由穀物或穀物副流酶促產生寡糖的製作方法

2023-09-14 15:31:20

專利名稱：由穀物或穀物副流酶促產生寡糖的製作方法
技術領域：
本發明涉及溶解谷麩用於製備包含谷麩的可溶性級分的組合物，以及包含溶解的谷麩的這些組合物用於製備食品例如麵包的用途。
背景技術：
穀物含有5-10%的阿拉伯糖基木聚糖，其與澱粉、纖維素和β -葡聚糖一起構成了最豐富的穀物碳水化合物。阿拉伯糖基木聚糖包含β-1，4-連接的D-吡喃木糖基單元的主鏈，0-2和/或0-3 α -L-阿拉伯呋喃糖基單元與之相連，或者4-0-甲基葡糖醛酸殘基或吡喃木糖基單元可用乙酸酯化。此外，L-阿拉伯呋喃糖基側鏈殘基可用阿魏酸和香豆酸酯化。在典型的阿拉伯糖基木聚糖中，存在未取代的、單取代的和雙取代的木糖殘基。穀物中的阿拉伯糖基木聚糖是水可提取的或水不可提取的。水不可提取的阿拉伯糖基木聚糖可能是在鹼性條件下、或通過利用酶(例如木聚糖內切酶)而部分可溶的。阿拉伯糖基木聚糖-寡糖(AXOS)是源自阿拉伯糖基木聚糖的寡糖並且被顯示發揮益生特性。益生元是通常為非-葡萄糖苷寡糖的化合物，其不能被上胃腸道的酶消化但是被大腸中一些類型的腸道細菌選擇性地發酵。益生元在膳食中的存在引起腸道菌群組成的變化，通常表徵為乳桿菌類(Lactobacillus)和雙歧桿菌(Bifidobacterium)種的相對增加。這種腸中微生物叢的變化與下列相關聯改善的整體健康、減少的腸感染、增加的腸短鏈脂肪酸水平、對礦物質更好的吸收、以及對結腸癌起始的抑制。Katapodis P 等人，European journal of Nutrition, 2003Jan ；42(1) :55_60 涉及由澄粉(wheat flour)阿拉伯糖基木聚糖酶促生產具有抗氧化活性的阿魏酸寡糖。Yuan 等人，Food Chemistry, Vol 95，Issue 3，2006，Pages484_492 涉及通過來自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的木聚糖酶由麥麩不可溶膳食纖維生產阿魏酸寡糖。例如 Courtin 等人 Journal of the science of food and agriculture. 88. ρ 2517-2522(2008)禾口 Cloetens 等人，Journal of the American College of Nutrition, Vol. 27,No. 4,512-518(2008)最近顯示了，相比於不可溶的麩，溶解的麩在雞中具有更好的營養效果。Swennen 等人』 Journal of the science of food and agriculture, 2006, vol. 86，1722-1731，涉及麥麩阿拉伯木寡糖的大規模生產和表徵。W02008000050涉及作為整粒穀物發酵的副產品而製備可溶性阿拉伯糖基木聚糖
的方法。WO 2008087167涉及在烘烤的產品中原位增加水溶性阿拉伯糖基木聚寡糖的水平的方法。Rouau，X 禾口 Surget, A. , Carbohydrate polymers 24 123-132 (1994)，描述了用於確定澄粉中總的和水可提取的戊聚糖的快速半自動化方法。本領域中需要對穀物更好的利用，其中更少的穀物將用於低價的應用，例如牛飼料。此外，長久以來就需要能夠在傳統的、已經存在的穀物產品中利用來自穀物的麩級分， 而不顯著影響產品的外觀/結構、顏色或味道，並使得能夠增加現存產品的健康和營養效果。發明目的本發明的目的是提供增加谷麩溶解的方法，以提供更好地利用穀物的方法，其中更少的穀物將用於低價的應用，例如牛飼料。此外，本發明的目的還在於提供合適的方法使得能夠在傳統的、已經存在的穀物產品中利用來自穀物的麩級分，而不顯著影響產品的外觀/結構、顏色或味道，並使得能夠增加現存產品的健康和營養效果。
發明概要本發明的發明者已發現，通過在用細胞壁修飾酶和澱粉修飾酶處理時在谷麩中保留大量的澱粉，在溶解穀物澱粉的過程中可獲得顯著更高產量的阿拉伯糖基木聚寡糖和總的可溶性材料。在廣泛的方面，本發明涉及溶解谷麩以產生包含至少一部分溶解的谷麩的組合物。要理解，通過本發明的方法所獲得的組合物的另一部分可以是麩的完全或部分不可溶性級分。因此，在第一個方面，本發明涉及溶解包含澱粉的谷麩的方法，所述方法包括下列步驟a)製備含有大量澱粉的顆粒谷麩的懸浮液；b)用下列物質以任何順序順次(不去除任何組分)，或者同時處理懸浮液中的所述含有大量澱粉的顆粒谷麩一種或多種細胞壁修飾酶；一種或多種澱粉修飾酶；和任選地一種或多種其它的酶。在第二個方面，本發明涉及由本發明的方法所產生的溶解的谷麩。在另一個方面，本發明涉及由根據本發明的方法所產生的溶解的谷麩用於生產食品的用途。在又一個方面，本發明涉及通過在食品生產中使用根據本發明的方法生產的溶解的谷麩而獲得的食品。在另外的方面，本發明涉及包含下列的部分的試劑盒a)包含下列的酶組合一種或多種細胞壁修飾酶；一種或多種澱粉修飾酶，和任選地一種或多種其它的酶；b)用於根據本發明的方法的說明書；以及c)任選地用於食品的其它成分。


圖1.根據麩處理的提取緩衝液的回收。柱狀代表對於根據表3的試驗號1-6所回收的提取物體積。圖2.根據麩處理獲得的可溶性級分中的乾物質。柱狀代表對於根據表3的試驗號1-6的乾物質含量(％)。圖3.根據麩處理的麩溶解度。柱狀代表對於根據表3的試驗號1-6的麩溶解度。圖4.根據麩處理的校正的(針對回收提取體積)麩溶解度。柱狀代表對於根據表3的試驗號1-6的麩溶解度％ (針對回收提取體積校正的)。
圖5.烘烤試驗結果。麵包相對於空白的相對體積(％ )。柱狀代表根據表9的烘烤試驗1-4的麵包體積(％ )。試驗1 (空白設為100% )。圖6.用(從左邊起)對照麵粉、2. 5%可溶性纖維、5%可溶性纖維、和5%不可溶性纖維烘烤而獲得的麵包。圖7.用(從左邊起)對照麵粉、2. 5%可溶性纖維、5%可溶性纖維、和5%不可溶性纖維烘烤而獲得的麵包。發明詳述本發明涉及溶解穀物側流(sidestream)(麩)的方法(以及產生的產品)，產生了可在穀物應用中被利用的產品。本發明將允許在穀物應用中利用穀物側流而不對所生成產品的感覺和質地特性帶來不利作用，並且其將增加原材料(穀物)的利用。在根據本發明的方法中將產生益生性寡糖，例如β-葡聚糖，和AX0S、生育酚、以及生育三醇(tocotriols)， 後兩者具有抗氧化效果。還被認為生成均具有乳化劑效果的單-和雙-甘油酯，Iyso-PC和單/雙-半乳糖基-單-甘油酯，其對於最終穀物產品的表觀、結構和穩定性具有進一步的積極效果。在一些實施方式中，由根據本發明的方法獲得的溶解的產品將包含選自益生元、 抗氧化物和乳化劑的化合物。在一些實施方式中，由根據本發明的方法獲得的溶解的產品將包含阿拉伯糖基木聚寡糖(AM)S)。在一些實施方式中，由根據本發明的方法獲得的溶解的產品將包含異麥芽寡糖 (IMO)。在一些實施方式中，在本發明的方法中所使用的谷麩來自穀物副流(bi-stream)， 例如來自傳統研磨的麥麩。 進行傳統的小麥研磨至65-85 %的提取度(基於穀粒重量的％麵粉產量)，產生由細胞壁多糖(例如阿拉伯糖基木聚糖、葡聚糖、纖維素)組成的麥麩，此外，蛋白質、脂類、木質素和澱粉將存在於麩中。用a) —種或多種細胞壁水解活性，例如來自木聚糖酶、 β-葡聚糖酶、纖維素酶和b) —種或多種澱粉水解酶，例如α-澱粉酶、支鏈澱粉酶、β-澱粉酶和轉葡萄糖基酶(例如轉葡糖苷酶)的組合處理谷麩將產生AX0S，並且在一些實施方式中也將產生ΙΜ0，以及其它的細胞壁寡糖/多糖。此技術可被應用於研磨側流，以產生益生元和低碳水化合物膳食纖維產品，其可被應用於穀物應用中(例如烘烤、早餐穀物、蛋糕、義大利麵食(pasta)等)。本發明的一個重要特徵可以是最終產品更易於接受的感覺性表觀和健康影響。在穀物應用中使用根據本發明的麩級分將主要影響四種不同的參數1)產品結構/外觀，2) 產品顏色，幻產品味道，和/或4)健康方面。1)將麩級分加入穀物產品中將影響最終產品的結構。如果所述產品是酵母發酵的麵包，麩級分將對於麵筋強度有破壞作用，產生具有更小體積的更緻密的產品。通常，向產品中加入麩將影響產品結構和外觀。這可被消除或減少，如果麩級分或纖維級分是以可溶的形式而不是固體形式被加入到產品中的。溶解的麩不會例如對酵母發酵的麵包中麵筋的生成和強度具有相同的影響。2)在穀物產品中使用麩對於產品的顏色具有顯著的影響-產品變得更暗。其原因在於麩級分中的顏色組分(主要是細胞壁中的酚類化合物)將影響整體的產品顏色。與僅由胚乳(麵粉)產生的更白的產品相比，此特徵通常被視為是缺點並且是吸引力較差的產品。使用根據本發明的溶解的麩，顏色可被減弱甚至消除。其原因在於許多所述酚類化合物通常位於最難酶促進入的細胞壁區域，因此它們將不被溶解並促成使用溶解的麩級分所產生的最終產品的深顏色。利用這些產物的特異性酶促水解或者是通過應用分離和/或純化技術，根據本發明的方法可被優化以完全去除促成顏色生成的化合物。3)當應用麩級分時，促成更暗產品的同樣組分也將改變最終產品的感覺性特性。 與由胚乳生產的產品相比，這些化合物的特徵是更苦的味道。此味道在斯堪地那維亞和歐洲北部是公知的並且受歡迎的，在那裡傳統上消費黑麵包。然而，對於世界的許多其它部分，所述味道是不受歡迎的並且更多地被視為是產品的缺點。4)許多注意力被集中在通過我們的膳食影響腸道健康。被廣泛認可的是，我們的膳食、特別是我們消耗的膳食纖維(可溶的和不可溶的)對於腸道菌群的組成以及由此對個體的整體健康有巨大的影響。已顯示應用可溶的麩(或者更準確地，阿拉伯糖基木聚糖 (AXOS)的可溶性低分子寡糖)顯著地改變腸道菌群。通過結合AXOS和IMO的產生，使用纖維級分將不會向產品中加入更多的澱粉而提高可代謝的能量，但是將殘留的澱粉和葡萄糖轉化為另一種益生性纖維ΙΜ0。所產生的級分可被用於早餐穀物中，增加穀物(小麥)的利用率，減少所使用的增量劑(糖)，減少卡路裡負荷並向膳食中引入益生元。總之，根據本發明的方法將產生對穀物更好的利用，更少的穀物將用於低價的應用，例如牛飼料。此外，本申請中所描述的方法將使得能夠在傳統的、已經存在的穀物產品中利用來自穀物的麩級分，而不顯著影響產品的外觀/結構、顏色或味道。最後，本申請中所描述的方法將使得能夠增加現存產品的健康和營養效果。定義如本申請中所使用的，術語"穀物"指來自禾本(Poaceae)科植物的果實，此類種子至少含有包含糊粉粒的麩、以及澱粉性胚乳，另外存在或不存在果皮、種子外皮(備選地稱為種皮)和/或胚。此術語包括但不限於例如下列的種小麥、大麥、燕麥、斯佩耳特小麥(spelt)、黑麥、高梁、玉米和稻。如本申請中所使用的，術語"麩」指源自穀物的研磨級分，其與相應的完整種子相比富含選自下列的任何或全部組織糊粉粒、果皮和種子外皮。如本申請中所使用的，術語「溶解」指在根據本發明的方法中溶解谷麩並且意在包括任何程度的溶解。因此，「溶解」可以是為了獲得100%可溶的材料或可以是為了獲得低於100%的溶解度，例如低於70%，例如在40% -60%的範圍內或者例如在20% -40%的範圍內。在一些實施方式中，所述溶解度是基於乾物質相對於乾物質麩而被測定的。如本申請中所使用的，術語"研磨級分"指由機械減小穀粒大小而產生的全部或部分級分，所述機械減小穀粒大小是通過例如但不限於切削、軋制、壓碎、破裂或研磨，伴隨或不伴隨通過例如(但不限於)篩析，篩選，篩分，吹制，抽氣，離心篩分，風篩，靜電分離， 或電場分離而分級。在本發明的情境中，「大量澱粉」是指含有大約在傳統機械加工穀物後(例如商業上研磨穀物後)通常存在的殘留澱粉量的谷麩。在一些實施方式中，至少約1%，例如至少約3 %，例如至少約5 %，例如至少約10 %，例如至少約20 %，例如至少約30 %，例如至少約 40%，例如至少約50%通常存在於穀物中的澱粉仍存在於根據本發明所使用的谷麩級分中。優選地，谷麩未經澱粉水解酶預處理或以其它方式被酶促處理以從麩中去除澱粉。要理解，根據本發明的方法涉及製備基本上分離的、含有殘留澱粉的顆粒谷麩的懸浮液，以及酶促處理此谷麩。因此，要理解所述酶將對帶有其殘留澱粉的谷麩具有酶促作用。本發明並不意在涵蓋酶促處理具有額外添加的麵粉製備物的組合物，例如原位酶促麵包製作應用。在一些實施方式中，低於約50%，例如低於約40%，例如低於約30%，例如低於約 20%，例如低於約10%，例如低於約6%，例如低於約3%，例如低於約(w/w)的顆粒谷麩懸浮液是澱粉或含有澱粉的組分，例如麵粉。在本發明的情境中，「細胞壁修飾酶」指任何能夠水解或修飾植物細胞壁的複雜基質多糖的酶，例如任何將在本申請所包括的「細胞壁溶解測試」中具有活性的酶。在「細胞壁修飾酶」這一定義中所包括的有纖維素酶(例如纖維二糖水解酶I和纖維二糖水解酶II)、 內切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶、和半纖維素降解酶(例如木聚糖酶)。如在本申請中所使用的，術語"纖維素酶"或"纖維素降解酶"被理解為包括纖維二糖水解酶(EC 3. 2. 1. 91)，例如纖維二糖水解酶I和纖維二糖水解酶II，以及內切葡聚糖酶(EC 3. 2. 1. 4)和 β -葡糖苷酶(EC3. 2. 1. 21)。包括在纖維素酶定義中的有隨機切割纖維素鏈的內切葡聚糖酶(EC 3. 2. 1. 4)； 從纖維素鏈末端切割纖維二糖基單元的纖維二糖水解酶(EC 3.2. 1.91)和將纖維二糖及可溶性的纖維糊精轉化為葡糖糖的β -葡糖苷酶(EC 3. 2. 1. 21)。在這三類涉及纖維素的生物降解的酶中，纖維二糖水解酶是降解天然結晶纖維素的關鍵的酶。術語"纖維二糖水解酶I 「在本申請中被定義為纖維素1，4- β -纖維二糖苷酶(也稱為外切葡聚糖酶，外切纖維二糖水解酶或1，4- β -纖維二糖水解酶)活性，如在酶類別EC 3. 2. 1. 91中所定義的，其通過從鏈的非還原末端釋放纖維二糖而催化纖維素和纖維四糖中l，4-i3-D-葡萄糖苷連接的水解。術語"纖維二糖水解酶II活性"的定義是相同的，除了纖維二糖水解酶II從鏈的還原末端攻擊之外。纖維素酶可包含碳水化合物結合模塊(CBM)，其提高酶與含有纖維素的纖維的結合併增加酶的催化活性部分的效力。CBM被定義為碳水化合物活性酶中連續的胺基酸序列，其含有具有碳水化合物結合活性的離散摺疊(discreet fold)。關於CBM的其它信息，參見 CAZy 網際網路伺服器(Supra)或 Tomme 等人(1995)，Enzymatic Degradation of Insoluble Polysaccharides(Saddler 禾口 Penner, 編輯)，Cellulose-binding domains !classification and properties, pp.142—163, American Chemical Society, Washington。在優選的實施方式中，所述纖維素酶或纖維素降解酶可以是如美國專利申請號60/941，251(其在此通過引用而被併入)中所定義的纖維素降解製備物。在優選的實施方式中，所述纖維素降解製備物包含具有纖維素降解增強活性的多肽(GH61A)，優選WO 2005/074656中所描述的多肽。所述細胞壁修飾酶還可以是β -葡糖苷酶，例如源自木黴屬 (Trichoderma)，麴黴屬(Aspergillus)或青黴屬(Penicillium)株系的β-葡糖苷酶，包括美國申請號60/832，511 (Novozymes)中公開的具有β _葡糖苷酶活性的融合蛋白。在一些實施方式中，細胞壁修飾酶是CBH II，例如太瑞斯梭孢殼黴(Thielavia terrestris)纖維二糖水解酶II (CEL6A)。在一些實施方式中，細胞壁修飾酶是纖維素酶，例如源自瑞氏木黴的(Trichoderma reesei)酶。在一些實施方式中，纖維素降解活性可以源自真菌來源，例如木黴屬的菌株，例如瑞氏木黴菌株；或腐質黴屬(Humicola)的菌株，例如特異腐質黴(Humicola insolens)菌株。在一些實施方式中，細胞壁修飾酶是WO 2005/074656中所公開的具有纖維素降解增強活性的多肽(GH61A)；纖維二糖水解酶，例如太瑞斯梭孢殼黴纖維二糖水解酶 II (CEL6A)，β-葡糖苷酶(例如，美國申請號60/832,511中所公開的融合蛋白)和纖維素降解酶(例如源自瑞氏木黴的)。在一些實施方式中，細胞壁修飾酶是WO 2005/074656中公開的具有纖維素降解增強活性的多肽(GH61A) ； 葡糖苷酶(例如，美國申請號60/832，511中公開的融合蛋白)以及纖維素降解酶(例如，源自瑞氏木黴的)。在一些實施方式中，細胞壁修飾酶是商業上可得的產品，例如可從Danisco的分支機構Genencor (UQ獲得的GC220或者可從 Novozymes A/S，丹麥，獲得的CELLUCLAST 1. 5L 或 CELLUZYME 。內切葡聚糖酶(EC No. 3. 2. 1. 4)催化下列的內切水解纖維素、纖維素衍生物(例如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)、地衣多糖中的1，4-β-D-糖苷連接，混合的β _1，3葡聚糖(例如穀物β-D-葡聚糖)或木聚葡糖中的β_1，4鍵，以及含有纖維素部分的其它植物材料。經認可的名稱是內切-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，但是在本說明書中使用的是簡稱內切葡聚糖酶。內切葡聚糖酶活性可以根據(ihoSe，1987，Pure and App 1. Chem. 59 257-268的方法利用羧甲基纖維素(CMC)水解來確定。在一些實施方式中，內切葡聚糖酶可以源自木黴屬菌株，例如瑞氏木黴菌株; 腐質黴屬菌株，例如特異腐質黴菌株；或者金孢子菌屬(Chrysosporium)菌株，優選 Chrysosporium Iucknowense 菌株。術語〃纖維二糖水解酶〃指1，4- β -D-葡聚糖纖維二糖水解酶(Ε. C. 3. 2. 1. 91)， 其催化纖維素、纖維素寡糖、或任何含有β _1，4連接的葡萄糖的聚合物中l，4-i3-D-葡萄糖苷連接的水解，從鏈的還原或非還原末端釋放纖維二糖。上文中提及的纖維二糖水解酶的實例包括來自瑞氏木黴、特異腐質黴的CBH I和 CBH II ；和來自太瑞斯梭孢殼黴纖維二糖水解酶(CELL6A)的CBH II。纖維二糖水解酶活性可根據Lever等人.，1972，Anal. Biochem. 47 :273-279和 van Tilbeurgh 等人，1982，FEBS Letters 149 :152-156 ；van Tilbeurgh 禾口 Claeyssens，1985， FEBS Letters 187 :283-288描述的方法確定。Lever等人的方法適於評估玉米秸稈中纖維素的水解，而van Tilbeurgh等人的方法適於在螢光二糖衍生物上確定纖維二糖水解酶活性。術語〃 β -葡糖苷酶〃指β -D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶(Ε. C. 3. 2. 1. 21)，其催化末端非還原性β-D-葡萄糖殘基的水解，伴隨β-D-葡萄糖的釋放。為了本發明的目的， β-葡糖苷酶活性是根據由Venturi等人，2002，J.Basic Microbiol. 42 :55-66所描述的基本方法而確定的，除了如本申請中所述採用了不同的條件。一個單位的葡糖苷酶活性被定義為在500°C、pH 5，從IOOmM檸檬酸鈉，0. 01%TWEEN 20中、作為底物的4mM對硝基苯-β -D-吡喃葡萄糖苷產生1. 0 μ mole的對硝基苯/分鐘。在一些實施方式中葡糖苷酶是真菌來源的，例如木黴屬，麴黴屬或青黴屬菌株。在一些實施方式中β-葡糖苷酶源自瑞氏木黴，例如由bgll基因編碼的β-葡糖苷酶 (參見EP 562003)。在另一個實施方式中，β-葡糖苷酶源自米麴黴(Aspergillus oryzae) (根據W002/095014，在米麴黴中重組產生的)，煙麴黴(Aspergillus fumigatus)(根據WO 02/095014的實施例22在米麴黴中重組產生的)或者黑麴黴(Aspergillus niger) (1981， J. App 1. 3 :157-163)。術語「半纖維素降解酶」或「半纖維素酶」，如在本申請中所使用的，指可降解半纖維素的酶。可使用任何適合用於水解半纖維素(優選水解為阿拉伯糖基木聚寡糖)的半纖維素酶。優選的半纖維素酶包括木聚糖酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，乙醯木聚糖酯酶，阿魏酸酯酶， 葡萄糖醛酸梅，半乳聚糖酶，內切-半乳聚糖酶，甘露聚糖酶，內切或外切阿拉伯糖酶，外切半乳聚糖酶，果膠酶，木聚葡糖酶，或者其中兩種或更多種的混合物。適合用於本發明的半纖維素酶的實例包括Grindamyl Powerbake 930 (可從DaniscoA/S，丹麥獲得)或VISC0ZYM E (可從Novozymes A/S，丹麥獲得)。在一個實施方式中，所述半纖維素酶是木聚糖酶。 在一個實施方式中，所述木聚糖酶是微生物來源的，例如真菌來源的(例如木黴屬，節毛菌屬(Meripilus)，腐質黴屬，麴黴屬，鐮刀菌屬(Fusarium))或來自細菌(例如芽孢桿菌 (Bacillus))。在一些實施方式中，所述木聚糖酶源自絲狀真菌(filamentous fungus)，優選源自麴黴屬菌株(例如棘孢麴黴(Aspergillus aculeatus))；或者腐質黴屬菌株(優選柔毛腐質黴(Humicolalanuginosa))。木聚糖酶可優選地是內切_1，4-β -木聚糖酶，更優選地是GH 10或GHll的內切-1，4-β-木聚糖酶。商業上的木聚糖酶的實例包括來自 Danisco A/S,^^^ Grindamyl H121 Grindamyl Powerbake 930g Novozymes
A/s，丹麥的 Shearzymets^p biofeed wheat 。阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3. 2. 1. 55)催化α -L-阿拉伯糖苷中末端非還原α -L-阿拉伯呋喃糖苷殘基的水解。半乳聚糖酶(EC 3.2. 1.89)、阿拉伯半乳聚糖內切-1，4-β-半乳糖苷酶催化阿拉伯半乳聚糖中1，4-D-半乳糖苷連接的內切水解。果膠酶(EC 3. 2. 1. 15)催化果膠酸和其它聚半乳糖醛酸中1，4_ α -D-半乳糖醛酸連接的水解。木聚葡糖酶催化木聚葡糖的水解。如本申請中所使用的，術語"木聚糖酶"指能夠水解木聚糖或阿拉伯糖基木聚糖的非末端β-D-吡喃木糖基-1，4-β-D-吡喃木糖基單元中β_1，4糖基鍵的酶。其它的名稱包括l，4-i3-D-木聚糖木聚糖水解酶，1，4-β-木聚糖木聚糖水解酶，β-1，4-木聚糖木聚糖水解酶，(1-4)_β-木聚糖4-木聚糖水解酶，內切-1，4-β-木聚糖酶，內切-(1-4)-β-木聚糖酶，內切-β_1，4-木聚糖酶，內切-l，4-i3-D-木聚糖酶，內切-1， 4-木聚糖酶，木聚糖酶，β-1，4-木聚糖酶，β-木聚糖酶，β-D-木聚糖酶。木聚糖酶可源自各種生物體，包括植物，真菌(例如，麴黴屬、青黴屬、Disporotrichum、鏈孢黴屬 (Neurospora)、鐮刀菌屬、腐質黴屬、木黴屬的種)或者細菌的種(例如，芽孢桿菌屬、氣單胞菌屬(Aeromonas)、鏈黴菌屬(Str印tomyces)、諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)、嗜熱真菌屬 (Thermomyces)的種)(參見，例如 W092/17573、W092/01793、W091/19782, W094/21785)。
在本發明的一個方面，本發明的方法中所使用的木聚糖酶是歸類為EC 3.2. 1.8 的酶。官方的名稱是內切_1，4-β-木聚糖酶。系統化名稱是1，4-β-D-木聚糖木聚糖水解酶。可使用其它的名稱，例如內切-(1-4)-β-木聚糖酶；(1-4)-β-木聚糖4-木聚糖水解酶；內切-1，4-木聚糖酶；木聚糖酶；β-1，4-木聚糖酶；內切-1，4-木聚糖酶；內切-β-1， 4-木聚糖酶；內切-1，4-β-D-木聚糖酶；1，4-β-木聚糖木聚糖水解酶；β-木聚糖酶； β -1，4-木聚糖木聚糖水解酶；內切-1，4- β -木聚糖酶；β -D-木聚糖酶。所催化的反應是木聚糖中1，4-β-D-木糖苷連接的內切水解。在本發明的一個方面，本發明的木聚糖酶是糖苷水解酶(GH)家族11的木聚糖酶。 術語「糖苷水解酶(GH)家族11的」是指所論及的木聚糖酶是或者可以被歸類在GH家族11中。在本發明的一個方面，根據本發明所使用的木聚糖酶是具有如在本申請中所描述的「木聚糖酶測試」中所測量的木聚糖酶活性的木聚糖酶。 根據Cazy (ModO)位點，家族11糖苷水解酶可被如下表徵已知的活性木聚糖酶(EC 3. 2. 1.8)機制保留催化性親核物質/鹼基Glu (實驗的)催化性質子供體Glu (實驗的)3D結構狀態摺疊β -膠凍卷族群(Clan)=GH-C如本申請中使用的，「族群C"指享有共同的三維摺疊和相同的催化機構 (machinery)的家族組(參見，例如 Henrissat，B.禾口 Bairoch，A. ，(1996) Biochem. J. ，316， 695-696)。如本申請中所使用的，「家族11」指如由Henrissat和Bairoch(1993)Biochem J.，293, 781-788 (也參見 Henrissat 禾口 Davies (1997) Current Opinion in Structural Biol. 1997，& :637-644)所設立的酶家族。家族11成員的共同特徵包括高的遺傳同源性，約 20kDa的尺寸和雙重置換(double displacement)催化機制(參見iTenkanen等人.，1992 ； Wakarchuk等人.，1994)。家族11木聚糖酶的結構包括由β _鏈和α -螺旋構成的兩個大的β-摺疊。家族11木聚糖酶包括下列黑麴黴XynA，白麴黴(AspergillusKawachii) XynC, Aspergillus tubigensis XynA,環狀芽抱桿菌(Bacillus circulans)XynA, Baci 1 luspunziIus XynA,枯草芽抱桿菌 XynA, Neocalliniastix patriciarum XynA, 淺青紫鏈黴菌(Sti^ptomyces lividans) XynB,淺青紫鏈黴菌 XynC，Streptomyces therinovio laceus XynI I,褐色熱單抱菌(Thermomonospora fusca) XynA,哈茨木黴 (Trichoderma harzianum)Xyn,瑞氏木黴 XynI,瑞氏木黴 XynII,綠色木黴(Trichoderma viride)Xyn0在本發明的情境中，「澱粉修飾酶」，指任何催化葡萄糖苷中的α _1，3和/或α _1， 6葡萄糖苷連接的水解的酶。包括在此術語中的是通常根據其所作用的底物而被命名的糖苷水解酶。在根據本發明的一些實施方式中，所述「澱粉修飾酶」選自乳糖酶，澱粉酶，支鏈澱粉酶，異澱粉酶，殼多糖酶，蔗糖酶，麥芽糖酶，神經氨酸酶，轉化酶，透明質酸酶和溶菌酶。在一些實施方式中，所述澱粉修飾酶是澱粉脫支酶。在本發明的一個方面，根據本發明所使用的澱粉修飾酶是具有如本申請中所描述的「澱粉脫支活性測試」中所測量的澱粉脫支活性的酶。澱粉脫支酶包括支鏈澱粉酶(EC 3. 2. 1. 41)和異澱粉酶(EC3. 2. 1. 68)。它們水解支鏈澱粉，β-有限糊精和支鏈澱粉(pullulans)中的α _1，6-D-葡萄糖苷分支連接。可通過異澱粉酶不能夠攻擊支鏈澱粉以及通過對於α-有限糊精有限的作用而將異澱粉酶與支鏈澱粉酶(EC 3. 2. 1. 41)相區別。「澱粉酶"意指包括任何澱粉酶，例如芽孢桿菌屬的種(例如地衣芽孢桿菌 (B. Iicheniformis)和枯草芽孢桿菌(B. subtilis))的葡糖澱粉酶，α -澱粉酶，β -澱粉酶和野生型α-澱粉酶。「澱粉酶"應該特別是指能夠催化澱粉降解的酶。澱粉酶是裂解澱粉中α-D-(1 — 4)0-糖苷連接的水解酶。通常，α-澱粉酶(EC 3. 2. 1. 1 ； (X_D_ (1 — 4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)被定義為以隨機的方式裂解澱粉分子內的a-D-(l — 4)0-糖苷連接的內切-作用性酶。相反地，外切-作用性澱粉分解酶，例如β-澱粉酶(EC 3.2.1.2; α-D-(1 — 4)-葡聚糖麥芽糖水解酶)以及一些產物特異性澱粉酶(比如麥芽糖生成性 α -澱粉酶(EC3. 2. 1. 133))從底物的非還原末端裂解澱粉分子，β _澱粉酶、α -葡糖苷酶 (EC 3.2. 1.20 ； α-D-葡糖苷葡糖水解酶)、葡糖澱粉酶(EC3. 2. 1. 3 ； α-D-(1 — 4)-葡聚糖葡糖水解酶)、和產物特異性澱粉酶可以從澱粉產生葡萄糖。「 α-澱粉酶變體"，「α-澱粉酶變體多肽「和"變體酶「指通過置換成熟 α_澱粉酶蛋白氨基末端的胺基酸殘基而經修飾的α-澱粉酶蛋白。如本申請中所使用的，「親本酶〃、「親本序列〃、「親本多肽〃、「野生型α-澱粉酶蛋白〃和〃親本多肽"應指所述α-澱粉酶變體多肽所源自的酶和多肽。親本酶可以是野生型的酶或之前經重組工程化的α-澱粉酶。所述α-澱粉酶變體還可包括在α-澱粉酶親本多肽的信號序列中或α-澱粉酶親本多肽的其它位置的突變。因此，所述α-澱粉酶多肽可以是經重組工程化的酶。在本發明的一個方面，根據本發明所使用的α-澱粉酶是具有如在本申請中所描述的「 α -澱粉酶測試」中所測量的α -澱粉酶活性的α "澱粉酶。在本發明的一個方面，根據本發明所使用的澱粉酶是具有如在本申請中所描述的「 β -澱粉酶測試」中所測量的β -澱粉酶活性的β -澱粉酶。術語"支鏈澱粉酶"指特定種類的葡聚糖酶，其是降解支鏈澱粉的澱粉分解內切酶。其例如是由克雷伯桿菌(Klebsiella)屬的革蘭氏陰性細菌作為細胞外、細胞表面-錨定的脂蛋白而產生的。然而，革蘭氏陽性細菌產生支鏈澱粉酶作為分泌的蛋白。I型支鏈澱粉酶特異性地攻擊α-1，6連接，而II型支鏈澱粉酶還能夠水解α_1，4連接。它也由一些其它的細菌和古細菌產生。在生物技術中，支鏈澱粉酶被用作去汙劑。支鏈澱粉酶(EC 3.2.1.41)也已知為支鏈澱粉-6-葡聚糖水解酶(脫支酶)。支鏈澱粉被認為是由α-1， 6-葡萄糖苷鍵連接的麥芽三糖單元的鏈。支鏈澱粉酶將水解裂解支鏈澱粉(α-葡聚多糖)。術語"轉葡萄糖基酶"指具有轉葡糖苷酶活性的任何酶，例如轉葡糖苷酶。術語"轉葡糖苷酶"指將l，4-a-D-葡聚糖中的α-D-葡糖基殘基轉移至葡萄糖的伯羥基基團的酶，為游離的或是在l，4-a_D-葡聚糖中結合的。本申請中所描述的轉葡糖苷酶具有作為EC 2. 4. 1. 24(根據IUBMB酶命名)而被描述的活性。本申請中所描述的轉葡糖苷酶的系統化名稱是1，4- α -D-葡聚糖1，4- α -D-葡聚糖(D_葡萄糖)6_ α -D-葡糖基轉移酶。 在某些出版物中，此酶可被稱作α-葡糖苷酶。如上文所述，轉葡糖苷酶通常具有被定義為EC 2.4. 1.24(根據IUBMB酶命名)的活性，所述活性將某些葡聚糖中的葡糖基轉移至葡萄糖的伯羥基基團。在一些實施方式中，所述酶還可具有通過剪掉糖側鏈或裂解內部的鍵來破壞多糖主鏈從而降解天然樹膠多糖(例如，黃原膠，和含有半乳甘露聚糖的多糖(例如瓜爾豆膠或利馬豆膠)) 的活性。任何適合的轉葡糖苷酶可用於本發明中(參見例如，Pazur等人，Carbohydr. Res. 1986149 :137-47 ；and Nakamura 等人，J. Biotechnol. ,53 :75-84,1997) 在一些實施方式中，本發明中所用的轉葡糖苷酶是商業上可得的(例如，包括但不限於從Megazyme， Wicklow，愛爾蘭或 Danisco US Inc.，Genencor 分支，Palo Alto，CA 所獲得的酶)。在一些實施方式中，所述酶是在瑞氏木黴細胞中產生的黑麴黴轉葡糖苷酶。在一些其它的實施方式中，所述轉葡糖苷酶是野生型真菌轉葡糖苷酶(例如，包括但不限於具有在NCBi的GENBANK 資料庫中以如下登錄號被保藏的胺基酸序列的真菌轉葡糖苷酶:D45356(GID :2645159 ；黑麴黴)，BAD06006. 1 (GID :4031328 ；泡盛麴黴(Aspergillus awamori)), BAA08125. 1 {G10 \054565 ；米麴黴)，XPJ) 01 210809. 1 (GID 1 15492363 ；土麴黴(Aspergillus terreus))，ΧΡ_001271891· 1 (GID 121707620 ；棒麴黴(Aspergillus clavatus))，XPJ) 01266999. 1 (GID 1 19500484 ；費氏新薩託(Neosartorya fischeri))， XP 751811. KGID :70993928 ；煙麴黴(Aspergillus fumigatus)), XP_659621. 1(GID 67523121 ；構巢麴黴(Aspergillus nidulans))，XP_001216899. 1 (GID :115433524 ； 土麴黴)和XPJ)01258585. 1 (GID :119473371 ；費氏新薩託))，或者它們的變體，所述變體具有的胺基酸序列與野生型真菌轉葡糖苷酶至少約70%相同，至少約80%相同，至少約85%相同，至少約90 %相同，至少約95 %相同，或至少約98 %相同。在本發明的一個方面，根據本發明所使用的轉葡糖苷酶是具有如在本申請中所描述的「轉葡糖苷酶測試」中所測量的轉葡糖苷酶活性的轉葡糖苷酶。根據本發明的酶活性測試細胞壁溶解測試優選地，利用下面的測試測量麩溶解性。將(0. IM)-磷酸氫二鈉(0. 2M)緩衝液(pH 5. 0)中的麥麩懸浮液製備為1. 33%麩 (w/w)的濃縮液。將750 μ 1的等分試樣在攪拌下從此懸浮液中轉移到印pendorph管中。 將各個底物管在40°C下預加熱5分鐘。向其中加入250 μ 1酶溶液，使得底物的最終濃度為 1%。每次測定(0，30，60和240分鐘)，由根據本發明的各個酶組合物製備三種稀釋液(一式兩份)，其具有增加的酶濃度(例如0，33 ;1. 0和3. 0 μ g酶/克麩)。作為空白，使用了經熱變性的酶組合物溶液。通過將所述管轉移到設置為95°C的培養箱中，而在給定的時間終止反應。將經熱變性的樣品保持在4°C直至所有的酶反應終止。當所有的酶反應均被終止時，離心Eppendorph管以獲得澄清的上清液。酶溶解麩的能力被表示為還原末端基團的增加(如使用PAHBAH(Lever，1972)所測定的)。如果所使用的麩含有殘留的澱粉，副活性(例如澱粉酶活性)可幹擾上述測試，麩溶解測試應該只在純化的細胞壁修飾酶(沒有澱粉酶活性)上進行。備選地，可根據下面的方法測量溶解度植物材料(例如谷麩)的溶解度可如下測定通過在有或沒有酶的提取緩衝液中懸浮不可溶的植物材料(通常10-25% (w/w)的麩在緩衝液中)，於40°C在攪拌下將所述懸浮液孵育受控的時間(例如30至1440分鐘)。溶解後，通過離心(20分鐘，25000x g， 室溫)將溶解的材料與不可溶的材料分離。通過凍幹部分樣品或通過水分分析(水分分析儀，AND ML-50,Buch & Holm，丹麥)來測定上清液中的乾物質含量。使用這一方案，所有的提取緩衝液不能均被回收，然而假定的是回收的提取緩衝液與未回收的提取緩衝液中可溶性材料的濃度是相同的，這就是為什麼對於總的所使用的提取緩衝液進行了校正。測定了可溶性級分中的乾物質含量之後，知道工作中所用的植物材料的量和提取緩衝液的量，可使用下面的等式來確定溶解度。溶解度=(((g乾物質/ml回收的上清液)χ (ml所使用的提取緩衝液))xl00% ) / g工作中所用的植物材料木聚糖酶測試(內切-β -1,4-木聚糖酶活件)在檸檬酸(0. IM)-磷酸氫二鈉(0. 2Μ)緩衝液(ρΗ 5. 0)中稀釋樣品，以在此測試中獲得大約OD59tl = 0.7。在40°C將樣品的三種不同的稀釋液預孵育5分鐘。在時間=5 分鐘時，將1片木聚糖酶(交聯的，經染色的木聚糖底物，Megazyme, Bray，愛爾蘭)加入 Iml的反應體積的所述酶溶液中。在時間=15分鐘時，通過加入IOml的2% TRIS/NaOH(pH 12)而終止反應。使用ΙΟΟΟμ 1的緩衝液代替酶溶液而製備空白。離心(1500x g，10分鐘， 200C )反應混合物並且在590nm處測量上清液的0D。一個木聚糖酶單位(XU)被定義為以 0. 025/分鐘增加OD 590的木聚糖酶活性。α-澱粉酶活性α -澱粉酶水解α _D_1，4_葡萄糖苷連接，並且其活性可作為澱粉_碘溶液由於 α 1，4-D-連接的水解而改變顏色的速率而被檢測。β-澱粉酶活性β -澱粉酶活性可作為麥芽糖從澱粉溶液的非還原末端的釋放而被檢測。轉葡糖苷酶活性轉葡糖苷酶在用α -D-寡聚葡萄糖孵育時催化水解和轉移反應。轉葡糖苷酶活性可在用麥芽糖或麥芽糊精孵育時作為寡聚異麥芽糖(例如異麥芽糖、潘糖和異麥芽三糖) 的形成而被檢測。澱粉脫支活性測試特異於澱粉中的α _D-1，6葡萄糖苷連接的酶目前包括異澱粉酶(EC 3. 2. 1. 68) 和支鏈澱粉酶(EC 3. 2. 1. 41)。作用於澱粉的α _D_1，6葡萄糖苷連接的酶也通過其對支鏈澱粉的作用而被分類並且其活性是作為對澱粉和支鏈澱粉的α _D-1，6葡萄糖苷連接的特異性水解而被測量的。本發明的特定實施方式如上文中所討論的，本發明涉及用於溶解包含澱粉的谷麩的方法，所述方法包括下列步驟a)製備含有大量澱粉的顆粒谷麩的懸浮液；
b)用下列物質以任何順序順次(不去除任何組分)、或者同時處理懸浮液中的所述含有大量澱粉的顆粒谷麩一種或多種細胞壁修飾酶；一種或多種澱粉修飾酶；和任選地一種或多種其它的酶。在本發明的一些實施方式中，用包含下列的酶組合同時處理所述顆粒谷麩一種或多種細胞壁修飾酶；和一種或多種澱粉修飾酶；以及任選地一種或多種其它的酶。在本發明的一些實施方式中，所述其它的酶是一種或多種轉葡糖苷酶。在本發明的一些實施方式中，所述其它的酶是脂肪酶，例如磷脂酶或半乳糖脂肪酶。在本發明的一些實施方式中，所述其它的酶是蛋白酶。在本發明的一些實施方式，所述方法還包括收穫從步驟b)獲得的可溶性級分的步驟。在本發明的一些實施方式中，所述一種或多種細胞壁修飾酶選自木聚糖酶，和纖維素酶(例如纖維二糖水解酶)，內切葡聚糖酶，和β-葡聚糖酶。在本發明的一些實施方式中，所述纖維素酶選自內切-纖維素酶，外切-纖維素酶，纖維二糖酶，氧化性纖維素酶，纖維素磷酸化酶。在本發明的一些實施方式中，所述一種或多種澱粉修飾酶選自α-澱粉酶，支鏈澱粉酶，異澱粉酶和β-澱粉酶。在本發明的一些實施方式中，所述一種或多種轉葡糖苷酶選自酶類別EC 2. 4. 1. 24 的酶。在本發明的一些實施方式中，所述顆粒麩的平均粒徑低於3000 μ m，例如低於 1000 μ m，例如低於 500 μ m。在本發明的一些實施方式中，所述谷麩是從工業研磨過程獲得的並且被進一步研磨以獲得低於500 μ m，例如低於400 μ m，例如低於200 μ m的平均粒徑。在本發明的一些實施方式中，所述溶解的谷麩被進一步處理以使其它的酶活性失活。在本發明的一些實施方式中，基於乾物質相對於乾物質麩所測定的溶解度高於 20%，例如高於25%，例如高於30%，例如高於35%，例如高於40%，例如高於50%，例如在 40% -60%的範圍內，例如在50% -60%的範圍內。在本發明的一些實施方式中，基於乾物質相對於乾物質麩所測定的、從步驟b)獲得的可溶性級分中阿拉伯糖基木聚寡糖(AXOS)的含量為高於20%，例如高於25%，例如高於30%，例如高於35%，例如高於40%，例如高於45%，例如高於50%.在本發明的一些實施方式中，谷麩中多於的澱粉，例如谷麩中多於2%的澱粉，例如谷麩中多於3%的澱粉，例如谷麩中多於4%的澱粉，例如谷麩中多於5%的澱粉， 例如谷麩中多於10%的澱粉，例如谷麩中多於15-50%的澱粉在從步驟b)獲得的可溶性級分中被轉化為異麥芽寡糖(IMO)。在本發明的一些實施方式中，基於乾物質相對於乾物質麩所測定的、從步驟b) 獲得的可溶性級分中經修飾的脂類含量為至少約0. 05%，例如至少約1.0%，例如在 0. 05-5%的範圍內。在本發明的一些實施方式中，來自谷麩的、經修飾的脂類總量的至少約2%，例如至少約10%，例如在2-80%的範圍存在於從步驟b)獲得的可溶性級分中。在本發明的一些實施方式中，所述方法還在步驟a)之前包括步驟i)將穀粒分級以獲得胚乳、麩和胚芽；ii)分離和分配所述胚乳、麩、和胚芽以允許它們被處理；和iii)研磨所述麩。在本發明的一些實施方式中，所述谷麩選自小麥，大麥，燕麥，黑麥和黑小麥，稻， 以及玉米。在本發明的一些實施方式中，所述方法還包括乾燥所獲得的溶解的谷麩的步驟。在本發明的一些實施方式中，所述方法還包括噴霧乾燥所獲得的溶解的谷麩的步
馬聚ο在本發明的一些實施方式中，所述方法還包括凍幹所獲得的溶解的谷麩的步驟。本發明還涉及根據本發明所獲得的溶解的谷麩的用途。在本發明的一些實施方式中，在根據本發明的方法中所獲得的溶解的谷麩作為可溶和不可溶的谷麩材料的混合物而在食品生產中被直接加入。要理解，根據本發明的方法可產生僅具有可溶性谷麩材料的分離的溶解級分，例如當可溶性級分是從可溶和不可溶的谷麩材料的混合物中被收穫的時候。在一些實施方式中，所述收穫的可溶性谷麩材料被用於食品的生產。在其它的備選實施方式中，含有可溶和不可溶材料的所述溶解的谷麩可不經進一步的分離或收穫而被直接用於食品生產中。在本發明的一些實施方式中，所述食品選自麵包，早餐穀物，義大利麵食，餅乾，小餅(cookies)，點心，和啤酒。本發明的溶解的谷麩可被用作食品或用在食品的製備中。在此，術語「食品」以廣泛的含義被使用-並且涵蓋用於人的食物及用於動物的食物(即，飼料)。在某些方面，所述食物是用於人消費的。所述食物可以是溶液或固體的形式取決於用途和/或應用模式和/或施用的模式。因此，在本發明的其它實施方式中，所收穫的可溶性谷麩材料和/或含有可溶和不可溶的材料的溶解的谷麩可被用於動物飼料中。本發明的溶解的谷麩也可被用作食物成分。如本申請中所使用的，術語「食物成分」包括是營養補充物和/或纖維補充物的製劑或可作為營養補充物和/或纖維補充物而被加入功能性食物或食品中的製劑。如本申請中所使用的，術語食物成分也指可以低水平被用於廣泛的各種產品中而不增加粘性的製劑，所述產品需要凝膠化、紋理化、穩定化、懸浮、成膜以及結構化、保持多汁性和改善的口感。所述食物成分可以是溶液或固體的形式-取決於用途和/或應用模式和/或施用的模式。本發明的溶解的谷麩可以是或者可以被加入至食物補充物。本發明的溶解的谷麩可以是或者可以被加入至功能性食物。如本申請中所使用的，術語「功能性食物」指不僅能夠提供營養效果和/或味道的滿足，還能夠給消費者遞送其它有益效果的食物。
因此，功能性食物是具有摻入其中的、除純的營養效果外還賦予食物特定功能 (例如醫療或生理學的益處)的組分或成分(例如本申請中所描述的那些)的尋常食物。雖然對於功能性食物沒有法律的定義，大多數在此領域中有興趣的參與方同意它們是被市場推廣為具有特定健康效果的食物。某些功能性食物是營養劑。在此，術語「營養劑」指不僅能夠提供營養效果和/或味道的滿足，還能夠給消費者遞送治療(或其它有益)效果的食物。營養劑跨越了食物和藥品之間的傳統分界線。調查顯示消費者最重視關於心臟疾病的功能性食物斷言。預防癌症是令消費者很感興趣的另一方面營養補給，但是有趣地，這是消費者感到他們可以施加最少的控制的領域。事實上，根據世界衛生組織所言，至少35%的癌症案例是膳食相關的。此外，涉及骨質疏鬆症、腸道健康和肥胖效果的斷言也是可能刺激功能性食物購買和驅動市場發展的關鍵因素。本發明的溶解的谷麩可被用於食品的製備中，所述食品為例如一種或多種果醬、 果子醬(marmalades)、果凍、奶製品(例如牛奶或奶酪)、肉製品、禽類產品、魚產品和烘烤
女口
廣 PFt ο作為示例，本發明的溶解的谷麩可被用作下列的成分軟飲料、果汁、或包含乳清蛋白的飲品、健康茶、可可飲料、牛奶飲料和乳酸菌飲料、酸奶以及飲用酸奶、奶酪、冰激凌、 水冰和甜點、甜食、餅乾蛋糕和蛋糕混合配料、零食、早餐穀物、方便麵和杯麵、速溶湯和杯裝湯、均衡的食物和飲料、甜味劑、質地改善的零食棒、纖維棒、烘烤穩定的水果餡料、保健釉、巧克力烘烤餡料、奶酪蛋糕風味的餡料、水果風味的蛋糕餡料、蛋糕和油炸圈糖衣、熱穩定的烘烤餡料、即時烘烤填料膏、餅乾的餡料、即用型烘烤餡料、卡路裡降低的餡料、成人營養飲料、酸化的豆/果汁飲料、無菌的/殺菌巧克力飲料、棒混合料(bar mixes)、飲料粉、加鈣的豆奶/原味和巧克力奶、加鈣的咖啡飲料。根據本發明的溶解的谷麩還可被用作食品中的成分，例如美國奶酪醬，用於奶酪粉和奶酪碎的抗結塊試劑，薯片蘸料，奶油奶酪，無脂肪酸奶油幹混合攪打澆料(topping)， 冷凍/融化的動物性鮮奶油(dairy whipping cream)，冷凍/融化的穩定攪打的tipping， 低脂和清淡的天然切達(Cheddar)奶酪，低脂瑞士型酸奶，充氣的冷凍甜點，和新型棒 (novelty bars)，硬包裝冰激凌，友好標識的、經濟和享受上改善的硬包裝冰激凌，低脂冰激凌軟供應的，燒烤醬，奶酪蘸醬，白乾酪調味品，幹混合的Alfredo醬，混合奶酪醬，幹混合番茄醬及其它。對於某些方面，所述食物是飲料。對於某些方面，所述食物是烘烤產品，例如麵包，丹麥糕點，餅乾或小餅。在一些實施方式中，麩的溶解度是作為可溶性級分中的乾物質含量(％ )相對於所使用的麩而被測量的，如在實施例1中所描述的「可溶性級分中的乾物質含量(％ )測試」 中所測量的。在一些實施方式中，如在「可溶性級分中的乾物質含量(％ )測試」中所測量的麩溶解度高於20%，例如高於25%，例如高於30%，例如高於35%，例如高於35%，例如高於 40%，例如高於50%，例如在40% -60%的範圍內，例如在50% -60%的範圍內。實施例實施例1商業麥麩的實驗室規模的溶解Mj使用的是獲得自商業磨坊的麥麩級分。所述級分由精細麩級分和粗製麩級分組成。在使用之前，所述粗製麩級分被研磨以獲得更小的粒徑，這將增加麩的比表面積，最終增加麩的酶促溶解的效率。研磨是在Retch磨粉機上進行的，以獲得500 μ m的平均粒徑。 然而，應注意到關於溶解度，較小的粒徑可能是優選的。Sl 表1.用於麥麩溶解的酶
酶活性
木聚糖酶纖維素酶/葡聚糖酶澱粉酶支鏈澱粉酶 β -澱粉酶轉葡糖苷酶方案表2.用於麩溶解的方案在具有密閉蓋的容器/反應器中將麥麩懸浮於50mM的NaPi (pH5) (20% w/w)中在攪拌下將所述麩懸浮液加熱至100°C，並煮沸2分鐘在攪拌下(帶有密閉蓋)將樣品置於50°C並使其關於溫度平衡加入酶並在50°C下使反應繼續進行M小時(溫度和時間可被進一步優化)將上清液與殘留的固體分離將上清液煮沸以使其它的酶活性失活冷卻樣品並儲存以避免汙染將沉澱冷凍乾燥分析上清液分析就以下方面對可溶性麩級分(上清液)進行分析可溶性級分中的乾物質含量(％ )測試將所獲得的可溶性麩的定量樣品凍幹。凍幹後，再次對樣品大小進行定量並計算乾物質的量。作為空白，緩衝劑被包括在此分析中。試驗表3.所進行的試驗引起對麥麩的不同處理
細菌木聚糖酶，DIDK 0218 (BS4 #158)
Genencor GC220 JWS#050808 Genencor Spezyme Fred (4016101001) Genencor Optimax L-1000 (401-05349-002) Genencor Optimalt BBA (EDS 221) Genencor TGL-500 (1600675782)
試驗
緩衝劑
-聚糖酶GC220
g酶樣品/IOg欽
支鏈澱粉酶β
卜酶
—葡糖苷酶
10
30
28. 81579 1. 184211OOOOO
29. 5O 0. 5OOOO
4 10 28. 31579 1. 184211 0. 5000O
29. 58O O 0. 40. 010. 010. 05
6 10 27. 89579 1. 184211 0. 5 0. 40. 010. 010. 05結果麩溶解度由於麩級分中細胞壁組分公知的保水能力，在這些實驗中沒有獲得提取緩衝液的有效回收。然而，如果開發了適當的過程，有效回收是可能的。在圖1中，顯示了實際回收的提取緩衝液。提取回收從25至55%變化。基於所獲得的可溶性級分中乾物質的含量測量溶解的效率。由圖2可見，單獨的溼制方法就溶解了大量的麩。然而，木聚糖酶、纖維素酶/葡聚糖酶和澱粉分解複合物的結合效果顯著增加了溶解。應該注意，在此實驗中實際上是結合了非-澱粉水解酶(木聚糖酶、纖維素酶和葡聚糖酶)與澱粉水解酶(澱粉酶、支鏈澱粉酶、澱粉酶和轉葡糖苷酶) 的加和效果。所述加和效果可由於下列事實而被獲得可能有對於單一酶複合物獲得與其底物接觸的位阻作用。當組合使用非-澱粉和澱粉修飾酶時，此位阻作用或與底物的接觸被優化。基於所獲得的各種可溶性級分中的乾物質含量和所回收的提取緩衝液的量，可能確定溶解度。麩級分的溶解度從溶解10%到25%變化。圖3中顯示了數據。然而，圖3中的溶解度不是準確的溶解度。準確的溶解度是顯著更高的。此偏差的原因是根據麩處理的提取緩衝液的低回收。然而，通過以實際使用的提取緩衝液體積對所獲得的提取緩衝液進行校正，可容易地獲得真正的提取度。此校正是可接受的。由於所回收的可溶物中可溶物的濃度被假定與未回收的可溶物中的濃度相同。此外，本申請中所獲得的可溶物的回收是通過此方案中所使用的方法而給出的。使用不同的分離方法或使用對殘留麩的重複提取可容易地獲得更高的回收。當關於麩溶解的數據經過校正時，獲得了圖4中的結果。實施例2商業麥麩的實驗室規模溶解麩通過應用500g麥麩，3300ml 50mM NaPi (pH 5. 0)和表4中所列的酶而準備了更大規模的實驗。根據表2中給出的方案進行了反應。Sl 表4 大規模溶解實驗中應用的酶
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酶活性酶ID 量/g
木聚糖酶細菌木聚糖酶，DIDK 0218 (BS4#158)59 纖維素酶/葡聚糖酶 Genencor GC220 JWS#0508082.5
澱粉酶 Genencor Optimax L-1000(401-05349-002) 0.5
支鏈澱粉酶 Genencor Optiinax L-1000 (401=05349=002) 0.5
β -澱粉酶Genencor Optimalt BBA (EDS 221)0. 5分析AX 含量就溶解的AX分析可溶物(上清液)樣品。根據Rouau和Surget (1994)進行分析。AX 麗/AM)S 分析由LC_MS測定了 AX的分子量。澱粉含量在如下總水解澱粉後，通過葡萄糖測定來分析麩和溶解的麩中的澱粉含量在 95°C用熱穩定的α澱粉酶反應90分鐘、隨後加入支鏈澱粉酶和葡糖澱粉酶於50°C反應45 小時。IMO 含量利用HPLC-陰離子交換色譜來測定所獲得的可溶性級分中的IMO濃度。結果麩溶解度當相對於此實驗中所使用的提取緩衝液的準確體積進行校正時，我們獲得了的溶解度，這與在之前的實驗中所獲得的相當。AX 含量麩級分中的AX量被測定為19mg/ml上清液。考慮到提取體積，溶解的麩中可溶性 AX的總量為62. 7g。根據文獻中關於麥麩中AX含量的數據，我們獲得了總AX大約53%的溶解。數據被總結在表5中。表5.用於工作的麩，g。所使用的提取緩衝液和體積，ml。溶解的麩中的AX濃度， mg/ml。對於提取體積校正過的總AX，g。相對於麩的提取的AX，％。關於麥麩中AX含量的文獻數據和最後，麩的提取度，％。
權利要求
1.用於溶解包含澱粉的谷麩的方法，所述方法包括步驟a)製備含有大量澱粉的顆粒谷麩的懸浮液；b)用下列物質以任何順序順次而不去除任何組分、或者同時處理懸浮液中的所述含有大量澱粉的顆粒谷麩一種或多種細胞壁修飾酶；一種或多種澱粉修飾酶；和任選地一種或多種其它的酶。
2.根據權利要求1的方法，其中用包含下述的酶組合同時處理所述顆粒谷麩一種或多種細胞壁修飾酶；和一種或多種澱粉修飾酶；以及任選地一種或多種其它的酶。
3.根據權利要求1或2中任一項的方法，其中所述其它的酶是一種或多種轉葡萄糖基酶。
4.根據權利要求1-3中任一項的方法，其中所述其它的酶是脂肪酶，例如磷脂酶或半乳糖脂肪酶。
5.根據權利要求1-4中任一項的方法，其中所述其它的酶是蛋白酶。
6.根據權利要求1-5中任一項的方法，所述方法還包括收穫從步驟b)獲得的可溶性級分的步驟。
7.根據權利要求1-6中任一項的方法，其中所述一種或多種細胞壁修飾酶選自木聚糖酶，和纖維素酶，例如纖維二糖水解酶，內切葡聚糖酶，和β -葡聚糖酶。
8.根據權利要求1-7中任一項的方法，其中所述纖維素酶選自內切-纖維素酶，外切-纖維素酶，纖維二糖酶，氧化性纖維素酶，纖維素磷酸化酶。
9.根據權利要求1-8中任一項的方法，其中所述一種或多種澱粉修飾酶選自α-澱粉酶，支鏈澱粉酶，異澱粉酶和澱粉酶。
10.根據權利要求1-9中任一項的方法，其中所述一種或多種轉葡萄糖基酶選自酶類別 EC 3. 2. 1. 20 的酶。
11.根據權利要求1-10中任一項的方法，其中所述顆粒麩的平均粒徑低於3000μ m，例如低於1000 μ m,例如低於500 μ m。
12.根據權利要求1-11中任一項的方法，其中所述谷麩是由工業研磨方法獲得的並且被進一步研磨以獲得低於500 μ m，例如低於400 μ m，例如低於200 μ m的平均粒徑。
13.根據權利要求1-12中任一項的方法，其中溶解的谷麩被進一步處理以使其它的酶活性失活。
14.根據權利要求1-13中任一項的方法，其中基於乾物質相對於乾物質麩所測定的溶解度高於20%，例如高於25%，例如高於30%，例如高於35%，例如高於40%，例如高於 50%，例如在40% -60%的範圍內，例如在50% -60%的範圍內。
15.根據權利要求1-14中任一項的方法，其中基於乾物質相對於乾物質麩所測定的、 從步驟b)獲得的可溶性級分中阿拉伯糖基木聚寡糖(AXOS)的含量為高於20%，例如高於 30%，例如高於40%，例如高於45%，例如高於50%。
16.根據權利要求1-15中任一項的方法，其中谷麩中多於的澱粉，例如谷麩中多於 2%的澱粉，例如谷麩中多於3%的澱粉，例如谷麩中多於4%的澱粉，例如谷麩中多於5% 的澱粉，例如谷麩中多於10%的澱粉，例如谷麩中多於15-50%的澱粉在從步驟b)獲得的可溶性級分中被轉化為異麥芽寡糖(IMO)。
17.根據權利要求1-16中任一項的方法，其中基於乾物質相對於乾物質麩所測定的、從步驟b)獲得的可溶性級分中經修飾的脂類含量為至少約0.05%，例如至少約1.0%，例如在0. 05-5%的範圍內。
18.根據權利要求1-17中任一項的方法，其中所述方法還在步驟a)之前包括步驟i) 將穀粒分級以獲得胚乳、麩和胚芽；ii)分離和分配所述胚乳、麩、和胚芽以允許它們被處理；以及iii)研磨所述麩。
19.根據權利要求1-18中任一項的方法，其中所述谷麩選自小麥，大麥，燕麥，黑麥和黑小麥，稻，以及玉米。
20.根據權利要求1-19中任一項的方法，其中所述方法還包括乾燥所獲得的溶解的谷麩的步驟。
21.根據權利要求1-20中任一項的方法，其中所述方法還包括噴霧乾燥所獲得的溶解的谷麩的步驟。
22.根據權利要求1-21中任一項的方法，其中所述方法還包括凍幹所獲得的溶解的谷麩的步驟。
23.由根據權利要求1-22中任一項的方法所產生的溶解的谷麩。
24.根據權利要求23的溶解的谷麩用於食品生產的用途。
25.根據權利要求M的用途，其中在根據權利要求1-5，7-22中任一項的方法中所獲得的溶解的谷麩作為可溶和不可溶的谷麩材料的混合物而在食品生產中被直接加入。
26.根據權利要求對或25中任一項的用途，其中所述食品選自麵包、早餐穀物、義大利麵食、餅乾、小餅、點心和啤酒。
27.由根據權利要求對-26中任一項的用途所獲得的食品。
28.包含下列的部分的試劑盒a)包含下列的酶組合一種或多種細胞壁修飾酶；一種或多種澱粉修飾酶，和任選地一種或多種其它的酶；b)用於在根據權利要求1-22中任一項的方法中使用的說明書；和c)任選地用於食品的其它成分。
全文摘要
本發明涉及溶解谷麩用於製備包含谷麩的可溶性級分的組合物，以及包含溶解的谷麩的這些組合物用於製備食品例如麵包的用途。
文檔編號A21D8/04GK102316751SQ201080007655
公開日2012年1月11日 申請日期2010年1月15日 優先權日2009年1月16日
發明者C·H·波爾森, J·F·索任森, K·M·克勞, R·米科爾森 申請人:丹尼斯科公司