α-澱粉酶及其用途的製作方法

2023-09-14 14:48:20

專利名稱：：α-澱粉酶及其用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及具有a-澱粉酶活性的分離的多肽和編碼所述多肽的分離的多核普酸。本發明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構建體、載體和宿主細胞，以及用於產生和使用所述多肽的方法。相關領域描述a-澱粉酶(a-l,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC.3.2丄1)組成了一組酶，其催化澱粉和其他線性和具有支鏈的1，4-糖苷寡糖和多糖的水解。多年來一直為多種不同目的而使用a-澱粉酶，最重要的用途是澱粉液化、紡織品脫漿、紙和紙漿工業中澱粉的修飾，和用於釀造、乙醇生產和烘培。有非常多與這種在工業上非常重要的酶類有關的專利和科學文獻。從，例如，WO90/11352、WO95/10603、WO95/26397和WO96/23874，已知稱作"Termamyf樣a-澱粉酶"的很多a-澱粉酶及其變體。Termamy產樣a-澱粉酶是非常熱穩定的，因此適用於在高溫進行的過程，如右旋糖生產工藝中的澱粉液化。另一組a-澱粉酶稱為"FungamyFM樣a-澱粉酶"，其為與源自米麴黴的a-澱粉酶有關或與其同源的a-澱粉酶。Fungamyl樣a-澱粉酶具有相對低的熱穩定性，NovozymesA/S,Denmark以商標名FUNGAMYL出售的商業產品的最適溫度為約55。C,並且不適合於在高溫進行的過程。Fungamyl樣a-澱粉酶當前用於製備糖漿，例如，用於釀造業。明顯地，有利的是提供可替換的a-澱粉酶，其具有不同於先前已知的a-澱粉酶的性質，特別是在中性或酸性pH具有高活性的a-澱粉酶。本發明的目的是提供具有a-澱粉酶活性的多肽和編碼所述多肽的多核苷3酸。發明概述本發明提供具有a-澱粉酶活性或澱粉結合活性的分離的多肽，所述多肽選自下組(a)多肽，其具有與SEQIDNO:2的胺基酸1至719有至少60%同一性的氛基酸序列；(b)多肽，其由在至少中嚴緊條件下與以下雜交的核苷酸序列編碼(i)SEQIDNO:1的核香酸1至2256，或(ii)(i)的互補《連；和(c)多肽，具有通過一個或多個胺基酸的取代(特別是保守取代)、缺失和/或插入而由SEQIDNO:2的胺基酸1至719得到的胺基酸序列。本發明還涉及分離的多核苷酸，其編碼具有a-澱粉酶活性的多肽，所述多核苦酸選自下組(a)多核苷酸，其與SEQIDNO:1的核苦酸97至2256具有至少60%同一性；和(b)多核苷酸，其在中嚴緊條件下與以下序列雜交(i)SEQIDNO:1的核苷酸97至2256，或(ii)(i)的互補《連。本發明還涉及包含所述多核苦酸的核酸構建體、重組表達載體和重組宿主細月包。本發明還涉及用於產生這些具有a-澱粉酶活性的多肽的方法，其包括(a)在有益於產生該多肽的條件下培養包含核酸構建體的重組宿主細胞，所述核酸構建體包含編碼所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。本發明進一步涉及包含編碼蛋白質的基因的核酸構建體，其中所述基因與編碼信號肽的核普酸序列可操作地連接，該信號肽由SEQIDNO:1的核苷酸1至96組成，其中所述基因對於編碼所述信號序列的核苷酸序列是外源的。a-澱粉酶(具有a-澱粉酶活性的多肽)可以用在用於產生麥芽糊精的多種工藝中，包括將澱粉或澱粉水解物與a-澱粉酶一起溫育，從而使澱粉或澱粉水解物中的a-l,44建水解。因此，a-澱4分酶可以用於澱;盼工業、食品加工業、紡織業和洗滌劑工業，例如，用於澱粉液化、液化澱粉的糖化、紡織品脫漿、紙和紙漿工業中的澱粉修飾、釀造、乙醇生產和烘培(baking)。a-澱粉酶可以用於產生酶修飾的澱粉衍生物，其中a-澱粉酶用於液化和/或糖化澱粉；用於產生糖漿(例如，高麥芽糖漿)，其中a-澱粉酶用於澱粉液化和/或液化澱粉的糖化；用於將紡織品脫漿，其中a-澱粉酶用於處理紡織品；和用於釀造，其中在麥芽汁發酵過程中加入a-澱粉酶；用於乙醇生產，其中a-澱粉酶用於蒸餾醪液中澱4分的液化；和用於將包含a-澱粉酶的麵團烘培的工藝。a-澱粉酶可以在澱粉轉化過程使用，用於液化和/或糖化；用於在高麥芽糖漿產生過程中液化澱粉；用於紡織品脫漿；用於產生乙醇；用於釀造；和用於烘培。定義a-澱粉酶活性術語"a-澱粉酶活性"在本文中定義為1,4-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(l，4-glucan4-glucanohydrolase)(E.C.No.3.2.U)活性，其催化澱粉和其他線性和分支的1，4-糖芬寡糖和多糖的水解。a-澱粉酶測定法如下所述。澱粉結合活性術語"澱粉結合活性"應理解為多肽結合天然澱粉的能力。就本發明而言，澱粉結合活性應理解為澱粉與糖結合模塊結合的結合活'l"生^口A.B.Boraston在(Boraston，A.B.等2004.Carbohydrate-bindingmodules:fme-tuningpolysacchariderecognition.Biochem.J.382:769-781)中綜述的。分離的多肽術語"分離的多肽"用於本文中指，如通過SDS-PAGE測定的，其為至少20%純，優選至少40%純，更優選至少60%純，甚至更優選至少80%純，最優選至少90%純，並且甚至最優選至少95%純的多肽。基本上純的多肽術語"基本上純的多肽"在本文表示多肽製備物，所述多肽製備物按重量計含有至多10%，優選至多8%,更優選至多6%,更優選至多5%，更優選至多4%，更優選至多3%，甚至更優選至多2%，最優選至多1%,並且甚至最優選至多0.50/。的與其天然結合的(associated)的其它多肽材料。因此，優選所述基本上純的多肽是按存在於製備物中的全部多肽材料的重量計至少92%純，優選至少94%純，更優選至少95%純，更優選至少96%純，更優選至少96%純，更優選至少97%純，更優選至少98%純，甚至更優選至少99%純，最優選至少99.5%純，並且甚至最4尤選100°/。純。本發明的多肽優選是基本上純的形式。具體而言，優選所述多肽是"基本上(essentially)純的形式"，即，所述多肽製備物基本上(essentially)不含與其天然結合的其它多肽材料。這能夠通過以下方式實現，例如，通過公知的重組方法或由經典純化方法製備多肽。在本文中，術語"基本上純的多肽"與術語"分離的多肽"和"分離形式的多肽"同義。同一性參數"同一性"描述兩個胺基酸序列之間的相關性。就本發明而言，兩個胺基酸序列的比對通過使用來自EMBOSS軟體包(http:〃emboss.org)2.8.0版的Needle程序來確定。Needle軟體執行Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453中所述的全局比對算法。使用的取代矩陣為BLOSUM62，缺口開放罰分為10,而缺口延伸罰分為0.5。第一和第二胺基酸序列之間的同一性程度如下計算兩個序列比對中完全匹配的數目，除以第一或第二序列其中較短者的長度。結果用百分比同一性表示。當兩個序列在重疊的相同位置有相同的胺基酸殘基時即發生完全匹配。序列的長度是序列中胺基酸殘基的數目。就本發明而言，兩個核苷酸序列之間的同一性程度通過Wilbur-Lipman方法(Wilbur和Lipman，1983，屍raceW"^q/"」c"^few少y&/e"ceOS^80:726-730)使用LASERGENEMEGALIGNtm軟體(DNASTAR，Inc.,Madison，WI)來確定，使用同一性表和以下多重比對參數缺口罰分10和缺口長度罰分10。配對比對參數是K元組(Ktuple"3，缺口罰分=3,和窗口=20。在一個具體的實施方案中，多肽的胺基酸序列與，或對，SEQIDNO:2的胺基酸1至719的同一性百分比通過下述方式確定i)使用Needle程序比對兩個胺基酸序列，用BLOSUM62取代矩陣，缺口開放罰分為10，和缺口延伸罰分為0.5;ii)計算比對中完全匹配的數目；iii)完全匹配的數目除以兩個胺基酸序列中最短者的長度，和iv)將iii)的除法結果轉換成百分比。對，或與本發明其他序列如SEQIDNO:2的胺基酸1-719的同一性百分比以類似的方法計算。本發明的多肽具有由SEQIDNO:2的胺基酸1至719所示胺基酸序列組成的多肽的a-澱粉酶活性的至少20%，優選至少40%,更優選至少50%，更優選至少60%，更優選至少70。/。，更優選至少80%，甚至更優選至少90%，最優選至少95%,並且甚至最優選至少100%。多肽片段術語"多肽片段"在本文中定義為從SEQIDNO:2的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個胺基酸的多肽，或其同源序列；其中所述片段具有生物活性，如a-澱粉酶活性或澱粉結合活性。等位變體(allelicvariant):術語"等位變體"在本文中表示佔據相同染色體基因座的基因的任何兩種或兩種以上可選形式。等位變異通過突變天然地發生，並且可導致種群內的多態性。基因突變可以是沉默的(在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基l拼列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。基本上純的多核香酸術語"基本上純的多核香酸"用於本文指不含其它外來的或不期望的核苷酸的多核苷酸製備物，並且所述多核苷酸製備物處於適合於在遺傳工程改造的蛋白質生產體系中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸按重量計含有至多10%,優選至多8%,更優選至多6%，更優選至多5%，更優選至多4%，更優選至多3%，甚至更優選至多2%，最優選至多1%,並且甚至最優選至多0.5%的與其天然結合的其它多核苷酸材料。然而，基本上純的多核芬酸可以包括天然存在的5'和3，非翻譯區，例如啟動子和終止子。優選基本上純的多核苷酸是按重量計至少90%純，優選至少92%純，更優選至少94%純，更優選至少95%純，更優選至少96%純，更優選至少97%純，甚至更優選至少98%純，最優選至少99%,並且甚至最優選至少99.5%純的。本發明所述多核苦酸優選為基本上純的形式。具體而言，優選本文公開的多核苷酸是"基本上(essentially)純的形式"，即，所述多核苷酸製備物基本上不含與其天然結合的其它多核苷酸材料。在本文中，術語"基本上純的多核苷酸"與術語"分離的多核苷酸"和"分離形式的多核苷酸"同義。所述多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的任何組合。核酸構建體術語"核酸構建體"用於本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子分離自天然存在的基因，或將所述核酸分子修飾以本來不存在於(nototherwiseexist)自然界中的方式含有核酸的區段。當所述核酸構建體含有本發明的編碼序列表達所需的調控序列時，術語核酸構建體與術語"表達盒"同義。調控序列(controls叫uence):術語"調控序列"在本文定義為包括對編碼本發明多肽的多核苷酸表達是必需的或有利的所有組分。每種調控序列對於編碼所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的。這些調控序列包括但不限於前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉錄終止子。最少的情況，調控序列包括啟動子和轉錄和翻譯的終止信號。調控7序列可提供有用於引入特異性限制位點的接頭，所述特異性限制位點促進調控序列與編碼多肽的核苷S交序列編碼區的連接。可操作地連接術語"可操作地連接"在本文表示這樣的構型，其中將調控序列置於相對於多核苷酸序列的編碼序列的合適位置，使得調控序列指導多肽的編碼序列的表達。編碼序列當用於本文時術語"編碼序列"的意思是直接指定其蛋白產物的胺基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開讀框確定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子例如GTG和TTG開始。編碼序列可以是DNA、cDNA或重組核苷酸序列。表達術語"表達，，包括涉及多肽產生的任何步驟，其包括但不限於轉錄、轉錄後修飾、翻譯、翻譯後修飾和分泌。表達載體術語"表達載體"在本文定義為線性的或環狀的DNA分子，其包含編碼本發明多肽的多核苷酸，並且所述多核苷酸與提供用於其表達的額外核苷酸可操作地連接。宿主細胞如本文中所使用的術語"宿主細胞"包括任何細胞類型，所述細胞類型對於使用包含本發明多核苷酸的核酸構建體的轉化、轉染、轉導等是易感的(susceptible)。修飾術語"修飾"在本文的意思是，對由SEQIDNO:2的胺基酸l至719組成的多肽的任何化學修飾，以及對編碼所述多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可以是一個或多個胺基酸的取代、缺失和/或插入，以及一個或多個胺基酸側鏈的置換。人工變體當用在本文時，術語"人工變體"的意思是具有a-澱粉酶活性的多肽，所述多肽由表達修飾的SEQIDNO:1的核苷酸序列的生物體產生。所述修飾的核苷酸序列通過人為幹預(humanintervention)，通過修飾公開於SEQIDNO:1的核苷酸序列來獲得。發明詳述a-澱4分酶在第一個方面，本發明涉及具有下述胺基酸序列的分離的多肽，所述胺基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽(即，胺基酸1至719)具有至少65%,至少70%,至少75%,至少80%，至少85%,至少90%，至少95%,或至少97%的同一性程度，所述多肽具有a-澱粉酶活性(下文中的"同源多肽")。在優選的方面，所述同源多肽具有的胺基酸序列與SEQIDNO:2的胺基酸1至719相差十個胺基酸，優選相差五個胺基酸，更優選相差四個胺基酸，甚至更優選相差三個胺基酸，最優選相差兩個胺基酸，並且甚至最優選相差一個胺基酸。本發明的多肽優選包含SEQIDNO:2的胺基酸序列或其等位變體；或其具有a-澱粉酶活性或澱粉結合活性的片段。在優選的方面，多肽包含SEQIDNO:2的胺基酸序列。在另一個優選方面，多肽包含SEQIDNO:2的胺基酸1至719,或其等位變體；或其具有a-澱粉酶活性的片段。在另一個優選方面，多肽由SEQIDNO:2的胺基酸序列或其等位變體；或其具有a-澱粉酶活性的片段組成。在另一個優選方面，多肽由SEQIDNO:2的胺基酸序列組成。在第二個方面，本發明涉及具有a-澱粉酶活性的分離的多肽，所述分離的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在非常低嚴緊條件下，優選低嚴緊條件下，更優選中嚴緊條件下，更優選中-高嚴緊條件下，甚至更優選高嚴緊條件下，並且最優選非常高嚴緊條件下，與以下雜交(i)SEQIDNO:1的核苷酸1至2256，(ii)(i)的亞序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989,Mo/ecw/arC7ow/"g,」Z^0rato/7Mawwa/,第2版,ColdSpringHarbor，NewYork)。SEQIDNO:l的亞序列含有至少100個連續的核苷酸或優選至少200個連續的核苦酸。此外，所述亞序列可編碼具有a-澱粉酶活性或澱粉結合活性的多肽片段。SEQIDNO:1的核苷酸序列或其亞序列，以及SEQIDNO:2的胺基酸序列或其片段，可用於設計核酸探針，以根據本領域內公知的方法從多種生物體鑑定和克隆編碼具有a-澱粉酶活性的多肽的DNA。具體而言，根據標準的Southern印跡方法，可將這些探針用於與感興趣的屬或種的基因組或cDNA雜交，以鑑定和從其中分離相應的基因。這些探針可明顯短於完整序列，但長度上應為至少14,優選至少25,更優選至少35，並且最優選至少70個核苷酸。然而，優選所述核S交探針是至少100個核苷酸長度。例如，所述核酸探針長度上可以是至少200個核苷酸，優選至少300個核苷酸，更優選至少400個核香酸，或最優選至少500個核苷酸。甚至可以使用更長的探針，例如，長vl是至少600個核苷酸，至少優選至少700個核苷酸，更優選至少800個核苷酸，或最優選至少900個核苷酸的核酸探針。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標記以探測相應的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標記)。這些探針包含於本發明中。因而，可從由這些生物體製備的基因組DNA或cDNA文庫中篩選DNA,所述DNA與上述探針雜交並且編碼具有a-澱粉酶活性的多肽。可以通過瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠電泳，或其它分離技術分離來自這些生物體的基因組或其它DNA。可以將來自文庫的DNA或分離的DNA轉移至硝化纖維素(nitrocellulose)或其它合適的載體材料並且固定於其上。為了鑑定與SEQIDNO:l或其亞序列同源的克隆或DNA，將所述載體材料用在Sounthern印跡中。就本發明而言，雜交表示核苷酸序列在非常低至非常高的嚴緊條件下與標記的核酸探針雜交，所述核酸探針對應於SEQIDNO:l所示的核苷酸序列、它的互補鏈或其亞序列。可使用X射線片(X-rayfilm)檢測在這些條件下與核酸探針雜交的分子。對於長度至少100個核苷酸的長探針，將非常低至非常高的嚴緊條件定義為在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200jug/ml已剪切並且變性的鮭精DNA中，並且對於非常低和低嚴緊性為25%的曱醯胺、對於中和中-高嚴緊性為35%的曱醯胺、或對於高和非常高嚴緊性為50%的曱醯胺，根據標準的Southern印跡法進行預雜交和雜交最佳12至24小時。對於長度為至少100個核苷酸的長探針，使用2XSSC、0.2%SDS優選至少在45°(3(非常低嚴緊性)，更優選至少在50。C(低嚴緊性)，更優選至少在55。C(中嚴緊性)，更優選至少在60。C(中-高嚴緊性)，甚至更優選至少在65°C(高嚴緊性)，並且最優選至少在70。C(非常高嚴緊性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。在一個具體的實施方案中，使用0.2XSSC、0.2%SDS優選至少在45°C(非常低嚴緊性)，更優選至少在50。C(低嚴緊性)，更優選至少在55。C(中嚴緊性)，更優選至少在60。C(中-高嚴緊性)，甚至更優選至少在65。C(高嚴緊性)，並且最優選至少在70°C(非常高嚴緊性)進行洗滌。在另一個具體的實施方案中，使用0.1XSSC、0.2%SDS優選至少在45。C(非常低嚴緊性)，更優選至少在50。C(低嚴緊性)，更優選至少在55。C(中嚴緊性)，更優選至少在W。C(中-高嚴緊性)，甚至更優選至少在65。C(高嚴緊性)，並且最優選至少在冗。C(非常高嚴緊性)進行洗滌。對於長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將嚴緊條件定10義為在比#4居Bolton和McCarthyi十算法(1962,Pracee^wgso/AeJVo"o"a/JcWe^y0/5We"ces"&448:1390)得出的Tm低大約5。C至大約10。C,在0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6，6mMEDTA，0.5%NP-40,1xDenhardt溶液，1mM傳、石舞酸4內(sodiumpyrophosphate),1mM石舞酸二氬4內(sodiummonobasicphosphate),0.1mMATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根據標準的Southern印跡步驟進行預雜交、雜交和雜交後洗滌。對於長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將所述載體材料在6xSSC加0.1%SDS中洗滌一次15分鐘，並用6xSSC在比計算的Tm低5。C至10。C的溫度下洗滌兩次，每次15分鐘。在含鹽的雜交條件下，有效的Tm可以控制探針和結合濾膜的DNA之間用於成功雜交所需的同一性程度。可以使用下述公式確定有效的Tm,從而確定在各種嚴緊性條件下兩個DNA雜交所需的同一性程度，從而。有效的Tm=81.5+16.6(logM[Na+])+0.41(%G+C)—0.72(%曱醯胺)(參見www.ndsu.nodak.edu/instruct/mcclean/plsc731/dna/dna6.htm)SEQIDNO:1的G+C含量為約55%。對於中嚴緊性，曱醯胺為35%,並且對於5XSSPE的Na+濃度為0.75M。對這些數值應用這一公式，得到有效Tm為76°C。另一個相關的關係是兩個DNA之間1。/。的不匹配會將Tm降低1.4°C。為了確定在42。C在中嚴緊條件下兩個DNA雜交所需的同一性程度，使用下述公式%同源性=100—[(有效Tm-雜交溫度)/1.4]對數值應用這一公式，在42。C中嚴緊條件下兩個DNA雜交所需的同一性程度為100-[(76-42)/1.4)]=76%。在第三個方面，本發明涉及具有活性的分離的多肽，其由包含SEQIDNO:1的核苷酸97至751的多核苷酸編碼，作為唯一的基序。多肽可以提供澱粉水解的下述降解產物除了分子量較高的糊精之外，還有葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖、麥芽七糖。具體而言，可以提供澱粉水解的下述降解產物相似量的葡萄糖(DPl)、麥芽糖(DP2)、麥芽三糖(DP3)、麥芽四糖(DP4)、麥芽五糖(DP5)、麥芽六糖(DP6)和麥芽七糖(DP7),和大量較大的糊精(〉DP10)。多肽的分子量可以約為78kDa。可以如下所述確定澱粉分解活性。pH6.0時a-澱粉酶活性的最適溫度為約60°C，37。C時的最適pH為約6.0。多肽可以是人工變體，其具有通過取代(特別是保守取代)、缺失和/或插入一個或多個胺基酸而由SEQIDNO:2的成熟片段得到的胺基酸序列。優選胺基酸改變對性質是較不重要的(ofaminornature),即保守的胺基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質的摺疊和/或活性；小缺失，通常為l至大約30個胺基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端曱硫氨酸殘基；多至大約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變淨電荷或其它功能來促進純化的'J、延伸(如多組氨酸區(polyhistidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或結合域(bindingdomain))。保守取代的實例是在以下組之內鹼性胺基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性胺基酸組(穀氨酸和天冬氨酸)、極性胺基酸組(穀氨醯胺和天冬醯胺)、疏水性胺基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族胺基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小胺基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和曱硫氨酸)。通常不改變比活性(specificactivity)的胺基酸取代是本領域已知的，並且由例如H.Neurath和R丄.Hill,1979，於77ze屍rato'ra，AcademicPress,NewYork中描述。最普遍發生的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、AWGly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。除了20個基本胺基酸，非基本胺基酸(如4-羥脯氨酸、6-7V-曱基賴氨酸、2-氨基異丁酸、異纈氨酸和a-曱基絲氨酸)可以取代野生型多肽的胺基酸殘基。有限數量的非保守胺基酸、不由遺傳密碼編碼的胺基酸和非天然胺基酸可以取代胺基酸殘基。"非天然胺基酸"在蛋白質合成後已經過修飾，和/或在它們的側鏈具有不同於基本胺基酸的化學結構。非天然胺基酸能夠以化學方法合威，並且優選是商業上可獲得的，包括六氫吡啶羧酸(pipecolicacid)、噻唑烷羧酸(thiazolidinecarboxylicacid)、脫氬月甫氨酸(dehydroproline)、3-和4-甲基脯氨酸，和3,3-二曱基脯氨酸。可供選擇的是，胺基酸改變具有這樣的性質以使多肽的物理化學性質改變。例如，胺基酸改變可改進多肽的熱穩定性，改變底物特異性，改變最適pH等。能夠根據本領域已知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區誘變法(Cunningham和Wells,1989,5We"ce244:1081-1085)來鑑定親本多肽中的必需胺基酸。在後一技術中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個殘基，並且測試所得突變分子的生物活性(即，a-澱粉酶活性)以鑑定對於所述分子的活性關鍵的胺基酸殘基。同樣參見Hilton等，1996，J所o/.C7zem.271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能夠通過結構的物理分析而確定，如通過以下這些技術如核》茲共振、晶體學、電子衍射或光親和標記，連同推定的4妻觸位點胺基酸的突變來確定。參見例如deVos等，1992，Sc/e"ce255:306-312;Smith等，1992,/Mo/.所o/.224:899-904;Wlodaver等，1992，丄e".309:59-64。必需胺基酸的同一性也能夠從與多肽的同一性分析來推斷，所述多肽與根據本發明的多肽相關。能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，然後是有關的篩選方法，如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988，5W騰e241:53-57;Bowie和Sauer，1989，屍rac.M^/.爿cac/.5W.86:2152-2156;WO95/17413;或WO95/22625公開的那些方法來進行並測試單個或多個胺基酸取代。能夠使用的其它方法包括易錯PCR、嗟菌體展示(例如，Lowman等，1991,所oc/^w.30:10832-10837;美國專利號5,223,409;WO92/06204)和區域定向的誘變(Derbyshire等，1986,46:145;Ner等，1988,DA^7:127)。誘變/改組方法能夠與高通量、自動化的篩選方法組合以檢測由宿主細胞表達的克隆的、誘變的多肽的活性。能夠從宿主細胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子，並且使用本領域內標準方法快速測序。這些方法允許快速確定感興趣的多肽中單個胺基酸殘基的重要性，並且能夠應用於未知結構的多肽。SEQIDNO:2的胺基酸1至719的胺基酸取代、缺失和/或插入的總數可為至多10，至多9,至多8，至多7,至多6，至多5，至多4,至多3，至多2,或者至多1。a-澱粉酶的降解譜由澱粉降解產生的降解產物依賴於降解使用的特定的a-澱粉酶。典型的真菌a-澱粉酶如米麴黴a-澱粉酶產生麥芽糖(DP2)、麥芽三糖(DP3)和麥芽四糖(DP4)作為主要降解產物，剩餘大部分較大的糊精(〉DP10)。芽孢桿菌屬a-澱粉酶如嗜熱脂肪芽孢桿菌a-澱粉酶和地衣芽孢桿菌a-澱粉酶，通常產生葡萄糖(DP1)、麥芽糖(DP2)、麥芽三糖(DP3)、麥芽五糖(DP5)或麥芽六糖(DP6)作為主要降解產物，僅剩餘小部分的較大糊精(〉DP10)。根據本發明的a-澱粉酶產生大約相似量的葡萄糖(DPl)、麥芽糖(DP2)、麥芽三糖(DP3)、麥芽四糖(DP4)、麥芽五糖(DP5)、麥芽六糖(DP6)和麥芽七糖(DP7)，使用RI檢測估計，剩餘大量較大的糊精(〉DP10)。因此，在另一個方面，本發明涉及a-澱粉酶，其降解澱粉提供相似量的葡萄糖(DP1)、麥芽糖(DP2)、麥芽三糖(DP3)、麥芽四糖(DP4)、麥芽五糖(DP5)、麥芽六糖(DP6)和麥芽七糖(DP7)，並剩餘大量較大的糊精(〉DP10)。具有(X-澱粉酶活性的多肽的來源本發明的多肽可以獲得自任何屬的生物體。優選本發明的多肽獲得自微生物。就本發明而言，用於本文與給定的來源有關的術語"獲得自"，意思是由核苷酸序列編碼的多肽通過已插入或天然存在本發明的核苷酸序列的生物體產生。在優選的方面，獲得自給定來源的多肽是胞外分泌的。多核香酸本發明還涉及分離的多核苷酸，其具有編碼本發明的多肽的核苷酸序列。在優選的方面，核苷酸序列示於SEQIDNO:1。在另一個優選方面，核苷酸序列是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼區。本發明還涵蓋編碼下述多肽的核苷酸序列，所述多肽具有SEQIDNO:2的胺基酸序列或其成熟多肽；由於遺傳密碼的簡併性，所述核苷酸序列不同於SEQIDNO:1。本發明還涉及SEQIDNO:1的亞序列，所述亞序列編碼具有a-澱粉酶活性的SEQIDNO:2的片段。本發明還涉及突變多核苷酸，所述突變多核苷酸在SEQIDNO:l的成熟多肽編碼序列中包含至少一個突變，其中所述突變核苷酸序列編碼由SEQIDNO:2的胺基酸1至719組成的多肽。用於分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術是本領域內已知的，並包括從基因組DNA分離，從cDNA製備，或其組合。可通過例如使用熟知的聚合酶鏈式反應(PCR)或表達文庫的抗體篩選以檢測具有共有結構特徵的克隆DNA片段，從而實現從這種基因組DNA克隆本發明的多核苷酸。參見，例如，Innis等,1990，PC7:爿GWtietoMef/c^AcademicPress,NewYork。可以使用其它核酸擴增方法，如連接酶鏈式反應(LCR)、連接活化轉錄(ligatedactivatedtranscription;LAT)和基於核苷酸序列的擴增(NASBA)。14在本發明中，使用元基因組(metagenomic)技術分離具有SEQIDNO:1中所示的核苷酸序列的多核香酸，即從土壤樣本純化多核苷酸，由純化的多核苷酸產生多核苷酸庫並篩選庫以提供包含SEQIDNO:2中所示的核苷酸序列的多核苷酸。因此不知道包含SEQIDNO:1中所示的核苷酸序列的多核苷酸源自哪種生物體。本發明還涉及具有編碼下述多肽的核苷酸序列的多核苷酸，所述多肽與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列(即，核香酸97至2256)具有至少60%,優選至少65%,更優選至少70%,更優選至少75%,更優選至少80%，更優選至少85%,更優選至少90%,甚至更優選至少95%,並且最優選至少97%同一性的同一性程度，所述多核苦酸編碼活性多肽。修飾編碼本發明多肽的核苷酸序列對於合成與所述多肽基本上相似的多肽可能是必需的。術語與所述多肽"基本上相似"指多肽的非天然存在的形式。這些多肽可能以一些工程改造的方式而不同於從其天然來源分離的多肽，例如，比活性、熱穩定性、最適pH等方面不同的人工變體。可以在作為SEQII)NO:l的多肽編碼區存在的核苷S吏序列，例如其亞序列的基礎上，和/或通過引入如下核苷酸取代來構建變體序列所述取代不產生由核苦酸序列編碼的多肽的另外的胺基酸序列，但是其符合意欲產生酶的宿主生物體的密碼子選擇；或者所述取代可產生不同的胺基酸序列。關於核苦酸取代的概述，參見,例^口,Ford等，1991,屍rafe/w￡!xp*as^/ow屍wnycafz'ow2:95-107。對於本領域技術人員顯而易見的是，這些取代能夠在對於分子功能重要的區域之外進行，並且仍然產生活性多肽。對於由本發明的分離的多核苷酸編碼的多肽活性是關鍵的並且因此優選不進行取代的胺基酸殘基，可以根據本領域公知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區誘變法(參見，例如，Cunningham和Wells,1989,5We"ce244:1081-1085)來鑑定。在後一的技術中，將突變引入到分子中的每個正電殘基處，並且測試所得突變分子的a-澱粉酶活性，以鑑定對於所述分子的活性關鍵的胺基酸殘基。底物-酶相互作用的位點也能夠通過分析三維結構而確定，如通過如核磁共振分析、晶體學或光親和標記這樣的技術來確定(參見，例如，deVos等，1992，5We"ce255:306-312;Smith等，1992,JoMrwa/o/Mo/ecw/ar傷o/ogv224:899-904;Wlodaver等，1992,F五^S丄e/化ra309:59-64)。本發明還涉及編碼本發明多肽的分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸在非常低嚴緊條件下，優選低嚴緊條件，更優選中等嚴緊條件，更優選中-高嚴緊條件，甚至更優選高嚴緊條件，並且最優選非常高的嚴緊條件下，與以下序列雜交(i)SEQIDNO:1的核苷酸96至2256;或(ii)(i)的互補鏈；或它們的等位變體和亞序列(Sambrook等，1989，見上文)，如本文所定義的。本發明還涉及分離的多核苷酸，其通過以下方式獲得(a)在中-高、高或非常高嚴緊條件下，將DNA的群體與以下雜交(i)SEQIDNO:1的核苷酸97至2256，或(ii)(i)的互補鏈；和(b)分離雜交的多核苷酸，其編碼具有a-澱粉酶活性的多肽。元基因組技術在本說明書和權利要求中，術語元基因組意欲表示從包含不同生物體的樣本分離的多核苷酸的集合。樣本可以是任何已知或疑似包含合適生物體的樣本，並且經常從自然環境收集。樣本可以是土壤、水、植物材料或疑似包含可能令人感興趣的多核苷酸的其他材料的樣本。當樣本已提供有完整基因組材料時，優選使用例如本領域已知的技術，如在(Ausuble等1995"CurrentprotocolsinmolecularbiologyPubl:JohnWileyandsons)中所述方法從樣本提取完整的基因組DNA。獲得的基因材料代表樣本中存在的生物體。當已經製備了元基因組時，可使用元基因組產生元基因組文庫，在其中篩選特別令人感興趣的多核苷酸序列。元基因組文庫和DNA的產生和篩選可以使用本領域公知的方法進行。所理解的，已經開發出幾種表達載體，其包括XZAP系統，可由Stratagene得到。根據本發明，可以使用公知的a-澱粉酶篩選系統篩選文庫，如將文庫塗布在含澱粉的瓊脂平板上，並且通過所述克隆周圍的透明圈鑑定包含編碼a-澱粉酶的多肽的克隆。澱粉可以是著色的，便於鑑定陽性克隆周圍的透明區域，或者可以在克隆生長後將澱粉染色，所述克隆通過，例如，將塗布有文庫克隆的平板置於包含碘蒸汽的室中生長，從而澱粉將著深色，並且透明區容易可見。當已經鑑定了陽性克隆時，可以使用公知的DNA操作技術如(J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis,1989,Mo/ecw/arC7om'"g，爿丄a6orato^yAfo廂a/，第2版，ColdSpringHarbor,NewYork)中所述，進一步表徵和操作分離的多核苷酸。核酸構建體本發明還涉及包含本發明的分離的多核苷酸的核酸構建體，所述分離的多核苷酸與一個或多個調控序列可操作地連接，所述調控序列在合適的宿主細胞中在與該調控序列相容的條件下指導編碼序列的表達。技術人員應了解的是，在合適的宿主細胞中，包括於適合表達根據本發明的多肽的核酸構建體中的元件依賴於特定選擇的宿主細胞。在本發明中，細齒細胞是優選的宿主細胞，並且因此詳細描述了根據本發明的適用於細菌細胞中的核酸構建體。然而技術人員應了解的是，其他宿主細胞如真菌細胞、哺乳動物細胞、植物細胞或昆蟲細胞也可以根據本發明使用，並且技術人員能夠決定哪種元件適合包含於意欲與這些宿主細胞聯合使用的核酸構建體中。可以用許多方式操作編碼本發明多肽的分離的多核苷酸以提供多肽的表達。依賴於表達載體，在將多核苷酸的序列插入載體之前對其進行操作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術是本領域熟知的。調控序列可以是合適的啟動子序列，其是由用於表達編碼本發明多肽的多核苦酸的宿主細胞識別的核苷酸序列。啟動子序列含有介導多肽的表達的酸序列，包括突變的、截斷的和雜合的啟動子，並且可以從編碼與宿主細胞同源或異源的胞外或胞內多肽的基因獲得。用於指導本發明的核酸構建體轉錄，特別是在細菌宿主細胞中轉錄的合適啟動子的實例是從下述獲得的啟動子大腸桿菌/ac操縱子、天藍色鏈黴菌(&reptomyc"^》0/^)瓊脂糖酶基因(^^4)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因0ac巧、地衣芽孢桿菌a-澱粉酶基因(amy丄)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產麥芽糖a-澱粉酶基因O^M)、解澱粉芽孢桿菌a-澱粉酶基因Owy0、地衣芽孢桿菌青黴素酶基因(pew屍)、枯草芽孢桿菌矽M和xy/B基因和原核P-內醯胺酶基因(Villa-Kamaroff等,1978,屍raceW"g^o/_/Va//owa/^4ca<i，_yo/5Wewc&st/S/475:3727-3731)，以及toc啟動子(DeBoer等，1983，屍rac^一o///ze淑/畫/Academy5Wewces80:21-25)。另夕卜的啟動子在"Usefulproteinsfromrecombinantbacteria"於5b/ew打yc爿wen'ca"，1980,242:74-94中；和在Sambrook等，1989,見上文中有所描述。在優選的方面，啟動子是由來自下述基因的啟動子組成的啟動子系統地衣芽孢桿菌a-澱粉酶基因(amy丄)、解澱粉芽孢桿菌a-澱粉酶基因(amy0和包含穩定化序列的蘇雲金芽孢桿菌C7//"啟動子，如WO99/43835中所述。調控序列也可以是合適的轉錄終止子序列，是由宿主細胞識別以終止轉錄的序列。所述終止子序列與編碼所述多肽的核苷酸序列的3'末端可操作地連接。可以將在所選宿主細胞中有功能的任何終止子用在本發明中。調控序列還可以是合適的前導序列，其是對於宿主細胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區。前導序列可操作地連接於編碼多肽的核苷酸序列的5，-末端。可以將在所選宿主細胞中有功能的任何前導序列用在本發明中。調控序列還可以是信號肽編碼區，其編碼與多肽的氨基末端相聯的胺基酸序列，並且指導編碼的多肽進入細胞的分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列5，端可固有地包含信號肽編碼區，其與編碼分泌多肽的編碼區的區段一起天然地連接在翻譯閱讀框中。可供選擇的是，編碼序列5'端可含有對於所述編碼序列是外源的信號肽編碼區。外源信號肽編碼區在編碼序列不天然地含有信號肽編碼區時可能是必需的。或者，外源信號肽編碼區可以簡單地替代天然信號肽編碼區以增強多肽的分泌。然而，指導表達的多肽進入所選宿主細胞的分泌途徑的任何信號肽編碼區可在本發明中使用。對於細菌宿主細胞有效的信號肽編碼區是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼區芽孢桿菌屬NCIB11837產麥芽糖a-澱粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌a-澱粉酶、地衣芽孢桿菌枯草蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢桿菌|3-內醯胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(";^r，w;^S，wpWW)和枯草芽孢桿菌jW""。另外的信號脈由Simonen和Palva，1993，7kf/craZ/o/og/ca/Aev/ems57:109-137描述。調控序列還可以是前肽編碼區，其編碼位於多肽氨基末端的氨基S交序列。所得多盧稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))。前多肽通常是無活性的並且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉化成成熟活性多肽。可以從枯草芽孢桿菌鹼性蛋白酶(a/^;)、18枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(w;^7)、釀酒酵母a因子、曼赫根毛黴天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲黴漆酶(WO95/33836)的基因獲得前肽編碼區。當信號肽和前肽區二者均出現在多肽的氨基末端時，將前肽區置於緊接著(nextto)多肽氨基末端，並且將信號肽區置於緊接著前肽區的氨基末端。同樣理想的是添加調節序列，其允許相對於宿主細胞的生長來調節多肽的表達。調節系統的實例是引起基因表達響應於化學或物理剌激，包括調節化合物的存在而開啟或關閉的那些系統。原核系統中的調節系統包括/ac、toc和/^操縱基因系統。表達載體本發明還涉及重組表達載體，所述重組表達載體包含本發明的多核苷酸、啟動子和轉錄和翻譯終止信號。上述的多種核酸和調控序列可以結合在一起以產生重組表達載體，所述表達載體可以包括一個或多個方便的限制位點以允許在這些位點插入或取代編碼多肽的核苷酸序列。可供選擇的是，可以通過在合適的用於表達的載體中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸構建體來表達本發明的核苦酸序列。在製備表達載體的過程中，將編碼序列置於載體中，從而將該編碼序列與合適的表達調控序列可操作地連接。重組表達載體可以是任何載體(例如，質粒或病毒)，其能夠方便地進行重組DNA步驟，並且能夠產生核苷酸序列的表達。載體的選擇將通常依賴於載體與將引入該載體的宿主細胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環狀質粒。載體可以是自主複製載體，即，作為染色體外實體(entity)存在的載體，其複製獨立於染色體複製，例如，質粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用於確保自複製的手段(means)。或者，載體可以是一種當被引入宿主細胞中時，整合到基因組中並且與整合了該載體的染色體一起複製的載體。此外，可以使用單獨的載體或質粒或兩個或更多個載體或質粒，其共同含有待引入宿主細胞基因組的完整DNA(totalDNA)，或可以使用轉座子(transposes)。本發明的載體優選地含有一個或多個選擇性標記，其允許簡單選擇經轉化的細胞。選擇性標記是基因，其產物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養缺陷型的原養性(prototrophytoauxotrophs)等。條件必需基因可以作為非抗生素選擇性標記起作用。細菌條件必需非抗生素選擇性標記的非限制性實例是來自枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌或其他芽孢桿菌的tfo/基因，其僅在缺少D-丙氨酸的條件下培養細菌時是必需的。當細胞在半乳糖存在的情況下或在能引起半乳糖存在的培養基中生長時，編碼參與UDP-半乳糖的轉換(turnover)的酶的基因也可以在細胞中作為條件必需標記起作用。這類基因的非限制性實例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的編碼UTP-依賴型磷酸化酶(EC2.7.7.10)、UDP-葡萄糖-依賴型脲芬醯轉移酶(EC2.7.7.12)或UDP-半乳糖差向異構酶(EC5丄3.2)的那些。芽孢桿菌的木糖異構酶基因如砂"也可以用作在以木糖作為唯一碳源在基本培養基中生長的細胞中的選擇性標記。利用葡萄糖酸所需的基因，gnW和g"/屍也可以用作以葡萄糖酸作為唯一碳源在基本培養基中生長的細胞中的選擇性標記。條件必需基因的其他實例在本領域中已知。抗生素選擇性標記可以賦予對這些抗生素的抗生素抗性，所述抗生素如氨千青黴素、卡那黴素、氯黴素、紅黴素、四環素、新黴素、潮黴素或曱氨蝶呤。本發明的載體優選含有元件，其允許載體整合入宿主細胞的基因組或載體在細胞中獨立於基因組的自主複製。為了整合入宿主細胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或用於通過同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件。或者，載體可以含有額外的核苷酸序列，用於指導通過同源重組整合入宿主細胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應該優選含有足夠數目的核酸，如100至10,000鹼基對，優選400至10,000鹼基對，並且最優選800至10,000鹼基對，其與相應的目標序列具有高度同一性以增強同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細胞基因組中的目標序列同源。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核苷酸序列。另一方面，可以將載體通過非同源重組整合到宿主細胞的基因組中。為了自主複製，載體可以進一步包含複製起點，其使載體能夠在所述的宿主細胞中自主地複製。複製起點可以是介導自主複製的任何質粒複製子(replicator),其在細胞中發揮功能。術語"複製起點"或"質粒複製子"在本文定義為能夠使質粒或載體在體內複製的核苷酸序列。細菌複製起點的實例是允許在大腸桿菌中複製的質粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的複製起點，和允許在芽孢桿菌屬中複製的質粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMBl的複製起點。可以將多於一個拷貝的本發明的多核苷酸插入宿主細胞以增加基因產物的產生。多核苷酸拷貝數的增加可通過如下方法獲得將至少一個額外拷貝的序列整合入宿主細胞基因組，或將可擴增的選擇性標記基因包括在多核苷酸中，其中可通過在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養細胞來選擇含有選擇性標記基因的擴增的拷貝，並且由此含有多核苷酸的額外拷貝的細胞。用於連接上述元件以構建本發明重組表達載體的方法是本領域技術人員熟知的(參見，例如，Sambrook等，1989,見上文)。宿主細胞本發明還涉及重組宿主細胞，所述重組宿主細胞包含本發明的多核苷酸，將其有利地用於多肽的重組產生中。將包含本發明多核苷酸的載體引入宿主細胞中，從而將該載體保留作為染色體整合體(chromosomalintegrant)或作為前述的自複製的染色體外載體。術語"宿主細胞"包含親本細胞的任何子代，其由於複製過程中發生的突變而與親本細胞不相同。宿主細胞的選擇將很大程度依賴於編碼多肽的基因和它的來源。宿主細胞可以是單細胞微生物，例如，原核生物，或非單細胞微生物，例:^，真4亥生物。有用的單細胞微生物是細菌細胞，例如革蘭氏陽性細菌，包括但不限於，芽孢桿菌屬細胞，例如，嗜鹼芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌(^^7/wc/aww7)、凝結芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇雲金芽孢桿菌；或鏈黴菌屬細胞，例如，淺青紫鏈黴菌和鼠灰鏈黴菌，或革蘭氏陰性細菌例如大腸桿菌和假單胞菌屬菌種。在優選的方面，細菌宿主細胞是遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細胞。在另一個優選的方面，芽孢桿菌屬細胞是嗜鹼的芽孢桿菌屬。可通過如下方法實現將載體導入細菌宿主細胞例如原生質體轉化(參見，例如，Chang和Cohen,1979,Afo/ecw/wGe"era/Ge"e/Zcs168:111-115),4吏用感受態細月包(參見，例如，Young和Spizizen，1961,Jowma/o/5a"en'o/ogy81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971,Jow謂/o/Mo/腦/ar腸/ogy56:209-221)，電穿孔(參見，例如，Shigekawa和Dower，1988，Aoto^m々way6:742-751)或接合(參見，例如，Koehler和Thome,1987，Jowwa/5a"en'o/ogy21169:5771-5278)。宿主細胞還可以是真核生物，例如哺乳動物、昆蟲、植物或真菌細胞。在優選的方面，宿主細胞是真菌細胞。"真菌"用在本文包括以下門子囊菌門(Ascomycota)、4旦子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)禾口接合菌門(Zygomycota)(如由Hawksworth等，於爿!.mw0W/2朋t/BZsfey》Z)/c/7.o"a/"yT7zeFw"g7',第8版，1995，CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK所定義)以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，見上，171頁中所引用)，和所有有絲分裂孢子真菌(mitosporicfongi)(Hawksworth等，1995,見上文)。在更優選的方面，真菌宿主細胞是酵母細胞。"酵母"用在本文包括產子嚢酵.母(ascosporogenousyeast)(內孑包黴目(Endomycetales))、產4a子酵母(basidiosporogenousyeast)禾口屬於半^口菌類(FungiImperfecti)(芽孑包糹岡(Blastomycetes))的酵母。由於酵母的分類在未來可能改變，就本發明而言，將酵母定義為如歷o/ogyJc//W/7'&so/Ife"W(Skinner,F.A.，Passmore,S.M.和Davenport,R.R.編，5bc.^/.5acfeWo/.Syw/as7'wmiSen'&sNo.9，1980)中所述。在甚至更加優選的方面，酵母宿主細胞是4支絲酵母屬、漢遜酵母屬(//araewM/a)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或耶氏酵母屬細月包。在最優選的方面，酵母宿主細胞是卡爾酵母，釀酒酵母，糖化酵母，道格拉氏酵母，克魯弗酵母，諾地酵母或卵形酵母細胞。在另一個最優選的方面，酵母宿主細胞是乳酸克魯維酵母(幻wj/veramycas/acto)細胞。在另一個最優選的方面，酵母宿主細胞是解脂耶氏酵母(7"mw/a印o/,'ca)細胞。在另一個更優選的方面，真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞。"絲狀真菌，，包括真菌門(Eumycota)和卵菌門的亞門(如由Hawksworth等，1995,見上文，所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特徵在於由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它複雜多糖組成的菌絲體壁。通過菌絲延伸進行營養生長，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營養生長通過單細胞菌體的出芽生殖(budding)進行，而碳分解代謝可以是發酵的。在甚至更優選的方面，絲狀真菌宿主細胞是枝頂孢黴屬、麴黴屬、短梗黴屬、煙管黴屬CSyeAa"t/era)、擬蠟菌屬(CeWpon'o戸&)、鬼傘屬(Opn'"w力、革蓋菌屬(Con'o/w)、隱球菌屬、Fz7oZ)osWmw、鐮孢屬、腐質黴屬、梨孢菌屬(M3g"apwt/2e)、毛黴屬、毀絲黴屬、新考瑪脂黴屬(iVeoca肌wa幼'x)、脈孢菌屬、擬青黴屬、青黴屬、平革菌屬(屍/2a/7erac/2"ete)、射脈菌屬(屍/2/eZ7/")、瘤胃壺菌屬(屍/raw;/cM)、側耳屬(戶/wra^s)、裂褶菌屬、踝節菌屬、嗜熱子嚢菌屬、梭孢殼屬、彎頸黴屬(ro/yjwc/at^m)、栓菌屬(rramete)或木黴屬細胞。在最優選的方面，絲狀真菌宿主細胞是泡盛麴黴、煙麴黴、臭麴黴、日本麴黴、構巢麴黴、黑麴黴或米麴黴細胞。在另外的最優選方面，絲狀真菌宿主細胞是杆孢狀鐮孢、禾穀鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢細胞。在另外最優選的方面，絲狀真菌宿主細胞是黑刺煙管菌(場'e^a^fera^/wto)、幹擬蠟菌(Or—"'o/w7'sa"ezW"a)、幹擬錯菌、Cer—".o/w/scflreg/ea、淺黃擬錯菌糹工扣乂錯菌(Cen)on'o/w^s、或蟲#以錯菌(Cen^on'o/w7'ssw6verm/5por")、灰蓋鬼傘(Co/n'm^cz'"ereu)、毛革蓋菌(Cw7'o/ms/2/raw似力、特異腐質黴、疏棉狀腐質黴、米赫毛黴、嗜熱毀絲黴、粗糙脈孢菌、產紫青黴、黃孢平革菌CP/zawerac/^etec/^sc^;on'Mw)、輻射射月永菌(屍/z/e6/araSWewces"&481:1470-1474中描述。用於轉化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardier等，1989，G麼78:147-156和WO96/00787描述。可以使用由如下文獻描述的方法轉化酵母Becker和Guarente,於Abelson，J.N.和Simon,M.I.Volume194，pp182-187,AcademicPress,Inc.,NewYork;Ito等,1983,/owtg(/o/Ba"en.o/ogy153:163;和Hinnen等,1978,屍raceW"gso/7Va"'owa/爿co(i證yo/Sc/e"c&y75:1920。最優選的宿主細胞是細菌細胞如屬於芽孢桿菌屬的革蘭氏陽性細菌。23產生方法
技術領域：
：本發明還涉及用於產生本發明多肽的方法，其包括(a)在有益於產生多肽的條件下培養細胞，所述細胞以其野生型形式能夠產生所述多肽；和(b)回收所述多肽。優選地，所述細胞是芽孢桿菌屬的細胞，並且更優選地，所述細胞是枯草芽孢桿菌的細胞。本發明還涉及用於產生本發明的多肽的方法，其包括(a)在有益於產生多肽的條件下培養宿主細胞；和(b)回收所述多肽。本發明還涉及用於產生本發明的多肽的方法，包括(a)在有益於產生多肽的條件下培養宿主細胞，其中所述宿主細胞包含突變核苷酸序列，其在SEQIDNO:l的成熟多肽編碼區中具有至少一個突變，其中所述突變核苦酸序列編碼由SEQIDNO:2的胺基酸1至719組成的多肽，和(b)回收所述多肽。在本發明的產生方法中，使用本領域熟知的方法在適合於產生所述多肽的營養培養基中培養細胞。例如，可以通過在合適培養基中和允許表達和/或分離所述多肽的條件下進行的搖瓶培養，和實驗室或工業發酵罐中的小規模或大規模發酵(包括連續、分批、補料分批或固態發酵)來培養細胞。使用本領域已知的方法在合適的營養培養基中進行培養，所述營養培養基包含碳源和氮源和無機鹽。合適的培養基能夠從商業供應商獲得或可以根據公開的組成製備(例如，在美國典型培養物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營養培養基中，該多肽能夠從所述培養基中直接回收。如果多肽不分泌到培養基中，其能夠從細胞裂解物(lysate)回收。可以使用本領域已知的對於所述多肽是特異性的方法來檢測多肽。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用、酶產物的形成或酶底物的消失。例如，酶試驗(enzymeassay)可用於測定如本文所述的多肽的活性。所得多肽可以-使用本領域已知的方法回收。例如，多肽可以通過常M^方法從營養培養基中回收，所述常規方法包括但不限於離心、過濾、提取、噴霧乾燥、蒸發或沉澱。本發明的多肽可以通過多種本領域已知的方法純化，所述方法包括-f旦不限於層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，製備型(preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉澱)、SDS-PAGE或4是取(參見，例如，屍wnyco^'o";J.-C.Janson和LarsRyden編，VCHPublishers,NewYork,1989)。組合物本發明還涉及包含本發明的多肽的組合物。優選地，所述組合物富含這種多肽。術語"富含"表示所述組合物的a-澱粉酶活性增加，例如，以至少1.1的富集因數(enrichmentfactor)增加。所述組合物可以包含本發明的多肽作為主要酶組分，例如，單組分組合物。或者，所述組合物可以包含多種酶活性，如氨肽酶、a-澱粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質酶、角質酶、環糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖苷酶、|3-半乳糖苷酶、葡糖澱粉酶、a-葡糖苷酶、(3-葡糖普酶、卣素過氧化酶、轉化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、肽穀氨醯胺酶(peptidoglutaminase)、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉穀氨醯胺酶或木聚糖酶。額外的酶可以通過例如屬於以下屬的微生物產生麴黴屬，優選棘孢麴黴、泡盛麴黴、煙麴黴、臭麴黴、日本麴黴、構巢麴黴、黑麴黴或米麴黴；鐮孢屬，優選杆孢狀鐮孢、禾穀鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢；腐質黴屬，優選特異腐質黴或疏棉狀腐質黴；或木黴屬，優選哈茨木黴、康寧木黴、長枝木黴、裡氏木黴或綠色木黴。可以依照本領域內已知的方法製備多肽組合物，並且可以是液體或幹組合物的形式。例如，所述多肽組合物可以是顆粒(granulate)或孩i粒(microgranulate)的形式。可以將包括於所述組合物中的多肽依照本領域內已知方法穩、定。以下提供的實施例是本發明多肽組合物的優選的用途。本發明的多肽組合物的劑量和使用該組合物的其它條件可以基於本領域內已知的方法確定。用途ot-澱粉酶可以用於產生麥芽糊精，包括在合適的條件下將澱粉或澱粉水解物與a-澱粉酶一起溫育以水解澱粉或澱粉水解物中的a-l,4鍵。麥芽糊精可以是線性或有支鏈的，並且可以包括葡萄糖(DP1)、麥芽糖(DP2)、麥芽三糖(DP"、麥芽四糖(DP4)、麥芽五糖(DP5)、麥芽六糖(DPQ和麥芽七糖(DP7)。可以通過如下方式製備麥芽糊精在熱穩定的a-澱粉酶存在的情況下液化(部分水解)澱粉，然後在本發明的a-澱粉酶存在的情況下，在適於切割a-(l，4)糖苷鍵的條件下將液化澱粉糖化(進一步水解)。可以處理非常高的澱粉濃度，例如30%至40%幹-固體。液化可以包括在約105。C初步水解約五分鐘，然後在85。C至90。C的溫度溫育約一小時，以得到10至15的右旋糖當量(D.E.)。用本發明的a-澱粉酶進行的糖化可以在pH5-6.5和50-70。C進行24-72小時，優選36-48小時。用本發明的a-澱粉酶進4亍的糖化可以在比用常規真菌澱粉酶糖化時更高的溫度和更低的pH進行。本發明的a-澱粉酶還可以用於澱粉轉化、醇生產、釀造和烘培。麥芽糖漿的產生可以包括以下步驟l)在a-澱粉酶存在的情況下液化澱粉；2)在本發明的a-澱粉酶存在的情況下糊精化；和3)回收所述糖漿；和任選地純化糖漿。步驟l)中用於液化的a-澱粉酶可以是任何a-澱粉酶。優選的a-澱粉酶是芽孢桿菌屬a-澱粉酶，如Termamyl-樣a-澱粉酶，包括地衣芽孢桿菌a-澱粉酶(作為TermamyFM商業上可得到(Novozymes))，解澱粉芽孢桿菌a-澱粉酶(作為BAN銷售(Novozymes))，嗜熱解脂肪芽孢桿菌a-澱粉酶(作為S型TermamylTM120L銷售)，源自芽孢桿菌屬菌種NCIB12289、NCIB12512、NCIB12513或DSM9375的菌抹的a-澱粉酶，所有上述菌4朱均在WO95/26397中詳細描述，和由Tsukamoto等,BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,151(1988),pp.25-31描述的a-澱粉酶。"Termamyl-樣a-澱粉酶"的定義中的a-澱粉酶在例如WO96/23874(Novozymes)中限定。在另一個方面，本發明涉及產生麥芽糖的方法，包括下述步驟l)在140-160。C在pH4-6液化澱粉;2)在60-95。C，特別是65-85。C，如70-80°C，在pH4-6，在本發明的真菌a-澱粉酶變體存在的情況下糊精化；和3)回收所述糖漿；和任選地純化所述糖漿。在本發明的一個實施方案中，在步驟(2)中加入有效量的葡糖澱粉酶。在這個實施方案(包括用葡糖澱粉酶處理)中的糖漿不是麥芽糖漿，而是具有不同糖譜(sugarprofile)的糖漿。葡糖澱粉酶可以是麴黴屬葡糖澱粉酶，具體為黑麴黴葡糖澱粉酶。或者，方法包含下述步驟1)在95-110。C在pH4-6，在芽孢桿菌屬a-澱粉酶存在的情況下液化澱粉；2)在70-95。C在pH4-6，在本發明的a-澱粉酶存在的情況下液化，然後回收和/或任選地純化獲得的產物。最後，本發明的一些方面涉及多種洗滌劑用途。一個方面涉及包含本發明的a-澱粉酶的洗滌添加劑，任選地為無粉塵顆粒、穩定化液體或受保護的酶的形式。這個方面的優選實施方案涉及包含0.02-200mg酶蛋白質/g添加劑的洗滌添加劑。另一個優選的實施方案涉及根據先前方面的洗滌添加劑，其額外包含另一種酶，如蛋白酶、脂肪酶、過氧化物酶、另一種澱粉分解酶和/或纖維素酶。另一個方面涉及包含本發明a-澱粉酶的洗滌組合物，並且這個方面的優選實施方案涉及洗滌組合物，其額外包含另一種酶，如蛋白酶、脂肪酶、過氧化物酶、另一種澱粉分解酶和/或纖維素酶。另一個方面涉及包含本發明的a-澱粉酶的手動或自動洗碗洗滌劑組合物。優選的洗^宛洗滌劑組合物額外包含另一種酶，如蛋白酶、脂肪酶、過氧化物酶、另一種澱粉分解酶和/或纖維素酶。最後一個洗滌劑相關方面是包含本發明的a-澱粉酶的手動或自動洗衣組合物。根據本發明優選的洗衣組合物額外包含另一種酶，如蛋白酶、脂肪酶、過氧化物酶、澱粉分解酶和/或纖維素酶。澱粉結合域本發明還涉及包含編碼蛋白質的基因的核酸構建體，所述基因與由編碼具有澱粉結合活性的多肽的SEQIDNO:1的片段組成的核苷酸序列可操作連接，其中所述基因對於SEQIDNO:1是外源的。本發明還涉及包含這些核酸構建體的重組表達載體和重組宿主細胞。本發明還涉及用於產生蛋白質的方法，其包括(a)在適於產生所述蛋白質的條件下培養這種重組宿主細胞；和(b)回收所述蛋白質。核苷酸序列可以單獨地以調控序列與外源基因可操作地連接(operablylinkedtoforeigngenesindividuallywithcontrolsequences),^口上文戶斤述。所述蛋白質對於宿主細胞可以是天然的或異源的。術語"蛋白質"在本文的意思不是指特定長度的編碼產物，並且因此涵蓋肽、寡肽和蛋白質。術語"蛋白質"還涵蓋組合以形成編碼產物的兩種或兩種以上多肽。所述蛋白質還包括雜合多肽，其包含部分或全部多肽序列的組合，所述多肽序列從至少兩種不同的蛋白質獲得，其中一種或多種蛋白質對於宿主細胞可以是異源或天然的。蛋白質進一步包括上述蛋白質和雜合蛋白質的天然存在的等位基因變異和工程改造的變異。27優選地，蛋白質是激素或其變體、酶、受體或其部分、抗體或其部分，或報導蛋白(reporter)。在更優選的方面，所述蛋白質是氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂合酶(lyase)、異構酶或連接酶。在更加優選的方面，所述蛋白質是氨肽酶、ot-澱粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質酶、角質酶、環糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖香酶、卩-半乳糖苷酶、葡糖澱粉酶、(x-葡糖苷酶、P-葡糖苷酶、轉化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變位酶(mutanase)、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉穀氨醯胺酶或木聚糖酶。基因可以從任何原核、真核或其它來源獲得。通過以下實施例進一步對本發明進行描述，但不應將其理解為對本發明範圍的限制。澱粉酶試驗二硝基水楊酸法就本發明而言，可以使用二硝基水楊酸法測定a-澱粉酶活性，所述方法為由Miller,G丄.在(Miller,G.L.1959.Useofdinitrosalicylicacidfordeterminationofreducingsugar.Anal.Chem.31:426428.)中描述的用於測定還原糖的方法。PNP-G7方法或者，可以通過使用PNP-G7為底物的方法測定a-澱粉酶活性。PNP-G7(對硝基苯基-a,D-麥芽庚糖香)是封閉的(blocked)寡糖，其能被內切澱粉酶切割。切割後，試劑盒中包括的a-葡糖苷酶消化底物以釋放游離的PNP分子，PNP分子為黃色，因此能在1=405nm.(400-420nm.)處通過可見光分光光度法測定。包含PNP-G7底物和a-葡糖苷酶的試劑盒可以從Boehringer-Mannheim獲得(目錄號1054635)。為了製備底物，向5ml緩衝液(BM1442309)中加入一併瓦底物(BM1442309)。為了製備a-葡糖苷酶，向45ml緩衝液(BM1442309)中加入一瓶a-葡糖苷酶(BM1462309)。通過將5mla-葡糖苷酶溶液與1ml底物混合製成工作溶液。通過將20pi酶溶液轉移至96孔微量滴定板並在25。C溫育而進行試驗。在25。C加入200(il工作溶液。將溶液混合併預溫育1分鐘，在3分鐘內在OD405nm每15秒鐘測定吸收。依賴時間的吸收曲線的斜率與指定條件組下的所述a-澱粉酶的比活性(活性每mg酶)成正比。實施例用作緩衝液和底物的化學品都是至少試劑級的商業產品。使用Phadebas試-瞼測定a-澱4分酶活性通過使用Phadebas⑧片為底物的方法測定a-澱粉酶活性。Phadebas片(Phadebasa-澱粉酶測試，由PharmaciaDiagnostic提供)包含交聯的不可溶藍色澱粉聚合物，其已經與牛血清白蛋白和緩沖液物質混合併製成片劑。對於每次單獨的測試，將一片懸浮於包含5ml50mMBritton-Robinson緩沖液(50mM乙酸，50mM磷酸，50mM硼酸，0,1mMCaCl2，用NaOH將pH調至感興趣的數值)的試管中。在感興趣的溫度，在水浴中進行測試。將待測試的a-澱粉酶用xml50mMBritton-Robinson緩衝液稀釋。向5ml50mMBritton-Robinson緩衝液中加入1ml這種a-澱粉酶溶液。由a-澱粉酶水解澱粉產生可溶的藍色片段。在620nm處用分光光度計測定獲得的藍色溶液的吸光度，所述吸光度是a-澱粉酶活性的函數。重要的是，在溫育10或15分鐘(測試時間)後測定的620nm吸光度於620nm在0.2至2.0吸光度單位的範圍內。在此吸光度範圍中，活性和吸光度之間有線性(Lambert-Beer定律)。因此必須調整酶的稀釋度(dilution)使其符合此標準。在特定的條件組(溫度、pH、反應時間、緩衝液條件)下，lmg給定的a-澱粉酶將水解一定量的底物，並產生藍色。在620nm測定顏色強度。測得的吸光度與給定條件組下所述a-澱粉酶的比活性(活性/mg純a-澱粉酶蛋白質)成正比。培養基與溶液除非另外指出，限制性內切酶和其他用於DNA操作的酶由(供應商)提供，並且#4居製造商的說明-使用。實施例1:序列SEQIDNO:1的鑑定A.基因組文庫構建從Denmark,Sandbjerg中的地點採集含沙土壤(sandysoil)樣本。將土壤樣本巴氏殺菌並用橄欖油富集(oliveoilenriched)。通過使用標準分子生物學技術(Ausuble等1995"CurrentprotocolsinmolecularbiologyPubl:JohnWileyandsons)從這一富集培養物中製備染色體DNA。用限制性內切酶Mbol部分切割製備的DNA,並通過超速離心在蔗糖梯度中分離。提取3至10kb的片段，沉澱並重懸於合適的緩沖液中。通過^f吏用StratageneZAPExpressTM予貞消^化的載體試劑盒和StratageneZAPExpressTM預消化的Gigapack⑧克隆試劑盒(用BamHI預消化)(StratageneInc.,USA)，根據銷售方的說明/推薦，製備基因組文庫。得到的lambdaZAP文庫包含200pfU/ul，收集其中的100,000pfu用於大量剪切(massexcision)。將得到的41，900,000cfli/ul大腸桿菌菌落匯集，並通過使用QiagenSpin微量製備試劑盒(Qiagen,德國)製備質粒。B.文庫篩選將約100,000個文庫克隆均勻地塗布在包含用Cibachron紅染色的支鏈澱粉(1%，重量百分比)、LB瓊脂和卡那黴素(25微克/ml)的平板上。在37。C過夜溫育後，通過菌落周圍指示分泌澱粉降解酶的透明區(clearingzone)來鑑定陽性克隆。鑑定出這個文庫中的一個陽性克隆(pSBL0622-2),通過如下^r證這個克隆胞外產生澱粉降解酶使克隆在包含卡那黴素(25微克/ml)和1%(重量百分比)馬鈴薯澱粉(Sigma,S-2630)的LB平板上過夜生長，然後將澱粉進行碘蒸汽染色，當澱粉降解時，其在菌落周圍指示透明區。此外，在SDS-Page凝膠上計算的分子量(78kDa)的條帶對應於來自SEQIDNO:2位置1-719的成熟多肽的的計算的分子量，其指示了酶的表達。僅篩選宿主(大腸桿菌DH10B)本身不顯示這個蛋白質條帶。根據製造商的推薦，通過使用Qiagen質粒製備試劑盒，製備活性克隆的質粒。C.基因的分析使用載體中具有退火位點的T3和T7測序引物，通過Sanger測序由質粒獲得基因序列，根據獲得的序列設計定製的測序引物，如SEQIDNO:3-8中所示。.本發明編碼a-澱粉酶的完整DNA序列如SEQIDNO:1中所示，推定的30胺基酸序列如SEQIDNO:2中所示，並且鑑定了信號肽。分析推定的胺基酸序列，全長多肽顯示包括下述序列的域結構能劃分為糖基水解酶家族13亞家族2的成員的a-澱粉酶蛋白質序列(MarkR.Stam等,"Dividingthelargeglycosidehydrolasefamily13intosubfamilies:towardsimprovedfunctionalannotationsofa-alpha-amylase-relatedproteins",ProteinEngineering,Design&Selectionvol.19no.12pp.555-562，2006)並且包含N誦端信號肽序列，GH13—2域，a-澱粉酶C-端域(Pfam登錄號PF02806)和糖結合域(CBM)20(PfamPF00686)。實施例2:枯草芽孢桿菌中a-澱粉酶的克隆通過PCR融合來自地衣芽孢桿菌的a-澱粉酶(AmyL)的信號肽，使其符合編碼a-澱粉酶的基因的閱讀框。通過同源重組，將編碼獲得的編碼序列的DNA整合到枯草芽孢桿菌宿主細胞基因組上。在三啟動子系統(如WO99/43835中所述)的控制下表達基因構建體，所述系統由來自地衣芽孢桿菌a-澱粉酶基因(amyL)的啟動子、來自解澱粉芽孢桿菌a-澱粉酶基因(amyQ)的啟動子和包括穩定化序列的蘇雲金芽孢桿菌cryIIIA啟動子組成。使用編碼氯黴素乙醯專爭移酶的基因作為才示i己(在例3口Diderichsen等，Ausefulcloningvectorforto/腸s由iPlasmid,30，p.312,1993中描述)。選捧十個具有氯黴素抗性的轉化體，在大豆基培養基(soybasedmedia)中的4mL培養物中在37。C生長3天，並將20微升上清液點樣在包含cibachron-鄉f標記支鏈澱粉的瓊脂平板上。選擇一個這樣的克隆，通過DNA測序分析來一瞼i正構建體的DNA序列正確。在旋轉搖床上，在300mL帶擋板的錐形瓶中進行a-澱粉酶表達克隆的發酵，每瓶包含補加34mg/1氯黴素的100mL大豆基培養基。在37。C將克隆發酵4天。使用色語，在苯基瓊脂糖柱上從上清液純化酶，然後使用鹽梯度，在Q瓊脂糖柱上洗脫。匯集物(pool)的吸收值為A280=0.79和A260=0.43，並且純化的澱粉酶為12%SDS-PAGE凝膠上的主要條帶。在實施例4、5和6中使用純化的酶。實施例3:a-澱粉酶活性的檢測A.使用二硝基水楊酸的試驗通過使用二硝基水楊酸方法進行澱粉分解活性的確定，所述方法為測定還原衝唐的方'法.(Miller,G.L.1959.Useofdinitrosalicylicacidfordeterminationofreducingsugar.Anal.Chem.31:426-428.)。B.用酶譜;險測通過加入三氯乙酸至終濃度10%，然後在冰浴中溫育30分鐘並在13，000xg離心5分鐘，將來自攜帶a-澱粉酶基因(SEQIDNO:l)的表達克隆(實施例2)的兩百微升培養物上清液沉澱。去除上清液，並在10%SDS-PAGE凝膠上對樣品(50jiiL)進行大小排阻。在室溫在包含100mMTrispH8和5mMCaCl2的2.5%TritonX-100中洗滌凝膠，然後在室溫在1%Paselli澱粉(Avebe,Netherlands)、100mMTrispH8和5mMCaCl2中溫育30分鐘。用Lugol溶液(溶於100mL水中的0.15gl2，1.5gKI)將凝膠染色10秒鐘，並用過量水將剩餘的Lugol溶液洗去。攜帶a-澱粉酶基因(SEQIDNO:2)的表達克隆的SDS-PAGE和酶譜(zymogram)指示了期望大小(78kDa)的蛋白質條帶和透明區。實施例4:N-端N-端序列測定為ASGQSLGPVT(SEQIDNO:2中的位置1至10)。實施例5:最適pH與最適溫度通過37。C在調至從pH2.0至pH9.0的不同pH值的緩衝液中運行Phadebas試驗，來進行關於最適pH的實驗。發現酶的最適pH為約pH6。相似地，在pH6，通過在從30。C至80。C的溫度運行Phadebas試驗，來進行關於最適溫度的實驗。發現酶的最適溫度為約60°C。實施例6:澱粉降解譜對製備於50mM乙酸緩衝液，1mMCaCl2，pH6.0(煮沸3分鐘以溶解澱粉)中的5%(重量百分比)蠟質玉米澱粉(waxycornstarch)(Cerestar蠟質玉蜀黍0401)進行澱粉降解譜分析。以0.2mg酶/g乾物質的量，向1ml底物加入如實施例2所製備的純化的酶，並將混合物在50。C溫育24小時。加入一滴濃HC1，並將樣品在IO(TC溫育15分鐘使酶失活。通過0.22微米濾器過濾樣品，並使用BIO-RADAminexHPX-42A柱(Cat.nr.125-0097)，與1套BIO匿RADMicro-GuardDeashingcartridge(脫灰筒)(目錄號125-0118)相適合的BIO-RADDeashingHolder(支持器)(Cat.nr.125-0139),在WatersHPLC系統上進行分析，用兩次脫氣的蒸餾水洗脫並使用WatersRI檢測器4全測。使用RI檢測評價，降解譜顯示大約相似量的葡萄糖(DP1)、麥芽糖(DP2)、麥芽三糖(DP3)、麥芽四糖(DP4)、麥芽五糖(DP5)、麥芽六糖(DP6)和麥芽七糖(DP7),並剩餘大量的(substantialamount)較大的糊精(〉DP10)。權利要求1.具有α-澱粉酶活性的分離的多肽，其選自下組(a)多肽，其具有與SEQIDNO2的胺基酸1至719有至少65％同一性的胺基酸序列；(b)多肽，其由在低嚴緊條件下與以下序列雜交的多核苷酸編碼(i)SEQIDNO1的核苷酸97至2256，或(ii)(i)的互補鏈；和(c)多肽，其具有通過取代(特別是保守取代)、缺失和/或插入一個或多個胺基酸而由SEQIDNO2的胺基酸1至719得到的胺基酸序列。2.權利要求1的多肽，其具有與SEQIDNO:2的胺基酸1至719有至少95%同一性的胺基酸序列。3.權利要求1或2的多肽，其具有包含SEQIDNO:2的氨基S臾1至719或由SEQIDNO:2的胺基酸1至719組成的胺基酸序列。4.分離的多核苷酸，其包含編碼權利要求1-3中任一項的多肽的核苷酸序列。5.分離的多核苷酸，其編碼具有a-澱粉酶活性的多肽，所述多核苷酸選自下組a)多核苷酸，其與下述核苷S交序列具有至少60%同一性(i)SEQIDNO:1的核芬酸97至2256,或(ii)(i)的互補《連；和b)多核苷酸，其在中嚴緊條件下與以下序列雜交(i)SEQIDNO:1的核芬酸97至2256,或(ii)(i)的互補鏈。6.核酸構建體，其包含權利要求4或5的多核苷酸，所述多核苷酸與指導所述多肽在表達宿主中產生的一個或多個調控序列可操作地連接。7.重組表達載體，其包含權利要求6的核酸構建體。8.重組宿主細胞，其包含權利要求6的核酸構建體或權利要求7的載體。9.用於產生權利要求1-3中任一項的多肽的方法，其包括(a)在有益於所述多肽產生的條件下培養權利要求8的重組宿主細胞；和(b)回收所述多肽。10.權利要求1-3中任一項的多肽用於澱粉液化、紡織品脫漿、紙和紙漿工業中的澱粉修飾，用於釀造、乙醇生產或烘培的用途。11.用於產生麥芽糊精的方法，其包括將澱粉或澱粉水解物與權利要求1-3中任一項的多肽一起溫育，從而水解澱粉或澱粉水解物中的a-l,4鍵。全文摘要本發明涉及具有α-澱粉酶活性的分離的多肽和編碼所述多肽的分離的多核苷酸。本發明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構建體、載體和宿主細胞，以及用於製備和使用所述多肽的方法。文檔編號C12N9/28GK101600794SQ200880003832公開日2009年12月9日申請日期2008年1月31日優先權日2007年2月1日發明者安德斯·維克索-尼爾森,馬丁·伯徹特申請人:諾維信公司