增強外源蛋白表達的增強子樣基因及其應用的製作方法
2023-09-19 23:27:20
專利名稱：增強外源蛋白表達的增強子樣基因及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及一種增強外源蛋白表達的增強子樣基因序列，用於提高外源基因在原核細胞中的蛋白表達水平。
背景技術：
隨著分子生物學及基因工程的發展，外源基因表達為蛋白表達系統的開發提供了廣闊的應用前景。目前常用的蛋白表達系統有大腸桿菌表達系統、酵母表達系統、昆蟲細胞表達系統和哺乳動物細胞表達系統等。大腸桿菌表達系統是目前研究較為成熟的，但是某些表達的目的產物仍表達水平很低；酵母表達系統也經常出現外源基因拷貝數低；哺乳動物細胞表達系統，外源基因不能持久表達，且成本很高，技術背景複雜。因此，無論在何種表達系統中，外源基因表達水平低都是一個共有的難題。20世紀80年代初，首先在真核病毒SV40基因組中發現了能夠增強蛋白表達基因序列(Banerji J et aL, CeLL, 1981，27(2Ptl) : 299-308)，此後研究證明這類序列廣泛存在於真核生物及其病毒基因組中，這對改造蛋白表達系統提供了一個新的方向。對原核生物基因表達調控的深入研究，人們發現在原核生物基因組也存在類似於真核轉錄增強調控模式，且某些真核生物DNA片段在原核細胞中也具有增強子樣功能，這類序列稱為增強子樣序列(enhancer-Like sequence,ERLS)。目前開發改進的蛋白表達系統中，通過增加蛋白表達標籤，補充外源基因表達所需的稀有密碼子以及增加表達系統中外源基因拷貝數等方法使用較多，採用增強子樣基因序列改進蛋白表達系統目前使用比較少，且很多未知的調控基因表達序列可能尚未被開發。增強子(enhancer，ER)，在基因表達調控中，增強子長度通常為10(T200bp，與啟動子、絕緣子及沉默子協同作用，對調控基因的時空表達具有重要作用。增強子重要作用特點之一無方向性，即不論增位於啟動子上遊或下遊，均能激活其相應啟動子。它的增強活 性能體現在基因的表達水平上，目前已有少數的增強子樣序列應用於提高蛋白表達水平。基因陷阱(gene trap)是研究基因與調節元件功能的一個有力工具。目前已成功地應用於果蠅、小鼠、擬南芥等重要模式動植物的功能基因組研究(O』Brochta DA et aL, Proc NatLAcadSci USA, 2011，108(39) : 16339-16344)，並發現了大量的新基因。本發明增強子樣基因序列的篩選方法即採用了融合報告基因和基因陷阱的思路，增強子樣序列誘捕載體以人乳頭瘤病毒(Human PapiLLomavirus, HPV)58型主要衣殼蛋白LI基因和氯黴素乙醯轉移酶基因(CAT)融合表達作為報告基因，在增強子樣序列插入時，菌株的氯黴素抗性提高，因而通過增加氯黴素濃度達到大規模篩選以獲得相應的增強基因表達的序列。目前發現的增強子樣序列(enhancer-Like sequence, ERLS)主要應用在增強低分子量蛋白表達，例如幹擾素，白細胞介素，本發明的報告基因需要表達較大融合蛋白基因(85KD),利用該融合基因篩選的序列也可構建一種高分子量蛋白表達系統,進而解決一些高分子量基因在外源表達系統中產率低的難題。大腸桿菌是重要基因工程菌，遺傳背景清楚，操作簡便、快速且成本低廉，成為篩選表達外源基因原核增強子樣序列的首選。因此，本發明將病毒衣殼蛋白與抗生素基因連接形成融合表達報告基因，發現的增強外源基因表達的增強子樣基因序列ER1，可作為改善異源基因原核表達系統方面具有重要實用價值一種工具。
發明內容
本發明的目的是提供一種增強外源蛋白表達的增強子樣基因，旨在改進外源基因原核表達系統，該增強子樣基因序列具有如SEQ ID NO:I所示的核苷酸序列或其截短序列。本發明中所述增強子樣基因截短序列為增強子樣基因ERl任一長度的序列，如實施例7即為其截短序列，核苷酸序列為SEQ ID NO 1第99 516bp所示。本發明首先抽提細菌基因組樣品，細菌基因組源於昆明市呈貢區居民生活汙水樣品和昆明市第四十三解放軍總醫院附近汙水處理廠汙水樣品中的細菌經富集抽提獲得。基因組經酶切500bp以下DNA片段，並由此構建到增強子樣序列篩選重組載體Ll-CAT-pET21a啟動子上遊，構建基因文庫，通過氯黴素抗性融合報告基因篩選含增強子樣序列的菌株，之 後，對菌株抗氯黴素抗性和增強子樣序列進行了來源分析及其增強外源蛋白表達的能力進行檢測。本發明通過如下技術方案實現本發明目的
(O構建含融合報告基因的重組篩選菌株
由雲南省第一人民醫院(雲南省昆華醫院)宮頸癌患者的腫瘤組織樣品經過樣品處理，抽提DNA，通過PCR擴增獲得人乳頭瘤病毒HPV58型LI基因，並構建成Ll_pMD18_T載體。從Ll-pMD18-T上將LI基因酶切下來，通過膠回收純化後，連接到含有CAT基因的重組載體CAT-pET21a上，並通過酶切鑑定，測序驗證Ll_CAT_pET21a載體構建正確。含融合報告基因載體Ll-CAT-pET21a採用熱休克法轉化到大腸桿菌表達菌株中，獲得重組篩選菌株Ll-CAT-pET21a/BL21(DE3)；
大腸桿菌表達菌株可選自 E. coZiBL21 (DE3)、Ε· coLi BL21 (DE3) pLys、Origami 或Rosetta,以及其它用於外源蛋白表達的原核菌株；
(2)重組菌株抗氯黴素閾值和LI -CAT融合蛋白表達水平檢測在一定濃度梯度氯黴素固體Amp+-LB培養基中，重組篩選菌Ll-CAT-pET21a/BL21(DE3)使用IPTG誘導，記錄菌落生長數目，測定菌株抗氯黴素閾值。而含有融合報告基因Ll-CAT大腸桿菌轉化子進一步液體培養並用IPTG誘導表達，通過SDS-PAGE檢測融合蛋白Ll-CAT的表達。(3)基因文庫構建與含增強子樣基因序列的菌株篩選
待篩選各汙水樣品經細菌富集，獲得菌體培養物，按《精編分子生物學實驗指南》(科學出版社)細菌基因組DNA提取方法製備細菌基因組。基因組利用限制性內切酶Sau3A I酶切至500bp以下DNA片段，凍融法膠回收，並與經沒貧7 II酶切後去磷酸化檢測載體Ll-CAT-pET21a連接，即待檢序列通過同尾酶互補連接到載體啟動子上遊，電轉化至E. coZiBL21 (DE3)感受態，構建細菌基因組文庫。之後，含增強子樣基因序列的菌株篩選用高於抗氯黴素閾值初步篩選，獲得單克隆菌株。所獲菌株的質粒進行酶切鑑定，並利用氯黴素濃度梯度測定其抗氯黴素閾值，含增強子樣基因序列的菌株篩選即完成。本發明中表達載體可選自PET系列、PQE系列、pGEX系列、pMAL系列，以及其它原核系統的表達載體。
(4)序列測定，同源性分析序列來源及其誘導蛋白表達增強活性分析
在插入位點下遊設計引物ENHP2，將引物和質粒送至測序公司，測定插入序列。所測序列原始載體序列利用DNAMAN (5. 2.2版)比對，確定插入序列，並將這些序列在NCBIBLastN進行序列同源性檢索分析序列來源。並且構建了 ERl-Lll-pET21a/BL21(DE3)和Lll-pET21a/BL21 (DE3)重組菌，通過SDS-PAGE再次檢測ERl序列是否能夠增強HPV LI截短序列Lll蛋白表達。本發明另一目的是將增強外源蛋白表達的增強子樣基因應用在增強外源蛋白表達中，該基因插入到表達載體啟動子上遊和啟動子下遊的任意位置。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果
I、在現有的表達系統中很多外源基因經常出現蛋白表達水平低，進而使這些基因工程產品的進一步開發受限，本發明ERl序列能夠提高融合表達報告基因(85KD)抗氯黴素的抗 性，且能夠明顯增加人乳頭瘤主要衣殼蛋白LI基因截短序列Lll的蛋白表達，該序列能夠促進較大外源基因在原核表達系統中增加蛋白表達水平特性。2、表達載體選自pET系列,ERl序列可適用於原核表達系統的所有表達載體,提高了該序列應用到各原核表達系統的可能性，這對提高ERl序列實用性具有重要的意義。
圖I是載體CAT-pET21a酶切鑑定電泳示意圖；其中泳道I DNA Marker DL5000 ；泳道2 1號菌落質粒CAT-pET21a BamH I ,Xho I酶切；泳道3 2號菌落質粒CAT_pET21aBam^ I ,Xho I 酶切。圖2是載體Ll-CAT_pET21a酶切鑑定電泳示意圖；其中泳道I :DNA MarkerDL5000 ;泳道 2 Ll-CAT-pET21a BamH I 單酶切；泳道 3 :Ll_CAT-pET21a BawR I、Nde I 雙酶切；泳道4 :質粒Ll-CAT-pET21a。圖3 是重組菌 Ll-CAT-pET21a/BL21 (DE3)誘導表達 L1-CAT 融合蛋白 SDS-PAGE示意圖；其中泳道 I Protein Marker ;泳道 2 :Ll_CAT-pET21a/BL21 (DE3)誘導前；泳道 3 Ll-CAT-pET21a/BL21 (DE3)誘導後 4h ;泳道 4 BL21 (DE3)誘導前；泳道 5 BL21 (DE3)誘導後4h。圖4是I酶切基因組膠回收電泳示意圖；其中泳道I :DNA Marker DL2000 ；泳道2 500bp以下DNA回收片段。圖5是載體ERl-Ll-CAT-pET21a酶切鑑定電泳示意圖；其中泳道I :DNA MarkerDL15000 ;泳道 2 Ll-CAT-pET21a EcoR V , Nde I 雙酶切；泳道 3 :ERl-Ll_CAT-pET21aEcoRN、Nde I 雙酶切。圖6是載體Lll- pET21a酶切鑑定電泳示意圖；其中泳道I :DNA Marker DL5000 ；泳道 2 Lll-pET21a Xho I、Nde I 雙酶切；泳道 3 :質粒 Lll_pET21a。圖7是載體ERl-Lll- pET21a酶切鑑定電泳示意圖；其中泳道I :DNA MarkerDL5000 ;泳道2 1號菌落質粒ERl-Lll-pET2la EcoR I、Nde I雙酶切；泳道3 2號菌落質粒 ERl-Lll-pET21a EcoR I、Nde I 雙酶切；泳道 4 Lll-pET21a EcoR I、Nde I 雙酶切。圖8 是重組菌 ERl-Lll-pET21a/BL21(DE3)誘導表達 Lll 蛋白 SDS-PAGE 示意圖；其中泳道 I :Protein Marker ;泳道 2 :ERl_Lll-pET21a/BL21 (DE3)誘導前；泳道 3 :ERl-Lll-pET21a/BL21 (DE3)誘導後；泳道 4 Lll-pET21a/BL21 (DE3)誘導前；泳道 5 :Lll-pET21a/BL21(DE3)誘導後；泳道6 BL21(DE3)誘導前；泳道 7 BL21(DE3)誘導後。圖9是載體Lll- pET21a酶切鑑定電泳示意圖；其中泳道I :DNA Marker DL5000 ；泳道 2 ER14-Lll-pET21a Bgl II單酶切。圖 10 是重組菌 ER14-Lll-pET21a/BL21(DE3)誘導表達 Lll 蛋白 SDS-PAGE 示意圖；其中泳道 I Protein Marker ;泳道 2 ER14-Lll-pET21a/BL21 (DE3)誘導前；泳道3 ER14-Lll-pET21a/BL21 (DE3)誘導後；泳道 4 Lll-pET21a/BL21 (DE3)誘導前；泳道 5 :Lll-pET21a/BL21(DE3)誘導後；泳道6 BL21(DE3)誘導前;泳道 7 :BL21 (DE3)誘導後。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細說明，但本發明保護範圍不局限於所述內容；實施例中主要採用常規的基因工程分子生物學克隆方法，這些方法是本領域普 通技術人員所熟知的。按照以下實施例，不難根據具體情況略作修改和變換而成功實施本發明，這些修改和變換均落在本申請權利要求的範圍內。實施例I :構建Ll-CAT_pET21a增強子樣序列檢測載體
取雲南省第一人民醫院宮頸癌患者的腫瘤組織，按《精編分子生物學實驗指南》(科學出版社)動物組織基因組DNA提取方法製備樣品DNA基因組，經鑑定該樣品屬於人乳頭瘤病毒 HPV58 型感染，使用引物 pv58pl: 5』 -ATGGTGCTGATTTTATGTTGCACCCT-3 』 ；PV58P2: 5』 -TTATTTTTTAACCTTTTTGCGTTTG-3』，通過 PCR 擴增獲得 HPV58 型 LI 基因，構建成 Ll_pMD18_T載體(PMD18-T載體購買於TAKARA公司，CK5601C)。重組質粒Ll_pMD18_T轉化大腸桿菌DH5a (DH5a 購買於 TAKARA 公司，D9057)，並將 Ll-pMD18_T/DH5 a 菌株 37°C振蕩培養 16h，然後使用質粒小量提取試劑盒(購買於北京莊盟國際生物基因科技有限公司，ZP101-2)抽提質粒，質粒抽提步驟按操作說明執行。氯黴素抗性基因CAT來自pACYC184載體(購買於New EngLand BioLabs 公司，VKN0287)，通過 PCR 擴增獲得，其上遊引物為 CAT Pl 5 ' -TAGCGCGGCCGCAGAGCTCATGGAGAAAAAAATCACTG -3 ^，其下遊引物 CAT P2 5 ^ -CCGCTCGAGTTACGCCCCGCCCTGCCACTC _3入引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。將PCR產物純化回收，利用限制性內切酶I (購買於TAKALA，CKB701A)和沿ο I (購買於TAKALA，CK2401B)各IOU雙酶切Iyg PCR產物37 °C過夜，通透瓊脂糖凝膠試劑盒(購買於北京莊盟國際生物基因科技有限公司，ZP202-02)回收CAT基因，並且利用相同的酶切位點連接到pET21a(購買於Novagen，69740-3)，重組載體CAT_pET21a經酶切鑑定，測序驗證載體構建正確(見圖I)。質粒Ll-pMD18-T和質粒CAT-pET21a各IPg分別用IOU細H I (來源於TAKALA，CKB701A)和IOU Nde I (來源於TAKALA公司，CKB701A) 37°C酶切4h後，分別進行膠回收；取LI和CAT-pET21a酶切純化片段各IOOng用T4 DNA連接酶(來源於TAKALA，CK5021B) μ 於20μ1體系中，16°C連接過夜；連接產物通過熱休克法轉化CaCl2製備的疋co7iDH5 α，轉化產物塗布於Amp+-LB抗性平板上，37°C培養16h，挑單菌落接種與Amp+-LB抗性培養液中增菌後，使用粒抽提試劑盒提取質粒，用及I單酶切和及I ,Nde I雙酶切鑑定重組質粒，瓊脂糖凝膠電泳觀察，獲得了預期大小的片段(見圖2)，經測序結果表明重組質粒Ll-CAT-pET21a 構建成功。實施例2 :重組菌抗氯黴素閾值和Ll-CAT融合蛋白表達水平檢測取IOng增強子樣序列檢測質粒Ll-CAT-pET21a與ΙΟΟμΙ Ε· coLi BL21(DE3)(購買於Novagen公司，69450-3)感受態混勻，放置冰上30min，然後放入42°C水浴2min進行熱休克，然後加入Iml LB培養液，37°C培養lh，離心棄掉大部分上清，塗布Amp+-LB固體培養皿中，於37°C培養12 16h，獲得篩選菌株Ll-CAT-pET21a/BL21 (DE3);挑取該菌單菌落接種到Amp+-LB液體培養基中，37°C振蕩培養過夜，第二天按1%分別接種到Amp+-LB液體培養基，振蕩培養至0D600約為O. 5，將菌液稀釋IO5倍和IO6倍，取ΙΟΟμΙ直接塗布在含有ImmoLIPTG、5(^g/ml Amp+以及氯黴素(Cam+)不同濃度梯度的雙抗固體培養基上，經三次以上重複測定Ll-CAT-pET21a/BL21(DE3)重組菌株的抗氯黴素性閾值為在102Pg/mg(見表I氯黴素閾值檢測結果)。另外，挑取將該菌單菌落接種到Amp+-LB液體培養基中，37°C振蕩培養過夜，第二天按1%分別接種到Amp+-LB液體培養基，振蕩培養0D_約為O. 6。誘導前取樣，剩餘培養液加入終濃度lmmol IPTG，37°C誘導表達4h後，取適當樣品進行SDS-PAGE，檢測融合蛋白Ll-CAT的表達水平，結果顯示該蛋白的表達不明顯(見圖3)。實施例3 :基因組提取、酶切及構建文庫
源於昆明市呈貢區居民生活汙水和昆明市第四十三解放軍總醫院附近汙水處理廠汙水樣品，經振蕩混勻，取150μ1加入15ml牛肉膏蛋白腖液體培養基37°C振蕩培養16h，培養液分裝至IOml離心管，12000g離心2min，棄上清；細菌沉澱物加入2ml TE緩衝液，用移液槍反覆吹打使之重懸，加入180μ1 10%的SDS和12μ1 20mg/ml的蛋白酶K，混勻，於37°C溫育 Ih ;加入 600μ1 5moL/L NaCl，充分混勻，再加入 400μ1 CTAB/ NaCl，於 65°C溫育 IOmin ；加入等體積氯仿，充分混勻，12000g離心5min,上清轉移至新的離心管；加入等體積的酹/氯仿，混勻，12000g離心5min,上清按700μ1每支I. 5ml離心管分裝；加入等體積異戍醇，混勻，-40°C放置30min，12000g離心lOmin，去上清；沉澱先後用Iml 70%、100%乙醇各漂洗一次，在室溫條件下待乙醇揮發完全，加入50μ1 TE緩衝液溶解沉澱，再加入2μ1 RNaseC5mg/ml)消化20min，基因組製備完成。取全基因組DNA IPg用限制性內切酶0. 5U SauSA I (購買於TAKALA，CKA1018) 於37°C部分酶解lh，膠回收500bp以下DNA片段(見圖4);取基因組酶切回收產物10μ1和Ll-CAT-pET21a Bgl II酶切並用FastAP (來源於Fermentas，00087733)去磷酸化的回收片段300ng，用T4 DNA連接酶 μ 於16°C連接過夜；連接產物先經過乙醇沉澱純化，通過電穿孔轉化萬.coli BL21 (DE3)感受態，電穿孔條件電壓I. 8KV、電極杯1mm、電容2. 5 μ F、電阻200 Ω，電轉化後立即加入900μ冰冷的SOC培養基混勻，於37°C振蕩培養30min ;轉化產物塗布於6個Amp+-LB抗性平板上，37°C培養16h，記錄菌落生長數目，利用10ml Amp+-LB液體培養基將平板上菌落洗脫下來裝入15ml離心管，即文庫細菌，並保存於_40°C。實施例4 :含增強子樣序列的菌株篩選及其抗生素增強活性測定
取保存的文庫細菌10μ1，利用LB液體培養基進行10倍、100倍、1000倍、取1000倍稀釋，取ΙΟΟμΙ塗布在含IPTG、5(^g/ml Amp+和102Pg/ml Cam+雙抗LB固體篩選培養基，同時塗布新鮮培養的Ll-CAT-pET21a/BL21 (DE3)菌液20μ1於同樣的篩選培養基平板中，作為對照，37°C培養24h，獲得能夠在高於抗生素閾值的單菌落，命名為ERl-Ll-CAT-pET21a/BL21 (DE3)，並挑取該單菌落在Amp+-LB培養基振蕩培養過夜，並保存菌株。將利用氯黴素篩選出的菌株ERl-Ll-CAT_pET21a/BL21 (DE3)，採用與實施例2抗氯黴素閾值相同的測定方法，結果測出ERl-Ll-CAT-pET21a/BL21(DE3)的抗氯黴素閾值為17(^g/ml，抗生素抗性提高O. 6倍(見表I)。提取該菌株的質粒ERl-Ll-CAT-pET21a，用EcoR V (購買於TAKALA，CK502C)和I雙酶切鑑定重組質粒是否插入基因序列，瓊脂糖凝膠電泳觀察，說明質粒載體插入500bp左右的基因片段(見圖5)。
權利要求
1.一種增強外源蛋白表達的增強子樣基因，其特徵在於其具有如SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列或其截短序列。
2.根據權利要求I所述的增強外源蛋白表達的增強子樣基因截短序列，其特徵在於截短序列為增強子樣基因ERl任一長度的序列。
3.權利要求I或2所述的增強外源蛋白表達的增強子樣基因在增強外源蛋白表達中的應用，其特徵在於該基因插入到表達載體啟動子上遊和啟動子下遊的任意位置。
全文摘要
本發明公開了一種能夠在原核細胞增強外源蛋白表達的增強子樣基因ER1，該基因具有如SEQIDNO1所示的核苷酸序列或其截短序列，該基因序列通過構建融合表達報告基因重組載體篩選，融合報告基因由人乳頭瘤病毒主要衣殼蛋白L1基因和氯黴素乙醯轉移酶基因(CAT)組成，將待篩選基因片段和篩選重組載體進行連接、轉化、構建基因文庫，採用氯黴素抗性篩選出含有增強子樣基因序列的重組菌株，從而獲得增強子樣序列，該序列能提高菌株融合報告基因氯黴素活性和促進外源蛋白表達。
文檔編號C12N15/113GK102965375SQ20121049379
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月28日 優先權日2012年11月28日
發明者井申榮, 王應明, 曾韋錕, 黃芬 申請人:昆明理工大學