哺乳動物細胞因子:白介素-b30和相關試劑的製作方法

2023-09-13 23:19:35 5

專利名稱：哺乳動物細胞因子:白介素-b30和相關試劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及在控制哺乳動物細胞(例如哺乳動物免疫系統細胞)生物學和生理學 中起作用的蛋白質相關的組合物。具體地說，提供純化的基因、蛋白質、抗體和相關的有用 試劑，例如用以調節各種細胞類型(包括造血細胞)的活化、發育、分化和功能。
背景技術：
重組DNA技術一般是指這些技術，所述技術通過將來自供體源的遺傳信息整合到 載體中用於後續加工，諸如通過引入到宿主中，由此使所轉移的遺傳信息在該新環境中復 制和/或表達。通常，該遺傳信息以互補DNA(cDNA)的形式存在，所述互補DNA衍生自編碼 所需蛋白產物的信使RNA(mRNA)。該載體通常是一種質粒，該質粒具有將用於隨後複製的 cDNA加入宿主中的能力，在某些情況下，實際控制該cDNA的表達，並由此指導所編碼的產 物在該宿主中合成。一段時間以來，已經知道哺乳動物的免疫應答基於稱為「免疫網絡」的一系列複雜 的細胞相互作用。最近的研究已經提供了對該網絡內部運作的新的了解。儘管已經清楚 許多免疫應答實際上確實圍繞淋巴細胞、巨噬細胞、粒細胞和其它細胞的網絡樣相互作用 運轉，但免疫學家現在一般堅持這樣一種觀點稱為淋巴因子、細胞因子或單核因子的可溶 性蛋白，在控制這些細胞相互作用中起關鍵作用。因此，人們對細胞調節因子的分離、特徵 鑑定和作用機制相當感興趣，對這些信息的了解將導致在許多醫學異常(例如免疫系統失 調)的診斷和治療方面取得相當大的進展。這些因子中的某些因子是造血生長因子，例如 粒細胞集落刺激因子(G-CSF)。參見例如Thomson (1994編輯)TheCytokine Handbook (第 2 版)Academic Press, San DieRO :Metcalf 和 Nicola (1995) The Hematopoietic Colony StimulatinR Factors CambridgeUniversity Press ；和Aggarwal 和Gutterman (1991) Human CytokinesBlackwell Pub。淋巴因子顯然以多種方式介導細胞活性。已經表明，它們支持多能造血幹細胞的 增殖、生長並分化為大量的祖細胞(progenitor)，所述祖細胞包括構成複雜的免疫系統的 多樣化的細胞譜系。細胞組分之間適當和平衡的相互作用是健康的免疫應答所必需的。當 結合其它因子給予淋巴因子時，不同的細胞譜系常常以不同方式應答。對免疫應答尤其重要的細胞譜系包括兩類淋巴細胞B細胞，它們可以產生和分 泌免疫球蛋白(具有識別並結合外源物質以實現將其去除的能力的蛋白)；和各種亞群的 T細胞，它們分泌淋巴因子，並誘導或抑制B細胞和構成免疫網絡的各種其它細胞(包括其 它T細胞)。這些淋巴細胞與許多其它細胞類型相互作用。另一種重要的細胞譜系是肥大細胞(在所有哺乳動物物種中尚未被明確鑑定)，這是一種含顆粒的結締組織細胞，鄰近遍布機體的毛細血管定位。發現這些細胞在肺、皮膚 以及胃腸道和生殖泌尿道中的濃度尤其高。肥大細胞如下在變態反應相關的病症(特別是 過敏反應)中起中心作用當選定的抗原與結合於肥大細胞表面上受體的一類免疫球蛋白 交聯時，該肥大細胞脫顆粒並釋放引起變態反應(例如過敏反應)的介質，例如組胺、5-羥 色胺、肝素和前列腺素。一般不能在體外維持免疫系統的細胞，這已經阻礙了為更好地了解和治療各種免 疫失調而進行的研究。免疫學家已經發現，通過使用T細胞和其它細胞的上清液，可以完成 對這些細胞的培養，所述上清液含有各種生長因子，包括許多淋巴因子。根據以上所述，可明顯看出，新的淋巴因子(例如與G-CSF和/或IL-6相關的淋 巴因子)的發現和研製，應該有助於用於範圍廣泛的直接或間接涉及免疫系統和/或造血 細胞的退行性病症或異常病症的新療法。特別是，對於增加或增強已知淋巴因子有益活性 的淋巴因子的發現和研製應該是非常有利。本發明提供新的白介素組合物和相關的化合物 以及它們的使用方法。

發明內容
本發明涉及哺乳動物(例如齧齒動物、犬科動物、貓科動物、靈長類動物)的白介 素-B30(IL-B30)及其生物活性。它包括編碼多肽本身的核酸和它們的生產和使用方法。 根據與本文包含的所克隆的互補DNA(cDNA)序列的同源性和/或應用於通常由這些核酸編 碼的多肽例如 G-CSF (參見 Nagata(1994)載於 Thomson The Cytokine Handbook 第 2 版， Academic Press, San Diego)禾口 / 或 IL-6 (參見 Hirano (1994)載於 ThomsonThe Cytokine Handbook第2版，Academic Press, San Diego)的生長因子樣活性或細胞因子樣活性的功 能測定，部分特徵鑑定出本發明的核酸。提供調節或幹擾依賴於生長因子的生理學或免疫 應答的控制的方法。本發明部分基於一種新細胞因子序列的發現，所述新細胞因子序列表現出與 G-CSF和IL-6顯著的序列和結構相似性。具體地說，它提供靈長類動物(例如人類)其編 碼的蛋白質成熟大小約168個胺基酸的基因以及豬和鼠類(例如小鼠)的序列。表現出顯 著序列同源性的功能相當物可得自其它哺乳動物，例如乳牛、馬和大鼠以及非哺乳動物物 種。在各種蛋白質實施方案中，本發明提供大致純的或重組的IL-B30蛋白或肽，它 在至少約12個胺基酸的長度內，表現出與SEQ ID N0:2的序列同一性至少約85%;SEQ ID NO 2的天然序列IL-B30 ；和包含IL-B30序列的融合蛋白。在某些實施方案中，所述同源性 為至少約90%的同一性，而所述部分至少約9個胺基酸；所述同源性為至少約80%的同一 性，而所述部分至少約17個胺基酸；或所述同源性為至少約70%的同一性，而所述部分至 少約25個胺基酸。在其它實施方案中，所述IL-B30:包含表1的成熟序列；或表現出與天然 IL-B30不同的翻譯後修飾模式；或所述蛋白或肽來自選自哺乳動物(包括靈長類動物) 的溫血動物包含SEQ ID NO :2的至少一個多肽區段；表現出多個部分表現出同一性；為 IL-B30的天然等位基因變異體；其長度至少約30個胺基酸；表現出至少兩個非重疊表位為 哺乳動物IL-B30特異性的；在至少約20個胺基酸的長度內，表現出與哺乳動物IL-B30的 序列同一性至少約90%;為糖基化的；其天然糖基化的分子量至少約10kD ；為合成多肽；連接至固體基質上；綴合於另一化學部分；為對天然序列進行5重或5重以下的置換；或為天 然序列的缺失或插入變異體。優選實施方案包括的組合物包含無菌IL-B30蛋白或肽；或 所述IL-B30蛋白或肽和一種載體，其中所述載體為水性化合物，包括水、鹽水和/或緩衝 液；和/或配製用於經口、直腸、鼻、局部或胃腸外給藥。在融合蛋白實施方案中，所述蛋白 可以具有表1的成熟蛋白序列；一種檢測或純化標記，包括FLAG、His6或Ig序列；和/或 另一細胞因子或趨化因子的序列。試劑盒實施方案包括的試劑盒具有IL-B30蛋白或多肽，和包含所述蛋白或多肽 的區室；和/或使用或處理該試劑盒中試劑的說明。在結合化合物實施方案中，所述化合物可以具有來自特異性地結合於天然IL-B30 蛋白的抗體的抗原結合位點，其中所述IL-B30為哺乳動物蛋白；所述結合化合物為Fv、 Fab或Fab2片段；所述結合化合物與另一化學部分綴合；或所述抗體針對表1成熟多肽 的肽序列而產生；針對成熟的IL-B30而產生；針對純化的齧齒動物IL-B30而產生；為免疫 選擇性的；為多克隆抗體；結合於變性的IL-B30 ；表現出的Kd至少為30yM ；連接至固體基 質，包括珠粒或塑料膜；在無菌組合物中；或進行了可檢測標記，包括放射性標記或螢光標 記。含結合化合物的試劑盒包括具有以下物質的試劑盒包含所述結合化合物的區室；和 /或使用或處理該試劑盒中試劑的說明。該試劑盒通常能夠進行定性或定量分析。優選的 組合物包含無菌結合化合物；或所述結合化合物和一種載體，其中所述載體為水性化合 物，包括水、鹽水和/或緩衝液；和/或配製用於經口、直腸、鼻、局部或胃腸外給藥。核酸的實施方案包括分離的或重組的核酸，它編碼IL-B30蛋白或肽或融合蛋白， 其中所述IL-B30來自哺乳動物；和/或所述核酸編碼表1的抗原肽序列；編碼多個表1 的抗原肽序列；表現出與編碼所述區段的天然cDNA的同一性至少約80% ；為一種表達載 體；還包含一個複製起點；來自天然來源；包含一種可檢測標記；包含合成的核苷酸序列； 小於6kb，最好小於3kb ；來自哺乳動物，包括靈長類；包含一種天然的全長編碼序列 』為編 碼所述IL-B30的基因的雜交探針；或為一種PCR引物、PCR產物或誘變引物。本發明也提 供包含這樣一種重組核酸的細胞、組織或器官，而所述細胞最好是原核細胞；真核細胞； 細菌細胞；酵母細胞；昆蟲細胞；哺乳動物細胞；小鼠細胞；靈長類細胞；或人細胞。試劑盒實施方案包括的試劑盒具有這類核酸，和包含所述核酸的區室；還包含 所述IL-B30蛋白或多肽的區室；和/或使用或處理該試劑盒中試劑的說明。通常，該試劑 盒能夠進行定性或定量分析。在某些實施方案中，所述核酸在30°C和低於2M鹽、或45°C和/或500mM鹽、或 55°C和/或150mM鹽的洗滌條件下，與SEQ IDN0 1雜交；或表現與靈長類IL-B30的的同 一性至少約85%和/或所述一段序列至少約30個核苷酸，或表現至少約90%的同一性和 /或所述一段序列至少約55個核苷酸，或表現至少約95%的同一性和/或所述一段序列至 少約75個核苷酸。本發明包括調節細胞或組織培養細胞生理學或發育的方法，該方法包括使所述細 胞與哺乳動物IL-B30的激動劑或拮抗劑接觸。所述方法為其中所述接觸為聯合G-CSG和 /或IL-6的激動劑或拮抗劑的接觸；或所述接觸為與拮抗劑的接觸，所述拮抗劑包括結合 組合物，所述組合物包含特異性結合IL-B30的抗體結合位點。CN 101851286 A說明書4/31 頁
具體實施例方式本文引用的所有參考文獻均通過引用結合到本文中，其程度與具體和單獨地表明 每個單獨的出版物或專利申請通過引用結合到本文中的程度一樣。I. 一般描述本發明提供編碼為細胞因子的各種哺乳動物蛋白的胺基酸序列和DNA序列， 所述細胞因子例如為分泌分子，可以介導免疫細胞或其它細胞之間的信號。參見例如 Paul (1994) Fundamental Immunology (第 3 版)Raven Press, N. Y.。所述全長細胞因子和 片段或拮抗劑可用於表達受體的細胞的生理學調節。對造血細胞，包括例如淋巴細胞，諸如 T細胞、B細胞、天然殺傷(NK)細胞、巨噬細胞、樹突細胞、造血祖細胞等，IL-B30可能具有 或者刺激效應或者抑制效應。所述蛋白也可用作抗原，例如免疫原，用於針對該蛋白上各種 表位(線狀表位和構象表位)產生抗體。從人細胞系中鑑定出編碼IL-B30的cDNA。該分子命名為huIL_B30。也鑑定出相 應於豬序列的相關基因。也描述了來自小鼠的齧齒動物序列。所述人基因編碼約168個胺基酸的小的可溶性細胞因子樣蛋白。所述信號序列可 能為約21個殘基，可能從Met至約Ala。參見表1和SEQ ID N0:1和2。IL-B30表現出長 鏈細胞因子成員特徵性的結構基元。比較例如可得自GenBank的IL_B30、G_CSF和IL-6的 序列。也參見表2。表1編碼靈長類(例如人)IL-B30的核畫1 (SEQ ID NO 1)。翻譯的胺基酸序列為SEQ IDNO 2o
ATGCTGGGGAGCAGAGCTGTAATGCTGCTGTTGCTGCTGCCCTGGACA
48
MetLeuGlySerArgAlaValMetLeuLeuLeuLeuLeuProTrpThr
-21-20-15-10
GCTCAGGGCAGAGCTGTGCCTGGGGGCAGCAGCCCTGCCTGGACTCAG
96
AlaGinGlyArgAlaValProGlyGlySerSerProAlaTrpThrGin
-51510
TGCCAGCAGCTTTCACAGAAGCTCTGCACACTGGCCTGGAGTGCACAT
144
CysGinGinLeuSerGinLysLeuCysThrLeuAlaTrpSerAlaHis
152025
CCACTAGTGGGACACATGGATCTAAGAGAAGAGGGAGATGAAGAGACT
192
ProLeuValGlyHisMetAspLeuArgGluGluGlyAspGluGluThr
303540
ACAAATGATGTTCCCCATATCCAGTGTGGAGATGGCTGTGACCCCCAA
240
ThrAsnAspValProHislieGinCysGlyAspGlyCysAspProGin
455055CN 10851286A說明書
CAGCCTCCAG GCCTTTGTGG CTGTAGCCGC CCGGGTCTTTGCCCATGGAG0085]CAGCAACCCT GAGTCCCTAA0086]齧齒動物，例如小鼠 IL-B30(SEQ ID NO 3 和 4)0087]CGCTTAGAAG TCGGACTACA GAGTTAGACT CAGAACCAAAGGAGGTGGAT AGGGGGTCCA600088]CAGGCCTGGT GCAGATCACA GAGCCAGCCA GATCTGAGAAGCAGGGAACA AG ATG1150089]Met0090]210091]CTGGATTGCAGAGCAGTAATAATGCTATGGCTGTTGCCCTGGGTCACT1630092]LeuAspCysArgAlaVallieMetLeuTrpLeuLeuProTrpValThr0093]-20-15-10-50094]CAGGGCCTGGCTGTGCCTAGGAGTAGCAGTCCTGACTGGGCTCAGTGC2110095]GinGlyLeuAlaValProArgSerSerSerProAspTrpAlaGinCys0096]15100097]CAGCAGCTCTCTCGCAATCTCTGCATCCTAGCCTGGMCGCACATGCA2590098]GinGinLeuSerArgAsnLeuCysMetLeuAlaTrpAsnAlaHisAla0099]1520250100]CCAGCGGGACATATGAATCTACTAAGAGMGAAGAGGATGMGAGACT3070101]ProAlaGlyHisMetAsnLeuLeuArgGluGluGluAspGluGluThr0102]3015400103]AMAATAATGTGCCCCGTATCCAGTGTGMGATGGTTGTGACCCACAA3550104]LysAsnAsnValProArglieGinCysGluAspGlyCysAspProGin0105]455055600106]GGACTCAAGGACMCAGCCAGTTCTGCTTGCAAAGGATCCGCCAAGGT4030107]GlyLeuLysAspAsnSerGinPheCysLeuGinArglieArgGinGly0108]6570750109]CTGGCTTTTTATAAGCACCTGCTTGACTCTGACATCTTCAMGGGGAG4510110]LeuAlaPheTyrLysHisLeuLeuAspSerAspliePheLysGlyGlu0111]8085900112]CCTGCTCTACTCCCTGATAGCCCCATGGAGCAACTTCACACCTCCCTA4990113]ProAlaLeuLeuProAspSerProMetGluGinLeuHisThrSerLeu0114]951001050115]CTAGGACTCAGCCAACTCCTCCAGCCAGAGGATCACCCCCGGGAGACC5470116]LeuGlyLeuSerGinLeuLeuGinProGluAspHisProArgGluThr0117]1101151200118]CMCAGATGcccAGCCTGAGTTCTAGTCAGCAGTGGCAGCGCCCCCTT5950119]GinGinMetProSerLeuSerSerSerGinGinTrpGinArgProLeu0120]1251301351400121]CTCCGTTCCAAGATCCTTCGAAGCCTCCAGGCCTTTTTGGCCATAGCT6430122]LeuArgSerLyslieLeuArgSerLeuGinAlaPheLeuAlalieAla0123]
0124]
0125]
0126]
0127]
0128]
0129]
0130]
0131]
0132]
0133]
0134]
0135]
0136]
0137]
0138]
145150155
GCC CGG GTC TTT GCC CAC GGA GCA GCA ACT CTG ACT GAG CCC TTA GTG Ala Arg Val Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Thr Glu Pro Leu Val
160165170
CCA ACA GCT TAAGGATGCC CAGGTTCCCA TGGCTACCAT GATAAGACTA Pro Thr Ala 175
ATCTATCAGC CCAGACATCT TCGTTTGTTT TGCGTGAAGG GAGCAGGCAG CTGGCTAGAG CCTTGGMGC GGGCAAGCAG CTGTGAGAAA ACCCAGAGCA AMAACAAGA MAGGGGAAC ACAGTACTCC AGACAGCAGC TAGTCACTAA GAACTMCAG
ACCAGTTAAT GCAAGGACAC MAGGAGCTG CTGCGTGGCC TCAGAMAAG ATTATACTTT TCTGTACCTG
TAACCCATTA GGACTTGTGC CATTATTAAA GAGAMAGAA GAGAAGAAGA ATAAAGTCTC TGAGGGGAAG GGGGCGGTGG TGAGCCCAGG CTTTGGCCAT CCTGGGTGGC TCAGGGAAAT CCTGCTCTGT CCCTCAGTTC ACGAACTGAC AAA
TGTTCTTGTT ACAMCCCCA GAGCCCTTGG CATCGAGAM TATCTGTAAG GTGCAGATGC TAACAGAATC
691
740
800 860 920 980 1040 1100 1160 1203
GACTACCAAT
表2 與IL-B30相比的各種IL-6和G-CSF實施方案的比較。人IL-B30為SEQ ID NO 2 ；小鼠 IL-B30 為 SEQ ID NO 4 ；豬 IL-B30 為 SEQ ID NO 5 ；牛 G-CSF 為 SEQ ID NO 6 ；貓 G-CSF 為 SEQ ID NO 7 ；人 G-CSF 為 SEQ ID NO 8 ；小鼠 G-CSF 為 SEQ ID NO 9 ；水獺 IL-6 為 SEQ ID NO 10 ；貓 IL-6 為 SEQ ID NO 11 ；人 IL-6 為 SEQ ID NO 12 ；綿羊 IL-6 為 SEQ ID NO 13 ；小鼠 IL-6 為 SEQ ID NO 14 ；雞 MGF 為 SEQ ID NO :15 ；而 KSHV (卡波西肉瘤 皰疹病毒)的病毒IL-6為SEQ ID NO :16。
0139]
0140]
0141]
0142]
0143]
0144]
0145]
0146]
0147]
0148]
0149]
0150]
0151]
0152]
0153]
0154]
0155]
0156]
鼠豬 鼠獺 羊鼠 - 鼠豬 人小 -牛貓人小水貓人綿小雞khl人小 -牛 - -3 ---------- 6 - - 3 |
ool— ffff66666f_—lool— f
33 i s s s SI—ii—ii—ii—ii—I s i 3 3 i s ,—I ,—I c c c c i i i i im:,—I ,—I c
1 i s s s s i i s
VPGG SSPVWTQCQQ LSQKLCT. LA WSAHPLVG. VPRS SSPDWAQCQQ LSRNLCM. LA WNAHAPAG.
TPLG
TPLG
TPLG VPLVTVSALP
AFPTPGPLG AFPTPGPLG AFPAPVPPG AFPTPGPLG AFPTSQVRR
HMD. LREEG HMNLLREEE
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GDSKDDATSN G. DATSN EDSKDVAAPH EDFKNDTTPS GDFTEDTTPN .APLAELS⑶
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DEETTNDVPH DEETKNNVPR
SLPQSFLLKC SLPQSFLLKC SLPQSFLLKC PLPRSFLLKS RPPLTSADKM RLPLTPADKM RQPLTSSERI RLLLTTPEKT R. PVYTTSQV HDFQLFLHKN KLPDAPEFEK I. . . QCGDGC I. . . QCEDGC
LEQVRKIQAD LEQVRKVQAD LEQVRKIQGD LEQVRKIQAS EDFIKFILGK EELIKYILGK DKQIRYILDG EALIKHIVDK GGLITHVLWE LEFTRKIRGD DLLIQRINWM DPQGLRDNSQ DPQGLKDNSQ
CAA. HKLCH PEELMLLRHS LGIP. QAPLS SCSSQSLQLR
GAELQERL. GTALQERL. GAALQEKLVS GSVLLEQL. ISALRNEM.. ISALKKEM.. ISALRKET. ISAIRKEI.. IVEMRKEL. VAALQRAV.. LWVIDECFRD FCLQRIHQGL FCLQRIRQGL SCLQRIHQGL GCLNQLHGGL0157]gcsf_貓.CAA. HKLCHPEELVLLGHALGIP. QAPLSSCSSQALQLTGCLRQLHSGL0158]gcsf_人ECAT. YKLCHPEELVLLGHSLGIP. WAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGL0159]gcsf_小鼠.CAT. YKLCHPEELVLLGHSLGIP. KASLSGCSSQALQQTQCLSQLHSGL0160]il6_水獺 CDK. YNKCEDSKEVLAENNLNLPKLAEKDRCFQSRFNQETCLTRITTGL0161]il6_貓 CDN. YNKCEDSKEALAENNLNLPKLAEKDGCFQSGFNQETCLTRITTGL0162]il6_人 CNK. SNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCLVKIITGL0163]il6_綿羊 CEK. NDECENSKETLAENKLKLPKMEEKDGCFQSGFNQAICLIKTTAGL0164]il6_小鼠 CNG. NSDCMNNDDALAENNLKLPEIQRNDGCYQTGYNQEICLLKISSGL0165]mgf_雞 CDT. FQLCTEEELQLVQPDPHLV. QAPLDQCHKRGFQAEVCFTQIRAGL0166]il6_khsvLCYR. TGICKGILEPAAIFHLKLPAINDTDHCGLIGFNETSCLKKLADGF0167]il30_人IFYEKLLGSDIFTGE..... PSLLPDSPVAQLHASLLGLSQLLQPE. G0168]il30_小鼠AFYKHLLDSDIFKGE..... PALLPDSPMEQLHTSLLGLSQLLQPE. D0169]土130_豬VFYEKLLGSDIFTGE..... PSLHPDGSVGQLHASLLGLRQLLQPE. G0170]gcsf_牛FLYQGLLQALAGIS.......PELAPTLDTLQLDVTDFATNIWLQMEDLG0171]gcsf_貓FLYQGLLQALAGIS.......PELAPTLDMLQLDITDFAINIWQQMEDVG0172]gcsf_人FLYQGLLQALEGIS...... PELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELG0173]gcsf_小鼠CLYQGLLQALSGIS.......PALAPTLDLLQLDVANFATTIWQQMENLG0174]il6_水獺QEFQIHLKYLESNYEG. NKDNAHSVYISTKHLLQTLRPM. NQIEVTT0175]il6_貓QEFQIYLKFLQDKYEG. . . DKENAKSVYTSTNVLLQMLKRKGKNQDEVTI0176]il6_人LEFEVYLEYLQNRFES. . . SEEQARAVQMSTKVLIQFLQKKAKNLDAITT0177]il6_綿羊LEYQIYLDFLQNEFEG. NQETVMELQSSIRTLIQILKEKIAGL.…I0178]il6_小鼠LEYHSYLEYKKNNLKDN. KKDKARVLQRDTETLIHIFNQEVKDLHKIVL0179]mgf_雞HAYHDSLGAVLRLLP.....NHTTLVETLQLDAANLSSNIQQQMEDLG0180]il6_khsvFEFEVLFKFLTTEFGKSVINVDVMELLTKTLGWDIQEELNKLTKTHY. S0181]表2(接上頁)0182]il30_人HHWETQQIP. SLSPSQ. PWQRLLLRFKILRSLQAFVAVAARVFAHGAA0183]il30_小鼠HPRETQQMP. SLSSSQ. QWQRPLLRSKILRSLQAFLAIAARVFAHGAA0184]土130_豬HHWETEQTP..SPSPSQ. . PWQRLLLRLKILRSLQAFVAVAARVFAHGAA0185]gcsf_牛AAPAVQPTQ..GAMPTFTSAFQRRAGGVLVASQLHRFLELAYRGLRYLAE0186]gcsf_貓MAPAVPPTQ. GTMPTFTSAFQRRAGGTLVASNLQSFLEVAYRALRHFTK0187]gcsf_人MAPALQPTQ..GAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQ0188]gcsf_小鼠VAPTVQPTQ..SAMPAFTSAFQRRAGGVLAISYLQGFLETARLALHHLA.0189]il6_水獺PDPTTDASL. QALFKSQDKWLKHTTIHLILRRLEDFLQFSLRAIRIM. 0190]il6_貓PVPTVEVGL. QLSCSHR. RVAEAHNNHLTLRRLEDFLQLRLRAVRIM. 0191]il6_人PDPTTNASL. LTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQM..0192]il6_綿羊TTPATHTDM. LEKMQSSNEWVKNAKVIIILRSLENFLQFSLRAIRMK..0193]il6_小鼠PTPISNALL. TDKLESQKEWLRTKTIQFILKSLEEFLKVTLRSTRQT. 0194]mgf_雞LDTVTLPAEQRSPPPTFSGPFQQQVGGFFILANFQRFLETAYRALRHLAR0195]il6_khsvP. PKFDRG. LLGRLQGLKYWVRHFASFYVLSAMEKFAGQAVRVLDSIPD
士130_人 TLSP....士130_小鼠 TLTEPLVPTA士130_豬 TLSQ....gcsf_ 41 P.......gcsf_ 貓 P.......gcsf_ A P.......gcsf_ 小鼠........il6_ 水獺........土16_貓 ........il6_ A ........il6_ 綿羊........il6_ 小鼠........mgf_ 雞 L.......il6_khsv VTPDVHDKIL-B30與相關細胞因子蛋白的結構同源性提示該分子相關的功能。IL-B30是一 種表現出與IL-6和G-CSF序列相似性的長鏈細胞因子。IL-B30的激動劑或拮抗劑也可以起功能拮抗劑或受體拮抗劑的作用，例如，它們 阻斷IL-6或G-CSF與其相應受體的結合，或阻斷IL-6或G-CSF介導相反的作用。因此， IL-B30或其拮抗劑可以用於治療異常的醫學病症，包括免疫失調，例如T細胞免疫缺陷、慢 性炎症或組織排斥，或心血管病症或神經生理學病症。所述天然抗原能夠介導導致靶細胞中生物學反應或生理學反應的各種生化反應。 本文特徵鑑定的優選實施方案來自人類，但實際上存在其它靈長類或其它物種的天然相應 物。例如靈長類、犬科動物、貓科動物和齧齒動物的其它哺乳動物物種中蛋白的其它序列也 可以利用。參見下文。下文的說明的典型目的是涉及人IL-B30，但同樣可應用於來自其它 物種的相關實施方案。II.純化的 IL-B30人IL-B30的胺基酸序列作為一個實施方案示於SEQ ID NO :2中。採用所提供的 序列，可以用例如PCR技術或雜交的標準方法，分離其它天然存在的編碼該蛋白的核酸。在 提供所述細胞因子的序列信息以便於鑑別該蛋白抗原與其它蛋白並例舉多種變異體方面， 這些從氨基至羧基提供的胺基酸序列是重要的。此外，所述肽序列使得可以製備肽，以產生 識別這類區段的抗體，核苷酸序列使得可以製備寡核苷酸探針，這兩種都是檢測或分離例 如克隆編碼這種序列的基因的策略。當用於蛋白質方面時，本文所用的術語「人可溶性IL-B30」將包括其胺基酸序列相 應於SEQ ID NO :2中所示可溶性多肽的蛋白質、或其有效片段(significant fragment)。 優選實施方案包括限定長度的大量不同的(例如非重疊)區段。通常，大多數為至少2個、 更通常為至少3個、優選至少5個、7個或更多個胺基酸。儘管提供了最小的長度，但更長的 各種大小的長度可以也是合適的，例如一個7個胺基酸長度的區段和兩個12個胺基酸長度 的區段。例如抗體的結合組分通常以高親和性結合於IL-B30，所述高親和性例如至少約lOOnM，通常優於約30nM，優選優於約lOnM，更優選優於約3nM。在非人類的哺乳動物物種 (例如其它靈長類、有蹄類動物或齧齒動物)中會發現相應蛋白(counterpart protein) 0 例如鳥類或兩棲類的非哺乳動物物種也應該具有結構上或功能上相關的基因和蛋白。本文所用的術語「多肽」包括有效片段或區段，包括一段至少約8個胺基酸的氨基 酸殘基，一般至少約12個胺基酸，通常至少約16個胺基酸，優選至少約20個胺基酸，在特 別優選的實施方案中，為至少約30個或30個以上的胺基酸，例如35、40、45、50個胺基酸 等。在所有實際的組合中，這類片段可以具有實際上在所有位置開始和/或結束的末端，例 如於殘基1、2、3等開始，和於例如殘基150、149、148等結束。特別感興趣的肽具有相應於 結構域邊界的末端，例如螺旋A、B、C和/或D。參見表1。術語「結合組合物」是例如在抗體_抗原相互作用中特異性地與IL-B30結合的分 子。特異性的範圍可以更寬或更窄，例如對特定實施方案特異性，或對數組相關實施方案特 異性，例如對靈長類、齧齒動物特異性等。它也包括例如蛋白質的化合物，所述化合物特異 性地與IL-B30結合，包括在天然的生理學相關蛋白-蛋白相互作用中或者共價結合或者非 共價結合。所述分子可以是聚合物或化學試劑。功能類似物可以是具有結構修飾的蛋白質， 或它可以是具有與所述合適結合決定簇相互作用的分子形狀的分子。所述化合物可以用作 受體結合相互作用的激動劑或拮抗劑，參見例如Goodman等(編輯)Goodman &Gilman，s The ParmacoloRical Bases of Therapeutics (當前版)PergamonPress。例如在蛋白質方面，大致純通常是指該蛋白沒有其它汙染蛋白、核酸或由所述原 始來源生物衍生的其它生物物質。可以用標準方法，通常通過重量分析純度，純度通常為至 少約40 %，一般至少約50 %，常常至少約60 %，通常至少約80 %，優選至少約90 %，在最優 選實施方案中，純度至少約95 %，通常加入載體或賦形劑。多肽或片段的溶解性取決於環境和所述多肽。許多參數影響多肽的溶解性，包括 溫度、電解質環境、所述多肽的大小和分子特徵以及所述溶劑的性質。通常，使用所述多肽 的溫度範圍為約4°C至約65°C。使用時的溫度常常高於約18°C。對於診斷目的，所述溫度 通常約為室溫或更高的溫度，但低於該測定中組分的變性溫度。對於治療目的，所述溫度常 常為體溫，對於人和小鼠而言通常為約37°C，儘管在某些情況下，在原位或體外下所述溫度 可以升高或降低。所述多肽的大小和結構應該一般為大致穩定狀態，通常不是變性狀態。在四級結 構中所述多肽可以與其它多肽結合，例如以賦予溶解性，或與脂質或去汙劑結合。所述溶劑和電解質通常為用於保存生物活性的類型的生物相容的緩衝液，通常接 近生理水性溶劑。所述溶劑常常具有中性pH，通常為約5和10之間，最好為約7. 5。在某 些情況下，加入一種或多種去汙劑，通常為溫和的非變性去汙劑，例如CHS(膽固醇半檸檬 酸酯(cholesteryl hemisuccinate))或 CHAPS (3_[3_ 膽醯氨基丙基)二甲氨基]丙烷 石黃酸酉旨(3-[3_cholamidoprophyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate))，或去汙劑的 濃度足夠低，以避免顯著破壞所述蛋白的結構或生理特性。在其它情況下，可以使用強去汙 劑實現顯著變性。III.天然變異體本發明也包括與所述IL-B30抗原的胺基酸序列具有大致胺基酸序列同一性的蛋 白或肽。所述變異體包括物種變異體、多態或等位基因變異體。
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通過使殘基匹配最優化，必要時，根據需要引入間隙，確定胺基酸序列的同源性或 序列同一'性。也參見 Needleham 等(1970) T. Mol. Biol. 48 443-453 ；Sankoff 等，(1983) Time ffarps,StrinR Edits,andMacromolecules :The Theory and Practice of Sequence Comparsion 的第 1 章,Addison-Wesley, Reading,MA ；禾口 IntelliGenetics (Mountain View, CA)的軟體包；禾口 the University of Wisconsin Genetics Computer Group (Madison, WI) 的軟體包。當將保守取代考慮為匹配時，序列同一性會有變化。保守取代通常包括以下組 內的取代甘氨酸、丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、穀氨酸；天冬醯胺、穀氨 醯胺；絲氨酸、蘇氨酸；賴氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。保守性可以應用於生物學特 徵、功能特徵或結構特徵。同源的胺基酸序列通常計劃包括蛋白質序列中的天然多態或等 位基因變異和種間變異。典型的同源蛋白或肽與所述IL-B30的胺基酸序列的同一性將從 25-100% (如果可以引入間隙)至50-100% (如果包括保守取代)。同一性測量結果將至 少為大約35 %，一般至少為大約40 %，常常至少為大約50 %，典型的至少為大約60 %，通常 至少為大約70%，優選至少為大約80%，而更優選至少為大約90%。通過核苷酸置換、核苷酸缺失、核苷酸插入和短的核苷酸序列倒位，可以容易地修 飾分離的IL-B30 DNA。這些修飾產生編碼這些抗原、其衍生物或具有相似生理、免疫原性、 抗原性或其它功能活性的蛋白質的新的DNA序列。這些修飾的序列可以用來產生突變抗 原，或增強表達。增強的表達可以包括基因擴增、轉錄增加、翻譯增加和其它機制。「突變 IL-B30」包括這樣的多肽，它們在其它方面屬於以上提出的IL-B30的序列同一性定義內， 但其胺基酸序列無論由於缺失、置換，還是由於插入，均不同於自然界中發現的IL-B30的 胺基酸序列。這通常包括與具有SEQ ID NO :2序列的蛋白質具有顯著同一性、並且與那些 序列享有不同的生物活性(例如抗原性或免疫原性)的蛋白，在優選實施方案中，包含天 然的全長所公開的序列的大部分。通常最好使用全長序列，儘管也可以使用截短的變體，同 樣，通常最需要從天然來源發現的基因或蛋白。相似的概念適用於不同的IL-B30蛋白，特 別是在各種溫血動物(例如哺乳動物和鳥類)中發現的那些IL-B30蛋白。這些描述一般 是指包括所有的IL-B30蛋白，但不限於具體討論的特定的靈長類實施方案。也可以通過製備胺基酸插入或缺失，進行IL-B30誘變。可以產生置換、缺失、插入 或任何組合，以得到最終的構成物。插入包括氨基或羧基末端融合。可以於靶密碼子進行 隨機誘變，然後對所表達的突變體篩選所需活性。於序列已知的DNA預定位點製備置換突 變的方法是本領域眾所周知，例如通過M13引物誘變或聚合酶鏈式反應(PCR)技術。參見 例如 Sambrook 等(1989) ；Ausubel 等(1987 和增補本)；和 Kunkel 等(1987)Methods in Enzymol. 154 :367_382。優選實施方案包括例如1重、2重、3重、5重、7重置換等，最好於核 苷酸水平或胺基酸水平的保守置換。所述置換最好遠離保守的半胱氨酸，通常在遠離螺旋 結構域的區域中。這種變異體可以用來產生特異性抗體，通常享有許多或所有生物學特性。本發明也提供重組蛋白，例如採用這些蛋白區段的異源融合蛋白。異源融合蛋白 是天然情況下通常不以同一方式融合的蛋白或區段的融合體。相似的概念適用於異源核酸 序列。另外，可以組合源自其它蛋白的相似的功能域而製備新的構成物。例如，靶結合 區段或其它區段可以在不同的新融合多肽或片段之間「交換」。參見例如Cunningham等 (1989)Science 243 1330-1336 ；和 0，Dowd 等(1988)J. Biol. Chem. 263 15985-15992。
由 Beaucage 和 Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22 1895-1862 描述的亞磷醯胺法 將產生合適的合成DNA片段。或者通過合成互補鏈並使所述鏈在合適的條件下相互退火， 或者通過用DNA聚合酶與合適的引物序列，加入互補鏈(例如PCR技術)，通常可獲得雙鏈 片段。在對細胞因子IL-6家族的比較中，可以對該基因應用結構分析。該家族包括例 如 IL-6、IL-11、IL-12、G-CSF、LIF、OSM、CNTF 和 Ob。人、豬和小鼠 IL-B30 序列與 IL-6 家 族其它成員的序列對比應該使得能夠定義結構特性。特別是，可以用例如RASM0L程序確定 3 -摺疊和 a -螺旋殘基，參見 Bazan 等(1996) Nature 379 591 ；Lodi 等(1994) Science 263 1762-1766 :Sayle 和Milner~ffhite (1995) TIBS 20 :374_376 ；和 Gronenberg 等(1991) Protein Engineering 263-269。用於置換的優選殘基包括預期與受體相互作用的表面暴 露的殘基。應該保留功能的其它殘基將進行保守置換，特別是對於遠離表面暴露殘基的位 置。IV.功能變異體由於競爭性抑制所述配體與其受體的結合，可以導致阻斷對IL-B30的生理反應。本發明的體外測定通常使用分離的蛋白、包含這些蛋白受體結合區段的可溶性片 段、或連接至固相基質的片段。這些測定也將使得可以對或者結合區段突變和修飾、或者細 胞因子突變和修飾(例如IL-B30類似物)的效應進行診斷測定。本發明也設想使用競爭性藥物篩選測定，例如其中抗所述細胞因子抗體或受體結 合片段與測試化合物競爭。IL-B30抗原的「衍生物」包括天然存在形式的胺基酸序列突變體、糖基化變異體、 與其它化學部分的共價或聚集綴合物。例如通過採用標準方法將官能團(functionality) 交聯至IL-B30胺基酸側鏈或於N末端或C末端發現的基團上，可以製備共價衍生物。參見 例如 Lundblad 禾口 Noyes (1988) Chemical ReaRents for Protein Modification,第 1_2 卷， CRC Press, Inc. , Boca Raton, FL ；Hugli (1989 編輯)Techniques in ProteinChemistry, Academic Press, San Diego, CA ；禾口 Wong(1991)Chemistryof Protein Con jugation and Cross Linking, CRC Press, Boca Raton, FL。具體地說，糖基化改變包括例如通過在多肽合成和加工期間、或在進一步加 工步驟中修飾多肽糖基化模式製備的糖基化改變。參見例如E1 bein (1987) Ann, Rev, Biochem. 56 :497_534。也包括具有相同一級胺基酸序列、具有其它微小修飾的肽變異體，所 述微小修飾包括磷酸化胺基酸殘基，例如磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸。也提供IL-B30和其它同源或異源蛋白之間的融合多肽。許多細胞因子受體或其 它表面蛋白是多體的，例如同二體實體，重複構成物可能具有各種優點，包括減輕對蛋白水 解切割的敏感性。典型的實例是受體多肽(例如螢光素酶)與蛋白區段或結構域(例如受 體結合區段)的融合體，使得可以容易地確定所述融合配體的存在或位置。參見例如Dull 等的美國專利第4，859，609號。其它基因融合伴侶包括細菌半乳糖苷酶、trpE、蛋白A、 B-內醯胺酶、a澱粉酶、乙醇脫氫酶、酵母a交配因子和檢測或純化標記，諸如His6序列 的 FLAG 序列。參見例如 Godowski 等(1988) Science 241 :812_816。融合肽通常通過或者重組核酸法或通過合成多肽法製備。用於核酸操作和表達 的技術一般描述於例如 Sambrook 等(1989)MolecularCloninR :A Laboratory Manual (第2 版)，第 1-3 卷，Cold Spring HarborLaboratory ；和 Ausubel 等(1993 編輯)Current Protocols in MolecularBiology, Greene and Wiley，NY。用於多肽合成的技術描述 於 Merrifield(1963) T. Amer. Chem. Soc. 85 2149~2156 ；Merrifield (1986) Science 232 341-347 ；Atherton等(1989) Solid Phase Peptide Synthesis :A PracticalApproach, IRL Press, Oxford ；禾口 Grant (1992) Synthetic Peptides :AUser』 s Guide, ff. H. Freeman, NY。 可以將重摺疊方法應用於合成蛋白。本發明也設想使用非胺基酸序列改變或糖基化改變的IL-B30衍生物。這類衍生 物可以包括與化學部分或蛋白載體的共價或聚集綴合物。共價或聚集衍生物可用作免疫 原、免疫測定中的試劑，或用於諸如親和純化結合伴侶(例如其它抗原)的純化方法中。通 過用本領域熟知的方法將IL-B30共價結合於諸如溴化氰活化的SEPHAR0SE的固相支持 體，或通過或不通過戊二醛交聯吸附至聚烯烴表面上，可以將IL-B30固定化，以用於純化 抗IL-B30抗體或替代結合組合物的測定或純化。所述IL-B30蛋白也可以用可檢測基團標 記，例如用於診斷測定。通過固定化抗體或互補結合伴侶，例如受體的結合部分，可以實現 IL-B30的純化。本發明的溶解的IL-B30或片段可以用作免疫原，用於產生抗血清或結合特異性 抗體。純化的抗原可以用來篩選單克隆抗體或抗原結合片段，包括天然抗體的抗原結合片 段，例如Fab、Fab，、F(ab)2等。純化的IL-B30抗原也可以用作試劑，以檢測對存在水平提 高的所述細胞因子應答而產生的抗體，所述細胞因子可以是異常或特定的生理學病症或疾 病病症是診斷指標(diagnostic)。本發明考慮了針對SEQ IDN0 1所示核苷酸序列編碼的 胺基酸序列而產生的抗體。特別是，本發明考慮了對特定結構域(例如螺旋A、B、C或D)具 有結合親和性的抗體或針對特定結構域產生的抗體。本發明考慮了另外的密切相關物種變異體的分離。DNA印跡分析和RNA印跡分析 將確立相似的遺傳實體存在於其它哺乳動物中。可能IL-B30廣布於物種變異體中，其中所 述物種例如為齧齒動物、兔形目動物、食肉動物、偶蹄類、奇蹄類和靈長類。本發明也提供分離一組相關抗原的方法，其中所述相關抗體在結果、表達和功能 方面表現出不同和相似性。所述分子的另外不同物種或多態變異體的分離，將大大促進所 述分子生理效應的闡明。特別是，本發明提供用於鑑別不同物種中另外的同源遺傳實體的 有用探針。所述分離的基因將使得可以轉化缺乏IL-B30表達的細胞，例如缺乏相應蛋白並 表現出陰性背景活性的或者物種類型或者細胞。這應該使得可以與未轉化對照細胞相比分 析IL-B30的功能。採用現代分子生物學標準技術，特別是比較相關類別的成員時，解剖影響通過這 些抗原介導的各種生理功能的關鍵結果元件是可能的。參見例如在Cunningham等(1989) Science 243 1339-1336中描述的同系物掃描誘變技術；和0，Dowd等(1988) J. Biol. Chem. 263 15985-15992 和 Lechleiter 等(1990)EMBO J. 9 4381-4390 中所用的方法。胞內功能可以涉及受體發送信號。然而，蛋白內化可以發生在某些情況下，可能發 生胞內組分和細胞因子之間的相互作用。通過誘變或直接生化方法(例如交聯或親和法)， 可以鑑別IL-B30與互作組分相互作用的特定區段。也可應用採用晶體學方法或其它物理 方法的結構分析。信號轉導機制的進一步研究，將包括可以通過親和法或遺傳方法(例如互補分析突變體)分離的結合組分的研究。我們將繼續IL-B30表達和控制的進一步研究。與抗原結合的控制元件應該表現 出不同的生理、發育、組織特異性或其它表達模式。對例如控制元件的遺傳區上遊或下遊很 感興趣。所述IL-B30抗原的結構研究將導致設計新的抗原，特別是對該分子表現出激動 劑或拮抗劑特性的類似物。這可以與先前描述的篩選方法結合，以分離表現出所需活性範 圍的抗原。V.抗體可以產生針對其天然存在形式和為其重組形式的所述IL-B30蛋白不同表位的抗 體，包括物種、多態或等位基因變異體和它們的片段。另外，可以針對或者活性形式或者無 活性形式的IL-B30產生抗體，所述IL-B30包括天然或變性形式。也考慮了抗獨特型抗體。通過用所述抗原預定片段與免疫原性蛋白的綴合物免疫動物，可以產生針對所述 片段的抗體，包括結合片段和單鏈形式的抗體。從分泌所需抗體的細胞製備單克隆抗體。這 些抗體可以根據與正常或缺陷的IL-B30的結合進行篩選，或根據例如通過受體介導的激 動劑或拮抗劑活性進行篩選。例如由於抗體立體阻斷與受體的結合，抗體可以是激動劑或 拮抗劑。這些單克隆抗體通常以至少約ImM的Kd結合，其結合Kd更通常至少約300 y M，典 型的至少約100 u M，更典型至少約30 u M，優選至少約10 u M，更優選至少約3 y M或更好。本發明的抗體也可用於診斷應用。作為捕獲抗體或非中和抗體，可以篩選其結 合所述抗原的能力，而不抑制與受體的結合。作為中和抗體，它們可以用於競爭性結合測 定。它們也可用於檢測或定量測定IL-B30蛋白或其受體。參見例如Chan(1987編輯) Immunology :APractical Guide, Academic Press, Orlando, FL ；Price 禾口 Newman(1991編
) Priciples and Practice of Immunoassay, Stockton Press, N. Y.；禾口 Ngo (1988 編輯) Nonisotopic Immunoassay, Plenum Press, N. Y.。交叉吸收或其它試驗將鑑別表現出不同 特異性範圍(例如特有的或共享的物種特異性)的抗體。此外，包括抗原結合片段的本發明抗體可能是有效的拮抗劑，它們結合於抗原，並 抑制與可能引發生物學反應的受體的功能結合。它們也可以用作非中和抗體，可以偶聯至 毒素或放射性核素，使得當所述抗體結合於抗原時，將殺傷例如在其表面表達該抗體的細 胞。此外，這些抗體可以或者直接或者藉助接頭間接綴合於藥物或其它治療劑，可以實現藥 物導向。抗原片段可以連接至其它物質上，特別是連接至多肽，作為待用作免疫原的融合 或共價連接多肽。抗原及其片段可以融合或共價連接至多種免疫原，諸如匙孔蜮血藍蛋白、 牛血清白蛋白、破傷風類毒素等。關於製備多克隆抗體的方法的描述，參見Microbiology， HoeberMedical Division, Harper 禾口 Row，1969 ；Landsteiner (1962)Specificity ofSerological Reactions，Dover Publications，New York ；Williams ^ (1967)Methods in Immunology and Immunochemistry，第 1 卷，Academic Press, New York ；禾口 Harlow 禾口 Lane(1988)Antibodies :A Laboratory Manual，CSH Press，NY。在某些情況下，最好從各種哺乳動物宿主製備單克隆抗體，所述哺乳動物宿主 諸如小鼠、齧齒動物、靈長類、人類等。在例如Stites等(編輯)Basic and Clinicl ImmunoloRY,(第 4版)，Lange MedicalPublications, Los Altos, CA 禾口其中弓 | 用的參考文獻:Harlow禾口 Lane (1988) Antibodies :A Laboratory Manual, CSH Press ；Goding(1986) Monoclonal Antibodies Principles and Practice(第2版)，Academic Press,New York 中和特別是在Kohler和Milstein (1975)Nature 256 :495_497中(該文獻討論了產生單 克隆抗體的一種方法)，可以找到製備這類單克隆抗體的技術的描述。其它合適的技術涉及將淋巴細胞體外暴露於抗原多肽，或者暴露於噬菌體或相似 載體中抗體文庫的選擇。參見Huse等(1989)「在噬菌體\中產生免疫球蛋白所有組成組分 的大聯合文庫」,Science246 :1275_1281 ；和 Ward等(1989) Nature 341 :544_456。本發明的 多肽和抗體可以修飾或不修飾而使用，包括嵌合抗體或人源化抗體。通常通過或者共價或 者非共價連接提供可檢測信號的物質，標記所述多肽或抗體。種類繁多的標記和綴合技術 是已知的，並且在科學文獻和專利文獻中進行了廣泛的報導。合適的標記包括放射性核素、 酶、底物、輔因子、抑制劑、螢光部分、化學發光部分、磁性顆粒等。指出這類標記用途的專利 包括美國專利第 3，817，837 ；3，850，752 ；3，939，350 ；3，996，345 ；4，227，437 ；4，275，149 ； 和4，366，241號。也可以產生重組免疫球蛋白，參見Cabilly的美國專利第4，816，567號； Moore 等的美國專利第 4，642，334 號；和 Queen 等(1989)Proc. Nat』 1 Acad. Sci. USA86 10029-10033。本發明的抗體也可以用於分離所述蛋白的親和層析。當將所述抗體連接至固相支 持體時，可以製備柱子。參見例如Wilchek等(1984)Meth. Enzymol. 104 :3_55。針對每種IL-B30產生的抗體也可以用來產生抗獨特型抗體。這些抗體可用於檢 測或診斷與所述相應抗原表達相關的各種免疫學病症。VI.核酸所述肽序列和相關試劑可用於例如從天然來源檢測、分離或鑑別編碼IL-B30的 DNA克隆。通常，這可用於從哺乳動物分離基因，相似的方法將用於分離來自其它物種的基 因，所述其它物種例如溫血動物，諸如鳥類和哺乳動物。交叉雜交將使得可以從相同的例如 多肽變異體或其它物種分離IL-B30。許多不同方法可用來成功地分離合適的核酸克隆。純化的蛋白或特定肽可用於通過標準方法產生抗體，如上所述。可以將合成 肽或純化蛋白提呈給免疫系統，以產生單克隆或多克隆抗體。參見例如Coligan(1991) Current Protocols in ImmunoloRyffiley/Greene ；禾口 Harlow 禾口 Lane(1989)Antibodies :A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Press。例如，所述特異性結合組合物可以用來篩選由表達IL-B30的細胞系製備的表達 文庫。可以通過各種染色或免疫螢光方法，進行胞內表達的篩選。結合組合物可以用來親 和純化或分選出表達表面融合蛋白的細胞。所述肽區段也可以用來預測合適的寡核苷酸，以篩選文庫。可以用所述遺傳密碼 篩選可用作篩選探針的合適的寡核苷酸。參見例如SEQ ID NO :1。與聚合酶鏈式反應(PCR) 技術結合，合成寡核苷酸將可用於從文庫選擇正確的克隆。互補序列也可以用作探針、引物 或反義鏈。例如與錨定載體或poly-A互補PCR技術或與其它肽的互補DNA偶聯的各種片 段應該是特別有用的。本發明考慮了使用分離的DNA或片段，以編碼相應的生物活性IL-B30多肽，特別 是缺乏編碼所述序列非翻譯5』部分的部分。另外，本發明包括編碼生物活性蛋白或多肽、 並且能夠在合適條件下與本文所述DNA序列雜交的分離或重組DNA。所述生物活性蛋白或
18多肽可以是完整的抗原或片段，具有公開於例如SEQ ID NO :2的胺基酸序列，特別是成熟的 分泌多肽。此外，本發明包括其編碼的蛋白表現出與分泌IL-B30具有高度同一性的分離的 或重組的DNA或其片段的應用。所述分離的DNA可以在5』側翼和3』側翼具有相應的調節 序列，例如啟動子、增強子、poly-A添加信號和其它序列。或者，通過將編碼區段操作性連 接至異源啟動子，例如通過將啟動子插入內源基因上遊，可以實現表達。「分離的」核酸是與天然天然序列伴隨的其它組分(例如核糖體、聚合酶/或來自 起源生物的側翼基因組序列)大致分離的核酸，例如RNA、DNA或混合聚合物。該術語包括 已經從其天然存在的環境中取出的核酸序列，包括重組的或克隆的DNA分離物和化學合成 的類似物或通過異源系統生物合成的類似物。大致純的分子包括分離形式的所述分子。一 般而言，所述核酸位於小於約50kb的載體或片段中，所述載體或片段常常小於約30kb，通 常小於約10kb，最好小於約6kb。分離的核酸一般是分子的同種組合物，但在某些實施方案中，將含有少量異質性。 這種異質性通常發現於所述聚合物末端或對於所需生物功能或活性不重要的部分。「重組的」核酸根據或者其生產方法或者其結構定義。對於其生產方法，例如用 使用重組核酸技術的方法生產的產物，所述重組技術例如涉及在所述核苷酸序列中人的幹 涉，通常為選擇或生產。或者，它可以是用以下方法製備的核酸產生包含天然相互不相鄰 的兩種片段的融合體的序列，但是指排除天然產物，例如天然存在的突變體。因此，例如，包 括用任何非天然存在的載體轉化細胞而製備的產物，也包括包含用任何合成寡核苷酸方法 所衍生序列的核酸。通常進行這樣一種方法，以用編碼同一種胺基酸或保守的胺基酸的豐 餘密碼子取代一個密碼子，同時通常引入或去除一個序列識別位點。或者，進行該方法，以將所需功能的核酸區段連接在一起，以產生包括所需功能組 合的單一的遺傳實體，其中所述功能組合是未在通常可得到的天然形式中發現的組合。限 制性酶的識別位點常常是這類人工操作的靶，但可以通過設計，加入其它位點特異性靶，例 如啟動子、DNA複製位點、調節序列、控制序列或其它有用的特徵。相似的概念將用於重組 (例如融合)多肽。具體包括合成的核酸，它由於遺傳密碼的豐餘性而編碼與這些抗原片 段相似的多肽；和來自各種不同物種或多肽變異體的序列的融合體。在核酸方面，有效「片段」是一連續的區段，它至少為大約17個核苷酸，一般至少 為約22個核苷酸，常常至少為約29個核苷酸，更通常至少約35個核苷酸，典型至少為約41 個核苷酸，通常至少為約47個核苷酸，更優選至少為約55個核苷酸，在特別優選的實施方 案中，將至少為約60個或更多個核苷酸，例如67、73、81、89、95個等。編碼IL-B30蛋白的核酸將特別用來鑑定編碼相關或相似蛋白的基因、mRNA和 cDNA種類，以及鑑定編碼來自不同物種的同源蛋白的DNA。在其它物種中有同系物，所述其 它物種包括靈長類、齧齒動物、犬科動物、貓科動物和鳥類。各種IL-B30蛋白應該是同源 的，包括於本文中。然而，如果這些序列的同源性足夠大，則在合適條件下採用這些序列，甚 至可以容易地分離與所述抗原進化關係更遙遠的蛋白。對靈長類IL-B30蛋白特別感興趣。得自基因組序列(例如含有內含子)的重組克隆，將可用於轉基因研究，包 括例如轉基因細胞和生物，也可以用於基因治療。參見例如Goodnow(1992) 「轉基因 動物」，Roitt (編輯)Encyclopedia of Immunology, Academic Press, San Diego,第 1502-1504 頁;Travis (1992)Science 256 1392-1394 ；Kuhn 等(1991)Science 254
19707-710 ；Capecchi (1989) Science 244 1288 ；Robertson (1987)(編輯)Teratocarcinomas andEmbryonic Stem Cells :A Practical Approach, IRL Press, Oxford ； 禾口 Rosenberg(1992) T. Clinical Oncology 10:180-199。在核酸序列比較方面，大致同源性例如同一性是指當對比時，或者所述區段或者 其互補鏈，在插入或缺失合適的核苷酸進行最佳對比時，至少大約50%的核苷酸相同，相同 的核苷酸一般至少為約58 %，經常至少為約65 %，常常至少為約71 %，典型至少為約77 %， 通常至少為大約85%，優選至少為大約95%至98%或更多，而在特定實施方案中，高達大 約99%或更多的核苷酸相同。另一方面，當所述區段在選擇性雜交條件下與一條鏈或其 互補鏈雜交時，存在著大致同源性，一般使用IL-B30的序列，例如SEQ ID NO 1中的序列。 通常，當在一段至少大約30個核苷酸的序列中有至少大約55%同一性時，將發生選擇性雜 交，優選在約25個核苷酸的序列中同一性至少為大約75 %，最優選在約20個核苷酸中同一 件至少為大約90%。參見Kanehisa(1984)Nuc.Acids Res. 12 :203_213。所述的同源性比較 的長度如上所述，可以為更長的序列，在某些實施方案中為一段至少為大約17個核苷酸的 序列，一般至少為大約28個核苷酸，通常至少為大約40個核苷酸，優選至少為大約75-100 個或更多的核苷酸。關於雜交方面的同源性，嚴格條件將是通常在雜交反應中控制的鹽、溫度、有機溶 劑和其它參數的嚴格性的組合條件。嚴格性溫度條件通常包括超過大約30°C的溫度，通常 為超過大約37°C的溫度，典型的為超過大約55°C的溫度，優選為超過大約70°C的溫度。嚴 格性的鹽條件一般低於大約lOOOmM，通常低於大約400mM，典型的低於大約250mM，優選低 於大約150mM，包括約100、50或甚至20mM。然而，參數的組合比任何單個參數的測量值更 為重要。參見例如，ffetmur和Davidson(1968) J. Mol. Biol. 31 :349_370。嚴格條件下的雜 交得到的背景應該是背景的至少2倍，最好至少3-5倍或更高。對於序列比較，通常一個序列用作參比序列，將測試序列與其比較。當使用一種序 列比較算法時，將測試序列和參比序列輸入計算機，必要時指定亞序列坐標，並且指定序列 運算規則程序的參數。然後，該序列比較算法根據指定的程序參數，計算測試序列相對於參 比序列的序列同一性百分率。可以用如下進行用於比較的序列的光學序列對比(opticalalignment)例如 用 Smith 和 Waterman(1981)Adv. Appl. Math. 2 482 的局部同源性算法、用 Needleman 和 ffunsch (1970) J. Mol. Biol. 48 443 的同源性序列對比算法、通過 Pearson 和 Lipman(1988) Proc.Nat> 1 Acad. Sci. USA 85 2444的相似性方法的檢索、通過計算機實現這些算法 (Wisconsin Genetics 軟體包中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA，Genetics Computer Group, 575 Science Dr.，Madison，WI)、或通過目測檢查(一般參見 Ausubel 等，見上文)。有用的算法的一個實例是PILEUP。PILEUP採用漸進的成對序列對比，產生來自 一組相關序列的一個多重序列對比，以顯示關係和序列同一性的百分率。它也繪出一個樹 (tree)或枝叉圖(dendrogram)，顯示用來產生所述序列對比的成簇關係。PILEUP採用Feng 和Doolittle(1987).T. Mol. Evol. 35 =351-360的漸進序列對比法的簡化方法。所用的方法 類似於Hi^dns和Sharp (1989) CAB IPS 5 :151_153描述的方法。該程序可以對多達300個 序列進行序列對比，每個序列的最大長度為5，000個核苷酸或胺基酸。多重序列對比法以 兩個最相似的序列的成對序列對比開始，產生一組(a cluster of)兩個對比的序列。然後將該組與下一個最相關的序列或下一組對比的序列進行序列對比。通過簡單地延伸兩個單 獨序列的成對序列對比，將兩組序列進行序列對比。通過一系列漸進的成對序列對比，得到 最後的序列對比。通過指定序列比較區的特定序列及其胺基酸或核苷酸坐標，並且指定該 程序的參數，運行該程序。例如，可以將參比序列與其它測試序列比較，以採用以下參數測 定序列同一性關係的百分率默認間隙加權值(3. 00)、默認間隙長度加權值(0. 10)和加權 的末端間隙。適用於測定序列同一性和序列相似性百分率的算法的另一實例是BLAST算法，在 Altschul等(1990) T. Mol.Biol. 215 403-410中有描述。公眾可從國家生物技術信息中 心(http:WWW. ncbi. nlm. nih. gov/)得到進行BLAST分析的軟體。該算法包括首先通過在 查詢序列中鑑別長度為W的短字(short words)，而鑑別高計分序列對(HSP)，當與一數據 庫序列中相同長度的字進行序列對比時，它們或者匹配或者滿足某些陽性值的閾值計分T。 T稱為相鄰字計分閾值(Altschul等，見上文)。這些起始的相鄰字命中(word hit)用作 種子，起始搜尋以尋找含所述字命中的較長的HSP。然後，只要可以增加累積的序列對比計 分，則所述字命中在兩個方向上沿每個序列延伸。在以下情況下，每個方向上所述字命中的 延伸停止由於來自其最大得到的數值的數量X，累積的序列對比計分下降；由於一個或多 個負計分的殘基序列對比的累積，累積計分轉為零或零以下；或達到兩個序列之一的末端。 BLAST算法的參數W、T和X決定該序列對比的靈敏度和速度。BLAST程序使用時，默認字長 (W)為 11，BL0SUM62 計分矩陣(參見 Henikoff 和 Henikoff (1989)Proc. Nat，1 Acad. Sci. USA 89 :10915)序列對比⑶為50，期望值(E)為10，M = 5，N = 4，並且比較兩條鏈。除計算序列同一性百分率外，BLAST算法也進行兩個序列之間相似性的統計學分 析(參見例如 Karl in 和 Altschul (1993) Proc. Nat，lAcad. Sci. USA 90 :5873_5787)。BLAST 算法提供的相似性的一種測量是最小和概率(P(N))，這提供偶然發生兩個核苷酸序列或氨 基酸序列之間匹配概率的指標。例如，如果在測試核酸與參比核酸的比較中，最小和概率低 於大約0. 1，更優選低於大約0.01，最優選低於大約0. 001時，認為該核酸與參比序列相似。兩個多肽的核酸序列大致相同的再一指標是第一種核酸編碼的多肽與第二種核 酸編碼的多肽免疫交叉反應，如以下所述。因此，例如在一種多肽與第二種多肽僅由於保守 取代而不同時，這兩種多肽通常大致相同。兩個核酸序列大致相同的另一指標是所述兩種 分子在嚴格條件下相互雜交，如下所述。通過密切相關物種的交叉物種雜交，可以克隆並分離來自其它哺乳動物的 IL-B30。在遠緣物種之間的同源性可能相對低，因此最好是相對密切相關的物種的雜交。或 者，表現出物種同源性較低的抗體製備物的製備，可用於表達克隆方法。VII.製備 IL-B30 ；模擬物通過化學合成、篩選cDNA文庫或篩選由種類繁多的細胞系或組織樣品製備的基 因組文庫，可以獲得編碼所述IL-B30或其片段的DNA。參見例如Okayama和Berg(1982) Mol.Cell. Biol. 2 161-170 ；Gubler 和 Hoffman(1983)Gene 25 :263_269 ；和 Glover(1984 編輯)DNACloning :A Practical Approach, IRL Press, Oxford。或者，本文提供的序列提 供有用的PCR引物，或使得可以化學或其它製備編碼IL-B30的合適基因；包括天然存在的 實施方案。該DNA可以在種類繁多的宿主細胞中表達，用於合成全長IL-B30或片段，所述全長IL-B30或片段進而可以例如用來產生多克隆或單克隆抗體；用於結合研究；用於構建和 表達修飾的分子；和用於結構/功能研究。本文所用的載體包括質粒、病毒、噬菌體、整合型DNA片段和能夠將DNA片段整合 入宿主基因組中的其它載體。參見例如Pouwels等(1985和增補本)Cloning Vectors :A Laboratory Manual, Elsevier, N. Y.；禾口 Rodriguez 等(1988)(編輯)Vectors :A Survey of Molecular CloninRVectors and Their Uses, Buttersworth, Boston, MA。對於本發明的目的，當DNA序列功能上相互相關時，將它們操作性連接。例如，如 果DNA作為前蛋白表達或參與將所述多肽導向細胞膜或指導分泌所述多肽，則將前序列 (presequence)或分泌前導序列的DNA操作性連接至所述多肽。如果啟動子控制所述多肽 的轉錄，則將該啟動子操作性連接至編碼序列；如果將核糖體結合位點定位以允許翻譯，則 將核糖體結合位點操作性連接至編碼序列。通常，操作性連接是指鄰近的並且在讀框內，然 而，諸如阻抑物基因的某些遺傳元件不是鄰近連接的，但仍結合於操縱基因序列，進而控制 表達。參見例如 Rodrguez 等，第 10 章，第 205-236 頁:Balbas 和 Bolivar (1990)Methods in EnzymoloRY 185 14-37 ；禾口 Ausubel 等(1993) CurrentProtocols in Molecular BioloRY, Greene and Wiley, NY。合適表達載體的代表性實例包括pCDNAl ；pCD，參見Okayama等(1985)Mol. Cell Biol. 5 1136-1142 ；pMClneo Poly-A,參見 Thomas 等(1987)Cell 51 :503_512 ；和杆狀 病毒載體，諸如 pAC 373 或 pAC 610。參見例如 Miller (1988)Ann. Rev. Microbiol. 42 177-199。通常最好在提供特定或限定糖基化模式的系統中表達IL-B30多肽。參見例如 Luckow 和 Summers (1988) Bio/Technology 6 :47_55 禾口 Kaufman (1990) MetL Enzymol. 185 487-511。可以對所述IL-B30或其片段進行工程改造為連接於細胞膜的磷脂醯肌醇(PI)， 但可以通過用磷脂醯肌醇切割酶(例如磷脂醯肌醇磷脂酶C)處理從細胞膜去除。這釋放 生物活性形式的所述抗原，使得可以用蛋白化學的標準方法進行純化。參見例如Low(1989) Biochim. Biophys. Acta 988 :427_454 ；Tse 等(1985) Science 230 1003-1008 ；和 Brunner 等(1991).T. Cell Biol. 114 :1275_1283。既然已經特徵鑑定出所述IL-B30，而可以通過合成肽的常規方法製備其片段或 衍生物。這些包括諸如在以下文獻中描述的方法Stewart和Young(1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce ChemicalCo.，Rockford, IL ；Bodanszky 禾口 Bodanszky(1984) The Practice of PeptideSynthesis, Springer-Verlag, New York ；Bodanszky(1984)The Principlesof Peptide Synthesis,Springer-Verlag,New York ；禾口 Villafranca(1991 編 輯)Techniques in Protein Chemistry II, Academic Press, San Diego, Ca。VIII.用途本發明提供供例如IL-B30介導的病症或以下在診斷試劑盒描述的本文其它方面 描述的診斷應用之用的試劑。所述基因可以用於司法科學，例如以辨別齧齒動物與人類，或 用作辨別表現出差異表達或修飾模式的不同細胞的標記。本發明也提供具有顯著經濟潛力和/或治療潛力的試劑。所述IL-B30 (天然存在 的或重組的)或其片段及其抗體與鑑定為對IL-B30具有結合親和性的化合物，應該可用作教授分子生物學、免疫學或生理學技術的試劑。例如在實踐實驗室練習、生產或使用蛋白 質、抗體、克隆方法、組織學等方面，可以用所述試劑製備合適試劑盒。所述試劑也可以用於治療與異常生理或發育(包括炎症病症)相關的病症。它 們可以用於體外測試可能與特定治療策略的成功相關的互作組分的存在或不存在。特別 是，採用本文提供的組合物，通過合適的治療方法將得到各種例如造血細胞或淋巴細胞生 理的調節。參見例如 Thomson(1994 編輯)The Cytokine handbook(第 2 版)Academic Press, San Diego ；Metcalf 禾口 Nicola(1995)The Hematopoietic ColonyStimulatinR Factors Cambridge University Press 禾口ARRarwal 禾口Gutterman (1991) Human Cytokines Blackwell Pub.。例如，與異常表達IL-B30或IL-B30異常信號相關的疾病或病症，應該是激動劑或 拮抗劑的可能靶。所述新細胞因子應該在例如淋巴細胞的造血細胞調節或發育中起作用， 影響免疫應答，例如炎症和/或自身免疫失調。或者，它可能影響血管生理學或發育或神經 元作用。特別是，所述細胞因子應該在不同方面介導所述細胞的細胞因子合成、增殖等。 IL-B30的拮抗劑，諸如天然存在形式的IL-B30的突變蛋白變異體或阻斷抗體，可以提供 一種選擇性和有效的方法，以在諸如炎性或自身免疫反應的情況下阻斷免疫應答。也參見 Samter 等(編輯)Immunological Diseases 第 1 禾口 2 卷，Little，Brown and Co.。另外，某些聯合組合物可能例如與其它炎症調節劑一起使用。這類其它分子可以 包括類固醇、IL-6和/或G-CSF的其它變體(包括物種變異體)或病毒同系物以及它們各 自的拮抗劑。在通過RNA印跡分析表現出產生IL-B30 mRNA的每種細胞類型中，各種異常病症 是己知的。參見Berkow(編輯)The Merck Manual ofPiaRnosis and Therapy,Merck & Co.， Rahway, N. J. ；Thorn 等，Harrison』 sPrinciples of Internal Medicine, McGraw-Hill, N. Y.；禾口 Weatherall 等(編輯)Oxford Textbook of Medicine, Oxford University Press, Oxford.許多其它醫學病症和疾病涉及被巨噬細胞和單核細胞活化，許多這些病症 和疾病對用本文提供的激動劑或拮抗劑的治療有反應。參見例如Stites和Terr (1991編 輯)Basic and Clinical Immunology Appleton 禾口 Lange,挪威，Connecticut ；禾口 Samter 等(編輯)Immnological Diseases Little, Brownand Co.。這些醫學難題應該易於採用 本文提供的組合物預防或治療。胰島定位提示可能與糖尿病相關。可以純化IL-B30，拮抗劑、抗體等，然後將其給予獸醫患者或人類患者。例如在常 規藥學上可接受的載體或稀釋劑(例如免疫原性佐劑)中，可以將這些試劑聯合另外的活 性或惰性組分以及生理上無毒的穩定劑、賦形劑或防腐劑，用於治療用途。可以將這些組合 物過濾除菌，將這些組合物通過在劑量管制瓶中凍幹或貯存於穩定化水性製劑中，以劑量 形式放置。本發明也設想了包括非補體結合形式在內的抗體及其結合片段的用途。可以進行用IL-B30及其片段的藥物篩選，以鑑別對IL-B30具有結合親和性或對 IL-B30功能具有其它相關生物學效應的化合物，包括相關組分的分離。然後，可以利用後續 的生物測定，確定所述化合物是否具有內在刺激活性，並且是否由此因為阻斷所述細胞因 子活性而為阻斷劑或拮抗劑。同樣，具有內在刺激活性的化合物，可以激活所述信號途徑， 並由此因為它刺激IL-B30活性而為激動劑。本發明還設想了 IL-B30的阻斷抗體作為拮抗
23劑的治療用途和刺激性抗體作為激動劑的治療用途。該方法應該對於其它IL-B30物種的 變異體特別有用。有效治療所需的試劑量將取決於許多不同因素，包括給藥方法、靶部位、所述患者 的生理狀況和其它給予的藥物。因此，應該確定治療劑量，以優化安全性和效力。通常，體 外所用的劑量可以在原位給予這些試劑的用量方面提供有用的指南。治療特定病症的有 效量的動物測試將提供進一步的人類劑量的預測性指標。例如在Gilman等(1990編輯) Goodman and Gilmar^s-The PharmacoloRical Bases of Therapeutics,第8版，Pergamon Press 禾口 ReminRton』 s Pharmaceutical Sciences,第 17 版，(1990)， Mack Publishing Co. ,Easton,Penn中，描述了各種考慮。其中以及下文討論了給藥方法，例如經口、靜脈內、 腹膜內或肌內給藥、透皮擴散和其它給藥方法。藥學上可接受的載體將包括水、鹽水、緩衝 液和例如在Merck Index, Merck & Co.，Rahway, New Jersey中描述的其它化合物。通常 預計具有合適載體的劑量範圍為低於ImM濃度的量，通常低於約10 yM濃度，常常低於約 100 u M，優選低於約10pM(皮摩爾濃度)，最優選低於約lfM(費摩爾濃度)。慢釋製劑或慢 釋裝置通常用於持續或長期給藥。參見例如Langer(1990)Science249 :1527_1533。IL-B30、其片段、其抗體或抗體片段、拮抗劑和激動劑，可以直接給予待治療宿主， 或根據所述化合物的大小，可能最好在給予它們之前，將它們綴合於諸如卵清蛋白或血清 白蛋白的載體蛋白。治療製劑可以以許多常規劑量製劑給予。儘管可能單獨給予所述活 性組分，但最好將其作為藥用製劑給予。製劑通常包含至少一種以上定義的活性組分與其 一種或多種可接受的載體。在與其它組分相容並且對所述患者無害的意義上，每種載體應 該是藥學上和生理上可接受的。製劑包括適用於經口、直腸、鼻、局部或胃腸外(包括皮 下、肌內、靜脈內和皮內)給藥的製劑。所述製劑可以方便地以單位劑型給予，並且可以用 藥學領域熟知的方法製備。參見例如Gilman等(1990編輯)Goodmanand Gilman，s :The Pharmacological Bases of Therapeutics,第 8 版，Pergamon Press ；禾口 Remington』 s Pharmaceutical Sciences,第17版，(1990),Mack Publishing Co.,Easton,Penn. ；Avis等 (1993編輯)Pharmaceutical Dosage Forms :Parenteral Medications,Dekker,New York ； Lieberman 等(1990 編輯)Pharmaceutical Dosage Forms :Tablets,Dekker,New York ；禾口 Lieberman等(1990編輯)Pharmaceutical Dosage Forms :Disperse Systems,Dekker,New York。本發明的療法可以與其它藥劑聯合，或結合其它藥劑使用，其它藥物諸如其它細胞因 子，包括IL-6或G-CSF或其相應的拮抗劑。天然存在形式或重組形式的本發明IL-B30均特別可用於能夠篩選對所述蛋白有 結合活性的化合物的試劑盒和測定方法。最近數年已經開發了幾種自動測定方法，以便使 得可以在短時間內篩選數萬種化合物。參見例如Fodor等(1991) Science 251:767-773， 該文獻描述了用於在固相支持體上合成的多種限定聚合物結合親和性的測試方法。如本發 明提供的大量純化、可溶性IL-B30的可得性，可以大大促進合適測定的開發。其它方法可以用來確定IL-B30-IL-B30受體相互作用中的關鍵殘基。可以進行 突變分析，例如參見Somoza等(1993) J. Exptl. Med. 178 =549-558,以確定所述相互作用 和/或發送信號中關鍵的具體殘基。PHD(Rost和Sander(1994)Proteins 19 :55_72)和 DSC (King 和 Sternberg (1996) Protein Sci. 5 2298~2310)可以提供 a -螺旋(H)、鏈 (E)或捲曲螺旋(coil) (L)的二級結構預測。螺旋A和D是受體相互作用中最重要的，同時
24螺旋D是更為重要的區域。螺旋A在人類中可能從約pro (7)走向his (27)，而螺旋D可能 從約trp(135)走向gly(162)。表面暴露的殘基可能影響受體結合，而包埋的殘基可能影響 整體結構。預測的特別重要的殘基可能對應於arg(146)、ser(147)、gin(149)、ala(150)、 ala(153)、val(154)、ala(156)、arg(157)、ala(160)和 his(161)。例如，一旦已經例如通過四級結構數據確定了所述抗原的結構，則通常可以發現 拮抗劑。採用純化的IL-B30，因高度自動化測定方法的開發，潛在的互作類似物的測試現在 是可能的。特別是，通過採用本文描述的篩選技術，將發現新的激動劑和拮抗劑。特別重要 的是發現對一系列IL-B30分子具有組合結合親和性的化合物，例如，可以用作IL-B30物種 變異體拮抗劑的化合物。一種藥物篩選方法利用表達IL-B30的重組DNA分子穩定轉化的真核或原核宿 主細胞。可以分離表達與其它分子分離的IL-B30的細胞。這種活的或固定形式的細胞， 可以用於標準結合伴侶的結合鑑定法。也參見Parce等(1989) Science 246 :243_247 ；和 Owicki 等(1990)Proc. Nat，1 Acad. Sci. USA 87 :4007_4011，該文獻描述了測定細胞反應 的靈敏方法。用於藥物篩選的另一技術涉及一種方法，該方法提供對IL-B30具有合適結合親 和性的化合物的高通量篩選，詳細描述於Geysen的歐洲專利申請84/03564，該專利申請於 1984年9月13日公開。首先，在例如塑料釘或某些其它合適表面的固體基質上合成大量的 不同小肽測試化合物，參見Fodor等(1991)。然而，使所有釘與溶解的未純化或溶解的純化 IL-B30反應，然後洗滌。下一步涉及測定結合的IL-B30。合適的藥物設計也可以基於所述IL-B30或其它效應物或類似物的分子形狀的結 構研究。效應物可以是對結合應答而介導其它功能的其它蛋白，或為通常與IL-B30反應的 其它蛋白，例如受體。用於確定那些位點與特定的其它蛋白反應的一種方法是物理結構測 定，例如X射線晶體學或二維NMR技術。這些將為那些胺基酸殘基形成分子接觸區、例如針 對其它細胞因子-受體模型製作模型提供指南。關於蛋白結構測定的詳細描述，參見例如 Blundell 禾口 Johnson (1976) ProteinCrystallography, Academic Press, New York。IX.試劑盒本發明也考慮了 IL-B30蛋白、其片段、肽和它們的融合產物的用途，即用於在多 種用於檢測另一 IL-B30或結合伴侶存在的診斷試劑盒和方法。通常，所述試劑盒會具有含 或者特定IL-B30肽或基因區段或者識別一種或另一種(例如IL-B30片段或抗體)的試劑 的區室。用於測定測試化合物對IL-B30的結合親和性的試劑盒，通常包含一種測試化合 物；一種標記化合物，例如對IL-B30具有已知結合親和性的一種結合伴侶或抗體；一種 IL-B30源(天然存在的或重組的)；和用於將結合的標記化合物與游離標記化合物分離的 工具，例如用於將該分子固定化的固相。一旦篩選出化合物，則可以在合適的生物測定中評 估對該抗原具有合適結合親和性的那些化合物，所述生物測定是本領域熟知的，用於測定 它們是作為IL-B30信號途徑的激動劑還是作為拮抗劑起作用。重組IL-B30多肽的可得性 也提供了很好確定的校準這類測定的標準。用於測定樣品中例如IL-B30濃度的優選試劑盒，通常包含一種對所述抗原具有 已知結合親和性的標記化合物，例如結合伴侶或抗體；一種細胞因子源(天然存在的或重組的)和一種將結合標記化合物與游離標記化合物分離的工具，例如用於將所述IL-B30固 定化的固相。通常提供含試劑的區室和說明。包括抗原結合片段在內的所述IL-B30或片段的特異性抗體，可用於檢測水平提 高的IL-B30和/或其片段存在的診斷應用。這類診斷測定可以使用裂解液、活細胞、固定細 胞、免疫螢光、細胞培養物、體液，還可以涉及血清中與所述抗原相關的抗原的檢測等。診斷 測定可以是均相(在游離試劑和抗原結合伴侶複合物之間無分離步驟)或異相(有分離步 驟)的。存在各種商業測定，諸如放射免疫測定(RIA)、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、酶免疫 測定(EIA)、酶倍增免疫測定(enzyme-multiplied immunoassay)技術(EMIT)、底物標記熒 光免疫測定(SLFIA)等。參見例如 Van Vunakis 等(1980)Meth Enzymol. 70 1-525 ；Harlow 和 Lane (1980) Antibodies :A Laboratory Manua, CSH Press, NY;和 Coligan 等(1993 編 輯)Current Protocols in ImmunoloRY, Greene and Wiley, NY。抗獨特型抗體可以相似地用來診斷抗IL-B30抗體的存在，這樣可以診斷各種異 常狀態。例如，IL-B30的超量產生可能導致產生可能是異常生理狀況診斷標誌的各種免疫 反應，所述異常生理狀況特別是增殖性細胞病症(諸如癌症)或異常活化或分化。此外， 可得到的分布模式提供細胞因子在胰島中表達的信息，提示該細胞因子可能參與該器官功 能、例如參與糖尿病相關的醫學病症的可能性。通常，用於診斷測定的試劑在試劑盒中供應，以便使該測定的靈敏度最佳化。對於 本發明，根據該測定的性質，提供所述方案和所述標記(或者標記或未標記的抗體或結合 伴侶，或者標記IL-B30)。這通常與其它添加劑結合，所述添加劑諸如緩衝液、穩定劑、信號 產生必需的物質，諸如酶的底物等。所述試劑盒最好也含有正確使用和使用後正確處理內 容物的說明。所述試劑盒通常具有每種有用試劑的區域。當所述試劑可以在水性介質中重 建，提供進行該測定的合適試劑濃度時，所述試劑最好是作為乾燥的凍乾粉提供。所述藥物篩選和所述診斷測定的許多上述組分可以不修飾而使用，或以多種方 式進行修飾。例如，通過共價或非共價結合直接或間接提供可檢測信號的部分，可以達到 標記。在這些測定中的任一種中，可以或者直接或間接標記所述結合伴侶、測試化合物、 IL-B30或其抗體。直接標記的可能性包括標記基團諸如1251的放射標記；酶(美國專利 第3，645，090號)，諸如過氧化物酶和鹼性磷酸酶；和能夠監測螢光強度、波長移動或螢光 偏振變化的螢光標記(美國專利第3，940，475號)。間接標記的可能性包括將一種組分生 物素化，然後結合於偶聯至一種上述標記基團的抗生物素蛋白。也有許多分離結合I1-B30與游離IL-B30、或者分離結合測試化合物與游離測試 化合物的方法。所述IL-B30可以固定於各種基質上，然後進行洗滌。合適的基質包括諸如 ELISA板的塑料、濾膜和珠粒。參見例如Coligan等(1993編輯)Current Protocols in ImmunoloRY,第1卷，第2章，Greene and Wiley，NY。其它合適的分離技術包括但不限於 Rattle等(1984)Clin. Chem. 30 :1457_1461中描述的螢光抗體可磁化微粒法、以及美國專 利第4，659，678號中描述的雙抗體磁性微粒分離。在所述文獻中已經廣泛報導了用於將蛋白或其片段交聯於各種標記的方法，本文 不需要詳細討論。許多這些技術涉及或者通過碳二亞胺或者活性酯而使用活化羧基，形成 肽鍵；通過巰基與活化滷素(諸如氯乙醯)或活化烯烴(諸如馬來醯亞胺)反應形成硫代 酸酯，以用於交聯等。融合蛋白也可供這些應用使用。
本發明的另一診斷方面涉及使用取自IL-B30序列的寡核苷酸序列或多核苷酸序 列。這些序列可以用作探針，以檢測懷疑患有異常病症(例如炎性病症或自身免疫病症) 患者樣品中所述IL-B30信息水平。由於該細胞因子可以是活化標記或中介體，所以可用來 檢測多種活性細胞，以確定例如在所述效應變顯著或進展為顯著之前可能例如以預防方式 需要其它療法的時間。RNA和DNA核苷酸序列的製備、所述序列的標記和所述序列的優選 大小在所述文獻中有大量的描述和討論。參見例如Langer-Sager等(1982)Proc. Nat，1. Acad. Sci. 79 4381~4385 ；Caskey (1987) Science 236:962-967;和 Wilchek 等(1988) Anal. Biochem. 171 :1_32。也考慮了也測試其它分子定性或定量表達的診斷試劑盒。診斷或預後可能取決 於用作標記的多種指標的組合。因此，試劑盒可以測試標記的組合。參見例如Viallet等 (1989)Progress in Growth Factor Res. 1 :89_97。其它試劑盒可以用來評估其它細胞亞群。X. IL-B30受體的分離由於已經分離出特異性配體-受體相互作用的配體，存在分離所述受體的方法。 參見Gearing等(1989)EMBO T. 8 :3667_3676。例如，可以確定標記所述IL-B30細胞因子、 但不幹擾與其受體結合的方法。例如，親和標記可以融合於所述配體的或者氨基末端或 者羧基末端。這種標記可以是FLAG附加表位，或例如Ig或Fc結構域。例如通過細胞分 選，或測定表達這種結合組分的亞群的其它篩選，可以對表達文庫篩選所述細胞因子的結 合。參見例如 Ho 等(1993)Proc. Nat，1 Acad. Sci. USA 90 :11267_11271 ；和 Liu 等(1994) T. Immunol. 152 :1821-29。或者，可以使用淘選法。參見例如 Seed 和 Aruffo (1987) Proc. Nat，1 Acad. Sci. USA 84 :3365_3369。可以應用蛋白質與標記交聯的技術來分離所述IL-B30細胞因子的結合伴侶。這 應該使得可以鑑定與該細胞因子例如以配體-受體樣方式特異性相互作用的蛋白。將進行早期試驗，以確定已知的IL-6或G-CSF受體組分是否參與對IL-B30的應 答。這些功能受體複合物可以與IL-B30受體複合物共享許多或所有組分，這種可能性也相 當大，其中所述組分或者為特定受體亞基或者為輔助受體亞基。可以對本發明進行許多修改和變化，而不偏離本發明的精神和範圍，這對於本領 域技術人員是顯而易見的。提供本文描述的具體實施方案僅僅是舉例說明，本發明僅受所 附權利要求書的條款以及這些權利要求賦予的相當物的全部範圍限制。實施例I. 一般方法在 Maniatis 等(1982)Molecular CloninR :A Laboratory Manual ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY ；Sambrook 等(1989)Molecular CloninR :A Laboratory Manual (第 2 版)第 1-3 卷，CSHPress，NY ；Aububel 等，Biology Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY;或 Ausubel 等(1987 禾口 J曾奪卜本)Current Protocols in MolecularBioloRY Wiley/Greene,NY ；Innis等(1990編輯)PCR Protocols A Guideto Methods and Applications Academic Press, NY 中，描述或弓丨用的以下的許 多標準方法。用於蛋白純化的方法包括諸如硫酸銨沉澱、柱層析、電泳、離心、結晶的方 法和其它方法。參見例如Ausubel等(1987和定期增補本)；Deutscher (1990) 「蛋白純化指南」，Methods in Enzymology第182卷和該系列中的其它卷；Coligan等(1995和 增補本)CurrentProtocls in Protein Science John Wiley and Sons, New York, NY; P. Matsudaira (1993^H) A Practical Guide to Protein and PeptidePurification for MicrosequencinR, Academic Press, San Diego, CA ；禾口例如 Pharmacia, Piscataway, NJ 或 Bio-Rad, Richmond, CA的生產商關於蛋白純化產品使用的文獻。與重組技術結合，使得可 以與合適區段(附加表位)融合，例如與FLAG序列或可以通過蛋白酶可去除序列融合的相 當序列融合。參見例如 Hochli (1989) Chemische Industrie 12:69-70 ；Hichuli (1990)「用 金屬螯合吸收劑純化重組蛋白」，Setlow(編輯)Genetic Engineeing, Principle and Methods 12 :87_98，Plenum Press, NY ；禾口 Crowe 等(1992) QIAexpress :The High Level Expression & ProteinPurification System QUIAGEN, Inc.，Chatsworth, CA。例如在 Hertzenberg 等(1996 版)ffeir s Handbook of ExperimentalImmnoloRY 第 1-4 卷，Blackwel1 Science :ColiRan (1991)CurrentProtocols in ImmunoloRY Wiley/Greene, NY;和 Methods in Enzymology 第 70、73、74、84、92、93、108、116、121、 132、150、162和163卷中，描述了標準免疫學技術。例如在Thomson(1994編輯)The Cytokine Handbook (第 2 版)Academic Press, San PieRO :Metcalf 禾口 Nicola (1995) The Hematopoietic Colony StimulatinR Factors CambridgeUniversity Press ；禾口Aggarwal 和 Gutterman(1991)Human CytokinesBlackwell Pub.中，描述了細胞因子測定。血管生物活性的測定是本領域熟知的。它們包括腫瘤或其它組織(例如動脈平 滑肌)增生(參見例如Koyoma等(1996)位11 87 1069-1078)、單核細胞粘著於血管上 皮(參見McEvoy等(1997) J. Exp. Med. 185 2069~2077)等中的血管生成活性和血管抑制 (angiostatic)活性。也參見 Ross (1993) Nature 362 :801_809 ;Rekhter 和 Gordon (1995) Am. J. Pathol. 147 668~677 ；Thyberg 等(1990)Atherosclerosis 10 966~990 ；禾口 Gumbiner(1996)Cell 84 :345_357。例如在 Wouterlood (1995 編輯)Neuroscience Protocls modules 10, Elsevier ； Methods in Neurosciences Academic Press ；禾口 NeuromethodsHumana Press, Totowa, NJ中，描述了用於神經細胞生物活性的測定。例如在Meisami (編輯)Handbook of Human Growth and DevelopmentalBiology CRC Press ；禾口 Chrispeels (編輯)Molecular Techniques andApproaches in Developmental Biology Interscience 中，描述了發育系 統的方法學。在Melamed等(1990)Flow Cytometry and SortinR ffiley-Liss,Inc. ,New York, NY ;Shapiro (1988)Practical Flow Cytometry Liss,New York,NY ；禾口 Robinson 等(1993) Handbook of Flow Cytometry Methods ffiley-Liss, New York, NY 巾，了 FACS ^JfoII.人 IL-B30 的克隆表1提供了該基因的序列。所述序列得自由黑素細胞、胎心和妊娠子宮製備的 cDNA文庫。從得自胰島的cDNA文庫序列中也發現了該序列。這些序列使得可以製備PCR 引物或探針，以測定該基因的細胞分布。所述序列使得可以分離編碼該信息的基因組DNA。使用所述探針或PCR引物，可以探測各種組織或細胞類型，以確定細胞分布。用例 如TA克隆試劑盒(Invitrogen)克隆PCR產物。在自動測序儀(Applied Biosystems)上， 從兩個末端對所得的cDNA質粒測序。
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III. IL-B30 的細胞表達製備對編碼靈長類IL-B30的cDNA特異性的合適探針或引物。通常，例如通過隨 機引物，標記該探針。表達可以在所述的細胞類型中，也許也在胰島中。DNA分析初次擴 增的cDNA文庫的DNA(5y g)用合適的限制性酶消化，以釋放插入片段，在1 %瓊脂糖凝膠上 電泳，並轉移至尼龍膜(Schleicher和Schuell, Keene, NH)上。用於人mRNA分離的樣品包括外周血單核細胞(單核細胞、T細胞、NK細胞、粒細 胞、B細胞)，靜息的(T100)；外周血單核細胞，用抗⑶3激活2、6、12小時的混合物(pooled) (T101) ；T細胞，TH0克隆Mot 72，靜息的(T102) ；T細胞，TH0克隆Mot 72，用抗CD28和 抗⑶3激活3、6、12小時的混合物(T103) ；T細胞，TH0克隆Mot 72，用特定肽無反應性處 理2、7、12小時的混合物(T104) ；T細胞，TH1克隆HY06，靜息的(T107) ；T細胞，TH1克隆 HY06，用抗CD28和抗CD3激活3、6、12小時的混合物(T108) ；T細胞，TH1克隆HY06，用特 定肽無反應性處理2、6、12小時的混合物(T109) ；T細胞，TH2克隆HY935，靜息的(T110)； T細胞，TH2克隆HY935，用抗CD28和抗CD3激活2、7、12小時的混合物(Till) ；T細胞腫 瘤系 Jurkat 和 Hut78，靜息的(T117) ；T 細胞克隆，混合的 AD130. 2、Tc783. 12、Tc783. 13、 Tc783. 58、Tc782. 69，靜息的(T118) ；T細胞隨機y ST細胞克隆，靜息的(T119) ；CD28-T細 胞克隆；脾細胞，靜息的(B100)；脾細胞，用抗CD40和IL-4激活的(B101) ；B細胞EBV系， 混合的 WT49、RSB、JY、CVIR、721. 221、RM3、HSY，靜息的(B102) ；B 細胞系 JY，用 PMA 和離子 黴素激活1、6小時的混合物(B103)；混合的NK 20克隆，靜息的(K100)；混合的NK20克 隆，用PMA和離子黴素激活6小時(K101) ；NKL克隆，得自LGL白血病患者的外周血，IL-2 處理的(K106)；造血前體系TF1，用PMA和離子黴素激活1、6小時的混合物(C100) ；U937 前單核細胞系，靜息的(M100) ；U937前單核細胞系，用PMA和離子黴素激活1、6小時的混 合物(M101)；淘析的單核細胞，用LPS、IFNy、抗IL-10激活1、2、6、12、24小時的混合物 (M102)；淘析的單核細胞，用LPS、IFNy、IL-10激活1、2、6、12、24小時的混合物(M103)；淘 析的單核細胞，用LPS、IFN Y、抗IL-10激活4、16小時的混合物(M106)；淘析的單核細胞， 用LPS、IFNy , IL-10激活4、16小時的混合物(M107)；淘析的單核細胞，用LPS激活1小 時(M108)；淘析的單核細胞，用LPS激活6小時(M109) ；DC 70% CDla+，來自CD34+GM-CSF、 TNFa 12 天，靜息的(D101) ;DC 70% CDla+，來自 CD34+GM-CSF、TNFa 12 天，用 PMA 和離 子黴素激活1小時(D102) ；DC 70% CDla+，來自CD34+GM_CSF、TNF a 12天，用PMA和離子黴 素激活 6 小時 0)103) ；DC 95% CDla+，來自 CD34+GM-CSF、TNF a 12 天，通過 FACS 分選，用 PMA和離子黴素激活1、6小時的混合物(D104) ；DC 95% CD14+，來自CD34+GM-CSF、TNFa 12天，通過FACS分選，用PMA和離子黴素激活1、6小時的混合物(D105) ；DC CDla+CD86+, 來自⑶34+GM-CSF、TNF a 12天，通過FACS分選，用PMA和離子黴素激活1、6小時的混合 物(D106) ；DC，來自單核細胞GM-CSF、IL-4 5天，靜息的(D107) ；DC，來自單核細胞GM-CSF、 IL-4 5天，靜息的(D108) ；DC，來自單核細胞GM-CSF、IL-4 5天，用LPS激活4、16小時的 混合物(D109) ；DC，來自單核細胞GM-CSF、IL-4 5天，用TNFa、單核細胞上清液(supe)激 活4、16小時的混合物(D110)；上皮細胞，未刺激的；上皮細胞，IL-10激活的；肺成纖維 細胞肉瘤系MRC5，用PMA和離子黴素激活1、6小時的混合物(C101)；腎上皮癌細胞系CHA， 用PMA和離子黴素激活1、6小時的混合物(C102)。在淘析的單核細胞，用LPS、IFNY、抗 IL-10激活4、16小時的混合物(M106)；淘析的單核細胞，用LPS、IFN Y、抗IL-10激活1、2、6、12、24小時的混合物(M102)；淘析的單核細胞，用LPS激活6小時(M109)；淘析的單 核細胞，用LPS激活1小時(M108)中，IL-B30轉錄物的表達非常高。在DC 95% CDla+， 來自⑶34+GM-CSF、TNF a 12天，通過FACS分選，用PMA和離子黴素激活1、6小時的混合物 (D104)；和混合的NK20克隆，用PMA和離子黴素激活6小時(K101)中表達高。在DC 70% CDla+，來自 CD34+GM-CSF、TNFa 12 天，用 PMA 和離子黴素激活 6 小時(D103) ;DC 70% CDla+，來自CD34+GM-CSF、TNFa 12天，用PMA和離子黴素激活1小時(D102) ；T細胞， TH1克隆HY06，用特定肽無反應性處理2、6、12小時的混合物(T109)；外周血單核細胞，用 抗⑶3激活2、6、12小時的混合物(T101) ；T細胞，TH0克隆Mot 72，用抗⑶28和抗⑶3激 活3、6、12小時的混合物(T103)；脾細胞，用抗CD40和IL-4激活的(B101) ；T細胞，TH0克 隆Mot 72，用特定肽無反應性處理2、7、12小時的混合物(T104)；脾細胞，靜息的(B100)； T細胞，TH1克隆HY06，用抗⑶28和抗⑶3激活3、6、12小時的混合物(T108)；上皮細胞， IL-13激活的；淘析的單核細胞，用LPS、IFNy、IL-10激活4、16小時的混合物(M107)；和 B細胞系JY，用PMA和離子黴素激活1、6小時的混合物(B103)中，檢測到較低的表達。在 DC，來自單核細胞GM-CSF、IL-45天，用LPS激活4、16小時的混合物(D109) ；T細胞，TH0克 隆Mot 72，靜息的(T102)；外周血單核細胞(單核細胞、T細胞、NK細胞、粒細胞、B細胞)， 靜息的(T100) ；T細胞，在抗CD28、IL-4和抗IFN-y中極化27天的CD4+CD45R0-T細胞，極 化的TH2，用抗CD3和抗CD28激活4小時(T116) ；T細胞克隆，混合的AD130. 2、Tc783. 12、 Tc783. 13、Tc783. 58、Tc782. 69，靜息的(T118) ；U937 前單核細胞系，靜息的(M100)；造血 前體系TF1，用PMA和離子黴素激活1、6小時的混合物(C100) ；T細胞，TH2克隆HY935，用 抗 CD28 和抗 CD3 激活 2、7、12 小時的混合物(Till) ；DC CDla+CD86+，來自 CD34+GM-CSF、 TNF a 12天，通過FACS分選，用PMA和離子黴素激活1、6小時的混合物(D106)；淘析的單 核細胞，用LPS、IFNy , IL-10激活1、2、6、12、24小時的混合物(M103) ；DC，來自單核細胞 GM-CSF、IL-45天，用TNFa、單核細胞上清液激活4、16小時的混合物(D110) ；DC，來自單核 細胞GM-CSF、IL-45天，靜息的(D108) ；U937前單核細胞系，用PMA和離子黴素激活1、6小 時的混合物(M101) ；T細胞隨機y ST細胞克隆，靜息的(T119)；和T細胞，TH1克隆HY06， 用抗⑶28和抗⑶3激活3、6、12小時的混合物(T108)中，觀察到可檢測的表達。在其它樣 品中沒有檢測到信號。總之，分布顯示，IL-B30在活化巨噬細胞中水平升高，提示在炎症中的作用；在活 化Thl細胞中水平升高，提示在T輔助細胞亞群(helper subset)中，特別是在Thl免疫應 答中有調節或效應物作用；在活化樹突細胞中水平升高，提示在抗原提呈或生發中心T或B 細胞與DC相互作用中的作用。用於小鼠mRNA分離的樣品可以包括靜息的小鼠成纖維細胞的L細胞系(C200)； Braf:ER(與雌激素受體融合的Braf融合體)轉染的細胞，對照(C201) ；Mell4+原初T細 胞，來自脾臟，靜息的(T209) ；Mel 14+T細胞，來自脾臟，用IFN-y、IL-12和抗IL-4刺激極 化為TH1細胞，暴露於IFN-y和IL-46、12、24小時的混合物(T210) ；Mell4+原初T細胞， 來自脾臟，用IL-4和抗IFN- y刺激極化為Th2細胞，暴露於IL-4和抗IFN- Y 6、13、24小時 的混合物(T211) ；T細胞，極化的THl(Mell4 bright，來自脾臟的⑶4+細胞，用IFN-Y和抗 IL-4極化7天；T200) ；T細胞，極化的TH2 (Mel 14 bright，來自脾臟的CD4+細胞，用IL-4和 抗IFN-y極化7天；T201) ；T細胞，高度極化3x的TH1，來自轉基因Balb/c (參見Openshaw
30等(1995) T. Exp. Med. 182 1357-1367 ；用抗 CD3 激活 2、6、16 小時的混合物；T202) ；T 細胞， 高度極化3x的TH2，來自轉基因Balb/c (用抗CD3激活2、6、24小時的混合物；T203) ；T細 胞，高度極化3x的TH1，來自轉基因C57 bl/6 (用抗CD3激活2、6、24小時的混合物；T212)； T細胞，高度極化3x的TH2，來自轉基因C57 bl/6 (用抗⑶3激活2、6、24小時的混合物； T213) ；T細胞，高度極化的TH1 (來自轉基因Balb/c的原初⑶4+T細胞，用FN- y、IL_12和 抗IL-4極化3x ；用IGIF、IL-12和抗IL-4刺激6、12、24小時的混合物)；CD44-CD25+前T細 胞，從胸腺分選的(T204) ；TH1 T細胞克隆D1. 1，用抗原最後一次刺激後靜息3周(T205)； TH1 T細胞克隆Dl. l，10ii g/ml ConA激活15小時(T206) ；TH2 T細胞克隆CDC35，用抗原最 後一次刺激後靜息3周(T207) ；TH2 T細胞克隆CDC35，10 y g/ml ConA激活15小時(T208)； 未刺激的B細胞系CH12(B201)；未刺激的成熟B細胞白血病細胞系A20(B200)；來自脾臟 的未刺激的大B細胞(B202)；來自全脾的B細胞，LPS激活(B203)；來自脾臟的三碘苯甲醯 氨基葡萄糖富集的樹突細胞，靜息的(D200)；來自骨髓的樹突細胞，靜息的(D201)；未刺激 骨髓源性樹突細胞，用抗B220、抗CD3和抗II類排除(d印lete)，在GM-CSF和IL-4中培養 的(D202)；骨髓源性樹突細胞，用抗B220、抗CD3和抗II類排除，在GM-CSF和IL-4中培 養，用抗⑶40刺激1、5天的混合物(D203)；單核細胞細胞系RAW 264. 7，用LPS激活4小 時(M200)；骨髓巨噬細胞，用GM和M-CSF衍生的(M201)；骨髓巨噬細胞，用GM-CSF衍生，用 LPS、IFNy和抗IL-10刺激24小時(M205)；骨髓巨噬細胞，用GM-CSF衍生，用LPS、IFN y 和抗IL-10刺激24小時(M206)；腹膜巨噬細胞(M207)；巨噬細胞系J774，靜息的(M202)； 於 0. 5、1、3、6、12 小時混合的巨噬細胞系 J774+LPS+抗 IL-10 (M203)；於 0. 5、1、3、5、12 小 時混合的巨噬細胞系J774+LPS+IL-10 (M204)；未刺激的肥大細胞系MC-9和MCP-12 (M208)； 得自腦微血管內皮細胞的無限增殖化內皮細胞系，未刺激的(E200)；得自腦微血管內皮細 胞的無限增殖化內皮細胞系，用TNFa刺激過夜(E201)；得自腦微血管內皮細胞的無限增 殖化內皮細胞系，用TNFa刺激過夜(E202)；得自腦微血管內皮細胞的無限增殖化內皮細 胞系，用TNFa和IL-10刺激過夜(E203)；來自wt C57bl/6小鼠的全主動脈；來自5月 齡ApoE K0小鼠的全主動脈(X207)；來自12月齡ApoE K0小鼠的全主動脈(X207) ；wt胸 腺(0214)；全胸腺，rag-1 (0208)；全腎臟，rag-1 (0209)；全腎臟，NZ B/W小鼠；和全心臟， rag-1 (0202) 0在單核細胞細胞系RAW 264. 7，用LPS激活4小時(M200) ；T細胞，高度極化 3x的TH1，來自轉基因C57 bl/6(用抗⑶3激活2、6、24小時的混合物；T212)；和T細胞，高 度極化的TH1 (來自轉基因Balb/c的原初CD4+T細胞，用IFN- y、IL-12和抗IL-4極化3x ； 用IGIF、IL-12和抗IL-4刺激6、12、24小時的混合物)中，檢測到高信號。在T細胞，高度 極化 3x 的 TH1，來自轉基因 Balb/c (參見 Openshaw 等(1995) J. Exp. Med. 182 :1357_1367 ； 用抗CD3激活2、6、16小時的混合物；T202) ；T細胞，極化的TH2 (Mel 14 bright，來自脾臟 的CD4+細胞，用IL-4和抗IFN-y極化7天；T201) ；T細胞，極化的TH1 (Mell4 bright，來 自脾臟的CD4+細胞，用IFN-y和抗IL-4極化7天；T200)；於0. 5、1、3、6、12小時混合的 巨噬細胞系J774+LPS+抗IL-10(M203)；巨噬細胞系J774，靜息的(M202)；於0. 5、1、3、5、 12小時混合的巨噬細胞系J774+LPS+IL-10 (M204)；得自腦微血管內皮細胞的無限增殖化 內皮細胞系，用TNFa刺激過夜(E201)；和骨髓巨噬細胞，用GM-CSF衍生，用LPS、IFN Y和 抗IL-10刺激24小時(M206)中檢測到可檢測信號。其它樣品未顯示信號。在RAW 264.7 小鼠單核細胞系中的表達提示一種天然蛋白源。
IV. IL-B30的染色體作圖使用編碼所述IL-B30的分離的cDNA。染色體作圖是一種標準技術。參見例如 BIOS Laboratories (New Haven, CT)和採用小鼠體細胞雜種庫和PCR的方法。間接證據表 明，小鼠IL-B30基因作圖至染色體10。V. IL-B30蛋白的純化對多個轉染的細胞系篩選以高於其它細胞的水平表達該細胞因子的細胞系。篩選 各種細胞系，在處理中選擇其合適的特性。天然IL-B30可以從天然來源分離，或採用合適 的表達載體通過表達從轉化細胞中分離。用標準方法可以達到所表達蛋白的純化，或可以 結合工程改造方法，以高效率從細胞裂解液或上清液中有效地純化所表達的蛋白。對於這 類純化特徵可以使用FLAG或His6區段。或者，可以用特異性抗體，使用親和層析，參見下 文。根據需要，在大腸桿菌(coli)、昆蟲細胞或哺乳動物表達系統中產生蛋白質。VI.同源IL-B30基因的分離所述IL-B30 cDNA或其它物種對應序列可以用作雜交探針，以從所需來源(例如 靈長類細胞cDNA文庫)篩選文庫。可以採用探針，對許多不同的物種篩選易於雜交必需的 嚴格性和存在。合適的雜交條件將用來篩選表達交叉雜交特異性的克隆。採用基於所述肽序列的簡併探針通過雜交篩選，也使得可以分離合適的克隆。或 者，使用合適的PCR篩選引物，將產生合適核酸克隆的富集。相似的方法可應用於分離或者物種變異體、多態變異體或者等位基因變異體。根 據作為探針的來自一個物種的全長分離物或片段的分離，採用交叉物種雜交技術，可以分 離物種變異體。或者，針對人IL-B30產生的抗體用來從合適的例如cDNA文庫中篩選表達交叉反 應性蛋白的細胞。純化的蛋白和限定的肽可用來通過如上所述的標準方法產生抗體。將合 成肽或純化蛋白提呈給免疫系統，以產生單克隆或多克隆抗體。參見例如Coligan(1991) CurrentProtocols in Immunology Wiley/Greene ；禾口 Harlow禾口 Lane(1989)Antibodies :A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press。所得的抗體用於如上所述的蹄選、純化 或診斷。VII. IL-B30特異性抗體的製備將合成肽或純化蛋白提呈給免疫系統，以產生單克隆或多克隆抗體。參見例如 Coligan(1991)Current Protocols in Immuno1ogyffi1ey/Greene ；禾口Harlow禾口Lane(1989) Antibodies :A LaboratoryManual Cold Spring Harbor Press。可以製備多克隆血清或雜 交瘤。在合適的情況下，所述結合試劑或者如上所述進行標記，例如螢光標記，或者固定化 至基質上用於淘選法。免疫選擇和相關技術可用來根據需要製備選擇性試劑。VIII.生物學功能廣度的評估根據IL-B30和IL_6和G-CSF之間序列同源性和結構同源性，測試IL-B30的生物 活性。最初，檢查已經顯示IL-6或G-CSF生物活性的測定。A.對細胞增殖的效應用不同濃度的細胞因子，評估對各種細胞類型增殖的效應。結合相關細胞因子 IL-6、G-CSF等進行劑量效應分析。
B.對人單核細胞上細胞表面分子表達的效應通過負選擇，從正常健康供體的外周血單核細胞純化單核細胞。簡而言之， 將3X 108ficoll帶的單核細胞與單克隆抗體混合物(Becton-Dickinson ；Mountain View, CA)在冰上孵育，所述單克隆抗體混合物包含例如200iilara2(Leu-5A)、200ia a CD3 (Leu-4),100u 1 aCD8(Leu 2a) ,100u 1 a CD19(Leu-12),100u 1 a CD20(Leu-16)、 100 u 1 a CD56 (Leu-19) ,100 u 1 a CD67 (IOM 67 ； Immnotech, ffestbrook, ME)和抗血型糖 蛋白抗體(10F7MN，ATCC，ROckVille，MD)。洗滌抗體結合細胞，然後與羊抗小鼠IgG偶聯的 磁性珠粒(Dynal，Oslo，挪威)一起溫育，珠粒與細胞之比為20 1。通過施加磁場，從單 核細胞中分離抗體結合細胞。隨後，在缺乏或存在IL-B30、IL-6、G-CSF或組合物的情況下， 在含人AB血清的Yssel氏培養基(Gemini Bioproducts, Calabasas, CA)中培養人單 核細胞。通過直接免疫螢光，可以進行細胞表面分子表達的分析。例如，將2X105純化的 人單核細胞在含人血清的磷酸緩衝鹽溶液(PBS)中在冰上孵育20分鐘。以200Xg沉 澱細胞。將細胞再懸浮於20ml PE或FITC標記的mAb中。於冰上再孵育20分鐘後，細胞 在含人血清的PBS中洗滌，然後在單獨的PBS中洗滌2次。將細胞在含低聚甲醛的 PBS 中固定，並在 FACScan 流式細胞儀(Becton Dickinson ；Mountain View, CA)上進行分 析。使用典型的 mAb，例如得自 Becton-Dickinson 的 CDllb(抗 macl)、CDllc (gpl50/95)、 CD14(Leu-M3)、CD-54(Leu 54)、CD80 (抗 BB1/B7)、HLA-DR (L243)禾口 CD86 (FUN 1 ； Pharmingen)、CD64 (32. 2 ；Medarex)、CD40 (mAb89 ；Schering-Plough 夕去國)。C. IL-B30對人單核細胞產生細胞因子的效應如上所述分離人單核細胞，並在缺乏或存在IL-B30 (1/100稀釋液，杆狀病毒表達 的物質)的情況下，在含人AB血清Yssel氏培養基(Gemini Bioproducts, Calaasas, CA)中培養。另外，在缺乏或存在IL-B30的情況下，用LPS(大腸桿菌0127:B8 Difco)刺激 單核細胞，並通過ELISA測定細胞培養上清液中細胞因子(IL-10、IL-6、TNFa、GM_CSF和 IL-10)的濃度。對於細胞因子的胞質內染色，在缺乏和存在IL-B30和LPS(大腸桿菌0127:B8 Difco)和 10mg/ml 布雷菲德菌素 A (Epicentre technologiesMadison WI)的情況下，在 Yssel氏培養基中培養(lX106/ml)單核細胞12小時。在PBS中洗滌細胞，並在2 %甲 醛/PBS溶液中於室溫下孵育20分鐘。隨後將細胞洗滌，再懸浮於透化緩衝液(0.5%皂 苷(Sigma)的PBS/BSA(0. 5% ) /疊氮化物(ImM)溶液)中，於室溫下孵育20分鐘。將 細胞(2X105)離心，於室溫下再懸浮於20ml直接綴合的抗細胞因子mAb中20分鐘，所 述mAb以1 10在透化緩衝液中稀釋。可以使用以下抗體11^-1[1^^(364-383-14); IL-6-PE(MQ2-13A5) ；TNFa-PE(Mabll) ；GM-CSF-PE(BVD2-21C11)；禾口 IL-12-PE(C11. 5. 14; Pharmingen San Diego, CA)。隨後，將細胞在透化緩衝液中洗滌2次，在PBS/BSA/疊氮化 物中洗滌1次，並在FACScan流式細胞儀(BectonDickinson ；Mountain View，CA)上進行分 析。D. IL-B30對人外周血單核細胞(PBMC)增殖的效應如所述(Boyum等)，通過Ficoll-hypaque離心，從正常健康供體的淺黃色層分離 總PBMC。在缺乏或存在IL-B30的情況下，將PBMC在96孔板(Falcon，Becton-Dickinson，NJ)中的 200 ii 1 含 人 AB 血清的 Yssel 氏培養基(Gemini Bioproducts, Calabasas, CA)中培養。將細胞在單獨的培養基中或結合100U/ml IL-2(R&D Systems)的培養基中培 養120小時。在培養的最後6小時期間，3H-胸苷，通過液閃計數測定3H-胸苷的摻入。可以在許多其它生物測定系統中，例如在T細胞、B細胞、NK、巨噬細胞、樹突細胞、 造血祖細胞等上，測試所述天然、重組和融合蛋白的激動劑或拮抗劑活性。因為IL-6和 G-CSF的結構關係，應該分析與那些活性相關的測定。在表達IL-6或G-CSF受體的轉染細胞和對照上，評估IL-B30的激動劑或拮抗劑 活性。參見例如 Ho 等(1993)Proc. Nat，l Acad. Sci. USA90,11267-11271 ；Ho 等(1995)Mol. Cell. Biol. 15 5043-5053 ；和 Liu 等(1994)T Immunol. 152 :1821_1829。評估IL-B30在對抗原或同種異型刺激物應答的巨噬細胞/樹突細胞活化和 抗原提呈測定、T細胞細胞因子產生和增殖方面的效應。參見例如De Waal Malefyt等 (1991) T. Exp. Med. 174 :1209—1220 :de WaalMalefyt 等(1991) T. Exp. Med. 174 915~924 Fiorentino 等(1991) T. Immunol. 147,3815-3822 ；Fiorentino 等(1991) T. Immunol. 146 3444-3451 ；和 Groux 等(1996) T. Exp. Med. 184 :19-29。也將評估IL-B30對NK細胞刺激的效應。測定可以基於例如Hsu等(1992) Internat. Immunol. 4 :563_569 ；禾口 Schwarz 等(1994) T. Immumother. 16 :95_104。將例如通過在Defrance 等(1992) T. Exp. Med. 175 :671_682 ；Rousset 等(1992) Proc. Nat，1 Acad. Sci. USA 89 1890-1893 中描述的方法，包括 IgG2 禾P IgA2 開關因子測 定，分析B細胞生長和分化效應。IX.遺傳改變動物的產生和分析通過標準方法可產生轉基因小鼠。這種動物可用來測定在特定組織或在整個 所述生物中該基因缺乏的效應。這種動物可以提供對該動物或特定組織在各個階段中 發育的有趣的了解。此外，可以評估對生物脅迫各種反應的效應。參見例如Hogan等 (1995)Manipulating theMouse Embrvo :A Laboratory Manual (第 2 片反)Cold Spring HarborLaboratory Press。已經產生的轉基因小鼠，儘管所述動物看來經受得住出生，但不能健康成長，通常 在數周內死亡。所述構成物基於具有CMV增強子的肌動蛋白啟動子，該啟動子應該導致寬 範圍的表達和高表達。象IL-6轉基因小鼠的小鼠發育不良。此外，它們表現出腹漲、胃和 腸有炎症、細胞浸潤到肝臟中，通常在第50天之前死亡。這些小鼠不能生育。第二亞組的 轉基因小鼠的表型嚴重性較低，正在試圖繁殖它們。已經測定了小鼠IL-B30的基因組結構。已經開發出產生IL-B30失效小鼠的策略， 並已經開始構建。本文引用的所有參考文獻均通過引用結合到本文中，對於所有的目的，其程度與 具體和單獨地表明每個單獨的出版物或專利申請通過引用結合到本文中的程度一樣。可以對本發明進行許多修改和變化，而不偏離本發明的精神和範圍，這對於本領 域技術人員是顯而易見的。提供本文描述的具體實施方案僅僅是舉例說明，本發明僅受所 附權利要求書的條款以及這些權利要求賦予的相當物的全部範圍的限制。
權利要求
編碼抗原多肽的分離的或重組的多核苷酸，包含a)SEQ ID NO2的成熟多肽的至少148個連續胺基酸；b)SEQ ID NO4的成熟多肽的至少17個連續胺基酸；c)SEQ ID NO5的成熟多肽的至少30個連續胺基酸。
2.權利要求1的多核苷酸，編碼以下成熟多肽a)SEQID NO 2 ；b)SEQID NO :4 ；或c)SEQID NO :5。
3.權利要求1的多核苷酸，它於至少65°C、低於大約150mM鹽的嚴格洗滌條件下與以 下序列的至少35個連續核苷酸的互補物雜交a) GTGCCTGGGGGCAGCAGCCCTGCCTGGACTCAGTGCCAGCAGCTTTCACAGAAGCTCTGCACACTGGCCTGGAGTGCACATCCACTAGTGGGACACATGGATCTAAGAGAAGAGGGAGATGAAGAGACTACAAATGATGTTCCCCATATCCAGTGTGGAGATGGCTGTGACCCCCAAGGACTCAGGGACAACAGTCAGTTCTGCTTGCAAAGGATCCACCAGGGTCTGATTTTTTATGAGAAGCTGCTAGGATCGGATATTTTCACAGGGGAGCCTTCTCTGCTCCCTGATAGCCCTGTGGCGCAGCTTCATGCCTCCCTACTGGGCCTCAGCCAACTCCTGCAGCCTGAGGGTCACCACTGGGAGACTCAGCAGATTCCAAGCCTCAGTCCCAGCCAGCCATGGCAGCGTCTCCTTCTCCGCTTCAAAATCCTTCGCAGCCTCCAGGCCTTTGTGGCTGTAGCCGCC b) GTGCGGGTCTTTGCCCATGGAGCAGCAACCCTGAGTCCC 或'T^iCCTAGGAGTAGCAGTCCTGACTGGGCTCAGTGCCAGCAGCTCTCTCGGAATCTCTGCATGCTAGCCTGGAACGCACATGCACCAGCGGGACATATGAATCTACTAAGAGAAGAAGAGGATGAAGAGACTAAAAATAATGTGCCCCGTATCCAGTGTGAAGATGGTTGTGACCCACAAGGACTCAAGGACAACAGCCAGTTCTGCTTGCAAAGGATCCGCCAAGGTCTGGCTTTTTATAAGCACCTGCTTGACTCTGACATCTTCAAAGGGGAGCCTGCTC TACTCCCTGATAGCCCCATGGAGCAACTTCACACCTCCCTACTAGGACTCAGCCAACTCCTCCAGCCAGAGGATCACCCCCGGGAGACCCAACAGATGCCCAGCCTGAGTTCTAGTCAGCAGTGGCAGCGCCCCCTTCTCCGTTCCAAGATCCTTCGAAGCCTCCAGGCCTTTTTGGCCATAGCTGCCCGGGTCTTTGCCCACGGAGCAGCAACTCTGACTGAGCCCTTAGTGCCA ACA GCT0
4.包含權利要求1的多核苷酸的表達載體。
5.包含權利要求4的表達載體的宿主細胞。
6.一種結合化合物，其 1)特異性地結合SEQ ID NO 2的成熟多肽；2)特異性地結合SEQID NO 4的成熟多肽；3)特異性地結合SEQID NO 5的成熟多肽；4)針對純化或重組產生的人IL-B30蛋白而產生；5)針對純化或重組產生的小鼠IL-B30蛋白而產生；6)針對純化或重組產生的豬IL-B30蛋白而產生。
7.權利要求6的結合化合物，所述結合化合物為1)抗體分子；2)單克隆抗體；3)Fab；4)F (ab) 2 ；5)多克隆抗血清；6)可檢測標記的；7)無菌的；或8)在緩衝組合物中。
8.大致純或分離的抗原多肽，它包含a)SEQ ID NO 2的成熟多肽的至少148個連續胺基酸；b)SEQID NO 4的成熟多肽的至少17個連續胺基酸；或c)SEQ ID NO 5的成熟多肽的至少30個連續胺基酸。
9.權利要求8的多肽，它a)為可溶性多肽；b)為可檢測標記的；c)在無菌組合物中；d)在緩衝組合物中；e)結合於細胞表面受體；f)為重組產生的，或；g)具有天然存在的多肽序列。
10.一種分離或重組的多核苷酸，其編碼包含SEQ ID NO :2的成熟多肽的多肽。
11.大致純或分離的多肽，其包含SEQID NO :2的成熟多肽。
12.一種融合多肽，它包含權利要求8的多肽和同源或異源多肽區段。
全文摘要
提供了編碼哺乳動物細胞因子的純化基因、與其相關的試劑，包括純化的蛋白、特異性抗體和編碼該分子的核酸。也提供了使用所述試劑的方法和診斷試劑盒。
文檔編號G01N33/53GK101851286SQ201010134610
公開日2010年10月6日 申請日期1998年7月24日 優先權日1997年7月25日
發明者J·F·巴贊 申請人:先靈公司