血小板血栓或臟器損傷的檢測方法
2023-09-18 09:50:25 2
專利名稱：血小板血栓或臟器損傷的檢測方法
技術領域：
本發明涉及血小板血栓或臟器損傷的檢測方法，尤其是涉及彌散性血管內凝血(Disseminated Intravascular Coagulation；DIC)或全身性炎症反應症候群(Systemic inflammatory response syndrome；SIRS)患者的上述檢測方法。根據本發明，通過分析受試者(尤其是，DIC或SIRS患者)的生物樣本(例如，血液)中的血管性血友病因子(vonWillebrand factor；vWF)和/或其分解因子，可檢測血小板血栓或臟器損傷，例如，檢測或預測血小板血栓形成程度、對血栓症或臟器損傷的發病情況進行預測(即，發病的危險性評價)、判斷血栓症或臟器損傷的有無、對血栓症或臟器損傷的預後進行預測、監測、確定治療方法等。
背景技術：
DIC繼發於嚴重的基礎性病變，在全身微血管內形成微血栓。因而，微循環發生障礙，表現出臟器功能衰竭或出血傾向。DIC的病情，也和SIRS有關。DIC時，會發生以下三種障礙或反應。
(1)微血栓形成引發的微循環障礙，由於缺血致使多種臟器功能衰竭。
(2)微血栓形成引發的消耗性凝血障礙，即，組織因子在細胞表面大量表達，促進外源性血液凝固。此外，血液凝固因子、血小板被消耗，呈現出血傾向。
(3)過度纖溶，即凝固促進了纖溶系統的激活，生成分解纖維蛋白的纖溶酶。抑制纖溶酶的α2纖溶酶抑制物(α2PI)被消耗，當其減少到低於正常情況的60％時，纖維蛋白就會被纖溶酶分解，呈現出血傾向。
此外，在並發敗血症的DIC的情況下，單核細胞(巨噬細胞)產生的腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素(IL-1β)等細胞因子，激活嗜中性粒細胞。嗜中性粒細胞產生的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶、活性氧引起血管內皮細胞損傷，使得血管內皮通透性過度增加，血管痙攣，循環泥化淤滯，發生微循環障礙。此外人們還認為，在受損的血管內皮上，單核細胞本身、血管內皮細胞被激活，細胞表面表達組織因子，形成微血栓。微血栓形成使微循環障礙進一步惡化，引發多臟器功能衰竭(multiple organ failure；MOF)。近年普及的SIRS概念中，將該MOF解釋成是由全身性炎症反應引起的。ARDS(adult respiratorydistress syndrome)時，血小板集中於肺循環，引起肺動脈閉塞。SIRS並非由於因與特定抗原反應，引起細胞因子數量增加所導致的炎症反應，而是因沒有特定靶標，針對入侵生物體的侵襲的非特異性免疫反應被激活，細胞因子生成失控而引起重症MOF的一類疾病(非專利文獻1，2)。
SIRS可分為非感染性SIRS和膿毒症(Sepsis)，前者是由休克、外傷、燒傷或急性胰腺炎等引起的，後者則是由各種病原菌的菌血症、其他重症感染引起的。SIRS是生物體對病原體入侵、組織損傷或缺氧等發生的自身免疫反應，是和侵襲種類無關的由各種內源性介質引起的非特異性全身急性炎症反應。SIRS並發的臟器功能衰竭，早期是源於組織缺血、炎症，但由SIRS拖延引起的多臟器功能失調症候群(Multiple organ dysfunction syndrome；MODS)的病情惡化與各種介質介導的過度生物反應有關，SIRS是一組很難預測預後的疾病。
SIRS時，血中TNF-α、IL-1、IL-6等炎症因子顯示高值，其中，TNF-α被認為是引發SIRS狀態下的嗜中性粒細胞激活、血液凝固反應亢進的細胞因子。若嗜中性粒細胞的活化程度超過其對血管內皮細胞的細胞保護作用，會發生嗜中性粒細胞彈性蛋白酶、組織蛋白酶G(Cathepsin G)所致的血管內皮細胞損傷。引起微循環障礙或形成微血栓。活化的嗜中性粒細胞，不但聚集於引起炎症反應的局部部位，而且還會聚集於肺、肝(灌流壓低，白細胞易於粘附)等遠處臟器。一般認為，微循環障礙引起血液泥化(sludging)，進而通過形成微血栓，引起血流停滯(stasis)，組織處於缺血狀態，從而引發多臟器功能衰竭。此外，嗜中性粒細胞通過血管外浸潤，引起實質性臟器損傷。若微血栓形成持續下去，血液凝固因子、血小板將被消耗掉。若SIRS狀態持續3天以上，則易並發DIC。由此，DIC和SIRS病情非常緊密的關聯在一起。
嗜中性粒細胞彈性蛋白酶是分子量約3萬的中性蛋白酶，存在於嗜天青(アズ一ル)顆粒。生理狀態下，嗜中性粒細胞彈性蛋白酶，在嗜中性粒細胞內，消化、分解被吞噬的細菌、異物，在嗜中性粒細胞外，則分解彈性蛋白、膠原(III型、IV型)、纖連蛋白、免疫球蛋白、血液凝固因子XIII等，調節組織生物合成。病理狀態下，嗜中性粒細胞彈性蛋白酶則使生物體構成成分，例如，彈性纖維、蛋白聚糖、膠原纖維、抗凝血酶III、α2-纖溶酶抑制物失活。若嗜中性粒細胞彈性蛋白酶作用於抗凝血酶III的肝素結合位點，使抗凝血酶III失活，則引發DIC。嗜中性粒細胞彈性蛋白酶，在血液中，結合於蛋白酶抑制物(α1-protease inhibitor；α1-AT)，α1-AT可在3毫秒內使由嗜中性粒細胞釋放到血液內的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶失活。然而，在發生炎症反應的組織，由於α1-AT被嗜中性粒細胞釋放的活性氧、髓過氧化物酶、乳鐵蛋白氧化，這使得嗜中性粒細胞彈性蛋白酶不能被失活，從而引起組織損傷。由於嗜中性粒細胞彈性蛋白酶底物特異性低，因而當其釋放過量，並且α1-AT等抑制物缺乏時，則存在生物體構成成分被分解，引發嗜中性粒細胞彈性蛋白酶所致的自身組織損傷的危險。受到嚴重損傷的血管內皮細胞脫落，血小板粘附凝集於脫落部位，形成血栓。
血漿中人vWF是該血小板粘附所必需的，以其為導火索，引發血小板凝集、細胞內顆粒釋放等一系列血小板活化過程，其結果是，形成血栓，從而止血。通常，vWF是作為分子量在20,000kDa以上的超大分子由血管內皮分泌到血中，然後被其中的金屬蛋白酶，即vWF分解酶切斷成500～20,000kDa的多聚合體(multimer)後，在血液中循環。在疾病狀態下(因閉塞等而產生高應力的狀態)，vWF的立體結構發生變化，成為伸展結構。這樣的vWF很難被vWF分解酶分解，因而，血中殘留大量通常觀察不到的巨大vWF分子，與血小板的結合更為有效，由此，促進了血管內血小板的凝集，在微循環形成血栓。儘管這種以血小板為主體的血栓形成是生理性止血機制所必需的，但血栓形成源自凝固因子(第VII因子、第II因子等)活化所引起的血小板融合和纖維蛋白形成。
非專利文獻1Bone RC，CriticalCare Medicine(美國)，1996，24卷，第1125-1128頁非專利文獻2Davies MG.等，British Journal of Surgery(英國)，1997，84卷，第920-935頁發明內容發明要解決的問題如上述，明確解釋以血小板為主體的血栓和以纖維蛋白為主體的血栓的形成的調控機制的因子，儘管至今尚未報導，然而，通過探明DIC患者、SIRS患者身上觀察到的全身微血管中的由纖維蛋白和血小板構成的微血栓的形成機制，可以對DIC、SIRS患者常見的預後不良狀態予以改善。此外，通過適當早期治療，則有可能阻止臟器損傷的發病。本發明人經過銳意研究，其結果是，發現彈性蛋白酶、纖溶酶或凝血酶使vWF分解酶分解，該分解模式因彈性蛋白酶、纖溶酶或凝血酶而有所不同，進而發現彈性蛋白酶值高的DIC或SIRS患者的血漿中的vWF分解酶的濃度顯著低於正常健康人，由此完成了本發明。
即，本發明的目的在於提供檢測受試者(尤其是，DIC或SIRS患者)的血小板血栓或臟器損傷的方法，以及上述檢測用試劑盒。
解決問題的手段根據本發明方法，通過分析血管性血友病因子(Von WillebrandvWF)和/或其分解因子，檢測彌散性血管內凝血或全身性炎症反應症候群患者的血小板血栓或臟器損傷，可以解決上述問題。
根據本發明方法的優選實施方式，上述分解因子是選自彈性蛋白酶、纖溶酶和凝血酶組成的組的蛋白酶(更優選彈性蛋白酶)。
此外，根據本發明方法的其它優選實施方式，通過免疫學方法對血管性血友病因子予以分析。
此外，根據本發明的其它優選實施方式，在加入含有血管性血友病因子分解酶的拮抗劑，抑制劑，激動劑或活性調節劑作為有效成分的醫藥組合物後，進行上述分析。
此外，根據本發明方法的其它優選實施方式，加入含有選自彈性蛋白酶、纖溶酶和凝血酶的蛋白酶的拮抗劑，抑制劑，激動劑或活性調節劑作為有效成分的醫藥組合物後，進行上述分析。
此外，本發明還關於彌散性血管內凝血或全身性炎症反應症候群患者的血小板血栓或臟器損傷的檢測用試劑盒，其含有與血管性血友病因子分解酶特異性結合的抗體或其片段，和/或與血管性血友病因子分解酶的分解因子特異性結合的抗體或其片段。
根據本發明的試劑盒的優選實施方式，還含有與經選自彈性蛋白酶、纖溶酶和凝血酶的蛋白酶切斷後的vWF分解酶特異性結合的抗體或其片段。
本說明書中的用語「分析」包含「檢測」和「測定」，即判斷分析對象物質(例如，vWF)是否存在(檢測)，又定量或半定量確定分析對象物質的量或活性(測定)。
發明效果本發明可檢測受試者，例如DIC或SIRS患者，更具體而言，發生彈性蛋白酶值度高的尿道感染、轉移性肺癌、和/或急性骨髓性白血病等基礎病變的DIC或SIRS患者的血小板血栓或臟器損傷情況，具有很高的臨床價值。根據本發明，可簡便、迅速和高特異性地對血小板血栓或臟器損傷進行檢測。
圖1是經彈性蛋白酶處理後的重組vWF分解酶抗原的電泳結果示意圖。
圖2是經纖溶酶或凝血酶處理後的重組vWF分解酶抗原的電泳結果示意圖。
圖3是顯示vWF分解酶和彈性蛋白酶相關的圖。
圖4是以彈性蛋白酶含量區分的各組患者的vWF分解酶抗原量的分布示意圖。
具體實施例方式
(1)本發明的檢測方法根據本發明，通過對vWF分解酶和/或其分解因子的量(濃度)或酶活性進行定量，並與正常健康人的vWF分解酶和/或其分解因子的量(濃度)或酶活性進行比較，可對血栓症或臟器損傷進行檢測(診斷)。本說明書中，血栓症或臟器損傷的檢測包括，例如，血小板血栓形成程度的檢測或預測、血栓症或臟器損傷的發病預測(即，發病的危險性評價)、血栓症或臟器損傷的存在與否的判定、血栓症或臟器損傷的預後預測、檢測、治療方法的確定等。
本發明方法既可分析vWF分解酶或vWF分解酶的分解因子的量(濃度)，也可分析酶活性，但優選分析量(濃度)。以下，主要基於分析vWF分解酶或其分解因子的量(濃度)的實施方式，對本發明進行說明，以下說明也應當適用於分析酶活性的實施方式。
本說明書中，血管性血友病因子分解酶(vWF分解酶)是指特異性切斷血管性血友病因子(vWF)的A2區域的酪氨酸(842)和甲硫氨酸(843)，也被稱為ADAMT13的金屬蛋白酶。
本發明方法中，可以將vWF分解酶濃度比正常健康人低作為指標。如後述實施例3所示，彈性蛋白酶為高值(例如，100ng/mL以上)的DIC和SIRS患者，與正常健康人相比，其體液樣本中所含的vWF分解酶濃度要低，其具有統計學意義(50％或其以下)。類似地，採用本發明方法，對vWF分解酶濃度進行定量，若比正常健康人的正常值範圍低(例如，超過閾值)，可斷定血小板血栓形成程度高，還可斷定血栓症或臟器損傷發病的危險性高，進而還可斷定血栓症或臟器損傷的預後情況不好。另一方面，若vWF分解酶濃度在正常值範圍內，則可斷定血小板血栓形成程度低，還可斷定血栓症或臟器損傷發病危險性低，進而還可斷定血栓症或臟器損傷的預後情況良好。
本發明方法的可適用對象(受試者)，只要是需要進行血小板血栓形成程度的檢測，或血栓症或臟器損傷(例如，腎損傷或肝損傷，優選腎損傷)的發病或預後預測的患者即可，沒有特別限定，例如，可以是DIC或SIRS患者，優選彈性蛋白酶為高值的DIC或SIRS患者，例如，患有白血病(例如，急性骨髓性白血病)、感染(例如，尿道感染)或癌(轉移性肺癌)等基礎病變的DIC或SIRS患者。
血栓症時，血液在血管中凝固，附著於血管壁形成血栓，由此，血管變狹窄，完全阻塞，血液流動停滯，引起組織、臟器損傷。血管受傷破裂時，血液中的血小板聚集於上述傷口，進行止血。纖維蛋白凝集於此處形成血栓，完全止血，血管壁細胞開始增殖，血管被修復。通常情況下，隨後，溶解血栓的成分發揮作用，血流恢復流動。若該纖溶作用沒有正常發揮作用，則血栓會阻礙血液流動，當血液流動被完全阻斷時，就成了血栓症。據說，40多歲的日本人，5人中就有1人，50多歲的，3人中就有1人，60多歲的2人中就有1人，70多歲的基本上都患有血栓症。血栓症的主要症狀是，在腦部，發生腦血栓、腦栓塞、短暫性腦缺血發作；在肺部，發生肺血栓栓塞症，在心臟，發生心絞痛、心肌梗塞、心房內血栓，其它的還有，腸繫膜血栓、深部靜脈血栓症(エコノミ一症等)。
本發明方法，通過分別從正常健康人和受試者(例如，DIC或SIRS患者)採集待檢樣品，分別測定其vWF分解酶濃度後，比較測定值，可進行上述檢測和/或預測，然而，通常優選預先用採自正常健康人的待檢樣本，確定vWF分解酶濃度的正常值範圍或判定用閾值。在正常值範圍或判定用閾值預先確定的情況下，只需對作為預測對象的受試者的vWF分解酶進行分析，就可以對上述受試者進行上述檢測和/或預測。上述正常值範圍或判定用閾值範圍，會因各種條件，例如，基礎病變、性別、年齡等有所變化，但本領域的技術人員，通過適當選擇與受試者對應的適當的母集團，並對從該集團獲得的數據進行統計學處理，就可確定正常值範圍或判定用閾值。
本發明方法中，vWF分解酶的分析方法，只要能夠定量或半定量確定vWF分解酶的量，或者是判定vWF分解酶的存在與否即可，沒有特別的限定，例如可以舉出，使用抗vWF分解酶抗體或其片段的免疫學方法(例如，酶免疫測定法、乳膠凝集免疫測定法、化學發光免疫測定法、螢光抗體法、放射免疫測定法、免疫沉降法、免疫組織染色或Westernblot等)、生化學方法(例如，酶學測定法)或測定mRNA量的分子生物學方法等。
在採用免疫學方法作為vWF分解酶的分析方法的情況下，抗vWF分解酶抗體或其片段，可以依照公知的方法，例如，WO2004/029242號小冊子中記載的方法進行製備，各種免疫學測定，例如，可依據WO2004/029242號小冊子中記載的方法進行。
vWF分解酶的測定方法，從敏感度和簡便性考慮，優選免疫學方法。此處，免疫學方法指的是，使用vWF分解酶的抗體，例如，以ELISA法、乳膠法或免疫色譜法對vWF分解酶進行分析的方法。免疫學方法，例如有，對vWF分解酶進行標記的競爭結合法、對抗體進行標記的夾心法、觀察塗覆有抗體的珠子的凝集情況的乳膠珠法、或使用了結合於膠體金等著色粒子的抗體的方法等各種各樣的方法，只要是使用了vWF分解酶的抗體的方法，就包含在本發明的優選實施方式內。抗體，可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體。此外，抗體片段，例如可以使用Fab、Fab』、F(ab』)2或Fv。
本發明方法中，待檢樣本，優選，例如血漿形態的血液，但也可使用其它材料，例如，細胞組織液、淋巴液、胸腺水、腹水、羊水、胃液、尿、胰液、骨髓液或唾液等各種體液。此外，上述血漿優選是枸櫞酸血漿或肝素血漿。
本發明方法中，可以對vWF分解酶和vWF分解酶分解因子一起分析，也可以分別獨立分析。作為待分析的上述分解因子，例如，可以是至少一種選自彈性蛋白酶、纖溶酶或凝血酶的蛋白酶。如後述實施例1和實施例2所示，本發明人發現vWF分解酶可被彈性蛋白酶、纖溶酶或凝血酶分解，並且，其分解模式也因彈性蛋白酶、纖溶酶或凝血酶而有所不同。因而，vWF分解酶的低下，是由彈性蛋白酶、纖溶酶或凝血酶造成的。
本發明方法，通過分析vWF分解酶或vWF分解酶分解因子的任意一方，可對血小板血栓或臟器損傷進行檢測，但若既對vWF分解酶進行分析，又對上述分解因子(即，蛋白酶)進行分析，則可更準確地檢測或預測。
本發明方法，可以將和正常健康人比較得到的上述蛋白酶濃度的變動作為指標。
上述蛋白酶濃度，可用各種公知方法予以測定，例如，可採用如下方法測定。在血中，90％或90％以上的彈性蛋白酶以和α1-抗胰蛋白酶結合的狀態存在。該複合體可採用使用單克隆抗體的ELISA法測定。此外，血中產生的凝血酶，也由於被各種因子快速中和，因而，無法直接測定。然而，通過測定凝血酶和抗凝血酶III形成的複合體(TAT)，可在一定程度上對血中產生的凝血酶的量進行預測。纖溶酶，和凝血酶一樣，由於很快從血中消失，因而無法直接測定，但可作為纖溶酶和α2-抗纖溶酶形成的複合物(PIC)來測定。在測定TAT、PIC複合物時，可以使用採用單克隆抗體、多克隆抗體的ELISA法、乳膠凝集法等。
本發明方法也可用於監測患者服用所需的醫藥組合物後的狀態(例如，血小板血栓形成程度的評價、血栓症或臟器損傷發病或預後預測)。上述醫藥組合物，沒有特殊限定，例如可以舉出，含有vWF分解酶的拮抗劑、抑制劑、激動劑或活性調節劑作為有效成分的醫藥組合物，或者是，含有選自彈性蛋白酶、纖溶酶和凝血酶的蛋白酶的拮抗劑、抑制劑、激動劑或活性調節劑作為有效成分的醫藥組合物。
此外，由於上述各種蛋白酶對vWF分解酶的分解模式不同，本發明人認為，血小板血栓和纖維蛋白血栓的生成調控如下首先，通過彈性蛋白酶分解vWF分解酶，形成血小板血栓，接著，纖維蛋白沉澱附著，形成纖維蛋白血栓，據此分泌的纖溶酶、凝血酶分解vWF分解酶。例如，通過掌握導致vWF分解酶的量的變化的主要因素是基於哪種蛋白酶，可更準確的判斷病情。
例如，當觀察到彈性蛋白酶量的增高和vWF分解酶量的減少時，可判斷處於血小板血栓形成初期階段，或者是當觀察到纖溶酶或凝血酶量的增高和vWF分解酶量的減少時，可判斷處於血小板形成後的後期階段。通過更準確地掌握病情，可選擇更為適當的治療方案。上述蛋白酶之中，從vWF分解酶分解活性最高和參與初期階段考慮，優選以彈性蛋白酶作為診斷指標。
(2)本發明的檢測用試劑盒本發明試劑盒，至少包含抗vWF分解酶抗體或其片段，和/或與vWF分解酶的分解因子特異性結合的抗體或其片段，優選包含2種或2種以上不同的抗vWF分解酶抗體，和/或2種或2種以上不同的抗分解因子抗體。此外，本發明試劑盒，根據需要還可含有與經蛋白酶切斷後的vWF分解酶特異性結合的抗體或其片段，其中，上述蛋白酶選自彈性蛋白酶、纖溶酶和凝血酶。本發明試劑盒，可在實施本發明方法時使用。
本發明試劑盒所含的抗vWF分解酶抗體或抗分解因子抗體，可以是單克隆抗體或多克隆抗體。此外，在含有2種或2種以上不同的抗vWF分解酶抗體，或2種或2種以上不同的抗分解因子抗體的情況下，可將任意一方(第2抗體)作為標記抗體，或者不標記，而是再在試劑盒中追加經過標記的抗第2抗體的抗體。
實施例以下，根據實施例對本發明進行詳細說明，本發明的範圍並不限於此。
《實施例1彈性蛋白酶對重組vWF分解酶抗原的分解作用》將重組vWF分解酶1.5μg溶解於tris緩衝液/生理鹽水，添加彈性蛋白酶直至終濃度為20nmol/L或140nmol/L，37℃孵育15分鐘或1小時後，分別取相當於0.5μg的vWF分解酶。將其以非還原SDS電泳(5～20％凝膠)分離後，用Westernblot法轉移至PVDF(聚偏氟乙烯)膜。用市售封閉劑(Block Ace，大日本製藥)室溫封閉30分鐘後，以tris緩衝液清洗。於1μg/mL抗vWF分解酶單克隆抗體(WH2-22-1A以vWF分解酶的解聯蛋白區域作為抗原決定簇)/tris緩衝液(pH7.4)/10％Block Ace中，室溫反應1小時後，以tris緩衝液(pH7.4)/0.05％NP-40清洗3次，然後在稀釋了2000倍的HRP(辣根過氧化物酶)標記的抗小鼠IgG抗體(BioRad)/tris緩衝液(pH7.4)/10％Block Ace溶液中，室溫孵育1小時。以tris緩衝液(pH7.4)/0.05％NP-40清洗3次後，用TMB溶液(Pierce公司)顯色。結果示於圖1。
圖1中各泳道的對應關係如下1未添加彈性蛋白酶2添加20nmol/L彈性蛋白酶後，37℃反應15分鐘3添加140nmol/L彈性蛋白酶後，37℃反應15分鐘4未添加彈性蛋白酶5添加20nmol/L彈性蛋白酶後，37℃反應1小時6添加140nmol/L彈性蛋白酶後，37℃反應1小時在添加20nmol/L彈性蛋白酶，37℃反應15分鐘的情況下，vWF分解酶的160KDa條帶基本上都被切斷成50KDa，在37℃反應1小時的情況下，160KDa條帶消失，50KDa的條件也基本上消失。另外，在添加140nmol/L彈性蛋白酶的情況下，若孵育15分鐘以上，160KDa的條帶全部消失。該結果提示，彈性蛋白酶對vWF分解酶的分解作用具有濃度和時間依賴性。
《實施例2纖溶酶或凝血酶重組vWF分解酶抗原的分解作用》將重組vWF分解酶1.5μg溶解於tris緩衝液/生理鹽水，添加纖溶酶原(終濃度1μmol/L)和組織纖溶酶原激活物(tPA)(終濃度0.2nmol/L或2nmol/L)，或者是添加凝血酶直至終濃度為20mU或200mU，37℃孵育15分鐘或1小時後，分別取相當於0.5μg的vWF分解酶。將其用SDS電泳分離後，以和實施例1一樣的方法，進行Westernblot，檢測vWF分解酶的條帶。結果示於圖2。
圖2中各泳道的對應關係如下1添加0.2nmol/L tPA後，37℃反應15分鐘2添加2nmol/L tPA後，37℃反應15分鐘3添加20mmol/L凝血酶後，37℃反應15分鐘4添加200mmol/L凝血酶後，37℃反應15分鐘5未添加蛋白酶6添加0.2nmol/L tPA後，37℃反應1小時7添加2nmol/L tPA後，37℃反應1小時8添加20mmol/L凝血酶後，37℃反應1小時9添加200mmol/L凝血酶後，37℃反應1小時在添加纖溶酶或凝血酶，在37℃反應15分鐘的情況下，基本上都沒有觀察到160KDa條帶分解。在添加纖溶酶，37℃反應1小時的情況下，兩個濃度，除160KDa條帶外，還都出現被認為是分解得到的130KDa和100KDa的條帶。此外，在添加凝血酶，37℃反應1小時的情況下，添加200mU時，出現130KDa條帶。由此顯示，纖溶酶和凝血酶對vWF分解酶剪切的部位相同，但在剪切時間上，兩者存在差異。
《實施例3vWF分解酶和彈性蛋白酶之間的相關性》本實施例中，以來自正常健康人、DIC患者和SIRS患者的血漿為待檢樣本，測定vWF分解酶抗原量和彈性蛋白酶量。vWF分解酶抗原量，用市售試劑盒(vWF分解酶ELISA kit，三菱化學ヤトロン)測定。此外，用市售試劑盒(PMN彈性蛋白酶/α1-PI複合物ELISA試劑盒，CALBIOCHEM公司)，測定彈性蛋白酶/α1-抗胰蛋白酶量來表示彈性蛋白酶量。
結果示於圖3和圖4。圖3中，X軸是彈性蛋白酶/α1-抗胰蛋白酶量(單位ng/mL)，Y軸是vWF分解酶抗原量(單位％)。此外，圖4中，「N.S.」表示沒有顯著性差異。
彈性蛋白酶/α1-抗胰蛋白酶和vWF分解酶抗原量之間顯示了良好的負相關(y＝-0.1382x+74.643；R2＝0.1549)，這表明，在彈性蛋白酶/α1-抗胰蛋白酶高值，即組織破壞繼續發展之類的MOF狀態下，由於vWF分解酶抗原被彈性蛋白酶分解，因而，vWF分解酶抗原量降低。此外，彈性蛋白酶高於等於100ng/mL的患者，vWF分解酶抗原量為46.4±23.2％(Mean±SD)，而彈性蛋白酶低於等於50ng/mL的患者，為71.7±29.0％，vWF分解酶抗原量顯著降低(P＜0.05)。
產業上的可利用性基於本發明得到的信息提示，TNF-α等細胞因子激活嗜中性粒細胞，引發血液凝固反應過度進行，在嗜中性粒細胞彈性蛋白酶、組織蛋白酶G等蛋白酶作用下，血管內皮細胞受損，此時，為修復損傷組織而釋放到血中的彈性蛋白酶，將vWF分解酶積極分解，從而促進血小板血栓形成。另一方面，血液發生過度凝固反應，纖維蛋白從血小板血栓上析出，纖溶酶類開始發揮作用，該作用晚於比彈性蛋白酶的作用，纖溶酶將vWF分解酶分解，引起纖維蛋白和血小板構成的微血栓在微血管中形成，引發DIC、SIRS發病。該信息提示，血小板血栓和纖維蛋白血栓的形成始於絲氨酸蛋白酶對vWF分解酶的調控參與。世界上還有大量血栓症不能僅用纖維蛋白血栓分解物解釋。本發明可能有助於解釋上述這樣的血栓症的機制。
本發明可適用於檢測受試者(例如，DIC或SIRS患者)的血小板血栓或臟器損傷。
多數DIC，常常合併惡性病變或嚴重病變等預後不良病情，不乏病情進一步惡化的情況。因此，在DIC治療時，DIC是繼發於各種基礎病變，引發凝固體系活化或凝固調控因子降低，微血栓在全身微血管大量發生，引起血管內閉塞，另一方面，由該血栓形成使血小板和凝固纖溶因子被消耗，並發消耗性止血障礙，出現嚴重出血傾向、臟器損傷。因此，在早期阻止微血栓形成並進行早期治療是非常重要的。
早期預測診斷SIRS的意義如下所述。發展至多臟器損傷的病例的救活率很低，即使進行高度集中治療，改善效果也微乎其微，病例並沒有減少。因此，早期捕捉到向臟器損傷轉移的警告信號，防止其向臟器功能衰竭發展，至為重要。即，正確判斷SIRS階段患者病情、嚴重程度，商討對策，是必要的。
以上，依照特定實施方式，對本發明進行了說明，本領域技術人員公知的變形或改良，也包含在本發明範圍內。
權利要求
1.分析血管性血友病因子分解酶和/或其分解因子，檢測彌散性血管內凝血症患者或全身性炎症反應症候群患者的血小板血栓或臟器損傷的方法。
2.根據權利要求1所述方法，其中，上述分解因子是選自彈性蛋白酶、纖溶酶和凝血酶的蛋白酶。
3.根據權利要求1或2所述方法，其中，上述分解因子是彈性蛋白酶。
4.根據權利要求1～3任一項所述方法，其中，採用免疫學方法分析血管性血友病因子分解酶。
5.根據權利要求1～4任一項所述方法，其中，在加入含有血管性血友病因子分解酶的拮抗劑、抑制劑、激動劑或活性調節劑作為有效成分的醫藥組合物後，進行上述分析。
6.根據權利要求1～4任一項所述方法，其中，在加入含有選自彈性蛋白酶、纖溶酶和凝血酶的蛋白酶的拮抗劑、抑制劑、激動劑或活性調節劑作為有效成分的醫藥組合物後，進行上述分析。
7.彌散性血管內凝血症患者或全身性炎症反應症候群患者的血小板血栓或臟器損傷的檢測用試劑盒，其含有與血管性血友病因子分解酶特異性結合的抗體或其片段，和/或與血管性血友病因子分解酶的分解因子特異性結合的抗體或其片段。
8.根據權利要求7所述試劑盒，其中，還含有與經選自彈性蛋白酶、纖溶酶和凝血酶的蛋白酶切斷後的vWF分解酶特異性結合的抗體或其片段。
全文摘要
公開了分析血管性血友病因子vWF分解酶和/或其分解因子，檢測彌散性血管內凝血(DIC)或全身性炎症反應症候群(SIRS)患者的血小板血栓或臟器損傷的方法。公開了彌散性血管內凝血或全身性炎症反應症候群患者的血小板血栓或臟器損傷的檢測用試劑盒，其含有與血管性血友病因子vWF分解酶特異性結合的抗體或其片段，和/或與血管性血友病因子vWF分解酶的分解因子特異性結合的抗體或其片段。
文檔編號G01N33/573GK101056989SQ20058003784
公開日2007年10月17日 申請日期2005年11月8日 優先權日2004年11月8日
發明者小野智子 申請人:株式會社三菱化學藥得論