用於分子生物學應用的包含核酸聚合酶的乾燥和穩定的即用組合物的製作方法

2023-09-14 16:20:50 3

專利名稱：用於分子生物學應用的包含核酸聚合酶的乾燥和穩定的即用組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及核酸聚合酶的穩定化，且涉及還可用於診斷的目的的包含這樣的聚合酶穩定劑的即用反應組合物和試劑盒的製備。
現有技術核酸的體內和體外合成通過鏈的準確複製來控制，其中每一個單一核酸鏈確定完全互補的鏈中的核苷酸的順序。DNA複製的具體機制必須通過稱為聚合酶的酶家族使用，且通過聚合酶來進行。從各種有機體純化的聚合酶通常用於研究和診斷，特別是隨著基因擴增的各種系統例如聚合酶鏈反應的出現(PCR-Mullis等人，美國專利第4，683，195號；第4，683，202 號；和第4，800，159號)。PCR的基本配置由兩種合成引物、核酸模板和聚合酶組成。每一種引物與靶核酸中的區互補，或更好是與兩個互補的鏈中的一個互補。聚合酶明顯地是擴增系統的關鍵性部分，這是由於聚合酶以3』方向按順序地加入核苷酸，將它們鍵合至能夠通過氫鍵與模板鏈結合的靶特異性多核苷酸引物的羥基的能力。標準擴增混合物可以具有以下組成dNTP、緩衝液、MgCl2、正向引物、反向引物、 Taq聚合酶、DNA禾口 H2O。反應混合物必須被加熱至90_95°C，以使模板DNA的雙螺旋變性。在變性步驟之後，將溫度降低至50-60°C，以使得引物與互補鏈退火；聚合酶通過在通常被稱為延伸 (extension)的步驟中延長所述引物來完成該過程。PCR反應中使用的酶已經從嗜熱生物分離，且因此在高溫下是穩定的。然而，即使這些高熱穩定的酶也可能由於化學劑、蛋白酶或環境變化而失活。使用熱穩定的酶，如同其他酶一樣，常常需要伴隨使用變性條件例如高溫如對於 PCR的情況、具有次優濃度的輔因子和底物的含水混合物和最大酶活性的非最佳的pH。該情況表明，酶的穩定化是強烈所需的且對於酶的長期保存來說是必需的，尤其是如果連同其他試劑和用於擴增核酸的即用反應混合物一起被包括在含水混合物中。許多用於穩定聚合酶的技術是已知的且已經被描述在專利和申請中。所述技術包括酶的化學改性、在固相支持體上的固定、適體的使用、酶的基因工程和穩定劑的加入。已經證明穩定活性的一組物質是表面活性劑，表面活性劑在酶的活性形式和包含它們的水環境之間的界面處起作用。分子生物學技術中使用的穩定酶的常用方法是通過將每一種酶的液體製劑儲存在-20°C下的包含50%甘油和還原劑例如二硫蘇糖醇(DTT)或β-巰基乙醇的溶液中。該程序足以保存酶的活性達幾個月，且活性損失最小。相比之下，當儲存在室溫或在+4°C下時，酶活性迅速地損失。
非離子型洗滌劑例如Triton X_100和Tween 20已經被表明穩定DNA聚合酶活性。 專利申請EP 776，970A1描述了包括Tween 20 和NP-40 的非離子型洗滌劑穩定熱穩定的 DNA聚合酶的活性的用途。已表明低濃度的十二烷基硫酸鈉(SDQ穩定酶活性。使酶能夠容忍長時間暴露於室溫或簡短暴露於較高溫度的保存酶的方法，仍然是對於郵政託運的更容易的和更成本有效的管理和新領域中的利用的唯一的現實限制。酶且尤其是聚合酶，包括衍生自嗜熱生物的聚合酶，即通常用於聚合酶鏈反應(PCR)的聚合酶， 至今已經在低於+2-8°C且通常在-20°C的溫度下被運輸。在用於保存生物材料的方法中，冷凍乾燥至今已經用於保存食品、細胞、生物膜、 生物大分子，且甚至是酶。冷凍乾燥方法包括從被凍結的樣品除去水，S卩，在低於室內壓力條件下不經過液態蒸發固體的含水組分。蛋白製劑在被乾燥之前通常被凍結以減少由於乾燥弓I起的結構變形。不完全乾燥的冷凍乾燥，即還包含低百分比的水的冷凍乾燥，比完全乾燥的冷凍乾燥似乎確保更好的保存，尤其是如果隨後在不高於+4-10°C的溫度下保存時。然而，甚至在這些條件下，存在少量的酶活性損失。然而，一些酶例如聚合酶在沒有冷凍保護劑下冷凍乾燥之後完全失活，與冷凍乾燥的類型(乾燥或以其他方式)無關。許多具有冷凍防護活性的物質或添加劑已經用於或被建議用於穩定聚合酶。例如，US 5，614，387和US 5，834，2M描述了用於製備用來擴增核酸的穩定的凍幹酶組合物的方法和組合物，其中海藻糖和/或聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)用作防凍劑。已知技術的分析和目前出售的產品表明，保存聚合酶的問題和簡化聚合鏈反應混合物的製備(和因此甚至在實驗室環境中PCR反應的標準化)的潛力是時下非常關注的和在連續的開發中。市售的被稱為puRe Taq Ready-To-Go PCR Beads (GE Healthcare)的系統由用於標準PCR擴增的單一劑量的預混合凍幹製劑組成。然而，該系統具有用被描述為先導酶(leading enzyme)的特異性Taq聚合酶(puRe Taq聚合酶)來製備的由於其穩定性和純度的限制。相反，本發明的所建議的方法可以與所有的聚合酶一起使用，因為纖維二糖能夠穩定和保護所有的Taq聚合酶，不管是簡單的聚合酶還是熱啟動聚合酶(Hot Start Polymerase)或甚至它們的活性片段例如Klenow。概述本發明涉及適合於用適當的溶劑稀釋的乾燥或凍幹的組合物，該組合物包含被穩定為經得起冷凍乾燥和在高達的溫度下儲存的核酸聚合酶，其特徵在於，所述組合物具有在0. 01至250單位(0，4-10000U/ml)範圍內的核酸聚合酶濃度、在50mM(17, 115g/L) 至500mM(171，15g/L)範圍內的濃度的纖維二糖和緩衝液。所述核酸聚合酶是優選地選自由以下組成的組的DNA聚合酶Taq聚合酶、熱啟動聚合酶或它們的活性片段。所述組合物還被稱為「凍幹和即用的擴增混合物」或「Universal Master Mix」。本發明的另外的方面涉及適合於用適當的溶劑稀釋的組合物，該組合物包含被穩定為經得起冷凍乾燥和在高達的溫度下儲存的核酸聚合酶，其特徵在於，所述組合物具有在0. 01至250單位範圍內的核酸聚合酶濃度、在50至500mM範圍內的濃度的纖維二糖、緩衝液、dNTP、KCl 和 MgCl2。本發明還涉及組合物用於核酸的擴增尤其是用於分子生物學應用的用途，分子生物學應用例如但不限於，PCR、實時PCR、熔解曲線分析、高解析度熔解曲線分析、測序、定量螢光PCR、多重PCR、全基因組擴增、等溫擴增。本發明還另外涉及用於核酸的擴增的方法，該方法包括以下步驟i.在水中或在緩衝液中重構本發明的組合物； 加入靶DNA特異性引物；iii.加入核酸模板；iv任選地加入選自由以下組成的組的試劑中的一種或多種KC1、MgCl2, dNTP、至少一種任選地被標記的探針、還原劑和另外的穩定劑。本發明還提供即用產品，該產品包含根據本發明的乾燥或凍幹的組合物和用於重構所述組合物的溶劑。此外，本發明包括用於DNA樣品的PCR擴增的試劑盒，該試劑盒包含根據本發明的組合物和任選的關於聚合酶鏈反應中的酶的重構和使用的說明書。本發明的特別優選的實施方式由纖維二糖用於在冷凍乾燥和在高達55°C的溫度下長期儲存期間保存核酸聚合酶的用途組成。附圖描述

圖1.在完成冷凍乾燥過程之後立即進行的凍幹和即用的擴增混合物的瓊脂糖凝膠電泳圖。泳道1-6 用來自公司X的熱啟動聚合酶製備的凍幹和即用的組合物擴增的PCR 產物；在冷凍乾燥之前的體積25 μ 1 (泳道1-3)或9. 1 μ 1 (泳道4-6)。泳道7_12 用公司 Y的熱啟動DNA聚合酶製備的凍幹和即用混合物獲得的擴增產物；在冷凍乾燥之前的體積 25 μ 1 (泳道7-9)或7. 5 μ 1 (泳道10-12)。泳道13-15 用獲自公司X的聚合酶製備的凍幹和即用的擴增混合物獲得的PCR產物；在冷凍乾燥之前的體積25μ 1。M 分子量標記物"BenchiTop PCR 標記物」，Promega。PCR產物268bp 人類β -珠蛋白基因的片段；240bp ；瘧原蟲(Plasmodium spp) 18s RNA基因的片段。圖2.在室溫下或在37°C下保存三個星期之後的凍幹和即用的擴增混合物的瓊脂糖凝膠電泳圖。泳道1-8 用包含公司X的熱啟動DNA聚合酶的擴增混合物獲得的擴增產物；在冷凍乾燥之前的體積25 μ 1 (泳道1-4)或9. 1 μ 1 (泳道5-8)。泳道9_12 用包含公司X的DNA聚合酶的凍幹和即用的反應混合物獲得的擴增產物；在冷凍乾燥之前的體積 25 μ 1。在室溫下(泳道1-3、5-7、9-11)或在37°C下(泳道4、8、12)保存三個星期。M 分子量標記物"BenchiTop PCR 標記物」，Promega。PCR產物268bp 人類β-珠蛋白基因的片段；240bp ；瘧原蟲18s RNA基因的片段。圖3.在完成冷凍乾燥過程之後立即進行的凍幹和即用的擴增混合物的瓊脂糖凝膠電泳圖。凍幹和即用的混合物包含(i)公司W的反應緩衝液(泳道1-4)、公司X的反應緩衝液(泳道5-8)、公司R的反應緩衝液(泳道9-12)或公司Y的反應緩衝液(泳道 13-19) ； (ii)獲自公司W的熱啟動DNA聚合酶(泳道1、5、9和13)、獲自公司Y的熱啟動 DNA聚合酶(泳道2、6、10、14、17、18和19)、獲自公司X的熱啟動DNA聚合酶(泳道3、7、11和15)或獲自公司R的熱啟動DNA聚合酶(泳道4、8、12和16)。泳道17、18和19的擴增產物用還分別包含 0. 25% NP-40 和 0. 25% Tween-20、IOOmM 蔗糖和 0. 25% NP_40、0. 25% Tween-20和IOOmM蔗糖的凍幹和即用的混合物獲得。M 分子量標記物"BenchTop PCR 標記物」,Promega0PCR產物268bp 人類β-珠蛋白基因的片段；240bp ；瘧原蟲18s RNA基因的片段。圖4.在室溫下保存六個星期之後的凍幹和即用的擴增混合物的瓊脂糖凝膠電泳圖。凍幹和即用的混合物分別包含(i)公司W的反應緩衝液(泳道1-4)、公司X的反應緩衝液(泳道5-8)、公司R的反應緩衝液(泳道9-12)或公司Y的反應緩衝液(泳道13-19)； (i i)獲自公司W的熱啟動DNA聚合酶(泳道1、5、9和13)、獲自公司Y的熱啟動DNA聚合酶 (泳道2、6、10、14、17、18和19)、獲自公司X的熱啟動DNA聚合酶(泳道3、7、11和15)或獲自公司R的熱啟動DNA聚合酶(泳道4、8、12和16)。泳道17、18和19的擴增產物用還分別包含 0. 25% NP-40 和 0. 25% Tween-20UOOmM 蔗糖和 0. 25% NP_40、0. 25% Tween-20 和IOOmM蔗糖的凍幹和即用的混合物獲得。M 分子量標記物"BenchiTop PCR 標記物」，Promega。PCR產物268bp 人類β-珠蛋白基因的片段；240bp ；瘧原蟲18s RNA基因的片段。圖5.在完成冷凍乾燥過程之後立即進行的包含250mM蔗糖的凍幹和即用的擴增混合物的瓊脂糖凝膠電泳圖。凍幹和即用的混合物包含(i)公司X的反應緩衝液(泳道 1、8和9)、公司W的反應緩衝液(泳道2、3、14-17)、公司R的反應緩衝液(泳道4、5、10-13) 或公司Y的反應緩衝液(泳道6、7、18-21) ； (ii)獲自公司X的熱啟動DNA聚合酶(泳道 1-7)或獲自公司R的熱啟動DNA聚合酶(泳道8-21)。在泳道1、2、4、6、8、10、14和18中使用的凍幹和即用的混合物中，沒有加入物質；在泳道3、5、7、11、15和19的凍幹和即用的混合物中，將250mM蔗糖加入反應緩衝液；在泳道9、12、16和20的凍幹和即用的混合物中， 將250mM蔗糖加入儲存緩衝液，而在泳道13、17和21的凍幹和即用的混合物中，將250mM 蔗糖加入反應緩衝液和儲存緩衝液兩者中。M 分子量標記物"BenchiTop PCR 標記物」，Promega。PCR產物268bp 人類β-珠蛋白基因的片段；240bp ；瘧原蟲18s RNA基因的片段。圖6.在室溫下保存八個星期之後的包含250mM蔗糖的凍幹和即用的擴增混合物的瓊脂糖凝膠電泳圖。凍幹和即用的混合物包含⑴公司X的反應緩衝液(泳道1、8和9)、公司W的反應緩衝液(泳道2、3、14-17)、公司R的反應緩衝液(泳道4、5、10-13)或公司Y的反應緩衝液(泳道6、7、18-21) ； (ii)獲自公司X的熱啟動DNA聚合酶(泳道1_7)或獲自公司R的熱啟動DNA聚合酶(泳道8-21)。在泳道1、2、4、6、8、10、14和18中使用的凍幹和即用的混合物中，沒有加入物質；在泳道3、5、7、11、15和19的凍幹和即用的混合物中，將250mM蔗糖加入反應緩衝液；在泳道9、12、16和20的凍幹和即用的混合物中，將250mM蔗糖加入儲存緩衝液，而在泳道13、17和21的凍幹和即用的混合物中，將250mM蔗糖加入反應緩衝液和儲存緩衝液兩者。
M 分子量標記物"BenchiTop PCR 標記物」，Promega。PCR產物268bp 人類β-珠蛋白基因的片段；240bp ；瘧原蟲18s RNA基因的片段。圖7.在完成冷凍乾燥過程之後的包含下面所描述的穩定劑的凍幹和即用的擴增混合物的瓊脂糖凝膠電泳圖。凍幹和即用的混合物包含獲自公司W(泳道1-5)或獲自公司 R(泳道6-10)的反應緩衝液和熱啟動DNA聚合酶。作為穩定劑被加入至凍幹和即用的混合物中的是200mM海藻糖(泳道2和7)、250mM蔗糖(泳道3和8)、200mM麥芽糖(泳道4 和9)或0. 025%瓊脂糖(5和10)。沒有將物質加入到泳道1和6中使用的凍幹和即用的混合物。M 分子量標記物"BenchiTop PCR 標記物」，Promega。PCR產物268bp 人類β-珠蛋白基因的片段；240bp ；瘧原蟲18s RNA基因的片段。圖8.在室溫下或在37°C下保存一個星期之後的凍幹和即用的擴增混合物的瓊脂糖凝膠電泳圖。凍幹和即用的混合物包含獲自公司W(泳道1-5)或獲自公司R(泳道 6-10)的反應緩衝液和熱啟動DNA聚合酶。作為穩定劑被加入至凍幹和即用的混合物中的是200mM海藻糖(泳道2和7)、250mM蔗糖(泳道3和8)、200mM麥芽糖(泳道4和9)或 0. 025%瓊脂糖(5和10)。沒有將物質加入到泳道1和6中使用的凍幹和即用的混合物。M 分子量標記物"BenchTop PCR 標記物」,Promega0PCR產物268bp 人類β-珠蛋白基因的片段；240bp ；瘧原蟲18s RNA基因的片段。圖9.在完成冷凍乾燥過程之後立即進行的包含穩定劑的凍幹和即用的擴增混合物的瓊脂糖凝膠電泳圖。凍幹和即用的混合物包含獲自公司W (泳道1-5)或獲自公司R (泳道6-10)的反應緩衝液和熱啟動DNA聚合酶。被加入至凍幹和即用的混合物中的是250mM 海藻糖(泳道2和7)、6. 6%右旋糖(泳道3和8)、200mM纖維二糖(泳道4和9)或6. 6% 支鏈澱粉(5和10)。沒有將物質加入到泳道1和6中使用的凍幹和即用的混合物。M 分子量標記物"BenchiTop PCR 標記物」，Promega。PCR產物268bp 人類β-珠蛋白基因的片段；240bp ；瘧原蟲18s RNA基因的片段。圖10.在37°C下保存一個星期之後的包含穩定劑的凍幹和即用的擴增混合物的瓊脂糖凝膠電泳圖。凍幹和即用的混合物包含獲自公司W(泳道1-5)或獲自公司R(泳道 6-10)的反應緩衝液和熱啟動DNA聚合酶。被加入至凍幹和即用的混合物中的是250mM海藻糖(泳道2和7)、6. 6%右旋糖(泳道3和8)、200mM纖維二糖(泳道4和9)或6. 6%支鏈澱粉(5和10)。沒有將物質加入到泳道1和6中使用的凍幹和即用的混合物。M 分子量標記物"BenchTop PCR 標記物」,Promega0PCR產物268bp 人類β-珠蛋白基因的片段；240bp ；瘧原蟲18s RNA基因的片段。圖11.在完成冷凍乾燥過程之後立即進行的包含纖維二糖的凍幹和即用的擴增混合物的瓊脂糖凝膠電泳圖。凍幹和即用的混合物包含獲自公司W(泳道1-5)或獲自公司 R(泳道6-10)的反應緩衝液和熱啟動DNA聚合酶。被加入至凍幹和即用的混合物中的是250mM海藻糖(泳道2和7)、6. 6%右旋糖(泳道3和8)、200mM纖維二糖(泳道4和9)或 6. 6%支鏈澱粉(5和10)。沒有將物質加入到泳道1和6中使用的凍幹和即用的混合物。M 分子量標記物"BenchTop PCR 標記物」,Promega0PCR產物268bp 人類β-珠蛋白基因的片段；240bp ；瘧原蟲18s RNA基因的片段。圖12.在37°C下保存兩個星期之後的包含纖維二糖的凍幹和即用的擴增混合物的瓊脂糖凝膠電泳圖。凍幹和即用的混合物包含獲自公司R的反應緩衝液和熱啟動DNA聚合酶(泳道1-13)。將不同濃度(mM)的纖維二糖加入凍幹和即用的混合物0(泳道1)、 50 (泳道 2)、100 (泳道 3)、150 (泳道 4)、200 (泳道 5)、250 (泳道 6)、300 (泳道 7)、350 (泳道 8)、400(泳道 9)、450(泳道 10)、500(泳道 11)、600(泳道 12)、700(泳道 13)。M 分子量標記物"BenchiTop PCR 標記物」，Promega。PCR產物268bp 人類β-珠蛋白基因的片段；240bp ；瘧原蟲18s RNA基因的片段。圖13.在完成冷凍乾燥過程之後立即進行的包含纖維二糖或海藻糖的凍幹和即用的擴增混合物的瓊脂糖凝膠電泳圖。凍幹和即用的混合物包含獲自公司R的反應緩衝液和熱啟動DNA聚合酶(泳道1-16)。被加入至凍幹和即用的混合物中的是100mM纖維二糖 (泳道1-5)、200mM纖維二糖(泳道6_10)或200mM海藻糖(泳道12-16)。沒有將物質加入到泳道11中使用的凍幹和即用的混合物。M 分子量標記物"BenchiTop PCR 標記物」，Promega。PCR產物268bp 人類β-珠蛋白基因的片段；240bp ；瘧原蟲18s RNA基因的片段。圖14.在37°C下保存兩個星期之後的包含纖維二糖或海藻糖的凍幹和即用的擴增混合物的瓊脂糖凝膠電泳圖。凍幹和即用的混合物包含獲自公司R的反應緩衝液和熱啟動DNA聚合酶(泳道1-15)。被加入至凍幹和即用的混合物中的是100mM纖維二糖(泳道 1-5)、200mM纖維二糖(泳道6-10)或200mM海藻糖(泳道11-15)。M 分子量標記物"BenchiTop PCR 標記物」，Promega。PCR產物268bp 人類β-珠蛋白基因的片段；240bp ；瘧原蟲18s RNA基因的片段。圖15.在55°C下保存24小時(泳道1和6)、48小時(泳道2和7)、72小時(泳道3和8)、96小時或一個星期(泳道5和10)之後的包含纖維二糖或海藻糖的凍幹和即用的擴增混合物的瓊脂糖凝膠電泳圖。凍幹和即用的混合物包含獲自公司R的反應緩衝液和熱啟動DNA聚合酶(泳道1-10)。M 分子量標記物"BenchiTop PCR 標記物」，Promega。PCR產物268bp 人類β-珠蛋白基因的片段；240bp ；瘧原蟲18s RNA基因的片 段。在所有的圖中，「M」對應於Promega公司的分子量標記物「Bench TopPCR標記物」 的泳道；所述標記物的片段從50bp至IOOObp變化。圖16.用凍幹和即用的擴增混合物和用參考方法獲得的野生型(Wt)DNA對照樣品 (Cl)、未知的DNA樣品(C2)、突變體DNA對照樣品(C3)以及無模板對照(N)擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖16a.在擴增產物的純化程序之前的結果。圖16b.在擴增產物的純化程序之後的結果。圖17.直接測序結果。圖17a.用凍幹和即用的擴增混合物獲得的野生型和突變體序列擴增產物的直接測序結果。圖17b.用參考方法獲得的野生型和突變體序列擴增產物的直接測序結果。圖 18. PCR 和實時 PCR圖18a(i).用凍幹和即用的擴增混合物獲得的野生型(Wt)DNA對照樣品(Cl)、未知的DNA樣品(C2)、突變體DNA對照樣品(O)以及無模板對照(N)擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖18a(ii).用凍幹和即用的擴增混合物獲得的實時PCR起始曲線(take off curve)；圖18a(iii).用凍幹和即用的擴增混合物獲得的實時PCR定量比較結果。圖18b(i).用參考方法獲得的野生型(Wt)DNA對照樣品(Cl)、未知的DNA樣品 (C2)、突變體DNA對照樣品(C3)和無模板對照(N)擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖18b(ii).用參考方法獲得的實時PCR起始曲線；圖18b (iii).用參考方法獲得的實時PCR定量比較結果。圖19a.用凍幹和即用的擴增混合物獲得的熔解曲線分析結果；圖19b.用參考方法獲得的熔解曲線分析結果。圖20a.用凍幹和即用的擴增混合物獲得的高解析度熔解曲線分析(HRM)結果；圖20b.用參考方法獲得的高解析度熔解曲線分析(HRM)結果。圖21a.用凍幹和即用的擴增混合物獲得的定量螢光(QF)酶蛋白色層圖 (pherogram)結果；圖21b.用參考方法獲得的定量螢光(QF)酶蛋白色層圖結果。發明詳述定義為了利於理解本發明，在下面定義了一些術語。術語「穩定劑」意指相比於在沒有穩定劑下保存材料，當被加入至生物學上活性材料時可以防止或延遲活性隨時間損失的劑。術語「聚合酶」是指能夠從DNA模板和可用的核糖核苷三磷酸或脫氧核苷三磷酸合成核酸鏈(RNA或DNA)的酶或其活性片段。術語「聚合酶活性」是指酶由核糖核苷三磷酸或脫氧核苷三磷酸開始合成核酸鏈 (RNA或DNA)的能力。術語「緩衝液」或「緩衝劑」是指當被加入至溶液時給予該溶液對PH變化的抵抗性的物質或製劑。術語「還原劑」是指電子供體，S卩，將電子貢獻給第二物質以還原第二物質的原子中的一個或多個的氧化態的物質。術語「溶液」是指含水的或非含水的混合物。
術語「緩衝溶液」是指包含緩衝劑的溶液。術語「反應緩衝液」是指在其中進行酶反應的緩衝溶液。術語「儲存緩衝液」是指在其中保存酶的緩衝溶液。術語「模板」是指分析「靶」的存在的起源於生物樣品的核酸。術語「靶」是指當根據分子生物學技術使用時，被用於擴增反應的特異性引物識別的核酸的區。在用於診斷用途的PCR的情況下，靶DNA由病原體的核酸組成。術語「引物」或觸發劑是指當在誘導核酸合成的條件(存在核苷酸和聚合酶)下使用時能夠作為合成的觸發劑的合成的寡核苷酸。術語dNTP (脫氧核苷三磷酸)是指脫氧腺苷、脫氧胸苷、脫氧鳥苷和脫氧胞苷的混合物，其中指出了脫氧核苷三磷酸中的每一種的濃度。術語「PCR產物」或「擴增片段」是指由以下步驟的兩個或更多個PCR循環，即鏈聚合，產生的通常雙螺旋的DNA片段模板DNA鏈的變性、其與特異性引物的退火和與模板 DNA互補的鏈由引物的OH末端開始的延伸或延長。詳細描述本發明涉及二糖纖維二糖用於在冷凍乾燥(或乾燥)期間穩定核酸聚合酶尤其是 DNA聚合酶、熱啟動DNA聚合酶、RNA聚合酶或它們的活性片段和長時間地以該形式保存它們的用途。在一個優選的方面，本發明涉及適合於用適當的溶劑稀釋的乾燥或凍幹的組合物，該組合物包含被穩定為經得起冷凍乾燥和在高達的溫度下的儲存的核酸聚合酶，其特徵在於，所述組合物具有在0. 01至250單位的範圍內的核酸聚合酶濃度、在 50mM(17, 115g/L)至500mM(171，15g/L)範圍內的濃度的纖維二糖和緩衝液，其中緩衝液優選地是Tris HCl0所述核酸聚合酶是優選地選自由以下組成的組的DNA聚合酶Taq聚合酶、熱啟動聚合酶或它們的活性片段。所述組合物還被稱為「凍幹和即用的擴增混合物」或「Universal Master Mix」。乾燥或凍幹的組合物通過從液體或凍結混合物冷凍乾燥(或乾燥)來獲得，其中纖維二糖的濃度包括在50mM和500mM之間或包括在150mM(51, 345g/L)和250mM(85, 575g/ L)之間或優選地為250mM，且其中核酸聚合酶濃度在0. 01至250單位的範圍內或優選地為至少2單位。用於冷凍乾燥的纖維二糖優選地具有分析等級。在一個優選的方面，本發明涉及適合於用適當的溶劑稀釋的組合物，該組合物包含被穩定為經得起冷凍乾燥和在高達的溫度下的儲存的核酸聚合酶，其特徵在於，所述組合物具有在0. 01至250單位的範圍內的核酸聚合酶濃度、在50至500mM範圍內的濃度的纖維二糖、緩衝液、dNTP, KCl和MgCl2,其中緩衝液優選地是Tris HCl0根據一個實施方式，組合物優選地包含PCR中即用形式的酶，甚至更優選地以下試劑中的至少一種i.穩定劑，其選自由以下組成的組表面活性劑、離子型洗滌劑或非離子型洗滌劑例如NP40、Tween 20或Triton-XlOO和/或非還原糖例如右旋糖、蔗糖、海藻糖； 還原劑，其選自由以下組成的組β -巰基乙醇、DTT或硫酸銨；iii.至少一種探針，其任選地被標記。任選地，當凍幹組合物用於實時PCR時，該凍幹組合物可以包含可以用例如螢光基團標記的探針，所述探針選自由以下組成的組TaqMan探針 、分子Beacons 、 Scorpions探針 、HiBeacon探針 或可用於實時PCR的其他探針。當在水中或在包含DNA的緩衝系統中重構本發明的組合物時，纖維二糖的濃度包括在50mM和500mM之間，或包括在150mM和250mM之間或優選地為250mM，且在該濃度下其不會干擾基因擴增反應。甚至更優選地，組合物由即用的凍幹或乾燥製劑組成，該凍幹或乾燥製劑包含在優選的實施方式中描述的所有試劑且被預先製備，在單一容器例如管或微板(microplate) 中或大批地重構之後立即用於基因擴增。本發明還涉及組合物用於可以自動化方式進行的核酸的擴增尤其是用於分子生物學應用的用途，分子生物學應用例如但不限於，PCR、實時PCR、熔解曲線分析、高解析度熔解曲線分析、測序、定量螢光PCR、多重PCR、全基因組擴增、等溫擴增。本發明還提供即用產品，該產品包含根據本發明的乾燥或凍幹的組合物和用於重構所述組合物的溶劑。根據本發明製備的凍幹組合物導致由該凍幹組合物進行的PCR過程的相當大的簡化，因而使得汙染問題能夠被預防，但主要提供關於反應所需要的核酸體積的相當大的靈活性，且因此測試穩健性顯著增加。該最後方面在法學上(forensic science)是特別令人感興趣的，因為更大體積的核酸可以與凍幹組合物一起使用。此外，包含聚合酶的組合物的室溫穩定性的相當大的增加意味著，對獸醫和人類診斷領域以及食品分析領域特別關注的應用變成可能，尤其是如果在非裝備精良的設施中進行時。這些用途因此是特別優選的。組合物在高達55°C的溫度下儲存的穩定性的增加還提供了裝運和儲存的更大的靈活性。本發明還進一步涉及用於核酸的擴增的方法，該方法包括以下步驟v.在水中或在緩衝液中重構本發明的組合物；vi.加入靶DNA特異性引物；Vii加入核酸模板；viii.任選地加入選自由以下組成的組的試劑中的一種或多種KCl、MgCl2、dNTP、 至少一種任選地被標記的探針、還原劑和另外的穩定劑。本發明的另外的方面涉及一種用於製備包含在室溫下穩定的聚合酶，優選地DNA 聚合酶，且甚至更優選地Taq聚合酶或還更優選地熱啟動聚合酶的乾燥或凍幹的組合物的方法，該方法基本上由以下來表徵根據被定義為「最低限度(minimal) 」的方案將所述酶 (或所述多種酶)與在50mM和500mM之間，優選地在150mM和250mM之間的濃度的纖維二糖混合在可以由例如Tris-HCl組成的冷凍乾燥和儲存緩衝液中，且優選地在迅速凍結之後使該溶液經歷冷凍乾燥或乾燥。加入至少1-5IU的量的酶最低限度方法還提供在冷凍乾燥之前優選地選自由 KCUMgCl2組成的組的鹽的加入。本發明的優點之一是，藉助於纖維二糖穩定的系統來適應來自不同製造公司的所有DNA聚合酶。此外，纖維二糖通過由纖維素開始的酶促水解系統來生產，所述纖維二糖是由植物源的葡萄糖(糖)的長鏈組成的分子。植物源保證沒有源自於細菌汙染的可能的核酸汙染物，當如在海藻糖的情況下，生產包括將細菌培養物用於其合成時，細菌汙染是可能的。存在將一種或多種酶和單獨的或與其他組分一起的穩定劑(纖維二糖)混合的許多系統，這些系統都可適用。例如，將包含溶解的酶的溶液與穩定劑一起加入的方法，或將包含酶的溶液與包含穩定劑的第二溶液混合的方法，或將酶溶解在包含穩定劑的溶液中的方法以及將包含酶和穩定劑兩者的溶液作為液體或凍幹形式保存的另一種方法。根據本領域專家已知的標準進行冷凍乾燥。用於冷凍乾燥的可能的方案的實例如下長時間的冷凍乾燥方案·從+20°C至_40°C的梯度，在5分鐘內·_40 ，3 小時·從_40°C至-10°C的梯度，在30分鐘內·_10 ，4 小時·從-10°C至+10°C的梯度，在15分鐘內.+101:,2 小時·從+10°C至+30°C的梯度，在15分鐘內·+30°C，4_8 小時。冷凍乾燥可以根據以下較短的方案來進行，由於所涉及的體積小，這也可適用。用於冷凍乾燥的可能的方案的實例如下短時間的冷凍乾燥方案·從 +20°C至 _40°C 的梯度，在 5min 內『 -40°C,30min·從 _40°C至-10°C 的梯度，在 15min 內『 -IO0C, 30min·從-10°C至+10°C 的梯度，在 15min 內『 +10°C,60min·從+10°C至+30°C的梯度，在 15min 內·+30°C,60min。當酶未被儲存在甘油中時，特別指定短的凍結-乾燥方案，而無論酶是否被儲存在甘油中，都可以使用長的凍結-乾燥方案。在另外的和優選的實施方式中，尤其是對於診斷用途，本發明涉及一種用於製備冷凍乾燥聚合酶的即用形式的組合物的方法，該方法包括以下步驟-根據被定義為「最低限度的」方案，將酶與包括在50和500mM之間，優選地在150 和250mM之間的濃度的纖維二糖(或反之亦然)混合在可以由例如Tris-HCl組成的冷凍乾燥和儲存緩衝液中，-加入優選地選自由以下組成的組的鹽KC1、Tris-HCl、MgCl2,-任選地加入以下物質OdNTP,〇引物，優選地對樣品中存在的靶DNA具有特異性的至少一種5』引物(正向)和一種3』引物(反向)，
〇任選地加入選自由以下組成的組的另外的穩定劑離子型洗滌劑或非離子型洗滌劑例如NP40、Tween-20和/或非還原糖例如右旋糖、蔗糖、海藻糖、或諸如DTT或β -巰基乙醇的還原劑，-優選地在迅速凍結之後如上所指出的冷凍乾燥(或乾燥)，和保存該形式的酶。該方法還可以包括在冷凍乾燥之前加入聚合鏈反應的對照DNA和特異性引物。術語穩定劑意指洗滌劑(或表面活性劑)例如ΝΡ-40(烷基酚乙氧基化物)、 Tween-20(山梨聚糖-聚氧乙基化物單月桂酸酯)或Triton-XlOO或其類似物，以及非還原糖例如右旋糖、蔗糖、海藻糖。另外的試劑可以被單獨地加入或被預混合在反應混合物中，例如來自製造商的與酶一起被供應的另外的試劑，是比用於聚合反應的最終濃度濃縮η倍(通常xlO)。可以即用的凍幹形式的酶可以被維持在室溫下達若干月。這一形式的酶的冷凍乾燥和穩定性，可能地加上用於隨後的聚合酶鏈反應的特異性試劑，使得能夠製備包括在用緩衝液或用水重構之後被使用的乾燥和即用的形式的混合物的容器(管、試管或微板)，該緩衝液或水可能地包含樣品中的將被擴增的DNA/RNA模板 (如果存在的話)。該方面因此能夠使用於包括診斷用途的本發明的所有用途的隨後的擴增反應標準化。此外，冷凍乾燥和保存方案適合於傳統PCR和實時PCR的鏈擴增反應兩者，並因此用於定量類型用途和定性類型用途兩者。本發明的優點之一是，所使用的穩定劑(纖維二糖)對酶的冷凍乾燥和保存兩者有效，而已知領域的穩定劑通常用於一個目的或另一個目的。雖然可與用於該目的的其他分子相容，但是纖維二糖的使用使得其他「穩定」分子對於多個階段不是必須的。此外，因為纖維二糖比海藻糖更不可溶，所以還預期其吸溼性更差，且因此能夠給予凍乾產物優良的貯存期限。此外，本發明包括用於DNA樣品的PCR擴增的試劑盒，該試劑盒包含根據本發明的組合物和任選的關於聚合酶鏈反應中的酶的重構和使用的說明書。本發明的一個特別優選的實施方式由纖維二糖在凍結-乾燥和在高達55°C的溫度下長期儲存期間保存核酸聚合酶的用途組成。用於單一反應的所述凍幹組合物在最少體積的幾μ 1 Q-50，優選地5-30)中重構之後適用於擴增至少Ing的DNA樣品。還可以直接地在包含樣品的DNA的緩衝液中重構凍乾物(lyophilisate)。即用形式的凍幹組合物中或在酶重構之後立即被加入的反應混合物中的各種試劑的濃度，必須是使得對於通過PCR的DNA擴增來說，在用合適體積的水或緩衝液重構組合物之後是最佳的，即，優選地，其中KCl的濃度在20和150mM之間，MgCl2的濃度在0. 5和5mM之間，用於聚合反應和靶DNA的擴增的特異性引物的濃度在0. 05和0. 2mM之間，且dNTP的濃度在50 和200mM之間。包含凍幹形式的酶的這樣的試劑盒，可以維持在室溫下。本發明的另一個方面涉及纖維二糖在凍結-乾燥和在高達55°C的溫度下儲存期間保存DNA聚合酶，優選地熱啟動DNA聚合酶的用途。如上所述，酶的冷凍乾燥和酶的甚至以單一劑量或大批的即用反應混合物的形式的穩定性，允許鏈擴增反應條件更加標準化。因此，通過本發明變成可能的本發明組合物和冷凍乾燥方法的優選用途，涉及具體地用於確定生物流體或組織中寄生體的存在的診斷試劑盒的製備。因此，特別優選用於DNA樣品中的所述病原體的診斷鑑定的即用形式的凍幹或乾燥組合物，該組合物除了酶和纖維二糖以及上文定義的試劑(例如，鹽和dNTP)之外， 還包含瘧原蟲的靶DNA的特異性引物(對於物種惡性瘧原蟲(falciparum)、三日瘧原蟲 (malariae)、間日瘧原蟲(vivax)和卵形瘧原蟲(ovale)中的每一種為一對)，該特異性引物優選地被設計在ISsRNA的保守區，或利什曼原蟲(Leishmania)的靶DNA的特異性引物， 引物優選地被設計在ISsRNA的保守區，或另外的弓形體(Toxoplasma)的靶DNA的特異性引物，引物優選地被設計在高度重複區HRE。每一種即用形式的凍幹組合物還包含優選地對應於通常在參考系統中表達的基因例如優選地人類β -珠蛋白基因的引物對的內部擴增對照和任選的用於擴增的對照DNA 模板。優選地存在於以即用的形式生產的組合物中的另外的組分是在重構之後包括在20和150mM之間的最終濃度的KCl和在0. 05-5mM之間的MgCl2、優選地在5_20mM的 Tris-HCl緩衝液(pH 8. 0)、任選的0. 05-0. 2mM的濃度的用於在樣品中檢測需要存在的DNA 的擴增的特異性引物，和包括在50和200mM之間的濃度的dNTP。本文在一些具體的非限制性實施例中描述本發明的實施。實驗部分材料方法.在不另外和單獨指出的情況下，實驗部分中描述的冷凍乾燥組合物通常包含在適當的時間加入的以下具體的試劑DNA聚合酶(在1至5單位的範圍內)、由製造商供應的反應緩衝液、MgCl2、dNTP和引物。特定地，在本發明給出的實施例中，反應混合物包含用於擴增DNA中的兩個區的引物1)被設計在瘧原蟲的18s核糖體RNA基因(靶DNA)中的MObp (鹼基對)片段，2) 被設計在人類β-珠蛋白基因中、用作內部擴增對照(DNA對照)片段；鹽和dNTP。在冷凍乾燥之後，通過矽膠方法從對惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)呈陽性的外周血提取的約IOng (納克)基因組DNA被加入至凍幹混合物，並用無菌蒸餾水使最終的體積達到25μ1 (微升)。在94°C初始變性2分鐘之後，進行由變性(94°C，2分鐘)、退火(55°C，30秒)和延伸(72°C，45秒)組成的擴增循環。為了完成反應，進行40次如前所述的循環。所使用的冷凍乾燥方案之一由以下組成·從+20°C至_40°C的梯度，在5分鐘內·_40 ，3 小時·從-40°C至-10°C的梯度，在30分鐘內·_10 ，4 小時·從-10°C至+10°C的梯度，在15分鐘內.+101，2 小時·從+10°C至+30°C的梯度，在15分鐘內·+30°C，4_8 小時。
實施例1.在DNA聚合酶和熱啟動聚合酶之間的比較為了鑑別在冷凍乾燥過程之後維持良好的聚合酶活性的DNA聚合酶的類型，我們比較了商業DNA聚合酶和可從兩個不同的製造商得到的兩種熱啟動DNA聚合酶。在圖1中，泳道1至6示出用獲自公司X的熱啟動聚合酶製備的凍幹和即用混合物擴增的PCR產物；特定地，在冷凍乾燥之前的反應體積，對於泳道1至3，對應於25 μ 1，和對於泳道4至6，對應於9. 1 μ 1。泳道7至12對應於用獲自公司Y的熱啟動DNA聚合酶製備的凍幹和即用混合物獲得的擴增產物；特定地，在冷凍乾燥之前的反應體積，對於泳道7 至9，對應於25 μ 1，和對於泳道10至12，對應於7. 5 μ 1。泳道13至15對應於用獲自公司 X的聚合酶製備的凍幹和即用的擴增混合物獲得的PCR產物；反應體積是25 μ 1。在冷凍乾燥之前，沒有將穩定劑加入至反應混合物。如圖1所示的，在冷凍乾燥過程之後立即分析擴增產物，從泳道7至12可以看出， 包含獲自公司Y的熱啟動DNA聚合酶的混合物不能實現兩種預期擴增產物的擴增，然而獲自公司X的熱啟動聚合酶和非熱啟動聚合酶兩者(分別地1至6和13至1 在冷凍乾燥之後維持了它們的聚合酶活性。公司X在其自己的反應緩衝液中包括物理地增加溶液密度的物質，它們被單獨地和一般地被定義為穩定劑。為了評估用於PCR的用獲自公司X的聚合酶製備的凍幹和即用的混合物的熱穩定性，將相同的混合物在室溫下和在37°C下保存3個星期。照片2示出用包含公司X的熱啟動DNA聚合酶的擴增混合物獲得的擴增產物；特定地，在冷凍乾燥用於PCR的混合物之前的最終體積，對於泳道1至4，對應於25 μ 1，和對於泳道5至8，對應於9. 1 μ 1。泳道9至12示出用包含來自公司X的DNA聚合酶的凍幹和即用的反應混合物獲得的擴增產物；在冷凍乾燥之前的反應體積對應於25 μ 1。在冷凍乾燥之後將所述凍幹反應混合物在室溫下(泳道1至3、5至7、9至11)或在37°C下(泳道 4、8和12)保存3個星期。如照片中所示的，在室溫下3個星期之後，用包含熱啟動DNA聚合酶的混合物獲得的擴增產物(泳道1至3和5至7)證明比用簡單的DNA聚合酶獲得的那些(泳道9至11) 強度更大。此外，熱啟動DNA聚合酶不會導致引物二聚體的形成，這與其他聚合酶相反。最後，在37 °C下3個星期的保存之後，熱啟動DNA聚合酶維持其酶活性(泳道4和 8)，而簡單的DNA聚合酶不能維持其酶活性(泳道12)。因此，絕對肯定的是1)穩定劑的使用對於在冷凍乾燥過程期間保存DNA聚合酶的酶活性是關鍵的，2)對於擴增效率，熱啟動DNA聚合酶比正常DNA聚合酶更適合，但對於冷凍乾燥過程不是這樣，因為兩種類別的DNA聚合酶展示相似的行為，即，它們需要冷凍乾燥的穩定劑。最後，在該實驗中，在冷凍乾燥步驟之前測試2種不同的體積(25 μ 1和9. 1 μ 1)， 而在結果上沒有注意到任何變化。實施例2.在不同的熱啟動DNA DNA聚合酶之間的比較在以下實驗中，製備包含獲自4個不同公司(W、X、R、Y)的熱啟動DNA聚合酶的凍幹和即用的擴增混合物，每一個與它們的4種反應緩衝液或與加入的穩定劑例如NP-40、 Tween-20和蔗糖組合，總計19種組合。
在圖3和圖4中，泳道1至4、5至8、9至12和13至19表示使用分別包含獲自公司W、X、R或Y的反應緩衝液的凍幹的即用混合物通過PCR擴增的產物。在相同的圖中，泳道1、5、9和13對應於用包含獲自公司W的熱啟動DNA聚合酶的凍幹和即用的擴增混合物獲得的擴增產物；泳道2、6、10、14、17、18和19對應於用包含獲自公司Y的熱啟動DNA聚合酶的凍幹和即用的擴增混合物獲得的擴增產物；泳道3、7、11和15對應於用包含獲自公司 X的熱啟動DNA聚合酶的凍幹和即用的擴增混合物獲得的擴增產物；泳道4、8、12和16對應於用包含獲自公司R的熱啟動DNA聚合酶的凍幹和即用的擴增混合物獲得的擴增產物。 在圖3和圖4中，泳道17、18和19對應於用還分別包含0. 25% NP-40和0. 25% Tween-20、 IOOmM蔗糖和0. 25% NP_40、0. 25% Tween-20和IOOmM蔗糖的凍幹和即用的混合物獲得的擴增產物。圖3中呈現的PCR產物在完成冷凍乾燥方案之後立即使用凍幹和即用的混合物來擴增。相比之下，圖4示出在室溫下保存6個月的相同混合物的結果。如圖3中清楚地示出的，在冷凍乾燥之後就被監測的包含公司X的反應緩衝液的混合物維持了 4種聚合酶中的3種的酶活性，然而，對於第四種聚合酶，活性僅部分地被維持。用公司W或R的反應緩衝液製備的混合物保存4種聚合酶中的1種的活性。最後， 在獲自公司Y的反應緩衝液的存在下，沒有看到對應於兩種預期片段的擴增；在IOOmM蔗糖的存在下僅可以看到殘餘的酶活性。此外，在進行通過PCR擴增之前，將凍幹和即用的擴增混合物在室溫下保存6個星期。如圖4所示的，只有用公司X的反應緩衝液製備的凍幹混合物能夠保存所使用的四種熱啟動DNA聚合酶中的三種的酶活性。這些結果強調了在冷凍乾燥過程期間將穩定劑包括在PCR反應混合物中以便保存聚合酶的酶活性的重要性。實施例3.用於PCR的包含250mM蔗糖的凍幹和即用的組合物的穩定性為了評估凍幹PCR反應混合物的穩定性的改進，初步評估250mM蔗糖在儲存緩衝液中、在反應緩衝液中或在兩者中存在的影響。評估獲自兩個不同的公司的兩種不同的熱啟動DNA聚合酶。在圖5和圖6中，泳道1至7和泳道8至21表示用分別包含獲自公司X或R的熱啟動DNA聚合酶的凍幹和即用的反應混合物獲得的擴增產物。在圖5和圖6中，泳道1、8 和9對應於用公司X的反應緩衝液製備的凍幹和即用的反應混合物獲得的擴增產物；泳道 2和3和泳道14至17對應於用公司W的反應緩衝液製備的凍幹和即用的反應混合物獲得的擴增產物；泳道4和5和泳道10至13對應於用公司R的反應緩衝液製備的凍幹和即用的反應混合物獲得的擴增產物；泳道6和7和泳道18至21對應於用公司Y的反應緩衝液製備的凍幹和即用的反應混合物獲得的擴增產物。在圖5和圖6中，泳道3、5、7、11、15和 19表示用通過將250mM蔗糖加入至反應緩衝液中製備的凍幹和即用的反應混合物獲得的擴增產物；泳道9、12、16和20表示用通過將250mM蔗糖加入至儲存緩衝液中製備的凍幹和即用的反應混合物獲得的擴增產物；泳道13、17和21表示用通過將250mM蔗糖加入至反應緩衝液和儲存緩衝液中製備的凍幹和即用的反應混合物獲得的擴增產物。圖5中示出的擴增產物用在完成冷凍乾燥過程之後立即被利用的凍幹和即用的反應混合物來擴增，而圖6的結果與圖5的結果相同，但是在將凍幹和即用的混合物在室溫下保存8個星期之後。如圖5中顯著的，在反應緩衝液中但不在儲存緩衝液中存在250mM蔗糖對於在冷凍乾燥過程期間和在冷凍乾燥過程之後維持酶活性是必不可少的。在室溫下保存8個星期之後，酶活性的保存僅在半數情況(10個中的5個)下是可能的(圖6)。因此，可以推斷出，蔗糖對酶活性具有保護作用，雖然其對於長期保存來說並不有效。實施例4.用不同的穩定物質製備的凍幹組合物的穩定性為了比較包含不同的穩定劑的凍幹和即用的擴增混合物的熱穩定性，利用諸如二糖、多糖或碳水化合物的成分，它們被加入至如在引言所描述地製備的擴增混合物中。在圖7和圖8中，泳道1至5和泳道6至10表示用分別包含獲自公司W或R的熱啟動DNA聚合酶的凍幹和即用的擴增混合物獲得的擴增產物。在圖7和圖8中，泳道1和 6、2和7、3和8、4和9、以及5和10對應於分別包含以下物質的凍幹和即用的擴增混合物 無穩定劑；200mM海藻糖、250mM蔗糖、200mM麥芽糖和0.025%瓊脂糖。圖7中示出的擴增產物在完成冷凍乾燥過程之後立即用凍幹和即用的擴增混合物來獲得，而圖8中示出的結果與圖7的結果相同，但在將凍幹和即用的反應混合物在37°C 下保存一個星期之後。250mM蔗糖、200mM海藻糖、200mM麥芽糖和0. 025%瓊脂糖在凍幹和即用的反應混合物中的存在最初通過使用獲自兩個不同公司的兩種不同的熱啟動DNA聚合酶來評估。如圖7中顯著的，海藻糖、蔗糖和麥芽糖(分別地泳道2和7、3和8以及4和9)在凍幹和即用的反應混合物中的存在使得兩種酶的酶活性被保存，雖然該作用好像不如對獲自公司R 的酶(泳道7、8和9)有效；這對於蔗糖(泳道8)是特別明顯的。對於瓊脂糖，沒有記錄到擴增帶(圖7，泳道5和10)。此外，在通過PCR處理之前，凍幹和即用的混合物在37°C下被保存一個星期。包含200mM海藻糖的凍幹混合物維持了兩種熱啟動DNA聚合酶(圖8，泳道 2和7)的完整酶活性，而具有250mM蔗糖和0. 025%瓊脂糖的那些凍幹混合物則沒有(圖 8，分別地泳道3和8、5和10)。200mM的麥芽糖維持一種聚合酶的活性(圖8，泳道9)，但僅部分地維持其他聚合酶的活性。然後在相同的兩種聚合酶上評估在被凍幹之前被加入至反應混合物中的250mM 海藻糖、6. 6%右旋糖、200mM纖維二糖(Fluka Analytical22150D-(+)-纖維二糖)和6. 6% 支鏈澱粉的作用。在圖9和圖10中，泳道1至5和泳道6至10表示用分別獲自公司W或R的熱啟動DNA聚合酶製備的凍幹和即用的反應混合物獲得的擴增產物。在圖9和圖10中，泳道1 和6、2和7、3和8、4和9、5和10對應於分別包含以下物質的凍幹和即用的反應混合物無穩定劑、250mM海藻糖、6. 6%右旋糖、200mM纖維二糖或6. 6%支鏈澱粉。圖9中的結果對應於在已經完成冷凍乾燥過程之後立即被處理的凍幹混合物，而圖10中示出的結果對應於與先前的反應混合物相同的時間被製備但在37°C下被保存一個星期的具有相同特徵的反應混合物。如圖9所示的，將海藻糖和纖維二糖引入凍幹反應混合物中保存了兩種熱啟動 DNA聚合酶的酶活性(分別地泳道2和7、4和9)，而右旋糖和支鏈澱粉僅保護兩種酶中的一種(分別地泳道3和8、5和10)。此外，具有相同的特徵和在與先前的反應混合物相同的時間被製備的反應混合物在通過PCR處理之前，在37°C下被保存一個星期。包含作為穩定劑的250mM海藻糖和200mM纖維二糖的凍幹反應混合物保護兩種聚合酶的酶活性(圖10， 分別地泳道2和7、4和9)，而6. 6%右旋糖和6. 6%支鏈澱粉不保存兩種聚合酶的酶活性 (圖10，分別地泳道3和8、5和10)。此外，還評估0.5%白蛋白、2%白蛋白和3%乳糖，但沒有獲得與用海藻糖和纖維二糖得到的那些結果相當的結果。因此，清楚地證明，只有纖維二糖和海藻糖對DNA聚合酶提供保護。實施例5.評估用於穩定凍幹組合物的纖維二糖的最佳濃度為了鑑別保存DNA聚合酶的酶活性的最有效的纖維二糖濃度，如引言中所描述地製備包含增加濃度的纖維二糖的凍幹和即用的反應混合物。纖維二糖的分析的濃度範圍是0至700mM。在圖11和圖12中，泳道1至13表示用分別包含以以下濃度加入的纖維二糖的凍幹反應混合物獲得的擴增產物:0、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600和 700mMo圖11的擴增產物通過在完成冷凍乾燥過程之後立即使用凍幹反應混合物來獲得，而圖12的結果對應於具有相同的特徵且在與先前的反應混合物相同的時間被製備但在37°C下被保存兩個星期的反應混合物。如圖11和圖12中所示的，最好地保存聚合酶的酶活性的纖維二糖濃度在150至 250mM的範圍內，甚至在37°C下保存一個星期之後(圖12)。因此，證明了纖維二糖在150至250mM的濃度範圍內向凍幹和即用的反應混合物提供最好的穩定性。實施例6.評估包含作為穩定劑的海藻糖或纖維二糖的凍幹和即用的組合物的時間穩定性為了鑑別包含海藻糖或纖維二糖的凍幹和即用的混合物的時間穩定性，如引言中所描述地製備凍幹的即用的反應混合物，但加入200mM纖維二糖或200mM海藻糖。混合物在經歷通過PCR擴增之前被凍幹。在圖13中，泳道1至5、6至10、11以及12至16對應於分別包含IOOmM纖維二糖、 200mM纖維二糖、無穩定劑和200mM海藻糖的混合物。圖13中示出的擴增產物在完成冷凍乾燥過程之後立即用凍幹反應混合物獲得， 而圖14的結果對應於具有相同的特徵且在與先前的反應混合物相同的時間被製備但在 37 0C下被保存兩個星期的反應混合物。在圖14中，泳道1至5、6至10、11至15對應於分別包含IOOmM纖維二糖、200mM 纖維二糖或200mM海藻糖的凍幹混合物。圖15中示出的擴增產物用在55°C下分別被保存以下時間的凍幹反應混合物獲得24小時、48小時、72小時、96小時和一個星期(分別地， 泳道 1、6 和 11 ；2、7 和 12 ；3、8 和 13 ；4、9 和 14 ；5,10 和 15)。在圖15中，泳道1至5表示在55°C下保存M小時(泳道1和6)、48小時(泳道 2和7)、72小時(泳道3和8)、96小時或一個星期(泳道5和10)之後的包含纖維二糖或海藻糖的凍幹和即用的擴增混合物的瓊脂糖凝膠電泳圖。凍幹和即用的混合物包含獲自公司R的反應緩衝液和熱啟動DNA聚合酶(泳道1-10)。M 分子量標記物「Bench Top PCR標記物」，Promega0PCR產物268bp 人類β-珠蛋白基因的片段；240bp 瘧原蟲18s RNA基因的片段。在所有圖中，「M」對應於!Iomega公司的分子量標記物「Bench Top PCR標記物」 的泳道；所述標記物的片段從50bp至IOOObp變化。如圖13中所示的，存在於該實施例的凍幹和即用的反應混合物中的穩定劑非常好地保存聚合酶活性。在用PCR處理之前，凍幹反應混合物還在37°C下被保存一個星期。甚至在暴露於該應激之後，存在於包含200mM纖維二糖(圖14，泳道6至10)的凍幹和即用的反應混合物中的聚合酶維持它們的完整酶活性，與加入200mM海藻糖(圖14，泳道11至15)的那些一樣。與200mM纖維二糖(圖14，泳道6至10)或200mM海藻糖(圖 14，泳道11至1 在37°C下保存兩個星期之後，酶維持它們的活性。最後，具有相同的特徵和在與先前的反應混合物相同的時間被製備反應混合物在 55°C下被保存24小時、48小時、72小時、96小時和一個星期(圖15)，然後經歷PCR擴增。使用海藻糖作為穩定劑(圖15，泳道6至10)能夠保護熱啟動DNA聚合酶的酶活性，甚至在55°C的應激之後。在55°C下延長處理(48小時、72小時和96小時)部分地損害酶活性(圖15，分別地泳道2、3和4)。然而，包含200mM纖維二糖的凍幹和即用的混合物具有與包含200mM海藻糖的混合物相同的穩定性。我們因此可以斷言，作為穩定劑，纖維二糖具有與海藻糖相同的性質， 但是與海藻糖相比，纖維二糖具有前述優點，包括從纖維素通過酶水解系統來生產，所述纖維素是由植物源的長葡萄糖(糖)鏈組成的分子。植物源確保沒有源自於細菌汙染的可能的核酸汙染物，當如在海藻糖生產的情況下，細菌培養物用於合成它時，細菌汙染是可能的。實施例7.纖維二糖穩定劑形成用於寄生蟲學領域中的診斷試劑盒的即用組合物的用途在適合於形成寄生蟲學領域中的診斷試劑盒的即用和凍幹混合物的製備中，纖維二糖用作熱啟動DNA聚合酶的穩定劑。特定地，對於所研究的寄生蟲的每一種，預先製備包含以下物質的最終反應混合物IOmM Tris-HCl(pH 8. 0)、50mM KC1、0. 25 μ M 正向引物、0. 25 μ M 反向引物、0. 2mM dNTP、1. 5mM MgCl2和2單位的Taq聚合酶。瘧原蟲的觸發劑或引物(對於物種惡性瘧原蟲、三日瘧原蟲、間日瘧原蟲和卵形瘧原蟲中的每一種為一對)被設計在ISsRNA的保守區。利什曼原蟲的引物被設計在ISsRNA 的保守區。弓形體的引物被設計在高度重複區HRE。所有製備的混合物包含對應於被設計在人類珠蛋白基因序列中的引物對的內部對照。在多種配置中的每一種引物以0. 25 μ M的濃度被供應。
實施例8. DNA擴增和直接測序性能的比較 擴增的野生型(wt) DNA對照樣品(Cl)、未知的DNA樣品(C2)、突變體DNA對照樣品(C3)和無模板對照(N)的瓊脂糖凝膠電泳圖。進行DNA擴增以比較用凍幹和即用的擴增混合物獲得的PCR產物和用參考方法獲得的那些PCR產物。向凍幹和即用的擴增組合物加入以下組分
正向引物反向引物 DNA
H9O
參考方法具有以下組成
dNTP
緩衝液反應 MgCl2
正向引物反向引物 Taq聚合酶 DNA
0.4 μΜ 0.4 μΜ 3 Ong 至 25 μ 。
每種0.2 mM Ix
1.5 mM
0.4 μΜ 0.4 μΜ 0.003υ/μ1 3 Ong
H2O至 25 μ 。兩種系統的PCR收率相當。通過在2%瓊脂糖凝膠上電泳分析擴增產物(圖16a)。在測序分析之前，使用MultiScreen HTS真空歧管系統(Millipore)來純化每一種PCR產物。相比於用參考方法獲得的PCR產物，對於使用Universal Master Mix獲得的 PCR產物進行更短的時間的純化程序。凍結-乾燥形式保證高品質的PCR產物，消除了可以擾亂和延遲純化步驟的常規添加劑的存在，生成足夠量的用於隨後測序分析的擴增產物 (圖 16b)。結果表明，凍幹和即用的擴增混合物(Universal Master Mix)對於擴增反應和隨後的測序分析是理想的(圖17)。實施例9.在螢光染料存在下的實時PCR、熔解曲線分析和高解析度熔解曲線分析 (HRM)性能的比較凍幹和即用的擴增混合物(Universal Master Mix)的性能通過使用Rotor Gene 6000(Corbett Life Science)來評估。該儀器允許在同一分析會話中3種不同的應用在螢光雙鏈特異性染料(EvaGreen，Biotium)存在下的實時PCR、熔解曲線分析和高解析度熔解曲線分析。對於每一種應用，比較凍幹和即用的擴增混合物(Universal Master Mix)與參考方法。對於3種應用中的每一種，示出野生型DNA對照樣品(Cl)、未知的DNA樣品(C2)、 帶有A > G置換的突變體DNA樣品(C3)和無模板對照(N)的結果。顯示出相似的擴增效率擴增分析和實時PCR起始(take off)值的結果表明，凍幹和即用的擴增混合物 (Universal Master Mix)對於PCR和對於實時PCR是理想的。當使用凍幹和即用的擴增混合物(Universal Master Mix)和參考方法時，熔解分析提供明確定義的熔解溫度(T熔解)的鑑別。特定地，在89°C下鑑別用凍幹和即用的擴增混合物(Universal Master Mix)獲得的樣品的T熔解，而在87°C下確定用參考方法獲得的樣品的T熔解。此外，用凍幹和即用的擴增混合物(Universal Master Mix)獲得的熔解曲線允許在不同的樣品之間完全的重疊；對用參考方法獲得的熔解曲線，未觀察到該情況。熔解曲線分析的結果和高解析度熔解曲線分析的結果表明，凍幹和即用的擴增混合物(Universal Master Mix)對於在兩種應用中使用是理想的。實施例10.定量螢光(QF)PCR中的性能的比較特別是對於最普通的常染色體和性染色體非整倍性的產前診斷，在QFPCR中評估用凍幹和即用的擴增混合物(Universal Master Mix)獲得的性能和結果並將它們與用參考方法獲得的那些性能和結果進行比較。QF PCR分析包括擴增、檢測和分析染色體特異性 DNA微衛星。螢光標記的標記物特異性引物用於單個標記物的PCR擴增，且每一種標記物的複製數量表示染色體的複製數量。可以使用自動基因分析儀來分析和量化所得到的PCR產物。QF PCR 方案:
參考方法擴增混合物 7,5 μ 引物組7,5 μ DNA 50ng H2O 至 25 μ 。組合物引物組7，5μ1DNA 50ngH2O 至 25 μ 1。使用軟體GeneMarker分析QF PCR產物。擴增產物中的每一種的峰高和峰面積比的分析表明，凍幹和即用的擴增混合物(Universal Master Mix)對於在定量螢光中使用是理想的。
權利要求
1.一種適合於用適當的溶劑稀釋的乾燥或凍幹的組合物，包含被穩定為經得起冷凍乾燥和在高達55°C的溫度下的儲存的核酸聚合酶，其特徵在於，所述組合物具有在0. 01至 250單位的範圍內的核酸聚合酶濃度、在50mM(17，115g/L)至500mM(171，15g/L)範圍內的濃度的纖維二糖和緩衝液。
2.根據權利要求1所述的組合物，其中所述核酸聚合酶是選自由以下組成的組的DNA 聚合酶Taq聚合酶、熱啟動聚合酶或其活性片段。
3.根據權利要求1或2中任一項所述的組合物，包含250mM纖維二糖和2單位的核酸聚合酶。
4.一種適合於用適當的溶劑稀釋的組合物，包含被穩定為經得起冷凍乾燥和在高達 55°C的溫度下的儲存的核酸聚合酶，其特徵在於，所述組合物具有在0. 01至250單位的範圍內的核酸聚合酶濃度、在50mM至500mM範圍內的濃度的纖維二糖、緩衝液、dNTP、KCl和 MgCl20
5.根據權利要求1或4所述的組合物，其中所述緩衝液是TrisHCl0
6.根據權利要求4所述的組合物，還包含以下組分(i-iii)中的一種或多種 i.穩定劑，其選自由以下組成的組表面活性劑和/或非還原糖；i i還原劑，其選自由以下組成的組β -巰基乙醇、DTT ； iii.至少一種探針，其任選地被標記。
7.根據權利要求1或4所述的組合物用於核酸的擴增的用途。
8.根據權利要求7所述的用途，其中所述擴增方法以自動化的方式進行。
9.根據權利要求7或8中任一項所述的用途，用於進行PCR、實時PCR、熔解曲線分析、 高解析度熔解曲線分析、測序、定量螢光PCR、多重PCR、全基因組擴增或等溫擴增。
10.一種用於核酸的擴增的方法，包括以下步驟a.在水中或在緩衝液中重構根據權利要求1所述的組合物；b.加入靶DNA特異性引物；c.加入核酸模板；d.加入選自由以下組成的組的試劑中的一種或多種KCl、MgCl2、dNTP、至少一種任選地被標記的探針、還原劑和另外的穩定劑。
11.一種用於核酸的擴增的方法，包括以下步驟a.在水中或在緩衝液中重構根據權利要求4所述的組合物；b.加入靶DNA特異性引物；c.加入核酸模板；d.任選地加入至少一種任選地被標記的探針、還原劑和另外的穩定劑。
12.—種即用產品，包含a.根據權利要求1或4中任一項所述的乾燥或凍幹的組合物；b.用於重構所述組合物的溶劑。
13.一種用於DNA樣品的PCR擴增的試劑盒，包含根據權利要求1或4所述的組合物和任選的關於聚合酶鏈反應中的酶的重構和使用的說明書。
14.纖維二糖在冷凍乾燥和在高達55°C的溫度下長期儲存期間保存核酸聚合酶的用途。
15.根據權利要求14所述的用途，其中所述核酸聚合酶是DNA聚合酶。
全文摘要
本發明涉及包含核酸聚合酶和纖維二糖的乾燥或凍幹的組合物，其中所述酶甚至在高達55℃的溫度下穩定一段時間。本發明的組合物還可以包含另外的試劑例如鹽、對樣品中存在的模板DNA具有特異性的引物、探針等和可能的其他穩定化合物。本發明涉及一種可以在容器中製備包含核酸聚合酶和纖維二糖的乾燥或凍幹的組合物的方法，其中酶被凍幹並在加入樣品之後即用於分子生物學應用。
文檔編號C12Q1/68GK102414315SQ201080019549
公開日2012年4月11日 申請日期2010年5月19日 優先權日2009年5月19日
發明者烏戈·德盧卡, 毛裡奇奧·格拉梅尼亞, 路易吉·羅維德 申請人:森迪奈爾Ch有限責任公司