質量放大的壓電生物晶片的製作方法
2023-09-15 12:06:05 2
專利名稱：質量放大的壓電生物晶片的製作方法
技術領域：
本發明涉及壓電電傳感生物晶片的製作技術，納米材料標記技術，生物材料標記技術及電傳感晶片信號的讀取技術。
背景技術：
生物晶片是近年來在生命科學領域中發展起來的一項高新技術。它主要是指通過微加工技術和微電子技術在固體晶片表面構建的微型生物化學分析系統，以實現對細胞、蛋白質、DNA以及其它生物組分的準確、快速、大信息量的檢測。按所固定的探針，基因晶片可分為cDNA晶片和寡核苷酸微陣列晶片。cDNA晶片根據已有的cDNA文庫，通過PCR擴增獲得製備晶片所需的探針。寡核苷酸通過末端修飾集團固化在晶片上。基因晶片製備技術隨著基因晶片技術的不斷成熟而不斷發展，常用的製備技術有接觸點樣法(Stanford大學)、光刻原位合成法(affymetrix公司)、噴墨法、分子印章合成法等。基因晶片靶標常用螢光染料標記。雜交後，常用的晶片信號檢測是將晶片置入晶片掃描儀中，通過採集各反應點的螢光位置、螢光強弱、再經相關軟體分析圖像，即可獲得有關生物信息。
綜觀所有生物傳感機制，光技術是佔主導地位的。光譜分析法無疑是敏感度最高的化學分析手段。附著的螢光標記乃至一些生物分子本身都擁有特徵性強、方便的能級來進行光分子吸收與放射，從而使光在頻譜(等價於能量，E＝hν。h是普朗克常數，ν是光波頻率)中容易被分辯出來。光技術的不足之處是其讀入系統體積大，造價高，使用壽命短。另外，螢光染料有不穩定，易分解，背景螢光幹擾等弱點。因此，有必要找到一種新的檢測方法，能夠進一步提高檢測的特異性、準確度和靈敏度，開發出能克服前述缺點的新一代晶片。
電致傳感指的是將外界信號轉換成電信號的技術。與光致傳感相比，它們在生物領域應用較晚。直至上世紀五十年代後，精密電測量儀器普遍應用之後才開始顯示出優勢。微電子技術使所有技術都朝電子方向靠攏，傳感器也不例外。只有直接將生物信號轉換成電信號，然後直接傳入數據系統，才順理成章。而其它所有的方式都變得相對不那麼直接了。在感應性方面，電傳感完全有可能達到光的敏感度，甚至比光更高。一個很好的例子就是，所有生物都具有液相和氣相化學傳感器如動物的舌頭與鼻子，昆蟲的觸角。這些天然的傳感器在許多方面連我們最好的儀器都望塵莫及。它們都是以電傳導為基礎的化學信號直接激發細胞的電激感，並通過中樞神經回傳至大腦(當然也是電方式)。光系統通常都比較昂貴，診所很難擁有，更不用說患者個人了。相比之下，電子系統價格低廉。而且，同樣功能的電子晶片價格繼續以每18個月50％的速度下降(摩爾定律)。隨著時間推移，我們必將看到生物晶片越來越向電致傳感方向發展。
晶體受外界機械壓力的作用，在其表面產生電荷的現象，稱為壓電效應。比較常用的壓電材料有石英、鈮酸釔、PZT、鈦酸鋇等，還包括一些合成和天然的聚合物。研究發現，當交變激勵電壓施加於壓電晶體電極兩端時，晶體會產生機械變形振蕩。當交變電壓頻率達到晶體固有頻率時，振幅加大，形成壓電諧振。此特定頻率稱為諧振頻率。根據壓電傳感機理，用壓電晶體製成諧振結構，可以發現其輸出信號與晶體的物理尺寸和性質密切相關。一般來講，振動頻率與諧振器件的質量成相反的函數關係。當有附加物質結合在諧振器件表面，其質量改變時，共振頻率便隨之移動。如果我們在器件表面固化有特別化學識別性的材料，它會因某種特別樣品物質的存在而使器件表面總的附加物質量增加或減少，我們便可依靠共振頻率的移動來測定這種化學親和或剝離過程。由此實現化學或生物電傳感器。這就是壓電體聲波(Bulk Acoustic WaveBAW)傳感器的原理。壓電錶面聲波(Surface Acoustic WaveSAW)工作原理稍有改變。壓電聲波由發射極發出，經過晶片表面傳播到接收極。從發射到接收的延遲時間由延遲距離和延遲表面的負載決定(圖10)。但與BAW一致之處是我們同樣可以藉助一個時間域(頻率倒數便為時間)信號檢測器件表面總的附加物質質量增加或減少。這是本項發明的基本原理之一。
在壓電體中，石英因其良好的機械、電化學和溫度等綜合性能，應用最廣。是壓電化學和壓電生物傳感器的首選材料。以石英晶體製成的BAW器件又叫做石英晶微天平QCM(Quartz-Crystal-Microbalance)。對於AT方向切割的石英晶體，其振動頻率f0反比於晶體厚度d，關係式為f0＝kf/d。其中kf為頻率常數(一般取0.168Mhz.cm)。當有物質結合在具有化學敏感性的上表面時，晶體的質量變化為Δm，所產生的頻移Δf由Sauerbrey方程給出Δf＝-[2f02Δm]/[A(ρqμq)1/2]頻移Δf與質量變化為Δm呈線性關係。這裡ρq是石英的密度(2.648g-cm-3)，μq是石英的密度剪切模量(2.947×10-11dyn-cm-2)。對於共振頻率為5MHz的石英諧振器件，1Hz的共振頻率移動相當於17ng/cm2的質量變化。
壓電體聲波是比較成熟的技術。在化學或生物檢測上應用很廣。但由於其信號強度與表面附加物質質量變化成正比。對於DNA片段(切片之後的)，胺基酸，多肽酶等這樣的低中分子量的的生物分子，頻率移動較小。信號不穩定，受環境幹擾大。以含20至40個鹼基的DNA為例，在1014/cm2表面密度(這是已經報導的最高值)情況下，只能對5MHZ的石英BAW器件產生1HZ的頻率移動。SAW器件在靈敏度上也有類似問題。這就使其在這類生物傳感器上的應用非常有限。尤其是在生物晶片上，傳感器要做成信號重複性很高的陣列就更不可能了。本項發明利用納米或生物大分子材料，對樣品生物分子進行標記，從而增大了被探測分子的有效質量，使壓電聲波信號大大增強。由於這種標記側重的是樣品生物分子的有效質量，因此稱之為質量標記。出於這一原理，它的標記材料選擇範圍甚廣。計算表明，放大效應是非常可觀的。以常用的納米金為例，在理想狀態下，它對20至40個鹼基DNA放大作用為一百萬倍。即使考慮到不太理想的反應率、以及納米顆粒表面沉積等因素，我們預計仍有一萬倍的放大效果。顯而易見，質量標記對壓電體聲波效應的放大作用完全改變了BAW固有的缺陷。使其在中小分子的化學、生物檢測、尤其是陣列BAW傳感生物晶片的實用化成為可能。質量標記對SAW的意義與BAW基本相同。這是本項發明的基本原理之二。
發明內容
本發明提供一種利用壓電聲波原理製作的生物晶片，以及利用納米金或其它質量標記材料進行檢測的方法。
A、一種壓電體聲波(BAW)傳感器(圖3、圖4的第一到第4步)，包括壓電晶體基片和上下表面的傳感電極。壓電晶體基片一般採用AT方向切割的石英晶片，但亦包括其他可能的壓電晶體基片。上下表面傳感電極藉由半導體電子晶片的技術形成。電極可用金、銀以及其它一切與生物兼容的導電材料直接製成；或以其他金屬導電材料製成，然後再覆蓋與生物兼容的導電或絕緣材(鍍金層或沉積二氧化矽薄膜等)。
B、一種壓電錶面聲波(SAW)傳感器(圖10)，與BAW不同處在於電極只在壓電晶體基片的一側表面，設有發射極和接收極，它們與地極呈梳形安裝。壓電聲波由發射極發出，沿晶片表面傳播到接收極。延遲時間由發收電極的延遲距離和延遲表面的負載決定。壓電晶體基片一般採用石英晶片，但亦包括其他可能的壓電晶體基片。同樣，表面傳感電極藉由半導體電子晶片的技術形成。電極可用金、銀以及其它一切與生物兼容的導電材料直接製成；或以其它金屬導電材料製成，然後再覆蓋與生物兼容的導電或絕緣材(鍍金層或沉積二氧化矽薄膜等)。
C、在A所述的傳感器上表面、下表面、或上下二表面上固定生物探針。在B所述的傳感器電極同側延遲表面上固定生物探針。固定的生物探針一般是指單鏈DNA，RNA，抗體，蛋白；亦包括其它一切可能與分析物形成生物、化學親和或剝離反應的物質。這裡所指的親和反應包括單鏈DNA與單鏈DNA的雜交，mRNA與DNA，mRNA與tRNA，抗體與抗原的結合，蛋白質與荷爾蒙的結合，蛋白質與維生素的結合，蛋白質在酶催化條件下形成或擴展等等。這裡所指的剝離反應包括DNA在酶切割下斷鏈，蛋白質在酶催化分解，以及上述親和反應的逆過程(在濃度、溫度、酸礆度改變後及機械振動條件下而產生)。這種化學親和或剝離反應可依靠A、B所述的傳感器共振頻率移動來測定。
D、A所述的BAW單元傳感器可單獨使用；也可採用無源式或有源式形成陣列設計。無源式陣列可採用子元獨立連接法(見圖8)，或交叉連接法(見圖9)。交叉連接的上下電極貫穿線(BUS)交叉處不存在絕緣問題。由於貫穿線較細，交叉處的寄生壓電效應和寄生電容都屬於二級效應。交叉連接法避免了連線擁擠的問題。可實現中高密度陣列晶片，在數平方釐米大的基片上製作數萬子元的傳感器陣列。在圖8、圖9的設計中，某些情況下一側表面的諸個或所有電極可以在晶片上連通在一起，再與線路板連接。
E、B所述的SAW單元傳感器可單獨使用；也可採用無源式或有源式形成陣列設計。無源式陣列可採用子元獨立連接法(圖略，與圖8類似，把每個子元電極接線獨立從周邊引出)，或交叉連接法(見圖10)。交叉連接法的地、發、收三極貫穿線(BUS)交叉處絕緣問題可藉由半導體電子晶片製作技術中的通用的雙層金屬立體連接法完成。此法可實現中高密度陣列的晶片。在數平方釐米大的基片上製作數千乃至數萬子元的傳感器陣列。在(圖10)某些情況下諸個或所有的電極可以在晶片上連通在一起，再與線路板連接。
F、在D、E所述的傳感陣列晶片的情況下，C所述的生物探針採用與傳感器陣列同位固定，形成與傳感器陣列相匹配的生物探針陣列。可用光刻法逐一暴露傳感器點元實現，這個方法幾何精度是最高的。我們也可以採用接觸點樣法、光刻原位合成法、噴墨法、及分子印章合成法來完成。每個子元的傳感器可獨立地測定與其相配的生物探針上的特異的生物信號。
G、為了減輕A所述傳感器下表面的影響，A、D所述的晶片可用MEMS刻蝕方法在下表面蝕刻一個平槽；或者把下表面進行封裝；或者在下表面蝕刻平槽後再進行封裝。但在某些情況下，這些步驟可以免去。
H、一種利用BAW或SAW生物晶片進行生物檢測的方法，包括把樣品生物材料用納米粒子材料標記後，與生物晶片上的探針雜交，以獲得放大的壓電體聲波效應，便於進行信號採集和分析處理。此法稱為「直接標記法」。
I、一種利用BAW或SAW生物晶片進行生物檢測的方法，包括把樣品生物材料與生物晶片上的探針雜交後，再用標記材料標記樣品生物材料，以獲得由質量標記材料所產生的壓電體聲波效應。便於排除前面各步反應的幹擾，進行信號採集和分析處理。此法稱為「追加標記法」。
J、納米金、銀是H、I常用的質量標記材料。但本發明包括其它一切對壓電聲波效應有質量放大的納米粒子標記材料，或其它有質量放大的生物性(如大分子)標記材料。
K、一種生物材料的標記材料的鍵合方法生物材料與標記材料直接鍵合。此法適用於H、I所述的標記方法。
L、一種生物材料的標記材料的鍵合方法生物材料與標記材料首先被分別附著於一個親和對的兩部分，然後當這些經過預處理的生物材料與標記材料結合時，標記材料與生物材料藉由親和對的鍵合得以實現。這種方法使質量標記材料的製備過程更加簡單，因此一種預處理的質量標記材料能夠用來標記各種生物材料。此法適用於H、I所述的標記方法。但在I所述的標記方法中作用更大。
M、內容L所述生物親和對，可以使用卵白素-生物素體系、鏈球卵白素(streptavidin)-生物素體系、或者其它生物親和對體系。卵白素由四個相同的亞基組成。每個亞基能夠連接一個生物素分子，這種配對擁有目前為止最高的親和係數(K＝1015M-1)，幾乎是其最接近競爭者的1000倍。卵白素有四個位點，從而使附著多種納米粒子以發展多功能感應裝置成為可能。卵白素同樣也可用來連接一種感應系統裡的多種生物親和系統，或通過親和素-生物素的多點橋連和再次複合達到多次放大，進一步提高檢測靈敏度。
N、信號讀取方法(見圖12)。D、E中所述交叉連接法無源式陣列電路拓撲學與存儲器類似，在行列地址交叉的子元上讀取信號。故可借用許多通用IC實現整個陣列信號讀取。如果要製作小型可攜式測試系統，可利用數位訊號處理器(DSP)或掌中型電腦實現。此法當然也適合於對單個傳感器和獨立連接法所實現的陣列的信號讀取。區別只在復用器的連線上稍有改動。
本發明具有以下創新點●用納米粒子質量特性，放大原較微弱的BAW、SAW生物信號，尤其是中小分子量的分析物，擴大效率至少上萬倍，完全可使壓電型傳感器投入實用。將壓電體聲波技術應用於生物晶片，開闢了除螢光檢測，放射性標記檢測，金標銀染等常規檢測方法以外的生物晶片檢測新領域。壓電體聲波技術對質量變化的高敏感性成為生物晶片高敏感度和高準確率的有力保障。
●納米金用於光檢測較多，本發明首次將它用於電學性陣列生物晶片，拓展了納米金及其它納米粒子標記在生物晶片檢測中的應用範圍。將生物信號轉化為電信號檢測，避免了其它檢測方法、檢測設備昂貴複雜的缺點。電的好處是成本低，可大規模推廣。
●本發明提供了將生物識別系統與納米顆粒、傳感器系統結合起來的方法，它具有普遍意義並應用廣泛。它的意義在於將許多目前光機制生物晶片轉化為電機制生物晶片。在生物探針方面與光機制晶片完全一致，可藉助相同原理進行。
●獨特的陣列連接法使用與單個傳感器一樣多的工藝步驟便可實現陣列連接。電路拓撲學與存儲器類似，故可借用許多通用電器元件實現晶片信號讀出。
●生物晶片在電傳感器加工部分與現有半導體工藝完全一致，為大規模生產找到了生產平臺，從而使產品的質量監控得到保證。我們的方案突破了生物晶片項目在產品化過程中的瓶頸。
●這一設計在檢測信號處理上都可通過商業化IC晶片完成。最終小型化的檢測系統接近於手機或更小。
圖1為本發明所述的基因晶片的製作及其直接標記法檢測的流程圖；圖2為本發明所述的基因晶片的製作及其追加標記法檢測的流程圖；圖3為BAW基礎傳感器製作和直接標記法雜交過程的切面示意圖；圖4為BAW基礎傳感器製作和追加標記法雜交過程的切面示意圖；圖5為用光刻和提剝(Lift-off)形成電極的流程切面示意圖；圖6為直接標記法的原理示意圖。用通用鍵合法(L、M)；圖7為追加標記法的原理示意圖。用通用鍵合法(L、M)；圖8為BAW的獨立連接法的無源式陣列設計示意圖(只顯示了3×3陣列)；圖9為BAW的交叉連接法的無源式陣列設計示意圖(只顯示了4×4陣列)；圖10為SAW的交叉連接法的無源式陣列設計示意圖(只顯示了2×2陣列)；圖11為BAW上下電極與測試電路連接示意圖；圖12為信號檢測系統示意圖。
具體實施例方式
下面以石英壓電體聲波(BAW)無源陣列的設計製作，以及在DNA晶片生物探測框架下利用納米金的BAW放大效應實現電致傳感晶片為主幹，對本發明的具體實施方式
加以說明。本文對屬於前述發明內容所圈定的，並涉及公共知識領域和通用製作工藝的內容不一一贅述。但這不等於我們不了解這些可能性和它們的具體實施方式
。我們對前述發明內容所直接限定或明確引伸限定的智慧財產權保留一切應享有的權力。
如圖1所示，本發明所述的基因晶片的製作流程主要包括石英片的處理，石英片上下表面金電極的製作。將設計好的探針與上電極同位固化，完成整個晶片的製備。而上述基因晶片用於檢測的流程則包括按照常規方法採用PCR擴增樣品DNA，並用納米金標記樣品DNA(即發明內容H所述的直接標記法)。在納米金標記樣品DNA與晶片上的探針進行雜交後，檢測雜交前後BAW傳感器的頻移。數據分析後對每個陣元DNA雜交狀態作出判斷。並可藉此進行數據分析，得出醫學結論。
圖2所示的流程在晶片的製備與圖1所示流程完全一樣。檢測的流程採用發明內容I所述的追加標記法。樣品DNA一端與生物素結合。與晶片上的探針進行雜交後，再用結合有卵白素的納米金進行標記，然後檢測納米金標記前後BAW傳感器的頻移。
以上各過程和原理詳述如下(1)BAW基礎傳感器製作圖3展示本發明生物晶片製作過程的截面圖，以及直接標記法的DNA雜交情況。包括對石英片300下表面進行蝕刻處理，形成一平槽301後，在上下表面製作金電極302、303。上表面電極303同位固定DNA探針304於金膜表面後，與納米標記306材料標記過的樣品DNA305雜交，生成最終產物307。壓電體聲波測試通常在晶體片乾燥後進行。零點頻率信號檢測在第5步後進行。雜交後頻率信號檢測在第7步後進行。在乾燥情況下，可極簡單地理論處理納米標記的放大效應，並能實現壓電體聲波的最大靈敏度。潮溼和表面上的其它殘餘物可能引起幹擾，但在納米金標記後，這一弱點可大大減小，因為水分子以及空氣中吸附的氣體全都是小質量分子。納米顆粒的放大效應可使這些小分子的影響能減少到小於百萬分之一。但如果沒有納米金粒子增強時，它們的影響就是同分析物一個數量級。也可將晶片部分放在水溶液中進行檢測。這種情況下，BAW諧振會產生阻尼效應。通過納米標記放大後，即算考慮阻尼，頻率移動也可達到一個很適於檢測的範圍。在水溶液中檢測可以對DNA雜交的動態過程進行觀察。在圖3第5步後即接通測試系統，連續採集頻率信號，或對陣列進行定時掃描，加以記錄，然後進行分析處理。在水溶液中檢測還可以觀察到生物分子在水溶液中與乾燥狀態不同的力學特性。BAW是聲學基礎的傳感器，非常適合此類測試。
圖4展示本發明追加法記法的DNA雜交情況。生物晶片製作過程與圖3直接標記法一樣。與圖3不同的是把樣品DNA400與生物晶片上的探針304雜交後形成雙鏈DNA402，再用納米粒子材料401標記，最終產物也是307。此法可獲得由納米粒子材料所產生的壓電體聲波效應。如果測試在晶體片乾燥後進行，零點頻率信號檢測在第6步DNA探針與樣品雜交後進行。第7步進行追加納米標記，而雜交後頻率信號檢測在第8步進行。可以看出，由於頻率移動直接來自於最後一步的納米標記質量增加效應，別的幹擾因素被降到最低。此法更適合在水溶液中進行檢測，可以在第5步後即接通測試系統，也可在第6步後接通測試系統，連續採集頻率信號。但兩種情況都會在第7步納米標記過程中觀察到強烈信號。
圖3、圖4所展示的上下表面電極是藉由半導體電子晶片製作技術中的通用金屬工藝形成。圖5流程說明了這種通用金屬工藝的一種用光刻和提剝(Lift-off)形成電極的過程。在基片500上覆蓋一層光刻膠501。然後通過掩膜502(一般用Cr膜在透明基片上製成)對光刻膠501曝光。經過衝洗後，曝光部分被去掉，形成步驟4所示狀態。然後在步驟5中用蒸鍍法在光刻膠上覆蓋金膜503；最後，用光刻膠溶劑去掉所有光刻膠。與掩膜空白處一致的形狀便被複製在金膜上形成504的狀態(相當於302或303)。電極形成也可以用其它多種工藝完成。如種層/光刻/鍍金法，鍍金/光刻/金刻蝕法等等。二氧化矽和金都具有良好的生物兼容性。
需要使用的傳感器表面是上電極表面。在生物醫學實驗中，較少注重下表面。但下表面對BAW裝置同樣敏感。為減輕這種影響，可用MEMS處理在下表面蝕刻一條平槽301(見圖3、圖4)。平槽工藝可與圖5流程集成一體完成。也可在封裝過程中進行特別處理將下表面完全封閉。
(2)樣品的納米金標記樣品的納米金標記有兩種方法直接標記法和追加標記法。直接標記法是在雜交前先對樣品進行納米金標記，而追加標記法則是在雜交後才進行納米金標記。這兩種標記方法將在下面進行詳細說明。
標記的目的是將納米粒子與樣品DNA連接。對於連接辦法，我們既可以通過對生物材料和納米粒子有效的鍵合分子來實現，也可以制訂一個可以用於大多數生物材料的通用鍵合方案。納米金直接標記DNA或蛋白質已有成熟的技術。當納米粒子與生物材料已經確定時，直接鍵合方法可以從很多公開資料中找到。這裡不作過多討論(圖略)。圖6、圖7所示都是通用鍵合方案。生物材料與納米粒子首先被分別附著於一個親和對的兩部分，然後使這些經過預處理的生物材料與經過預處理的納米粒子結合，最終實現生物材料與納米粒子的鍵合。這種方案使納米粒子的製備過程更加簡單，因為一種預處理的納米粒子能夠用來標記各種生物材料。對於生物親和對，可以有多種選擇，但親和素-生物素體系最有發展前景。親和素(avidin)又稱卵白素，是從蛋白中提取的一種糖蛋白(分子量68kD)；生物素(biotin)又稱維生素H，是從卵黃和肝中提取的一種小分子物質(分子量244.31)。生物素能夠通過化學反應與多種低分子量或高分子量的生物分子結合，比如DNA，蛋白質、荷爾蒙等。
在圖6中，生物材料601(此處為DNA)與親和對中的第一部分602(此處為生物素)結合成預處理的樣品生物材料603。納米粒子與親和對中的第二部分604(此處為卵白素)結合，形成預處理的納米標記材料605。然後605與603結合，成為完整的納米標記的樣品生物材料606。606進而與固化的生物探針607(相當於304)雜交，形成帶有納米標記的雜交產物608(此處為雙鏈DNA，相當於307)。
這種納米粒子的鍵合方法很適合追加標記法。在圖7中，製備親和對預處理的樣品生物材料603、以及預處理的納米標記材料605的過程與圖6完全相同。區別在於603先與固化的生物探針607雜交，形成701狀態。然後追加標記605，形成與圖6完全相同的帶有納米標記的雜交產物608。這種方法的優勢在於首先，納米粒子可以比DNA、胺基酸和其它低中生物分子尺寸大很多，當這些分析物附著納米粒子後，會受到反應動力學影響，與基片上的生物探針的雜交會受到影響；同時，分析物與納米粒子結合時也存在一個化學反應率的影響。直接標記法中，在標記過程中有些樣本DNA受化學反應影響未能與納米顆粒結合而游離於溶液中，造成樣本分析物的浪費；但所有這些影響都可以在追加標記法中降低到最小程度。沒有結合納米粒子時，表面未標記的分析物與DNA探針的結合將非常順利。另一優勢是許多生物材料對被探測的電信號都會有作用。作為整個生物識別最後一步的標記過程，追加標記法可以區分納米粒子所產生的淨作用。同時，在這種方法中，可以通過足量使用與卵白素結合的納米粒子來確保納米標記不是反應全過程的限制環節。在納米顆粒飽和狀態下，所有已雜交的DNA將被充分標記。
納米顆粒在溶液中具有膠體粒子的性質。顆粒表面形成雙電層，依靠外電層的電荷排斥保持膠體溶液的穩定。溶液中的離子強度對納米顆粒的分散和穩定影響很大。離子強度大，將破壞納米顆粒表面的雙電層，造成粒子凝聚沉降，使其吸收光譜發生漂移。為消除雜交過程中的非特異性吸附造成的噪音，納米粒子與卵白素之間的結合力要滿足洗脫時不丟失信號。為使納米顆粒與卵白素達到最佳結合，孵育方式、孵育溫度及時間、單點或多點結合條件的控制，都是優化的內容。納米顆粒的粒徑不僅與納米製備技術有關，同時關係到納米粒子的精確定位，以及對雜交和信號檢測的協同作用。在直接標記法和追加標記法中，納米粒徑通過反應動力學和空間位阻而影響雜交及標記，通過顆粒尺寸大小來控制質量大小並影響其放大作用，從而決定晶片系統的靈敏性。所有這些影響因素都可以利用基本傳感器進行直接測量加以優化，獲得最佳條件。
(3)生物晶片陣列的設計與製作。
圖8所示的是在發明內容D所述的獨立連接法的BAW無源式陣列。其中800為基片，801為上電極，802為下電極，803為基片下表面平槽(相當於301)。這種設計避免了單元傳感器與陣列的設計跳躍。這個設計中，傳感器陣列的製作與單元傳感器除掩膜不同外，其它完全相同。此工藝步驟相對簡單，可以把成本降到最低。每個點元的大小及石英的厚度(決定振動基本頻率)應根據傳感器與生物探針的要求共同決定。這種連線方案至少可製成50到100的陣列，因而對於中小型的應用已經足夠了。在測試上可用復用器開關電路對點元逐一檢測。
圖9所示的是發明內容D所述的交叉連接法的BAW無源式陣列。其中900為基片，901為下表面電極、902為上表面電極、903為貫穿線、904為對外接線端，905為基片下表面平槽(相當於301)。這種設計的最大好處是避免了獨立連接法中的連線擁擠問題。可製成上萬個陣元的高通量晶片。與圖8一樣，其製作工藝步驟與單元傳感器除掩膜不同外，其它完全相同。
圖10所示的是發明內容E所述的交叉連接法的SAW無源式陣列。圖中，1000為壓電體基片。1001為貫穿線。1002為延遲表面。生物探針一般放在這裡。1003為延遲距離，它與1002的表面負載共同決定SAW的延遲時間。
在陣列製作中的另一方面是生物探針的同位連接，我們可用光刻法逐一暴露傳感器點元實現，這個方法幾何精度是最高的。我們也可以採用接觸點樣法、光刻原位合成法、噴墨法、及分子印章合成法來完成。
(4)信號檢測系統如圖11所示，上下表面電極的兩側接觸可以用電路版實現(圖中方法1)，上下電極直接與電路板連接。上下表面電極的兩側接觸也可以採用微電機系統(MEMS)通過穿透蝕刻後再用T接頭實現(圖中方法2)，其中1101為T形接頭、1102為貫穿孔。
採用如圖12電子線路設計，可測出BAW的諧振頻率，所有IC晶片都是通用型的，震蕩器前端線路有一定模擬成分。除此之外的其它部分都是數字線路。工作頻率在1到100兆赫之間。IC選擇範圍大。進入產品化後，整個信號採集及分析系統可以集中在一個板子上。一種方案是計數儀後加數位訊號處理器(DSP)。陣列地址可用平行接口實現，加上配合的液晶顯示系統便可完成。另一種方案是將圖中計算機部分用掌上型電腦代替，其接口和軟體都有與PC兼容的，這樣運算與顯示部分可全部搬用，但成本稍高一些。SAW的測試與BAW相同。延遲時間的測定還需增加一些索相環(PLL)IC及線路。
權利要求
1.一種壓電體聲波(BAW)傳感器，包括壓電晶體基片和上下表面的傳感電極。其特徵在於完整的BAW傳感器至少一個。上下表面傳感電極皆由半導體電子晶片的金屬工藝形成。每個電極使用至少一次光刻工藝成形，並與其它部件密配。電極可用金、銀以及其它一切與生物兼容的導電材料直接製成；或用其它金屬導電材料製成，然後再覆蓋與生物兼容的導電或絕緣材料實現生物兼容性。覆蓋絕緣材料的目的也可以是用來實現在液相檢測時的電極絕緣。
2.一種壓電錶面聲波(SAW)傳感器，包括壓電晶體基片，在壓電晶體基片的一側表面，設有發射極和接收極，它們與地極呈梳形安裝。其特徵在於完整的SAW傳感器至少一個。傳感器的地極、發射極和接收極皆由半導體電子晶片的金屬工藝形成。使用至少一次光刻工藝成形，並與其它部件密配。電極可用金、銀以及其它一切與生物兼容的導電材料直接製成；或以其它金屬導電材料製成，然後再覆蓋與生物兼容的導電或絕緣材料實現生物兼容性。覆蓋絕緣材料的目的也可以是用來實現在液相檢測時的電極絕緣。
3.改進的按權利要求1所述的壓電體聲波(BAW)傳感器，其特徵在於所述的基片用MEMS刻蝕方法在製作電極前在下表面蝕刻一個平槽；或者把下表面進行封裝；或者在下表面蝕刻平槽後，再進行封裝。
4.一種生物晶片，包括權利要求1所述的BAW傳感器，其特徵在於在所述的傳感器的上表面電極、下表面電極、或上下二表面電極上固定生物探針。
5.一種生物晶片，包括權利要求2所述的SAW傳感器，其特徵在於在所述的傳感器的電極同側延遲表面上固定生物探針。
6.採用按權利要求1所述的壓電體聲波(BAW)傳感器，按獨立連接法形成的無源式陣列。其特徵在於含完整傳感器至少兩個。每個子元各電極的接線獨立向周邊引出。工藝步驟與權利要求1所述的壓電體聲波(BAW)傳感器相同。傳感器電極和陣列連線的成形，都根據相應的掩膜設計而實現。
7.採用按權利要求1所述的壓電體聲波(BAW)傳感器，按交叉連接法形成的無源式陣列。其特徵在於含完整BAW傳感器至少兩個。由m和n根電極由貫穿線(BUS)分別把上下表面的m×n電極陣列連接成行和列的結構(無所謂上下表面哪個取行，哪個取列連接)。對外接線口總共有m+n個。工藝步驟與權利要求1所述的壓電體聲波傳感器相同。傳感器電極和陣列連線的成形，都依靠相應的掩膜設計而實現。
8.採用按權利要求2所述的壓電錶面聲波(SAW)傳感器，按獨立連接法形成的無源式陣列。其特徵在於含完整SAW傳感器至少兩個。每個子元各電極的接線獨立向周邊引出。工藝步驟與權利要求2所述的壓電錶面聲波傳感器相同。傳感器電極和陣列連線的成形，都依靠相應的掩膜設計而實現。
9.採用按權利要求2所述的壓電錶面聲波(SAW)傳感器，按交叉連接法形成的無源式陣列。其特徵在於含完整傳感器至少兩個。由m和n根電極由貫穿線(BUS)分別把m×n個電極陣列連接成行和列的結構(無所謂地、發、收三極哪個取行，哪個取列連接)。對外接線口總共有m+2n或2m+n個。連線(BUS)交叉處絕緣問題可藉由半導體電子晶片製作技術中的通用的多層金屬立體連接法完成，至少有兩層金屬。工藝步驟與權利要求2所述的壓電體聲波傳感器相同。傳感器電極和陣列連線的成形，都依靠相應的掩膜設計而實現。
10.權利要求6、7、8、9所述的諸個陣列電極可以在晶片上連通在一起，再與測試系統連接。
11.改進的按權利要求6、7所述的傳感器陣列。其特徵在於所述的基片用MEMS刻蝕方法在製作電極前，在下表面蝕刻一個平槽；或者把下表面進行封裝；或者在下表面先蝕刻平槽再進行封裝。
12.一種生物晶片。其特徵在於權利要求6或7所述的BAW傳感器陣列在所述的傳感器陣列的上表面電極、下表面電極、或上下二表面電極上同位固定生物探針。同位固定的方法包括光刻點元逐一暴露法、接觸點樣法、光刻原位合成法、噴墨法、及分子印章合成法等。
13.一種生物晶片。其特徵在於權利要求8或9所述的SAW傳感器陣列在所述的傳感器陣列的電極同側延遲表面上同位固定生物探針。同位固定的方法包括光刻點元逐一暴露法、接觸點樣法、光刻原位合成法、噴墨法、及分子印章合成法等。
14.一種改進的按權利要求12所述的生物晶片，其特徵在於所述的基片用MEMS刻蝕方法在製作電極前在下表面蝕刻一個平槽；或者把下表面進行封裝；或者在下表面蝕刻平槽後，再進行封裝。
15.諸種權利要求4、5、12、13所述的生物探針，其特徵在於以下單獨一種材料或多種材料混合陣元固化單鏈DNA、RNA、抗體、蛋白、一切可能與分析物形成生物、化學親和或剝離反應的物質。這裡所指的親和反應特徵在於單鏈DNA與單鏈DNA的雜交，mRNA與DNA，mRNA與tRNA，抗體與抗原的結合，蛋白質與荷爾蒙的結合，蛋白質與維生素的結合，蛋白質在酶催化條件下形成或擴展等等。這裡所指的剝離反應特徵在於DNA在酶切割下斷鏈，蛋白質在酶催化分解，上述親和反應的逆過程(在濃度、溫度、酸礆度改變後及機械振動條件下而產生)。在液相檢測中，親和或剝離反應也可由電化學反應引起，手段是在生物探針下面或附近的電極上，施加相對於溶液的電壓。
16.一種利用質量標記進行生物檢測的方法。其特徵在於把樣品生物材料用質量標記材料(納米粒子或其它生物分子)標記後與生物晶片上的探針雜交，以獲得放大的壓電體聲波效應。此法稱為直接標記法。此權利要求適用於權利要求4、5、11、12、13所述的器件和晶片，以及其它的質量傳感器件和晶片。
17.一種利用質量標記進行生物檢測的方法。其特徵在於樣品生物材料與生物探針雜交後，再用質量標記材料(納米粒子或其它生物分子)標記，以便排除前端各步反應的幹擾。此法稱為追加標記法。此權利要求適用於權利要求4、5、11、12、13所述的器件和晶片，以及其它的質量傳感器件和晶片。
18.一種生物材料的標記鍵合方法。其特徵在於生物材料與標記材料首先被分別附著於一個親和對的兩部分，然後當這些經過預處理的生物材料與標記材料結合時，生物材料與標記材料藉由親和對的鍵合得以實現。此權利要求適用於權利要求16、17所述的質量標記方法，以及其它標記方法，如螢光標記等。
19.一種生物材料的標記鍵合方法。其特徵在於使用卵白素-生物素體系、鏈球卵白素-生物素體系實現權利要求18所述的鍵合方法。
20.一種生物材料的標記鍵合方法。其特徵在於利用卵白素的四個相同的亞基位點，通過親和素-生物素的多點橋連和再次複合達到多次放大。
21.一種生物材料的標記鍵合方法。其特徵在於利用卵白素的四個相同的亞基位點，附著多種標記材料以實現多屬性標記。
22.一種對壓電生物晶片的信號讀出方法。其特徵在於使用振蕩器產生頻率信號，再由計數器轉成數位訊號，傳入電腦或電腦網路進行分析處理。
23.一種對SAW壓電生物晶片的信號讀出方法。其特徵在於使用振蕩器產生頻率信號，再由計數器轉成數位訊號。延遲時間的測定由索相環(PLL)線路完成。信號傳入電腦或電腦網路進行分析處理。
24.一種對陣列電致生物晶片的電信號讀出方法。其特徵在於使用復用器(multiplexer)至少一個，利用地址0/1設置，對晶片陣元逐一讀取。適用於至少兩個陣元。
25.一種對陣列電致生物晶片的電信號讀出方法。其特徵在於使用行與列至少兩個復用器(multiplexer)，利用它們地址0/1設置，對交叉連接的陣元逐一讀取。
26.一種由權利要求22、23、24、25所述原理製作的小型可攜式測試系統，可利用上述線路加數位訊號處理器(DSP)或掌中型電腦實現。
全文摘要
本發明公開了一種質量放大的壓電生物晶片。所述的發明將壓電聲波技術應用於生物晶片，開闢了除螢光檢測、放射性標記檢測、金銀染等常規檢測方法以外的生物晶片檢測新領域。其通過納米質量特性，放大原較弱的BAW生物信號，尤其是中小分子量的分析物，擴大效率至少千萬倍，使BAW可投入實用。此外，本發明還同時公開了晶片的陣列連接方法。
文檔編號C12Q1/68GK1566933SQ03126910
公開日2005年1月19日 申請日期2003年6月18日 優先權日2003年6月18日
發明者陳世正 申請人:中山市泰威技術開發有限公司