使用病毒啟動子，例如莫洛尼鼠類白血病病毒長末端重複(MMLV LTR)啟動子、勞斯肉瘤病毒(RSV)LTR啟動子或人巨細胞病毒(CMV)IE啟動子。
也可以最好是所述啟動子是誘導型啟動子，使得可以在所述細胞的生存期內調節異源基因的表達水平。誘導型是指採用可以被調節的啟動子獲得的表達水平。增強子另外，通過添加其它調節序列，例如增強子序列，可以對這些啟動子中的任一種進行修飾。也可以使用包含來自兩種或更多種上述不同啟動子的序列元件的嵌合啟動子。
術語「增強子」包括與轉錄起始複合物的其它蛋白組分結合併因此促進其相關啟動子所指導的轉錄起始的DNA序列。
本發明ScFv Ab的體外/體內/離體表達可以與感興趣的蛋白(POI)或編碼其的感興趣的核苷酸序列(NOI)聯合使用。與POI/NOI組合本發明的ScFv Ab或編碼其的核苷酸序列可以直接與POI(例如為前體藥物活化酶)聯合使用，或通過載體傳遞至例如靶細胞或靶組織，與POI聯合使用。不在靶組織中選擇性表達，或者除外在靶組織中選擇性表達外，本發明的ScFv Ab或編碼其的核苷酸序列可以與另外的POI(例如一種或多種前體藥物活化酶)或編碼一種或多種前體藥物活化酶的一種或多種感興趣的核苷酸序列(NOI)聯合使用。這些前體藥物活化酶可以直至用所述合適的前體藥物酶所作用的一種或多種前體藥物治療所述個體時才具有顯著的效應或無有害效應。在存在所述活性POI或編碼其的NOI的情況下，用所述合適的前體藥物治療個體，可能導致增強病症的減輕，例如腫瘤生長減弱或生存率降低。前體藥物POI可以將POI(例如前體藥物活化酶)傳遞至患病部位，例如傳遞至腫瘤部位以治療癌症。在所有情況下，聯合使用合適的前體藥物與合適的前體藥物活化酶，來治療所述患者。合適的前體藥物可以與所述ScFv Ab或包含編碼ScFv Ab的核苷酸序列的載體一起給予。前體藥物的實例包括磷酸依託泊苷(與鹼性磷酸酶，Senter等1988 Proc NatlAcad Sci 854842-4846)；5-氟胞嘧啶(與胞嘧啶脫氨酶，Mullen等1994Cancer Res 541503-1506)；多柔比星-N-對羥基苯氧基乙醯胺(與青黴素V醯胺酶，Kerr等1990 Cancer Immunol Immunother 31202-206)；對N-雙(2-氯乙基)氨基苯甲醯穀氨酸(與羧肽酶G2)；頭孢菌素氮芥氨基甲酸鹽(與βb-內醯胺酶)；SR4233(與P450還原酶)；更昔洛韋(與HSV胸苷激酶，Borrelli等1998 Proc Natl Acad Sci 857572-7576)；氮芥前體藥物與硝基還原酶(Friedlos等1997 J Med Chem 401270-1275)和環磷醯胺(與P450，Chen等1996 Cancer Res 561331-1340)。
用於本發明的合適前體藥物活化酶的實例包括胸苷磷酸化酶，它激活5-氟尿嘧啶前體藥物capcetabine和furtulon；得自單純皰疹病毒的胸苷激酶，它激活更昔洛韋；細胞色素P450，它將例如環磷醯胺的前體藥物激活為DNA損害劑；和胞嘧啶脫氨酶，它激活5-氟胞嘧啶。最好使用來源於人類的前體藥物活化酶。POI和NOI用於本發明中的其它合適的感興趣的蛋白(POI)或編碼其的NOI包括具有治療用途和/或診斷用途的那些POI和NOI，例如但不限於編碼以下分子的序列細胞因子、趨化因子、激素、抗體、工程免疫球蛋白樣分子、單鏈抗體、融合蛋白、酶、免疫共同刺激分子、免疫調節分子、反義RNA、靶蛋白的反式顯性失活(transdominant negative)突變體、毒素、條件毒素、抗原、腫瘤抑制蛋白和生長因子、膜蛋白、血管活性蛋白和肽、抗病毒蛋白和核酶以及它們的衍生物(例如具有相關報導基團)。當包括所述POI或編碼其的NOI時，所述POI或NOI可以通常與合適的啟動子有效連接，所述啟動子可以是在一種或多種特定細胞類型中驅動核酶表達的啟動子、或一個或多個不同的啟動子。旁觀者效應所述POI和/或編碼其的NOI可以是從細胞分泌的蛋白質。或者，所述POI表達產物不是分泌型的，而是在所述細胞內有活性。在任何一種情況下，所述POI表達產物都最好表現出旁觀者效應或遠距離旁觀者效應；也就是說，在一個細胞中產生所述表達產物，導致殺傷具有一種共同表型的其它相關細胞，所述相關細胞或者是相鄰的，或者是遠離的(例如轉移的)。
在本發明中用於治療或預防癌症的合適POI或編碼其的NOI包括以下蛋白質破壞靶細胞的蛋白質(例如核糖體毒素)，用作腫瘤抑制物(例如野生型p53)；抗腫瘤免疫機制的激活物(例如細胞因子、共同刺激分子和免疫球蛋白)；血管生成的抑制劑；或提供增強藥物敏感性的蛋白質(例如前體藥物活化酶)；間接刺激天然效應細胞破壞靶細胞的蛋白質(例如刺激免疫系統的強抗原或將前體物質轉化為破壞靶細胞的毒性物質的蛋白質(例如前體藥物活化酶)。所編碼的蛋白質也可以破壞旁觀者腫瘤細胞(例如用分泌型抗腫瘤抗體-核糖體毒素融合蛋白)、間接刺激對旁觀者腫瘤細胞的破壞(例如刺激免疫系統的細胞因子或引起局部血管閉合的前凝血素蛋白或將前體物質轉化為破壞旁觀者腫瘤細胞的毒性物質(例如將前體藥物激活為可擴散藥物的酶)。
此外，也可傳遞編碼反義轉錄物或核酶的NOI，而所述反義轉錄物或核酶是幹擾有關腫瘤持續性的細胞基因的表達的反應轉錄物或核酶(例如針對伯基特氏淋巴瘤中的異常myc轉錄物或針對慢性髓細胞性白血病中的bcr-abl轉錄物)。也設計了應用這類POI和/或編碼其的NOI的組合。
在PCT/GB95/00322(WO-A-9521927)中可以找到低氧可調節治療性NOI的實例。ScFv Ab的偶聯可以採用標準方法，將本發明的ScFv Ab與其它分子偶聯。ScFvAb的氨基末端和羧基末端可以用許多技術進行同位素標記和非同位素標記，例如用常規技術進行放射性標記(酪氨酸殘基-氯胺T、iodogen、乳過氧化物酶；賴氨酸殘基-Bolton-Hunter試劑)。這些偶聯技術是本領域技術人員眾所周知的。根據所述胺基酸上可利用的官能團，包括但不限於氨基、巰基、羧基、醯胺、酚和咪唑，來選擇偶聯技術。用來實現這些偶聯的各種試劑其中包括戊二醛、重氮化聯苯胺、碳二亞胺和對苯醌。化學偶聯可以將本發明的ScFv Ab與同位素、酶、載體蛋白、細胞毒性劑、螢光分子、放射性核素(radioactive nucleotides)或用於各種各樣應用(包括但不限於成象/預後、診斷和/或治療)的其它化合物化學偶聯。採用適合於特定反應的不同技術，測定偶聯反應的效率。例如，用氯胺T和具有高比活的Na125I，完成用125I對ScFv Ab肽進行放射性標記。用焦亞硫酸鈉終止反應，混合物在一次性柱上脫鹽。從該柱上洗脫標記的肽，收集各流分。從每個流分取出等份樣品，並在λ計數器上測量放射性。這樣，將未反應的Na125I與標記的ScFv Ab分離開。貯存具有最高比放射性的肽部分，以供隨後的應用，例如分析與ScFv Ab結合的能力。成象用短壽同位素標記的本發明ScFv Ab的應用，使得可以用放射自顯影技術或現代放射照相技術或其它膜結合技術(例如正電子發射體層攝影術)來定位具有ScFv Ab結合部位的腫瘤，在體內對DAM結合部位進行目測定量。這種應用提供了重要的診斷和/或預後研究的工具。綴合物在其它實施方案中，將本發明的ScFv Ab與以下物質偶聯閃爍照相放射性標記、細胞毒性化合物或放射性同位素、將非毒性前體藥物轉化為細胞毒性藥物的酶、激活免疫系統以將所得綴合物靶向患病部位(例如結腸腫瘤)的化合物、或刺激細胞的化合物。這類綴合物具有一個「結合部分」，該部分由本發明的ScFv Ab組成；和一個「功能部分」，該部分由所述放射性標記、毒素或酶組成。可以合成不同的ScFv Ab，以用於幾種應用，包括但不限於將ScFv Ab與細胞毒性劑連接，以定向殺傷結合所述ScFv Ab的細胞。
或者，可以單獨使用所述ScFv Ab，以便僅僅阻斷所述DAM的活性，特別是通過物理幹擾所述DAM與另一化合物的結合。
通過交聯多肽的任一常規方法，例如在O』Sullivan等(Anal.Biochem 1979100，100-108)中全面描述的方法，將所述綴合物(如果也是肽或多肽的話)的結合部分和功能部分連接在一起。例如，一個部分可能富含巰基，而另一個部分與能夠與那些巰基反應的雙官能劑(例如碘乙酸的N-羥基琥珀醯亞胺酯(NHIA)或N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP))反應。例如用間馬來醯亞胺基苯甲醯-N-羥基琥珀醯亞胺酯得到的醯胺鍵和硫醚鍵，一般在體內比二硫鍵更穩定。
另一方面，如果所述結合部分含有糖類，例如可能是抗體或某些抗體片段的情況，可以採用EP 0 088 695中的連接技術，將所述功能部分通過所述糖部分連接。
所述綴合物的功能部分可以是非毒性前體藥物轉化為毒性藥物的酶，例如Bagshawe及其同事的綴合物(Bagshawe(1987)Br.J.Cancer56，531；Bagshawe等(Br.J.Cancer 198858，700)；WO88/07378)或氰化物釋放系統(WO91/11201)。
可能不必整個酶都存在於所述綴合物中，但是當然，催化部分必須存在。可以使用所謂的「抗體酶」，其中針對參與人們所希望催化的反應的化合物(通常為反應性中間體狀態)，產生ScFv Ab。然後，所得的抗體可以用作該反應的酶。
所述綴合物可以通過大小排阻層析或親和層析來純化，並且測試雙重生物學活性。可以運用酶聯免疫吸附測定(ELISA)，用固定化抗原，在活細胞放射免疫測定中，測量抗原免疫反應性。對於β-葡糖苷酶而言，可以使用酶測定，使用當葡萄糖殘基被水解時改變吸光度的底物，例如oNPG(鄰硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷)，被水解時釋放2-硝基苯酚，後者在405nm下用分光光度計測量。
通過在血清中於37℃保溫，然後通過大小排阻FPLC分析，可以初步體外測試所述綴合物的穩定性。可以通過在注射所述綴合物後不同時間分析血清，以相同的方式在小鼠中測試體內穩定性。另外，在綴合之前，用125I對所述ScFvAb進行放射性標記，而用131I標記所述酶，並且測定小鼠體內所述綴合物、游離ScFv Ab和游離酶的生物分布，這也是可行的。
另一方面，可以通過重組DNA技術，將所述綴合物作為融合化合物產生，從而一段DNA包含編碼所述綴合物兩個部分的相應區，所述相應的區或者相互鄰近，或者被一個編碼不破壞所述綴合物的所需特性的接頭肽的區隔開。
可以想像，所述化合物的兩個功能部分可以完全重疊或部分重疊。然後，用已知方式，使所述DNA在合適的宿主中表達。診斷試劑盒本發明也包括用於檢測和測量生物體液和組織中DAM以及將組織中DAM定位的診斷方法和試劑盒。可以使用具有高結合特異性的本發明ScFv Ab，來建立易於使用的試劑盒，以快速、可靠、靈敏和特異性地測量和定位血漿、尿、組織的提取物中和細胞培養基中的DAM。本發明的ScFv Ab也可以用於診斷方法和試劑盒中，以允許測定循環DAM，而在某些情況下，循環DAM又可以指示疾病狀態的發展，例如原位原發性腫瘤的微轉移瘤的播散。
這些試劑盒可以包括但不限於以下技術競爭性測定和非競爭性測定、放射免疫測定、生物發光測定和化學發光測定、螢光測定、夾層測定、免疫放射分析、斑點印跡測定、酶聯測定包括ELISA、微量滴定板、用於快速監測尿液或血液的抗體包被紙條或浸棒(dipstick)、以及免疫細胞化學。對於每種試劑盒而言，確定了所述測定的範圍、靈敏度、精度、可靠性、特異性和再現性。位移或活性標準曲線上，測定內和測定間差異確定在20％、50％和80％點上。
通常用於研究和臨床的測定試劑盒的一個實例是放射免疫測定(RIA)試劑盒。在成功地放射碘化和純化ScFv Ab後，將幾個稀釋度的具有最高效價的抗血清加入在合適的緩衝體系中含有相對恆定量的放射性(例如10,000cpm)的試管中。其它試管含有緩衝液或免疫前血清，以測定非特異性結合。在於4℃保溫24小時後，加入A蛋白，將試管渦旋混合，於室溫保溫90分鐘，然後於4℃以約2000-2500×g離心，以沉澱與標記ScFv Ab結合的抗血清的複合物。通過吸取取出上清液，在λ計數器中對沉澱中的放射性進行計數。進一步鑑定在減去非特異性結合之後結合約10-40％標記ScFv Ab的抗血清稀釋度。免疫組織化學免疫組織化學試劑盒也可以用來對組織和細胞中DAM進行定位。這種免疫組織化學試劑盒提供說明、一種ScFv Ab以及可能的阻斷性血清和第二抗血清，所述第二抗血清與螢光分子(例如異硫氰酸螢光素)連接，或與用來顯現第一抗血清的某些其它試劑連接。免疫組織化學技術是本領域技術人眾所周知的。這種免疫組織化學試劑盒允許用光學顯微鏡以及電子顯微鏡，將組織切片和培養的細胞中DAM定位。它即可用於研究又可用於臨床。例如，可以對腫瘤進行活組織檢查或收集腫瘤，用切片機切組織切片，以檢查DAM產生的部位。這種信息對於診斷以及可能的治療目的而言，可用於檢測和治療諸如癌症的疾病。胎兒細胞分析本發明的ScFv抗體和/或犬5T4序列也可用於從母體血液中分離胎兒細胞的方法中。已經建議從母體血液中分離胎兒細胞，作為替代aminocentesis的非侵入性方法(參見WO97/30354)。
在本發明的該實施方案中，所述DAM可以是在母體細胞和胎兒細胞上以不同水平表達的任何分子。所述DAM最好是僅在胎兒細胞上表達。已知5T4在滋養層上以非常高的水平表達。因而，抗5T4的抗體可以用來從母體血液中分離滋養層。所述抗體可以是例如按照本發明的ScFv、或是對不同物種的5T4多肽特異性的(例如針對其產生的)抗體。
因此，本發明也提供一種方法，採用本發明的ScFv抗體或來自不同物種的抗5T4抗體，從母體血液中分離胎兒細胞。本發明的犬5T4多肽可用來產生這類交叉反應性抗體。
所述胎兒細胞可以是例如滋養層或紅細胞。
母體細胞/胎兒細胞可以來自人類或動物。因而，本發明的方法可以用於醫學或獸醫學應用。在一個優選實施方案中，母親和胎兒是非人類的，因而所述分離方法是獸醫學應用的一部分。
所述分離方法可以構成診斷方法的一部分。例如，然後可以使胎兒細胞經過生物化學取樣或遺傳學取樣。這樣一種方法應該用來測試胎兒異常(例如唐氏症候群)或用來檢測胎兒的性別。聯合治療本發明的ScFv Ab可以與用於治療疾病的其它組合物和方法聯合使用。作為實例，所述ScFv Ab也可以與疾病(諸如癌症)的常規療法聯合使用。作為另一實例，可以用常規外科、放射療法或化學療法聯合ScFv Ab來治療腫瘤，或者可以隨後將ScFv Ab給予所述患者，以延長微轉移瘤休眠時間，並且穩定任何殘留的原發性腫瘤。ScFv Ab的傳遞可以將所述ScFv Ab與治療有效藥物在同一時間傳遞至同一部位。或者，可以將所述ScFv Ab與所述治療有效藥物在不同時間傳遞至不同的部位。所述ScFv Ab和所述治療有效藥物甚至可以在同一傳遞載體內傳遞，以預防和/或治療病症，例如癌症。
基於應用所述ScFv Ab的治療策略包括通過運用DAM反應性ScFv Ab片段與細菌超抗原葡萄球菌腸毒素(Dohlsten等1994)的融合體，或通過運用針對DAM和T細胞CD3抗原兩者的雙特異性抗體(Kroesen等1994)，募集和激活T細胞。抗DAM抗體也可以與不同的細菌毒素綴合，以產生有效的免疫毒素(LeMaistre等1987；Zimmermann等1997)。ScFv Ab可以與細胞毒性藥物聯合使用，以預防和/或治療疾病狀態，例如血管生成和/或癌症。與ScFvAb連接的細胞毒性藥物(例如蓖麻毒蛋白)可以為破壞結合所述ScFv Ab的細胞提供工具。這些細胞可以在許多位置找到，包括但不限於微轉移瘤和原發性腫瘤。篩選本發明的ScFv Ab或其衍生物或同源物和/或表達本發明ScFv Ab或其衍生物或同源物的細胞系，可以用來篩選能夠影響所述ScFv Ab結合特異性的因子(例如肽、有機或無機分子)。
在一個實施方案中，本發明的篩選可以鑑定出本發明ScFv Ab的激動劑和/或拮抗劑。
在另一實施方案中，本發明的ScFv Ab可以用於各種各樣的藥物篩選技術中。用於這種試驗的ScFv Ab可以游離於溶液中、固定於固相支持體上、載於細胞表面或位於細胞內。可以測量ScFv Ab結合特異性的消失或所述ScFv Ab和所述待測因子之間結合複合物的形成。
用於篩選的另一技術可供用於對所述ScFv Ab具有適當結合親和性的藥物的高通量篩選(HTS)，並且基於WO84/03564中詳細描述的方法。
可以預期，本發明的測定方法將既適合於試驗化合物的小規模和大規模篩選，也適合於定量測定噬菌體展示篩選噬菌體展示可以用於鑑定因子，例如可被本發明ScFv Ab接合的因子，例如DAM。噬菌體展示是一種利用重組噬菌體的分子篩選方案。所述技術涉及用編碼能夠與靶ScFv Ab反應的合適配體(例如候選DAM)的核苷酸序列(或其衍生物或同源物)轉化噬菌體，或用編碼靶ScFv Ab的核苷酸序列(或其衍生物或同源物)轉化噬菌體。所述轉化噬菌體(它最好被束縛於固相支持體)表達所述合適的配體(例如所述候選因子)，並且在其噬菌體外殼上展示所述配體。分離並擴增帶有識別所述候選DAM的靶ScFv Ab分子的一種或多種實體(例如細胞)。然後鑑定成功的候選的DAM。
用本發明的ScFv Ab靶向表達DAM的細胞，便於開發ScFv Ab以調節表達所述DAM的細胞的活性。
在本發明的另一個實施方案中，可以用ScFv Ab文庫來篩選針對特定DAM的抗體。作為實例，可以用編碼能夠與靶DAM反應的合適配體(例如候選ScFv Ab)的核苷酸序列(或其衍生物或同源物)，或用編碼靶DAM的核苷酸序列(或其衍生物或同源物)，轉化噬菌體。所述轉化噬菌體(它最好被束縛於固相支持體)表達所述合適的配體(例如所述候選ScFv Ab)，並且在其噬菌體外殼上展示所述配體。分離並擴增帶有識別所述候選ScFv Ab的靶DAM分子的一種或多種實體(例如細胞)。然後鑑定成功的候選的ScFv Ab。
作為另一實例，通過將合成的重鏈和輕鏈可變區(VH和VL)從lox文庫載體重新克隆到噬菌粒載體pHEN2中，已經構建了稱為「Griffin-1文庫」的人類ScFv片段文庫。對於洗脫方法和篩選方法的修改，導致成功地篩選出針對各種各樣DAM的ScFv抗體的噬菌體展示文庫(參見de Bruin等1999，Nature Biotechnology 17397-399)。
噬菌體展示優於標準親和配體篩選技術。噬菌體表面以三維構型展示出所述候選因子，更加非常類似其天然存在的構象。這提供特異性更強且親和性更高的結合，以用於篩選。用於模擬物的測定使用噬菌體展示來正鑑定或者DAM或者ScFv Ab，可能便於應用組合文庫來鑑定能夠以相同或相似方式起作用的模擬物。這類模擬物可以單獨給予，或與用於治療與本發明的DAM相關的疾病的其它治療劑聯合給予。劑量本發明ScFv Ab的劑量將取決於待治療的疾病狀態或病症以及其它臨床因素，例如所述病人或動物的體重和病症以及所述化合物的給藥途徑。根據所述ScFv Ab在特定動物或人體內的半壽期，可以將所述ScFv Ab每日給予數次至每周給予一次。應該理解，本發明既應用於人類，也應用於獸醫學。本發明的方法考慮到一次給藥以及多次給藥，或者同時給予，或者在延長的時間內給予。製劑適合於胃腸外給予的製劑包括水性和非水無菌注射液，所述注射液可以含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑和使所述製劑與計劃的受體的血液等滲的溶質；和水性和非水無菌懸浮液，所述懸浮液可以包括懸浮劑和增稠劑。所述製劑可以存在於單位劑量容器，或存在於多劑量的容器中，例如密封的安瓿和管形瓶中，並且可以貯存於冷凍乾燥(凍幹)條件下，僅需要在加入無菌液體載體例如注射用水之後立即使用。臨時配製的注射液和懸浮液可以由無菌粉劑、顆粒劑和先前描述過的各種片劑來製備。
本發明的ScFV Ab可以有效地預防和/或治療疾病，例如癌症相關疾病。本發明包括用有效量的本發明ScFv Ab治療疾病(例如癌症相關疾病)的方法。本發明的ScFv Ab可以用本領域技術人員已知的配製方法，在藥學上可接受的組合物中作為合成肽或者作為經分離並且基本純化的蛋白質或蛋白片段或者它們的組合來提供。這些組合物可以通過標準途徑給予。這些包括但不限於經口、直腸、眼(包括玻璃體內或眼房內)、鼻、局部(包括頰和舌下)、子宮內、陰道或胃腸外(包括皮下、腹膜內、肌內、靜脈內、皮內、顱內、氣管內和硬膜外)、經皮、腹膜內、顱內、腦室內、腦內、陰道內、子宮內或胃腸外(例如靜脈內、脊柱內、皮下或肌內)途徑。
所述ScFv Ab製劑可以方便地以單位劑型存在，可以用常規製藥學技術來製備。這類技術包括使所述有效成分與所述藥用載體或賦形劑結合的步驟。一般而言，通過使所述有效成分與液體載體或細碎的固體載體或這兩者均勻地緊密結合，然後如有必要，使所述製品成型，來製備所述製劑。
另外，可以將本發明的ScFv Ab加入到生物可降解聚合物中，提供所述化合物的持續釋放，將所述聚合物植入需要藥物傳遞的部位的附近，例如腫瘤部位，或將其植入，使得系統緩釋所述ScFv Ab。所述生物可降解聚合物及其應用詳細描述於例如Brem等(J.Neurosurg199174441-446)。滲透微量泵也可以用來通過插管達到將高濃度ScFvAb控釋到感興趣部位中，例如直接釋放到轉移瘤生長部位或所述腫瘤的血管供應部位中。
本發明的ScFv Ab可以與細胞毒性劑連接，將其以設計用以將傳遞到所需位置的傳遞最大化的方式注入。例如，通過插管將蓖麻毒蛋白連接的高親和性ScFv Ab傳遞到供應靶部位的血管中，或直接傳遞到所述靶中。這類藥劑也可以通過與輸注插管連接的滲透泵以受控方式傳遞。
優選的單位劑量製劑是含有如上文引述的一個日劑量或單位、每日分次劑量的所述給予的組分或其合適的部分。應該理解，除所述組分尤其是上述組分外，本發明的製劑可以包括本領域關於上述製劑類型中常規的其它藥劑。
所述ScFv Ab綴合物可以以任何合適的方式給予，通常胃腸外給予，例如靜脈內或腹膜內給予，以稀釋劑和載體的標準無菌無熱原製劑例如等滲鹽水(當靜脈內給予時)給予。一旦所述ScFv Ab綴合物與所述靶細胞結合併且從血流中被清除(如有必要)(這通常需要一天左右)後，立即給予所述前體藥物，通常以單次輸注劑量給予，或者對所述腫瘤成象。如果需要，由於所述ScFv Ab綴合物可能具有免疫原性，因而可以給予環孢菌素或某些其它免疫抑制劑，以提供較長的治療時期，但通常這不是必不可少的。
可以以常規方式優化給予所述ScFv Ab綴合物和前體藥物之間的時間，因為綴合物的患病組織/正常組織之比(至少在靜脈內傳遞之後)在約4-6天後最高，而此時根據每克注射劑量的百分率而論，與DAM結合的綴合物的絕對量低於較早的時間。
因此，給予所述ScFv Ab綴合物和給予所述前體藥物之間的最佳間隔將是患病部位所述酶的峰濃度和患病組織與正常組織之間最佳分布比率之間的折衷。所述ScFv Ab綴合物的劑量將由醫師根據通常的標準來選擇。至少就使用所靶向的酶(例如β-葡糖苷酶)和利用靜脈內苦杏仁苷作為毒性前體藥物的方法而論，每平方米機體表面積0.1-10.0克、優選1.0-5.0g/m2的1-50個日劑量可能是合適的。對於口服療法，每日三劑0.05-10.0g、優選1.0-5.0g、給予1-50天可能是合適的。同樣將根據正常的標準，特別是參考疾病的類型、階段和患病組織的位置以及患者的體重，選擇所述ScFv Ab綴合物的劑量。治療持續時間將部分取決於對所述ScFv Ab綴合物的任何免疫反應的速度和程度。
當將所述ScFv Ab綴合物用於診斷時，所述ScFv Ab綴合物的功能部分通常包含以下原子或標記或可以由其組成用於閃爍照相研究的放射性原子，例如鎝99m(99mTc)或碘-123(123I))；或用於核磁共振(nmr)成象(也稱為磁共振成象，mri)的自旋標記物，例如又是碘-123、碘-313、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
當用於選擇性破壞例如腫瘤的化合物中時，所述ScFv Ab的功能部分可以包含發射足夠能量以破壞相鄰細胞的高放射性原子(例如碘-131、錸-186、錸-188、釔-90或鉛-212)或細胞毒性化合物(例如氨甲蝶呤、多柔比星、長春花生物鹼(長春新鹼、長春鹼、依託泊苷)、柔紅黴素或其它嵌入劑)。
可以以已知方式，將放射標記或其它標記摻入所述ScFv Ab綴合物中。例如，可以生物合成所述肽，或者可以通過化學胺基酸合成，採用例如涉及用氟-19取代氫的合適的胺基酸前體合成所肽。例如99mTc、123I、186Rh、188Rh和111In的標記，可以通過所述肽中的半胱氨酸殘基連接。釔-90可以通過賴氨酸殘基連接。IODOGEN法(Fraker等(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.8049-57)可以用來摻入碘-123。「Monoclonal Antibodies in Immunoscinigraphy」(Chatal，CRC Press1989)詳細描述了其它方法。藥用組合物一方面，本發明提供藥用組合物，所述藥用組合物包含一種按照本發明的ScFv Ab和任選的一種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑(包括它們的組合)。
所述藥用組合物可以在人類醫學和獸醫學方面用於人類或動物，並且通常包含任何一種或多種藥學上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑。用於治療應用的可接受的載體或稀釋劑是製藥領域眾所周知的，並且描述於例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Co.(A.R.Gennaro編著1985)。藥用載體、賦形劑或稀釋劑的選擇可以根據計劃的給藥途徑和標準製藥實踐來進行。所述藥用組合物可以包含作為載體、賦形劑或稀釋劑的任何合適的粘合劑、潤滑劑、懸浮劑、包衣劑、增溶劑，或除載體、賦形劑或稀釋劑外，還包含上述試劑。
在所述藥用組合物中可以提供防腐劑、穩定劑、染料和甚至調味劑。防腐劑的實例包括苯甲酸鈉、山梨酸和對羥基苯甲酸酯。也可以使用抗氧化劑和懸浮劑。
根據不同的傳遞系統，可能有不同的組合物/製劑要求。作為實例，本發明的藥用組合物可以配製為採用微量泵傳遞，或通過黏膜途徑傳遞，例如作為用於吸入的鼻用噴霧劑或氣霧劑或可攝入溶液，或通過胃腸外給予，其中所述組合物配製成注射劑形式用於傳遞，例如通過靜脈內、肌內或皮下途徑。或者，可以設計所述製劑通過兩種途徑傳遞。
在將所述藥用組合物通過胃腸黏膜經黏膜傳遞的情況下，它應該能夠在通過胃腸道傳遞期間保持穩定；例如，它應該抗蛋白水解降解，於酸性pH下穩定，並且抗膽汁的去垢劑效應。
合適時，所述藥用組合物可以通過以下途徑給予吸入；以栓劑或陰道栓的形式；局部給藥，以洗劑、溶液、乳膏、軟膏或撲粉的形式；利用皮膚貼劑；口服，以含有賦形劑(例如澱粉或乳糖或白堊粉)的片劑、或以或者單獨或者與賦形劑混合的膠囊或卵狀體、或以含有調味劑和著色劑的酏劑、溶液或注射懸浮液的形式；或者所述藥用組合物可以胃腸外注射，例如靜脈內，肌內或皮下注射。對於胃腸外給予，所述組合物可能最好以無菌水溶液的形式使用，它們可以含有其它物質，例如足夠的鹽和單糖，以使得所述溶液與血液等滲。對於口腔含化或舌下給藥而言，所述組合物可以以用常規方法配製的片劑或錠劑形式給予。給藥通常，醫師將確定最適於個別受治療者的實際劑量，這將隨所述特定患者的年齡、體重和反應以及病症的嚴重程度而變化。以下劑量是一般情況的示例。當然，有劑量範圍更高或更低的個別情況。
本發明的組合物(或其組分)可以經口給予。另外或在一個可供選擇的方法中，可以通過直接注射，給予本發明的組合物(或其組分)。另外或在一個可供選擇的方法中，可以局部給予本發明的組合物(或其組分)。另外或在一個可供選擇的方法中，可以通過吸入給予本發明的組合物(或其組分)。另外或在一個可供選擇的方法中，也可以通過以下給藥方法中的一種或多種給予本發明的組合物(或其組分)胃腸外、黏膜、肌內、靜脈內、皮下、眼內或經皮給藥，並且配製用於這種給藥。
作為另一實例，本發明的藥用組合物可以按照每日1-10次、例如每日一次或每日兩次的方案給予。對於任何特定患者的具體的劑量水平和給藥頻率可以改變，並且將取決於多種因素，包括所用具體化合物的活性、該化合物的代謝穩定性和作用時間、年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、給藥模式和時間、排洩速率、藥物組合、具體病症的嚴重程度和宿主正經歷的治療。
術語「給予」也包括但不限於通過黏膜途徑傳遞，例如作為用於吸入的鼻用噴霧劑或氣霧劑、或作為可攝入溶液傳遞；經胃腸外途徑傳遞，其中以注射液形式傳遞，例如靜脈內、肌內或皮下途徑傳遞。
因此，本發明的藥用組合物可以通過以下的一種或多種途徑給予口服、注射(例如直接注射)、局部、吸入、胃腸外給藥、黏膜給藥、肌內給藥、靜脈內給藥、皮下給藥、眼內給藥或經皮給藥。疾病包含有效量的ScFv Ab和/或編碼ScFv Ab的NOI的藥用組合物，可以用於治療疾病，例如WO-A-98/09985中列出的那些疾病。為了易於參考，現在提供該表的一部分巨噬細胞抑制活性和/或T細胞抑制活性和因此產生的抗炎活性；抗免疫活性，即針對細胞免疫應答和/或體液免疫應答(包括與炎症不相關的應答)的抑制效應；與病毒和/或其它細胞內病原體相關的疾病；抑制巨噬細胞和T細胞粘著於胞外基質組分和纖連蛋白以及抑制被正調節的T細胞中fas受體表達的能力；抑制不希望有的免疫反應和炎症，包括關節炎包括類風溼性關節炎，與過敏反應、變態反應、哮喘、系統性紅斑狼瘡、膠原病和其它自身免疫病相關的炎症，與動脈粥樣硬化、動脈硬化、動脈粥樣硬化性心臟病、再灌注損傷、心博停止、心肌梗塞、血管炎症、呼吸窘迫症候群或其它心肺疾病相關的炎症，與以下疾病相關的炎症消化性潰瘍、潰瘍性結腸炎和其它胃腸道疾病，肝纖維變性、肝硬化或其它肝病、甲狀腺炎或其它腺體疾病、腎小球腎炎或其它腎病和泌尿科疾病、耳炎或其它耳鼻喉疾病、皮炎或其它皮膚病、牙周病或其它牙科疾病、睪丸炎或睪丸附睪炎、不育症、睪丸創傷或其它免疫相關的睪丸疾病、胎盤功能障礙、胎盤機能不全、習慣性流產、子癇、先兆子癇和其它免疫和/或炎症相關婦科疾病、後色素層炎、中間眼色素層炎、前眼色素層炎、結膜炎、脈絡膜視網膜病、眼色素層視網膜病、視神經炎、眼內炎症(例如視網膜炎或囊樣黃斑水腫)、交感性眼炎、鞏膜炎、色素性視網膜炎，抑制變性性fondus疾病的免疫和炎性組分，抑制以下的炎性組分眼部創傷、由感染所致的眼部炎症、增生性玻璃體視網膜病、急性局部缺血視神經病、過度瘢痕形成(例如在青光眼過濾手術之後)、針對眼移植物和其它免疫和炎症相關眼病的免疫反應和/或炎症反應、與自身免疫病或免疫和/或炎症抑制可能有益的中樞神經系統(CNS)或任何其它器官中的病症或疾病相關的炎症、帕金森病、由於治療帕金森病引起的併發症和/或副作用、AIDS相關性痴呆、複合HIV相關腦病、德維克病、Sydenham舞蹈病、早老性痴呆和其它變性性疾病、CNS病症或疾病，抑制中風、小兒麻痺症後症候群的炎性組分，抑制以下的疾病的免疫和炎性組分精神病、脊髓炎、腦炎、亞急性硬化性全腦炎、腦脊髓炎、急性神經病、亞急性神經病、慢性神經病、Guillaim-Barre症候群、Sydenham舞蹈病、重症肌無力、腦假瘤、唐氏症候群、亨廷頓舞蹈病、肌萎縮性側索硬化，抑制CNS壓迫或CNS創傷或CNS感染的炎性組分，抑制以下的炎性組分肌萎縮和肌營養不良，以及免疫和炎症相關的疾病、中樞神經系統和周圍神經系統的病症或疾病、創傷後炎症、敗血症性休克、傳染病，抑制外科的炎性併發症或副作用、骨髓移植或其它移植併發症和/或副作用、基因治療的炎性和/或免疫性併發症和副作用(例如由於感染病毒載體所致)或與AIDS相關的炎症的炎性和/或免疫性併發症和副作用，以壓抑或抑制體液和/或細胞免疫應答，通過減少單核細胞或淋巴細胞的量，治療或緩解單核細胞或白細胞增生性疾病(例如白血病)，用於在移植天然或人工細胞、組織和器官(例如角膜、骨髓、器官、晶狀體、起搏器、天然或人工皮膚組織)的情況下預防和/或治療移植排斥。具體的癌症相關疾病包括但不限於實體瘤、血傳腫瘤(例如白血病)；腫瘤轉移瘤；良性腫瘤，例如血管瘤、聽神經瘤、神經纖維瘤、沙眼和膿性肉芽腫；類風溼性關節炎；牛皮癬；眼血管生成性疾病，例如糖尿病性視網膜病、早產兒視網膜病、黃斑變性、角膜移植排斥、新血管性青光眼、晶狀體後纖維組織形成、潮紅；Osler-Webber症候群；心肌血管生成；噬斑新血管形成；毛細管擴張；血友病性關節；血管纖維瘤；傷口肉芽形成；冠狀動脈側支(corornay collaterals)；腦動脈側支(cerebralcollaterals)；動靜脈畸形；局部缺血性肢血管生成；新血管性青光眼；晶狀體後纖維組織形成、糖尿病性新血管形成；螺桿菌相關的疾病、骨折、血管發生、血細胞生成、排卵、月經和胎盤形成。
附圖現在僅僅通過實施例進一步描述本發明，其中參考以下附圖圖1.顯示編碼名為5T4ScFv.1的5T4 ScFv的DNA序列(SEQ IDNo 5)。提供成熟的分泌型蛋白質的序列(SEQ ID No 1)。
圖2.顯示編碼B7-1.5T4.1融合蛋白的DNA序列(SEQ ID No 7)。也提供B7-1.5T4.1融合蛋白的推導胺基酸序列(SEQ ID No 3)。
圖3a.顯示了B7-1.5T4.1構建體的圖式說明。
圖3b.顯示了B7-1.5T4.2構建體的圖式說明。
圖4.顯示編碼B7-2.5T4.1融合蛋白的DNA序列(SEQ ID No 9)。也提供B7-2.5T4.1融合蛋白的推導胺基酸序列(SEQ ID No 10)。
圖5.顯示B7-ScFv的序列(SEQ ID No 11)。
圖6.顯示編碼Ig-5T4融合蛋白的DNA序列(SEQ ID No 8)。也提供Ig-5T4融合蛋白的推導胺基酸序列(SEQ ID No 4)。
圖7.顯示ScFv-IgE的序列(SEQ ID No 12)。
圖8.顯示B7-EGF的序列(SEQ ID No 13)。
圖9.顯示所述ScFvAb在35天期間對Balb/c小鼠體內CT26-neo腫瘤細胞生長的影響。
圖10.顯示所述ScFv Ab在35天期間對Balb/c小鼠體內CT26-h5T4腫瘤細胞生長的影響。
圖11.顯示所述ScFv Ab在35天期間對Balb/c小鼠體內B16-neo腫瘤細胞生長的影響。
圖12.顯示所述ScFv Ab在35天期間對Balb/c小鼠體內B16-h5T4腫瘤細胞生長的影響。
圖13.顯示ScFv構建體。
圖14.顯示B7-scFv與5T4靶抗原的結合。
圖15.顯示B7-scFv與CTLA4的結合。
圖16.顯示對與單獨的scFv蛋白或與scFV-HGl融合蛋白一起孵育後與山羊抗人IgG-FITC標記抗體一起孵育的A9-5T4(A)和A9-neo(5T4陰性)(B)細胞的FACS分析。
圖17.顯示5T4 scFv-Hλ1 ADCC活性。
圖18.顯示pONY8.1SM。
圖19.顯示pONY 8.1SM中的融合蛋白構建體a.B7-5T4scFvb.L-5T4scFv圖20.顯示pKLink圖21.顯示pBSII中的scFv和前導序列圖22.顯示pONY8.1SM中的前導序列-IL-5 scFv圖23.顯示pONY8.1SM中的前導序列HIV-gp120 scFv圖24.顯示pAdApt圖25.顯示pAdApt中的融合蛋白構建體a.B7-5T4scFv
b.L-5T4scFv圖26.顯示犬5T4編碼序列略微更詳細地描述圖14顯示將來自模擬轉染的293T細胞或用標記的B7-scFv構建體轉染的293T細胞的上清液與A9 5T4以及A9neo細胞一起孵育。檢測使用FITC綴合的αHis或αMyc抗體。
圖15顯示A9 5T4和A9neo細胞與單獨的所述ScFv、缺乏Myc-HIs標記的B7-scFv構建體或具有所述標記的B7-scFv構建體一起孵育。加入B7.1配體CTLA4-Ig，檢測使用FITC綴合的α小鼠IgG。
圖20顯示pBluesctipt II SK(pBS II)中的pKLink-(Gly4Ser)3接頭。該柔性接頭作為兩種互補寡核苷酸合成，將這兩種寡核苷酸退火，產生限制性酶突出端，然後作為雙鏈寡核苷酸克隆到pBSII中。(甘氨酸4絲氨酸)3胺基酸翻譯以單字母代碼顯示於DNA序列之下。
圖21顯示了PBSII中的scFv(例如IL-5或HIV gp120 scFv)和隨後添加所述前導序列。在該實施例中，擴增在5』端具有額外SpeI和MfeI限制性位點並且在3』端具有一個額外的Age I位點的VH。所述SpeI和AgeI位點用於克隆到pKLink中。擴增在5』端具有一個額外Bam HI限制性位點並且在3』端具有一個額外的Eco RI位點的VL，所述Bam HI和Eco RI位點用於克隆到pKLink中。前導信號肽作為兩種互補寡核苷酸合成，將這兩種寡核苷酸退火產生限制性酶突出端，然後作為雙鏈寡核苷酸克隆到所述scFv cDNA 5』端的SpeI和MfeI位點之間。包括ATG起始密碼子(下劃線)的Kozak序列以粗體加斜體表示。
圖26顯示了犬5T4的編碼序列。用根據h5T4 cDNA製備的探針，篩選λdash中的雜種基因組文庫。鑑定陽性克隆，並進行測序。實施例實施例1-5T4 ScFv Ab的構建和用逆轉錄病毒載體傳遞至腫瘤採用標準技術(Antibody engineeringa practical approach，McCafferty等編著，1996 OUP)，克隆編碼鼠5T4單克隆抗體的cDNA，並進行測序。可以用所述抗體可變區的序列來構建ScFv抗體。5T4 ScFv的編碼序列稱為5T4ScFv.1(SEQ ID No 1)，示於圖1中。在這種分子中，所述DNA序列編碼來自小鼠5T4單克隆抗體的VH、後接一個15個胺基酸的柔性接頭和小鼠5T4抗體的VL區。所述柔性接頭編碼3個拷貝的胺基酸序列gly-gly-gly-gly-ser，並且所述重複序列之間的DNA序列相似性已被減至最小，以避免含有所述重複序列的質粒在大腸桿菌中生長時在所述重複序列之間重組的危險。DNA盒盒1-翻譯起始信號和信號肽為了達到正確的翻譯起始和從哺乳動物細胞中分泌，使用以下序列aagcttCCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCC該序列含有一個便利的HindIII限制性位點(用於克隆到表達載體)(小寫)、哺乳動物細胞的共有翻譯起始信號(ANNATGPu)和免疫球蛋白基因信號肽序列的編碼序列。
盒2-scFv圖1顯示了5T4ScFv.1的分泌部分的序列。該分子可以以Vh-(gly4-ser)3接頭-V1來表示。
5T4 ScFv2 Ab由以順序V1-柔性接頭Vh連接的5T4可變區序列構成。在這種情況下，所述接頭編碼20個胺基酸的肽(gly4-ser)4。當所述V區區段以這種順序存在時，較長的接頭改善ScFv的裝配。(Pluckthun等，Antibody Engineeringa practical approach，McCafferty等編著，1996OUP)。5T4特異性ScFv的表達為了在人類細胞中表達5T4特異性ScFv，將所述編碼序列插入到載體pCIneo(Promega)中，置於強啟動子和聚腺苷酸化信號的控制之下。在編碼區5』端的來自盒1的翻譯起始信號和免疫球蛋白前導(信號肽)序列，確保所述ScFv從哺乳動物細胞有效地分泌。實施例2-用編碼ScFv Ab的表達載體轉染巨噬細胞/單核細胞以實驗室規模，採用標準技術程序(Sandlie和Michaelsen 1996，載於Antibody engineeringa practical approach.McCafferty等編著，第9章)，以及以大規模通過淘析法(例如得自CellPro的Ceprate)，從人外周血分離外周血單核細胞。通過過夜粘著至塑料上，富集粘著細胞(基本上是單核細胞)，通過培養粘著細胞達1-3周，可以讓細胞沿巨噬細胞分化途徑分化。
用能夠在人類細胞中表達ScFv Ab的表達載體轉染單核細胞和巨噬細胞。對於組成型高水平表達，在利用hCMV-MIE啟動子-增強子的載體pCI(Promega)中表達所述ScFv Ab。對於低氧誘導型表達，用含有至少一個HRE的啟動子取代hCMV啟動子。一種合適的啟動子是具有3個拷貝小鼠PGK HRE的截短的HSV TK啟動子(Firth等，1994Proc.Natl.Acad.Sci.916496-6500)。
可以用各種各樣的轉染法，將載體導入單核細胞和巨噬細胞中，包括粒子介導的DNA傳遞(基因槍)、電穿孔、陽離子劑介導的轉染(例如採用Superfect，Qiagen)。按照生產商的說明，實施這些方法中的每種，並且考慮改變所述參數，以獲得各個生產商具體描述的最佳結果。或者，可以使用病毒載體，例如缺陷型腺病毒載體(Microbix Inc或Quantum Biotechnololes Inc)。實施例3-B7-ScFc融合蛋白的構建B7-1的胞外結構域由天然人B7-1蛋白的胺基酸殘基1-215來限定。該序列與其信號肽編碼序列一起，用來構建分泌型融合蛋白，所述融合蛋白也含有來源於所述5T4單克隆抗體的ScFv。在圖1中給出了所述5T4 ScFv的序列。
採用標準分子生物學技術，構建一種DNA編碼序列，該DNA編碼序列編碼其中所述5T4 ScFv的N末端融合於人B7-1的胺基酸215之後的融合蛋白。該編碼序列B7-1.5T4.1的序列(SEQ ID No 7)示於圖2。該融合蛋白在B7-1序列和5T4 ScFv序列之間含有一個柔性(gly-gly-gly-gly-ser)間隔區。在接頭插入末端(始於核苷酸733)導入一個便利的BamHl限制性位點，也使得可以篩選其它接頭，以供雙功能融合蛋白最佳表達用。圖3以圖式形式顯示了該融合蛋白。同樣可能的是構建B7-1.5T4.2(圖3b)，在B7-1.5T4.2中，所述ScFv是N末端，而B7胞外結構域是C末端。在這種情況下，僅需要成熟B7-1的編碼序列(無信號肽)。在這種情況下，將信號肽例如免疫球蛋白的前導序列加至所述ScFv的N末端。
對於使用B7-2的共同刺激胞外結構域(Gerstmayer等1997 JImmunol 158(10)4584-90)的融合蛋白而言，用B7-2的信號肽和胞外結構域取代B7-1的序列。圖4顯示了SCM B7-2.5T4.1共同刺激結構域的編碼序列。它編碼前接其信號肽的人B7-2的前225個胺基酸和一個柔性接頭(gly4-ser)。在該序列末端的BamHI位點可以用來將所述結構域插入5T4ScFv.1上遊(參見圖3)。該序列包括所述B7-2的信號肽，所述信號肽可以用來讓該融合蛋白分泌，在所述融合蛋白中，所述B7-2結構域位於融合蛋白的N末端。
將每種工程cDNA插入哺乳動物表達載體pCI中，以允許在哺乳動物組織培養細胞中表達。為此，將一個接頭序列加至該編碼序列的5』端，該接頭序列導入一個用以插入pCI多接頭中的便利的限制性位點，並且緊鄰第一個ATG密碼子加入翻譯起始信號CCACC。將pCI中的構建體轉染到合適的哺乳動物宿主細胞系(例如COS-1)中，以證實所述SCM的分泌。隨後將來自pCI的轉錄盒或所述轉錄盒的合適區段亞克隆到該表達載體中，以用作用於治療應用的基因傳遞系統。實施例4-用編碼含分泌型共同刺激分子(SCM)的ScFv Ab的表達載體轉染巨噬細胞/單核細胞以實驗室規模，採用標準技術程序(Sandlie和Michaelsen 1996，載於Antibody engineeringa practical approach.McCafferty等編著，第9章)，以及以大規模通過淘析法(例如得自CellPro的Ceprate)，從人外周血分離外周血單核細胞。通過過夜粘著至塑料上，富集粘著細胞(基本上是單核細胞)，通過培養粘著細胞達1-3周，可以讓細胞沿巨噬細胞分化途徑分化。
用能夠在人類細胞中表達含SCM的ScFv Ab的表達載體轉染單核細胞和巨噬細胞。對於組成型高水平表達，在利用hCMV-MIE啟動子-增強子的載體pCI(Promega)中表達所述SCM。對於低氧誘導型表達，用含有至少一個HRE的啟動子取代hCMV啟動子。一種合適的啟動子是具有3個拷貝小鼠PGK HRE的截短的HSV TK啟動子(Firth等，1994 Proc.Natl.Acad.Sci.916496-6500)。
可以用各種各樣的轉染法，將載體導入單核細胞和巨噬細胞中，包括粒子介導的DNA傳遞(基因槍)、電穿孔、陽離子劑介導的轉染(例如採用Superfect，Qiagen)。按照生產商的說明，實施這些方法中的每種，並且考慮改變所述參數，以獲得各個生產商具體描述的最佳結果。或者，可以使用病毒載體，例如缺陷型腺病毒載體(Microbix Inc或Quantum Biotechnologies Inc)。實施例5-SCM與CTLA-4和5T4抗原表達細胞結合的分析預期ScFv Ab-SCM融合蛋白的B7-1或B7-2結構域與人T細胞上存在的CD28和CTLA-4特異性地結合。與用人CTLA-4或CD28轉染的T細胞或中國倉鼠卵巢細胞的結合，採用FACS分析如下測定。將5×105表達CTLA-4的靶細胞或缺乏CTLA-4的等同細胞(未轉染的CHO細胞)與0.1ml得自用SCM基因瞬時轉染的COS-1細胞的培養上清液一起於4℃孵育1小時。洗滌所述細胞，並且與1mg後接FITC標記的山羊抗小鼠IgG(Pharmingen)、對所述B7結構域特異性的單克隆抗體(例如Mab 9E10)一起孵育，然後通過FACS分析。
同樣採用表達5T4抗原的靶細胞(5T4轉染的A9細胞)或對照細胞(A9)，評估ScFv與5T4抗原的結合。實施例6-共同刺激活性的分析用插入到表達載體pCIneo中的編碼人5T4抗原的cDNA(Myers等1994 J.Biol.Chem.2699319-9324)，轉染Balb/c來源的已建立的小鼠細胞系，例如HC11細胞。
通過標準方法(Johnstone和Thorpe 1996載於Immunochemistry inPractice.Blackwell.第4章)分離來自Balb/c小鼠的脾T細胞。通過在含10ng/ml PMA(Sigma)和100U/ml人IL-2(Boehringer Mannheim)的培養基中培養1-2天，預先刺激T細胞。將HC11-5T4細胞在96孔組織培養板中以104細胞/孔，與至多0.1ml得自用SCM基因轉染的COS細胞的上清液一起孵育2小時。每孔中加入至多105預先刺激的T細胞，所述細胞用0.25 mCi/孔的3H-胸苷進行脈衝處理，並且在24小時後用液體閃爍計數器測量3H-胸苷的摻入。實施例7-在動物模型中分析共同刺激使用人5T4抗原基因轉染的HC11細胞在Balb/c小鼠中生長為腫瘤。在植入之前，將SCM基因B7-1.5T4.1或B7-2.5T4.1或這兩種基因的組合導入所述腫瘤細胞中，監測所述腫瘤的生長和在體內不表達SCM基因的對照腫瘤的生長。實施例8-對人5T4特異性的B7-1/ScFv融合蛋白的構建用標準分子生物學技術，構建一種融合蛋白，該融合蛋白由通過一個柔性接頭與對人5T4特異性的鼠Mab 5T4的VH和VL融合的B7-1前導序列和胞外結構域構成。
用以下寡核苷酸上遊寡核苷酸5′GGG GGT GGT GGG AGC GGT GGT GGC GGC AGT GGC GGC GGC GGA A3′和下遊寡核苷酸5′CTA GTT CCG CCG CCG CCA CTG CCG CCA CCA CCG CTC CCA CCACCC CC3′通過將具有工程5』SmaI和3』SpeI位點兩種同源寡核苷酸退火，構建用來連接B7.1的胞外結構域和所述ScFv的柔性接頭。
將該接頭通過SmaI和SpeI克隆到pBluescript(Stratagene)中，產生pLINK。通過導入5』EcoRI和3』SmaI位點的引物，從pLK444-mB7.1(由R.Germain NIH，USA供應)，通過PCR擴增鼠B7.1的信號肽(sp)和胞外結構域-正向引物5′C TCG AAT TCC ACCATGGCT TGC AAT TGT CAG TTG ATG C3′反向引物5′CTC CCC GGG CTT GCTATC AGG AGG GTC TTC 3′將B7.1 PCR產物通過Eco RI和Sma I克隆到pLINK中，形成pBS/B7Link。
通過引入5』Spe I和3』NotI位點的引物，從pHEN1-5T4 ScFv擴增5T4特異性ScFv的VH和VL，正向引物5′CTC ACT AGT GAG GTC CAG CTT CAG CAG TC 3′反向引物5′CTC GCG GCC GCT TAC CGT TTG ATT TCC AGC TTG GTG CCT CCA CC3′用SpeI和NotI消化PBS/B7Link，並與所述ScFv連接，形成由SEQ IDNo 11所示序列構成的OBM233B7 Link ScFv序列(圖5)。
該融合體可以用來構建重組載體，例如逆轉錄病毒、慢病毒、腺病毒、痘病毒、痘苗病毒、杆狀病毒。這類載體可以用來直接注射到患者腫瘤中。為了將所述融合蛋白傳遞至腫瘤細胞，用所述重組載體轉導離體的巨噬細胞/單核細胞/CD34+細胞，然後將其注射回患者體內。這些細胞將運輸至腫瘤。所述ScFv將結合於腫瘤細胞表面上表達的特定腫瘤抗原(例如5T4)(Myers等1994JBC)上。B7存在於專門的抗原呈遞細胞(例如巨噬細胞、樹突細胞和B細胞)表面上。它與其配體CD28和位於CD4細胞和CD8細胞上的CTL-A4相互作用。B7-CD28/CTL-A4和MHC-肽/T細胞受體同時相互作用，導致促進CD8(細胞毒性T細胞)擴充的IL-2的顯著增加(Linsley PS，Brady W，GrosmaireL，Aruffo A，Damle NK，Ledbetter JA J Exp Med 1991年3月1日；173(3)721-730B細胞活化抗原B7與CD28的結合共同刺激T細胞增殖和IL-2mRNA的積累)。已經用B7轉染的腫瘤細胞在動物模型中顯示出阻滯(Townsend SE，Allison JP Science 1993 15；259(5093)368-370)。實施例9-B7-1/ScFv和前導序列ScFv(LScFv)的瞬時表達和純化對於B7-1/ScFv的瞬時表達，使用人CMV表達質粒pCIneo(Promega)。通過用EcoRI/NotI消化，從OBM233上切下B7/ScFv，將其克隆到用EcoRI/NotI預先消化的pCIneo中。通過利用磷酸鈣，用相關的質粒轉染293T細胞(Profectin，Promega)，進行重組蛋白的瞬時表達。採用的條件與生產商建議的條件相似。為了降低牛血清汙染，使用無血清最適培養基(serum feee optimum media)(Gibco BRL)。36-48小時之後，收穫轉染上清液，通過Centriprep(Amicon，Glos.UK)10濾器(純化/濃縮大於10kDa的所有蛋白質)和Centricon(Amicon)10濾器離心(spin)。上清液被濃縮大約30倍。
對於具有生物學功能的B7-1而言，它必須能夠顯示出與特定T細胞群(例如CD4+)表面上存在的其天然配體之一(或者CTLA-4或者CD28)結合。分析B7-1/ScFv融合蛋白與其天然配體CTLA-4(為CTLA4-Ig形式，由Ancell，MN，USA供應)和表達人5T4的A9細胞同時相互作用的生物活性。簡而言之，讓大約5×105A9-h5T4細胞與100ul或者B7.1/ScFV或者LScFv上清液一起在U形底的96孔板中於4℃孵育1小時。洗滌後，讓細胞與CTLA4-Ig(Ancell)一起孵育1小時。洗滌後，用FITC綴合的抗小鼠Ig(Dako)檢測結合的CTLA4-Ig。
結果表明，具有CTLA-Ig與通過所述ScFv結合的B7-1胞外結構域明顯結合於人5T4陽性A9細胞的表面。缺乏與5T4陰性A9細胞的結合活性，進一步說明B7與CTLA4-Ig以及ScFv與5T4的相互作用是特異性的。實施例10-ScFv-IgG融合體實施例ScFv-IgG的構建編碼一個翻譯起始序列和人免疫球蛋白κ輕鏈信號肽的序列，以兩種互補的單鏈寡核苷酸來合成，這兩種寡核苷酸當退火時，在5』端也含有一個內部XhoI位點，並且另外還留下一個XbaI匹配的5』突出端和一個PstI匹配的3』突出端，ctagactcgagCCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG GTAGCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCC GAG GTC CAG ctgca和g CTG GAC CTC GGA GTG GAC ACC TGT AGC TGT TGC TAC CAA GAAGAG GAT GAT ACA GCT CCA TCC CAT GGTGGctcgagt然後，將其克隆到用XbaI和PstI限制的pBluescript II(Stratagene)中，產生pBSII/Leader。
使用在產物的5』端摻入一個PsfI位點和在3』端摻入一個HindIII的寡核苷酸GTC CAG CTG CAG CAG TCT GG和CG TTT GAT TTC AAG CTT GGT GC通過PCR從pHEN1中擴增5T4 ScFv。將其用那些酶來限制，並插入到用相同的酶限制的pBSII/Leader中，產生pBSII/Leader/ScFv。
使用在5』端摻入一個Hind III位點和在3』端摻入一個XhoI的寡核苷酸gcgc AAG CTT gaa atc aaa cgg GCC TCC ACC AAG GGC CCA和gcgc ctcgag TCA TTT ACC CGG AGA CAG GG通過PCR從所克隆的基因中擴增HIgG 1恆定區。然後將其用那些酶來限制，並插入到用相同的酶限制的pBSII/Leader/ScFv中，產生pBSII/Leader/ScFv/HG1。該構建體的序列示於圖4(SEQ ID No 10)。
該融合體可以用來構建重組載體，例如逆轉錄病毒、慢病毒、腺病毒、痘病毒、痘苗病毒、杆狀病毒。這類載體可以用來直接注射到患者腫瘤中。為了將所述融合蛋白傳遞至腫瘤細胞，用所述重組載體轉導離體的巨噬細胞/單核細胞/CD34+細胞，然後將其注射回患者體內。這些細胞將運輸至腫瘤。所述ScFv將結合於腫瘤細胞表面上表達的特定腫瘤抗原例如5T4(Myers等1994 JBC)上。結合的IgG將通過統稱為依賴於抗體的細胞的細胞毒性的機制的集合，促進特異性的腫瘤破壞(Munn等Can res 1991出處同上，Primus等1993 Cancer Res出處同上)。實施例11-ScFv-IgE1(人IgE1重鏈恆定區)的構建製備5T4 ScFv-人IgE重鏈恆定區的相似的融合構建體，該構建體由示於圖7的序列(SEQ ID No.12)構成。
從通過RT從人B細胞RNA獲得的cDNA，用在5』端摻入一個HindIII位點和在3』端摻入一個XhoI位點的寡核苷酸gcgc AAG CTT gaa atc aaa cgg GCC TCC ACA CAG AGC CCA和gcgc ctcgag TCA TTT ACC GGG ATT TAC AGA通過PCR擴增人IgE1重鏈恆定區，製備該融合構建體。然後將其用那些酶來限制，並插入到用相同的酶限制的pBSII/Leader/ScFv中，產生pBSII/Leader/ScFv/HE1。
如上所述，可以將所述ScFv-IgE構建體加入到重組病毒載體中，用於癌症的基因治療，例如直接注射到患者組織中，或轉導得自患者的離體巨噬細胞/單核細胞/CD34+細胞。該融合蛋白將分泌出來，並且結合於帶有所述ScFv對其特異性的抗原的腫瘤細胞上。IgE與腫瘤細胞的結合，應該通過激活肥大細胞，促進強的組胺應答。這將導致強的炎症反應和破壞腫瘤細胞，正如關於IgE對寄生蟲例如蠕蟲幼蟲的細胞毒性破壞所報導的(Capron M 1988疾病中的嗜酸性粒細胞受體和介質。載於Progress in allergy and clinical immunology(Proc.13thInt.Congress of Allergy and Clinical Immunology)Hogrefe和Huber Toronto第6頁)。這種炎症和腫瘤破壞，應該起動其它免疫效應細胞的募集。過去的報導表明，用MMTV抗原特異性IgEMab治療，引起抵抗表達MMTV抗原的腫瘤的保護作用(Nagy E Istanvan B，Sehon AH 1991Cancer Immunol.Immunotherapy 3463-69)。實施例12-B7/EGF的構建B7-EGF合成基因從編碼成熟EGF肽的基因(參見登記號X04571)的區中擴增PCR產物，通過將所述PCR產物插入pBS/B7 Link中，製備B7-EGF的融合構建體。該構建體具有示於圖8的序列(SEQ ID No.13)。
通過對從細胞系例如293人腎細胞系(ATCCCRL1573)分離的RNA進行RT獲得cDNA，採用所述cDNA，採用在N末端含有一個SpeI限制性酶切位點和在C末端含有一個終止密碼子和一個NotI位點的寡核苷酸GG ACT AGT AAT AGT GAC TCT GAA TGT CCC和ATT AGC GGC CGC TTA GCG CAG TTC CCA CCA CTT C通過PCR擴增所述DNA。用那些酶消化所產生的產物，連接到已經用相同的酶限制的pBS/B7Link中，產生pBS/B7Link EGF。然後用EcoRI和NotI切下所述B7Link EGF盒，將其插入到不再帶有LazZ基因的pHITll1(Soneoka等，1995，Nucl Acid Res 23628)的衍生物中。
替代使用ScFv的一個方法是使用對其相應受體具有高親和性的生長因子，例如與幾種受體(包括與腫瘤發生高度相關的erb-2)結合的表皮生長因子。
如上所述，可以將所述融合構建體加入到重組病毒載體中，用於基因治療，例如直接注射到患者組織中，或離體轉導患者來源的巨噬細胞/單核細胞/CD34+細胞。所述融合蛋白將分泌出來，並將結合於帶有erb-2抗原的腫瘤細胞。
表皮生長因子(EGF)將與其配體erb-2(一種EGF受體)結合，因而消除了對ScFv的需求。erb-2與腫瘤細胞高度相關(Hynes NE SeminCancer Biol 1993年2月；4(1)19-26，人類腫瘤中erbB-2基因的擴增和超量表達它涉及腫瘤的發生，作為預後因素的重要性和作為癌症治療靶的潛力)。B7存在於專門的抗原呈遞細胞(例如巨噬細胞、樹突細胞和B細胞)表面上。它與其配體CD28和位於CD4細胞和CD8細胞上的CTL-A4相互作用。B7-CD28/CTL-A4和MHC-肽/T細胞受體同時相互作用，導致促進CD8(細胞毒性T細胞)擴充的IL-2的大量增加(Linsley PS，Brady W，Grosmaire L，Aruffo A，Damle NK，Ledbetter JA JExp Med 1991年3月1日；173(3)721-730 B細胞活化抗原B7與CD28的結合共同刺激T細胞增殖和白介素2mRNA的積累)。已經用B7轉染的腫瘤細胞在動物模型中顯示出阻滯(Townsend SE，Allison JPScience 1993 15；259(5093)368-370直接共同刺激CD8+T細胞後B7轉染的黑素瘤細胞對腫瘤的排斥)。已經報導，B7將增強對腫瘤細胞特有的腫瘤抗原的CTL應答，從而導致對所有這類細胞的破壞。實施例13-表達融合構建體的細胞系的產生通過XhoI消化，從pBSII/L/ScFv/hIgGl切下ScFv-IgG基因，通過XhoI位點將其克隆到pLXSN中，產生pLXSN/ScFv-IgG，使得在染色體整合後，它處於LTR的轉錄控制之下。採用三聯質粒HIT系統(Landau和Littman 1992 J Virol 66，5110，Soneoka Y等1995 NAR23628-633)，通過共同轉染含有MLV gap-pol基因的質粒(pCIEGPPD)和包含VSV G包膜的質粒(pRV67)，在人腎細胞系293T中製備病毒。48小時後收穫病毒，將其用來轉導BHK-21細胞(ATCC#CCL-10)。轉導後大約24小時，通過添加1mg/ml G418(Gibco BRL)至培養基中，選擇轉導的細胞。收穫得自陽性菌落的上清液，通過Centriprep(Amicon，Glos，UK)10濾器(純化/濃縮大於10 kDa的所有蛋白質)和Centricon(Amicon)10濾器離心進行濃縮。上清液被濃縮約30倍。
將其它融合蛋白通過XhoI位點克隆到pLXSN中，採用相似的方案進行表達和濃縮。融合蛋白與表達特異性配體的細胞結合的FACS分析為了確定所述ScFv-IgG融合蛋白是否對其抗原-人5T4是特異性的，對人膀胱癌腫瘤系(EJ)或表達h5T4的穩定的鼠細胞系A9-h5T4(Myers等1994 JBC)以及5T4陰性系A9-neo進行FACS分析。在圓底96孔板(Falcon)中，將約5×105A9細胞或EJ細胞與100ul經濃縮的上清液(如上所述)的1∶5稀釋液一起於4℃溫育1小時。洗滌後，用抗人IgG/FITC綴合抗體(Dako)檢測結合的蛋白。在Becton DickinsonFACS儀上分析細胞。FACS結果表明，與僅由所述ScFv蛋白構成的陰性對照構建體相比，用所述ScFv-IgG構建體處理的那些5T4陽性細胞中，螢光活性有至少1log的位移。A9 neo FACS表明，沒有所述融合蛋白的ScFv組分的非特異性結合。
與上述相似地進行ScFv-IgE的FACS分析，只是用抗人IgE-FITC(Dako)檢測所述融合蛋白的結合。
用FACS和HCll-erb-2陽性細胞，分析所述B7/EGF融合蛋白的結合(Hynes等1990)。用CTLA4-Ig(Ancell，USA)來分析結合的融合蛋白的B7組分的生物活性。用抗小鼠IgG-FITC來顯示CTLA-4結合。融合蛋白的分析B7-scFv的FACS分析如下所述，通過從穩定轉染的BHK-21細胞系表達，產生重組蛋白(以允許鑑定以及純化)。在質粒pCIneo(Promega)中scFv的C末端(圖13B)。為了證實所述scFv能夠與所述5T4抗原結合，將來自這些細胞和來自模擬轉染的293T細胞的上清液加至表達h5T4的小鼠A9細胞(具有h5T4/新黴素抗性表達構建體的穩定轉染子)。用FITC綴合的αHis或αMyc抗體檢測，證實所述scFv與A9-5T4細胞結合，但不與5T4陰性A9 neo細胞結合，表明所述融合構建體能夠結合所述靶抗原(圖14)。
進行進一步的FACS分析，表明B7-scFv蛋白能夠同時結合B7.1配體CTLA4以及表達h 5T4的細胞。將A9 5T4細胞和A9 neo細胞與單獨的所述scFv、缺乏Myc-His標記的B7-scFv構建體或具有所述標記的B7-scFv構建體一起孵育。加入B7.1配體CTLA4-Ig，並且用FITC綴合的α小鼠IgG檢測(圖15)。Myc-His標記的存在與否，對所述蛋白與5T4抗原和CTLA-4的同時結合產生很小的差異。5T4 scFv HIgG1蛋白的分析通過用含有在CMV立即早期啟動子控制之下的或者單獨的5T4scFv或者5T4scFv-Hg1融合體(分別為圖13A和C)的構建體穩定轉染BHK-21細胞，產生重組蛋白。圖16顯示了小鼠A9 5T4細胞的FACS分析。將所述細胞與來自或者表達單獨的scFv或者scFv-HG1的BHK-21細胞的細胞上清液一起孵育，然後與山羊抗人IgG-FITC標記抗體一起孵育。正如可以觀察到的，scFv-HG1能夠結合表達5T4的細胞，並且可以用山羊抗人IgG-FITC標記抗體檢測到。圖16b表明，這是由於在細胞表面存在5T4，因為用表達新黴素抗性標記、但不表達h5T4的A9細胞沒有觀察到結合。
將上述上清液用於依賴於抗體的細胞介導細胞毒性(ADCC)測定中，證明scFv-Hλ1融合蛋白能夠指導A9 5T4細胞的裂解。將A9 5T4和neo細胞系用於鉻釋放測定中。在用51Cr標記後，將細胞或者與無蛋白單獨的scFv或者與scFv-Hγ1融合構建體一起孵育。加入新鮮分離的外周血淋巴細胞，並孵育4小時。取1等份上清液進行閃爍計數。裂解百分率計算為 與單獨的scFv比較時，隨著效應子靶比率的增加，獲得至多約40％的裂解。5T4陰性細胞系沒有表現出裂解增加(圖17)。實施例14-在動物模型中的功效分析按照很好建立的技術(參見例如Strobel等1997 Cancer Res.571228-1232；McLeod等1997 Pancreas 14237-248)，將人類腫瘤來源的細胞系和組織在遺傳免疫缺陷型「裸」鼠中進行體內培養。也可以使用其中將同源腫瘤系導入免疫活性小鼠品系的同源小鼠模型。這些用作適合於評估本發明基因傳遞系統的動物模型。將載體或工程細胞系統給予或直接給予到腫瘤中，在受治療和未治療動物體內監測腫瘤的生長。該系統用來確定本發明治療的有效劑量範圍和最合適的給藥途徑。ScFv融合蛋白的體內抗腫瘤功效的數據該項研究的目的是測試一系列單鏈抗體融合蛋白的功效。
小鼠模型基於CT26(一種BALB/c來源的化學誘導性腺癌)(Brittain等(1980)Cancer Res.40179-184)和基於B16(一種來源於C57 B6小鼠的黑素瘤系)。CT26系和B16系都被穩定轉化，表達人和鼠5T4。給小鼠靜脈內注射(以誘發肺部小節，CT26)或皮下注射(CT26和B16)，以產生單個的皮下大腫瘤。實驗設計表達人5T4的CT26細胞(CT26-h5T4)和CT26-neo將細胞與以下物質預孵育PBS、LScFv-1、LScFv-2、B7-ScFv、ScFv-Ig。
LScFv-1和LScFv-2在BHK細胞系中表達。LScFv-1通過其組氨酸標記在鎳柱上純化，而ScFv-2採用過濾系統純化。B7-ScFv通過His標記從BHK系中純化，而ScFv-Ig通過過濾柱純化。用於該實驗的每種ScFv的濃度以在FACS測定中CT26-h5T4細胞的飽和結合所需的蛋白量來限定。
將CT26-h5T4和CT26-neo細胞與飽和量的每種ScFv一起預孵育，然後孵育1小時。洗滌細胞後，將5×105細胞皮下注射到同源BALB/c小鼠的脅腹中。
每兩天進行腫瘤測量，並計算體積。結果14圖9CT26-neo除用LScFv-1治療外，在所研究的各組之間沒有顯著差異，對於LScFv-1而言，在腫瘤接種後36天，與PBS對照相比，腫瘤大小減至約三分之一。圖10CT26-h5T4用所有的5T4 ScFv構建體治療的腫瘤都對腫瘤生長有顯著影響。用5T4 ScFv-1治療的5隻小鼠中的4隻在第36天時沒有腫瘤。第36天時，經ScFv-1治療的腫瘤細胞是用PBS治療的腫瘤的60分之一以下。
當用工程改造以表達h5T4的小鼠黑素瘤系(B16)進行相似的實驗時，用所用的ScFv構建體發現最小的抗腫瘤效應(參見圖11和圖12)。CT26看來對ScFv結合所誘發的抗腫瘤免疫應答比B16細胞更為敏感。另外，B16細胞不表達鼠5T4，而CT26細胞具有鼠5T4的mRNA。
總之，看來在CT26和B16鼠模型中，將B7或IgG與5T4特異性ScFv融合沒有益處。事實上，我們已經發現，在我們的實驗中，單獨的ScFv比ScFv融合構建體更為有效，因為其結合親和性更高(如BIACORE中所示，與B7-ScFv相比)。因此，這些數據表明，在所述5T4模型中，單獨的ScFv對腫瘤阻滯有顯著的效應，可能不需要與所述ScFv融合的免疫增強分子來顯示對腫瘤阻滯的效應。實施例15-表達所述融合構建體的慢病毒載體的產生將B7-5T4 scFv和L-5T4 scFv克隆到pONY 8.1SM中pONY8.1SM(圖18)是一種在CMV啟動子下遊具有4個單一克隆位點的EIAV載體。它可從WO99/32646的圖1中所示的載體衍生。鑑於它含有的EIAV序列(～1.1kb)和它所表達的EIAV蛋白(無)，pONY8.1SM是一種迄今最小的EIAV載體。
為了將B7-5T4 scFv和Leader-5T4 scFv(L-5T4 scFv)克隆到pONY8.1SM中，採用以下所示的引物，通過PCR從先前克隆到pBluescript II的構建體(參見實施例8和10)擴增所述序列，以在所述基因的5』端摻入一個SbfI位點和在終止密碼子後摻入一個Eco RI位點。然後將所述產物直接連接至用相同的酶預先消化的pONY 8.1SM。對於B7-5T4 scFv，所述引物如下所示引物1.B7-Sbf SbfI位點＝下劃線Kozak序列＝粗體和斜體，並且用下劃線標註ATG起始密碼子。引物2.5T4sc-RI Eco RI位點＝下劃線TAA終止密碼子＝粗體和斜體然後將所得的產物克隆到pONY 8.1SM中，產生圖19a中所示的融合蛋白構建體。對於L-5T4 scFv，所述引物如下所示引物1.L-Sbf SbfI位點＝下劃線Kozak序列＝粗體和斜體，並且用下劃線標註ATG起始密碼子。引物2.5T4sc-RI Eco RI位點＝下劃線TAA終止密碼子＝粗體和斜體然後將所得的產物克隆到pONY 8.1SM中，產生圖19b中所示的構建體。IL-5特異性的scFv的裝配和克隆採用由雜交瘤系例如表達抗IL-5的人源化Mab SB 240563(Leckie，MJ，Am.J.Respir.Crit.Care Med.159，A624 1999)的雜交瘤系製備的物質，通過RT-PCR裝配抗IL-5 scFv。技術類似於Clackson等描述的技術(遺傳工程單克隆抗體。Br.J Rheumatol.1991；30增刊236-9)。簡而言之，由SB 240563細胞製備總RNA。運用oligo dT引物，採用MMLV逆轉錄酶進行第一條鏈的合成。用VH和VL基因特異性引物對，通過PCR擴增模板cDNA，所述引物對例如為如下所示的，包含限制性酶切位點以允許克隆到pKLink中，pKLink是一種pBluescript II SK(pBSII)質粒，含有一個柔性接頭序列(Gly4Ser)3(圖20)。這構成了單鏈抗體cDNA(圖19)。然後，將與scFv-5T4構建中描述的(參見實施例10)相似的雙鏈寡核苷酸克隆到所述scFv上遊，所述雙鏈寡核苷酸編碼一個翻譯起始序列、Kozak序列和用於分泌的人Igκ輕鏈信號肽(圖21)。
然後，用SbfI和Eco RI切下完整的構建體，將其克隆到pONY8.1SM中(圖22)。HIV包膜蛋白gp120特異性的scFv的裝配和克隆由表達抗HIV包膜蛋白gp120的mAb例如mAb 110.3(Conelly等，Virology 295554-557，1994)的雜交瘤系製備的物質，通過RT-PCR裝配抗HIV scFv。或者，利用指導的選擇(guided selection)來製備人源化抗體(參見Beiboer SH等，J Mol Biol，2000；296833-849)，然後由其衍生所述scFv。技術類似於Clackson等描述的技術(遺傳工程單克隆抗體。Br J Rheumatol.1991；30增刊236-9)。簡而言之，由所述雜交瘤細胞製備總RNA。運用oligo dT引物，採用MMLV逆轉錄酶進行第一條鏈的合成。用VH和VL基因特異性引物對，通過PCR擴增模板cDNA，所述引物對例如為如下所示的，包含限制性酶切位點以允許克隆到pKLink中，pKLink是一種pBluesc如t II SK(pBSII)質粒，含有一個柔性接頭序列(Gly4Ser)3(圖20)。這構成了單鏈抗體cDNA(圖21)。然後，將與scFv-5T4構建中描述的(參見實施例10)相似的雙鏈寡核苷酸克隆到所述scFv上遊，所述雙鏈寡核苷酸編碼一個翻譯起始序列、Kozak序列和用於分泌的人Igκ輕鏈信號肽(圖19)。
然後，用Sbf I和Eco RI切下完整的構建體，將其克隆到pONY8.1SM中(圖18)，產生圖23中所示的構建體。實施例16-表達所述融合構建體的腺病毒載體的產生表達5T4scFv融合構建體IL-5 scFv和HIVgp120scFv的重組腺病毒的產生將B7-5T4 scFv和L-5T4 scFv克隆到pAdApt中在CMV啟動子下遊具有8個單一克隆位點的腺病毒轉移載體(pAdApt；參見圖24)可得自Crucell，Leiden，Netherlands。
為了將B7-5T4 scFv和Leader-5T4 scFv(L-5T4 scFv)克隆到pAdApt中，從先前克隆到pBluescript II中的構建體(參見實施例8和10)切下所述序列，然後如下連接到所述載體中對於B7-5T4 scFv用XhoI切下B7-scFv，補平以產生平端，然後用Eco RI消化。然後將該片段與用HpaI和Eco RI預先消化的pAdApt載體連接(圖25A)。對於L-5T4 scFv用XbaI消化L-5T4 scFv，補平以產生平端，然後與用HpaI預先消化的pAdApt載體連接。然後對後來的克隆檢查L-5T4 scFv插入片段的正確定向(圖25B)。將IL-5特異性scFv克隆到pAdApt中克隆到pBSII中的L-scFv(參見實施例13)用XbaI消化，補平以產生平端，然後用Eco RI消化。pAdApt載體用HindIII消化，補平以產生平端，然後用Eco RI消化。然後將這兩種分子連接，產生類似以上圖25B的重組轉移載體(只是Eco RI限制性位點在融合構建體的3』端，所述基因的5』端鄰接補平的HindIII位點)。HIV包膜蛋白gp120特異性scFv的克隆克隆到pBSII中的L-scFv(參見實施例13)用XbaI消化，補平以產生平端，然後用Eco RI消化。pAdApt載體用HindIII消化，補平以產生平端，然後用Eco RI消化。然後將這兩種分子連接，產生類似以上圖25B的重組轉移載體(只是Eco RI限制性位點在融合構建體的3』端，所述基因的5』端鄰接補平的HindIII位點)。表達所述scFv融合構建體的重組腺病毒的產生為了產生表達所述scFv融合構建體的重組腺病毒，用等摩爾量的含有所述融合構建體的重組轉移載體和腺病毒基因組(Genome)載體(AdEasy，得自Quantum Apligene，Harefield UK)轉染PerC6細胞。然後按照Crucell方案中的描述，收穫重組病毒。總結因此，本發明提供能夠識別疾病相關細胞表面標記(DAM)的抗體。這些抗體可以用於診斷和治療與DAM相關的疾病。
在以上說明書中提及的所有出版物通過引用結合到本文中。在不偏離本發明範圍和精神的情況下對本發明所述方法和系統的各種修改和變化對於本領域技術人員是顯而易見。雖然結合具體優選實施方案描述了本發明，但應該理解，要求保護的本發明不應該被過分限於這類具體的實施方案。實際上，本發明將包括對分子生物學或相關領域技術人員顯而易見的所述實施本發明的模式的各種修改。
序列表110牛津生物醫學(英國)有限公司(Oxford Biomedica(UK)Limited)Kingsman，Alan120抗體130P8161WO CTH140PCT/GB00/043171412000-11-1316037170PatentIn version 3.02101211243212PRT213人工序列2202235T4ScFv.14001Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr20 25 30Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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600ggatatggga cggatttcac tttcaccatc agcactttgc aggctgaaga cctggcagtt 660tatttctgtc agcaagatta taattctcct ccgacgttcg gtggaggcac caagctggaa 720atcaaacgg 729210621143212DNA213人工序列220223Flexible linker to join the extracelluar domain of B7.1 and ScFv4006gggggtggtg ggagcggtgg tggcggcagt ggcggcggcg gaa4321072111467212DNA213人工序列220223B7-1.5T4ScFv.14007atgggccaca cacggaggca gggaacatca ccatccaagt gtccatacct caatttcttt 60cagctcttgg tgctggctgg tctttctcac ttctgttcag gtgttatcca cgtgaccaag 120gaagtgaaag aagtggcaac gctgtcctgt ggtcacaatg tttctgttga agagctggca 180caaactcgca tctactggca aaaggagaag aaaatggtgc tgactatgat gtctggggac 240atgaatatat ggcccgagta caagaaccgg accatctttg atatcactaa taacctctcc 300attgtgatcc tggctctgcg cccatctgac gagggcacat acgagtgtgt tgttctgaag 360tatgaaaaag acgctttcaa gcgggaacac ctggctgaag tgacgttatc agtcaaagct 420gacttcccta cacctagtat atctgacttt gaaattccaa cttctaatat tagaaggata 480atttgctcaa cctctggagg ttttccagag cctcacctct cctggttgga aaatggagaa 540gaattaaatg ccatcaacac aacagtttcc caagatcctg aaactgagct ctatgctgtt 600agcagcaaac tggatttcaa tatgacaacc aaccacagct tcatgtgtct catcaagtat 660ggacatttaa gagtgaatca gaccttcaac tggaatacaa ccaagcaaga gcattttcct 720gatggaggcg ggggatccga ggtccagctt cagcagtctg gacctgacct ggtgaagcct 780ggggcttcag tgaagatatc ctgcaaggct tctggttact cattcactgg ctactacatg 840cactgggtga agcagagcca tggaaagagc cttgagtgga ttggacgtat taatcctaac 900aatggtgtta ctctctacaa ccagaaattc aaggacaagg ccatattaac tgtagacaag 960tcatccacca cagcctacat ggagctccgc agcctgacat ctgaggactc tgcggtctat 1020tactgtgcaa gatctactat gattacgaac tatgttatgg actactgggg tcaagtaacc 1080tcagtcaccg tctcctcagg tggtggtggg agcggtggtg gcggcactgg cggcggcgga 1140tctagtattg tgatgaccca gactcccaca ttcctgcttg tttcagcagg agacagggtt 1200accataacct gcaaggccag tcagagtgtg agtaatgatg tagcttggta ccaacagaag 1260ccagggcagt ctcctacact gctcatatcc tatacatcca gtcgctacgc tggagtccct 1320gatcgcttca ttggcagtgg atatgggacg gatttcactt tcaccatcag cactttgcag 1380gctgaagacc tggcagttta tttctgtcag caagattata attctcctcc 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115 120 125Asn Phe Ser Gln Pro Glu Ile Val Pro Ile Ser Asn Ile Thr Glu Asn130 135 140Val Tyr Ile Asn Leu Thr Cys Ser Ser Ile His Gly Tyr Pro Glu Pro145 150 155 160Lys Lys Met Ser Val Leu Leu Arg Thr Lys Asn Ser Thr Ile Glu Tyr165 170 175Asp Gly Ile Met Gln Lys Ser Gln Asp Asn Val Thr Glu Leu Tyr Asp180 185 190Val Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro Asp Val Thr Ser Asn Met195 200 205Thr Ile Phe Cys Ile Leu Glu Thr Asp Lys Thr Arg Leu Leu Ser Ser210 215 220Pro Phe Ser Ile Glu Leu Glu Asp Pro Gln Pro Pro Pro Asp His Ile225 230 235 240Pro Gly Gly Gly Gly Ser245210112111518212DNA213人工序列220223B7-ScFv40011atggcttgca attgtcagtt gatgcaggat acaccactcc tcaagtttcc atgtccaagg60ctcattcttc tctttgtgct gctgattcgt ctttcacaag tgtcttcaga tgttgatgaa120caactgtcca agtcagtgaa agataaggta ttgctgcctt gccgttacaa ctctccgcat180gaagatgagt ctgaagaccg aatctactgg caaaaacatg acaaagtggt gctgtctgtc240attgctggga aactaaaagt gtggcccgag tataagaacc ggactttata tgacaacact 300acctactctc ttatcatcct gggcctggtc ctttcagacc ggggcacata 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Glu Leu Ala Ala Leu Asn Leu Ser Gly Ser115 120 125Ser Leu Arg Glu Val Cys Ala Gly Ala Phe Glu His Leu Pro Ser Leu
130 135 140Arg Gln Leu Asp Leu Ser His Asn Pro Leu Gly Asn Leu Ser Ala Phe145 150 155 160Ala Phe Ala Gly Ser Asp Ala Ser Arg Ser Gly Pro Ser Pro Leu Val165 170 175Glu Leu Met Leu Asn His Ile Val Pro Pro Asp Asp Arg Arg Gln Asn180 185 190Arg Ser Phe Glu Gly Met Val Ala Ala Ala Leu Arg Ala Gly Arg Ala195 200 205Leu Arg Gly Leu Gln Cys Leu Glu Leu Ala Gly Asn Arg Phe Leu Tyr210 215 220Leu Pro Arg Asp Val Leu Ala Gln Leu Pro Gly Leu Arg His Leu Asp225 230 235 240Leu Arg Asn Asn Ser Leu Val Ser Leu Thr Tyr Val Ser Phe Arg Asn245 250 255Leu Thr His Leu Glu Ser Leu His Leu Glu Asp Asn Ala Leu Lys Val260 265 270Leu His Asn Ala Thr Leu Ala Glu Leu Gln Ser Leu Pro His Val Arg275 280 285Val Phe Leu Asp Asn Asn Pro Trp Val Cys Asp Cys His Met Ala Asp290 295 300Met Val Ala Trp Leu Lys Glu Thr Glu Val Val Pro Gly Lys Ala Gly305 310 315 320Leu Thr Cys Ala Phe Pro Glu Lys Met Arg Asn Arg Ala Leu Leu Glu325 330 335Leu Asn Ser Ser His Leu Asp Cys Asp Pro Ile Leu Pro Pro Ser Leu340 345 350Gln Thr Ser Tyr Val Phe Leu Gly Ile Val Leu Ala Leu Ile Gly Ala
355 360 365Ile Phe Leu Leu Val Leu Tyr Leu Asn Arg Lys Gly Ile Lys Lys Trp370 375 380Met His Asn Ile Arg Asp Ala Cys Arg Asp His Met Glu Gly Tyr His385 390 395 400Tyr Arg Tyr Glu Ile Asn Ala Asp Pro Arg Leu Thr Asn Leu Ser Ser405 410 415Asn Ser Asp Val4202101621147212DNA213人工序列220223連接B7.1的胞外結構域和ScFv的柔性接頭40016ctagttccgc cgccgccact gccgccacca ccgctcccac caccccc 472101721138212DNA213人工序列220223PCR引物40017ctcgaattcc accatggctt gcaattgtca gttgatgc 382101821130212DNA213人工序列220223PCR引物40018ctccccgggc ttgctatcag gagggtcttc 302101921129212DNA213人工序列220223PCR引物40019ctcactagtg aggtccagct tcagcagtc 292102021144212DNA213人工序列220223PCR引物40020ctcgcggccg cttaccgttt gatttccagc ttggtgcctc cacc 442102121187212DNA213人工序列220223翻譯起始序列和人免疫球蛋白κ輕鏈信號肽40021ctagactcga gccaccatgg gatggagctg tatcatcctc ttcttggtag caacagctac60aggtgtccac tccgaggtcc agctgca872102221179212DNA213人工序列220223翻譯起始序列和人免疫球蛋白κ輕鏈信號肽40022gctggacctc ggagtggaca cctgtagctg ttgctaccaa gaagaggatg atacagctcc60atcccatggt ggctcgagt 792102321120212DNA213人工序列220223PCR引物40023gtccagctgc agcagtctgg202102421122212DNA213人工序列220223PCR引物40024cgtttgattt caagcttggt gc 222102521140212DNA213人工序列220223PCR引物40025gcgcaagctt gaaatcaaac gggcctccac caagggccca 402102621130212DNA213人工序列220223PCR引物40026gcgcctcgag tcatttaccc ggagacaggg 302102721140212DNA213人工序列220223PCR引物40027gcgcaagctt gaaatcaaac gggcctccac acagagccca 402102821131212DNA213人工序列220223PCR引物40028gcgcctcgag tcatttaccg ggatttacag a 312102921129212DNA213人工序列220223PCR引物40029ggactagtaa tagtgactct gaatgtccc 292103021134212DNA213人工序列220223PCR引物40030attagcggcc gcttagcgca gttcccacca cttc 342103121135212DNA213人工序列220223PCR引物40031atcgcctgca ggccaccatg gcttgcaatt gtcag 352103221134212DNA213人工序列220223PCR引物40032gcgcgaattc ttaccgtttg atttccagct tggt 342103321134212DNA213人工序列220223PCR引物40033atcgcctgca ggccaccatg ggatggagct gtat 342103421134212DNA213人工序列220223PCR引物40034gcgcgaattc ttaccgtttg atttccagct tggt 342103521148212DNA213人工序列220223pBS II中的接頭序列40035ctagtaccgg tggtggtggg agcggtggtg gcggcagtgg cggcggcg482103621115212PRT213人工序列220223pBS II中的接頭序列40036Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5 10 152103721176212DNA213人工序列220223pBS II中的前導序列40037ctagacctgc aggccaccat gggatggagc tgtatcatcc tcttcttggt agcaacagct60acaggtgtac actccc7權利要求
1.能夠識別疾病相關分子(DAM)的ScFv抗體(ScFv Ab)的應用，用於生產預防和/或治療與DAM相關病症的藥物。
2.權利要求1的ScFv Ab的應用，其中所述DAM是一種腫瘤相關抗原(TAA)。
3.權利要求1或權利要求2的應用，其中所述ScFv Ab具有SEQID No 1或SEQ ID No 2所示的序列或其變異體、同源物、片段或衍生物。
4.權利要求1或權利要求2的應用，其中所述ScFv Ab具有SEQID No 3所示的序列或其變異體、同源物、片段或衍生物。
5.權利要求1或權利要求2的應用，其中所述ScFv Ab具有SEQID No 4所示的序列或其變異體、同源物、片段或衍生物。
6.一種核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼權利要求1-5中任一項的ScFv Ab。
7.一種權利要求6的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列具有SEQID No 5或SEQ ID No 6所示的序列或其變異體、同源物、片段或衍生物。
8.一種權利要求6的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列具有SEQID No 7所示的序列或其變異體、同源物、片段或衍生物。
9.一種權利要求6的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列具有SEQID No 8所示的序列或其變異體、同源物、片段或衍生物。
10.一種核苷酸序列或與其互補的序列，所述核苷酸序列能夠與權利要求6-9中任一項的核苷酸序列雜交。
11.一種權利要求6-10中任一項的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列與啟動子有效連接。
12.一種構建體，所述構建體包含權利要求6-11中任一項的核苷酸序列。
13.一種載體，所述載體包含權利要求6-12中任一項的核苷酸序列。
14.一種質粒，所述質粒包含權利要求6-13中任一項的核苷酸序列。
15.一種宿主細胞，所述宿主細胞包含權利要求6-14中任一項的核苷酸序列。
16.一種製備權利要求1-5中任一項的ScFv Ab的方法，所述方法包括表達權利要求6-11中任一項的核苷酸序列，或當存在於權利要求12-15中任一項的表達實體中時表達權利要求6-11中任一項的核苷酸序列，並且任選地分離和/或純化所述ScFv Ab。
17.一種通過權利要求16的方法產生的ScFv Ab。
18.一種獲得任一前述權利要求的ScFv Ab的體外方法，所述方法包括(i)製備噬菌體文庫，其中每種噬菌體包含一種編碼含潛在結合結構域的蛋白的核酸構建體；(ii)使所述潛在蛋白表達，並且使所述潛在結合結構域展示在所述噬菌體的外表面；(iii)使所述噬菌體文庫與DAM靶接觸，其接觸條件使得所述潛在結合結構域和所述DAM靶相互作用；(iv)將展示出結合所述DAM靶的結構域的噬菌體從不結合所述DAM靶的噬菌體中分離出來；(V)回收至少一種在其外表面展示結合所述DAM靶的蛋白的噬菌體；(Vi)體外擴增所述結合蛋白，以產生結合結構的第二富集文庫；(vii)重複步驟(iii)至(Vi)至少兩次；(viii)在體外條件下表達編碼所述結合蛋白的核酸；和(ix)通過檢測信號存在與否，確定所述結合蛋白是否與所述DAM相互作用。
19.一種權利要求18的體外方法，其中所述體外方法是篩選可用於治療疾病的ScFv Ab。
20.一種方法，所述方法包括以下步驟(a)進行權利要求18或權利要求19的體外方法；(b)藉助可檢測信號，鑑定能夠識別DAM的一種或多種ScFvAb；和(c)製備大量的所述一種或多種ScFv Ab。
21.一種方法，所述方法包括以下步驟(a)進行權利要求18或權利要求19的方法；(b)藉助可檢測信號，鑑定能夠識別DAM的一種或多種ScFvAb；和(c)製備包含所述一種或多種經鑑定的ScFv Ab的藥用組合物。
22.一種方法，所述方法包括以下步驟(a)進行權利要求18或權利要求19的方法；(b)鑑定能夠識別DAM的一種或多種ScFv Ab；(c)修飾所述能夠識別DAM的一種或多種經鑑定的ScFv Ab；和(d)製備包含所述一種或多種經修飾的ScFv Ab的藥用組合物。
23.一種ScFv Ab，所述ScFv Ab如權利要求1-5中任一項或權利要求17中所限定，或者是通過權利要求18或權利要求19的體外方法鑑定的，其中所述ScFv Ab能夠識別一種TAA。
24.一種權利要求23的ScFv Ab，其中所述ScFv Ab能夠識別一種5T4抗原。
25.一種用ScFv Ab在體內影響疾病的方法，其中所述ScFv Ab在一種體外方法中識別一種DAM抗原，並且其中所述體外方法是權利要求18或權利要求19中限定的方法。
26.權利要求1-5中任一項或權利要求17或權利要求23或權利要求24中限定的ScFv Ab的應用，用於製備藥用組合物。
27.一種權利要求26中限定的藥用組合物，所述藥用組合物包含一種ScFv Ab和另一種治療有用的藥物。
28.一種權利要求27的藥用組合物，其中所述另一種治療有用的藥物是一種前體藥物活化酶。
29.一種權利要求28的藥用組合物，其中所述另一種治療有用的藥物是一種毒素。
30.一種權利要求26或權利要求27或權利要求28或權利要求29的藥用組合物，其中所述ScFv Ab能夠識別一種5T4抗原。
31.ScFv Ab的應用，用於製備用於治療與DAM相關病症的權利要求26-30的一種藥用組合物。
32.權利要求1的能夠識別DAM的ScFv Ab的應用，所述ScFvAb與權利要求27-30中限定的另一種治療有用藥物或編碼所述另一種治療有用藥物的感興趣的核苷酸序列(NOI)聯合，用於與DAM相關的病症的治療。
33.權利要求31或32的ScFv Ab的應用，用於與DAM相關疾病的體內成像和/或輔助治療。
34.權利要求31-33的應用，其中所述疾病是癌症。
35.ScFv Ab的應用，用於篩選可以調節ScFv Ab的DAM結合特異性的藥物，其中所述ScFv Ab是權利要求1-5或權利要求17或權利要求23-24中限定的ScFv Ab，或由權利要求6-12的核苷酸或其變異體、同源物、片段或衍生物表達。
36.一種用於診斷個體中涉及DAM的表達和/或活性的病症的方法，所述方法包括(i)提供編碼6-12中限定的ScFv Ab的核苷酸序列或其表達產物；(ii)分析所述ScFv Ab與得自所述個體的樣品中的DAM的結合；其中所述結合指示在所述個體中存在所述DAM。
37.一種在患有與DAM相關病症的哺乳動物中體內誘發治療反應的方法，所述方法包括給所述哺乳動物接種權利要求1-5或權利要求17或權利要求23-24中限定的ScFv Ab或指導權利要求6-12的核苷酸序列或其變異體、同源物、片段或衍生物表達的載體，以便誘發治療反應，以保護所述哺乳動物抵抗所述病症。
38.一種權利要求37的方法，其中所述病症是癌症。
39.基本上如本文所述並且參考附圖的ScFv Ab的應用。
40.一種用作藥物的ScFv。
41.一種犬5T4多肽或其變異體、同源物、片段或衍生物，所述犬5T4多肽具有SEQ ID No 14所示的胺基酸序列。
42.一種核苷酸序列，所述核苷酸序列能夠編碼權利要求41的犬5T4多肽。
43.一種權利要求42的核苷酸序列或其變異體、同源物、片段或衍生物，所述核苷酸序列具有SEQ ID No 15所示的序列。
44.一種抗體，所述抗體能夠與權利要求41的犬5T4多肽特異性地結合。
全文摘要
描述了應用能夠識別疾病相關分子(DAM)的ScFv Ab(ScFv Ab)生產預防和/或治療與DAM相關病症的藥物。所述ScFv Ab具有治療、診斷和預後應用。
文檔編號A61K48/00GK1423660SQ0081841
公開日2003年6月11日 申請日期2000年11月13日 優先權日1999年11月18日
發明者A·金斯曼, S·M·金斯曼, C·R·貝兵頓, M·W·克羅爾, F·M·埃拉德, K·A·邁爾斯 申請人:牛津生物醫學(英國)有限公司