可用於靶向、檢測、成像和治療的組合物以及其生產和使用方法

2023-07-02 22:41:56 2

可用於靶向、檢測、成像和治療的組合物以及其生產和使用方法
【專利摘要】本文公開了可用於靶向檢測、成像和治療的組合物，以及其生產和使用方法。
【專利說明】可用於靶向、檢測、成像和治療的組合物以及其生產和使用方法
[0001]相關申請的交叉引用
按照35 U.S.C.119(e)，本申請要求2010年9月28日提交的US序列號61/387，137的權益。上述申請的全部內容明確地通過引用併入本文。
[0002]關於由聯邦政府贊助的研究或開發的聲明 不適用。
[0003]發明構思背景 1.發明構思領域 此公開並要求權益的發明構思一般涉及可用於靶向檢測和/或治療的組合物，以及其生產和使用方法。
[0004]2.【背景技術】描述
靶向的微氣泡(miciObubble)是重要的且新出現的超聲分子成像和治療工具。許多疾病狀態諸如(但不限於)癌、炎症和血栓形成具有獨特的血管腔表面上的蛋白的表達。
[0005]Lanza等人(1996)描述了生物素化的生物標誌物、抗生物素蛋白和全氟化碳乳液的序貫遞送。在US專利7，186，399中，Lanza等人描述了活體內或活體外基於配體進行的脂質包封粒子與表面上分子表位結合方法。這是通過用生物素活化試劑活化的位點特異性配體、抗生物素蛋白活化試劑和用生物素活化試劑活化的脂質包封粒子的序貫遞送來完成的。
[0006]文獻中還描述了靶向的造影劑的更高階聚集體的同時遞送。這些更高階聚集體採用不同組合形式的微氣泡、脂質體、納米粒、泡泡脂質體、脂質體微泡、納米結構材料、超分子聚集體、量子點、納米管和膠束。這些粒子中有許多是多模態的並具有治療特性。例如參見，Lentacker 等人(2010) ；Suzuki 等人(2007 和 2008) ；Myhr 等人(2006) ；Tinkov 等人(2009) ;Kheirolomoom 等人(2007) ；Huang (2008) ;Kim 等人(2009) ；Cai 等人(2008)；Accardo 等人(2009) ；Ghaleb 等人(2008) ；Husseini 等人(2008) ；Schroeder 等人(2009)；McCarthy等人(2008);US專利7，078，015。上面引用的每一專利和公開文件的全部內容據此明確地通過引用併入本文。
[0007]令人遺憾的是，靶位點處所保留的微氣泡的典型粘著率低(數量級為10個微氣泡/微升組織(Dayton,2009)),即使在加了聽福射力的情況下。特別是，Dayton (2009)列出了靶向的造影劑技術的以下限制:(1)粘著於靶位點的造影劑數量少；(2)缺乏對少量造影劑的靈敏度；和(3)來自循環性未靶向的造影劑的高背景。這些限制在下文中進行更詳細的討論。
[0008]儘管靶向的超聲造影劑表現出良好的疾病特異性，但是疾病狀態的診斷受限於成像技術可達到的靈敏度。當造影劑靶向特異性位點時，它們限於腔內皮表面上可用的結合位點數目，因此一個結合位點僅容許單個微氣泡的結合。此外，微氣泡與內皮表面上位點的相互作用受限於穿經腔的血流所產生的剪切力；因此，微氣泡不能與它不「觸及」(即，與之接觸)的表面結合。因此，現有技術方法導致約10個微氣泡/微升的典型結合水平。[0009]現有技術的進一步技術限制在於成像設備:對於超聲，可見到深度和頻率依賴性衰減，並且在高功率(high power)成像下,高峰值負壓導致微氣泡爆裂。此外,採用其它成像模式諸如但不限於MRI和PET時，可見到類似的深度限制。
[0010]因此，在本領域中需要可用於靶向成像和/或治療的新的和改良的試劑。此公開並要求權益的發明構思涉及這樣的組合物以及其生產和使用方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1描繪此公開並要求權益的發明構思的通用多模態靶向和治療系統。
[0012]圖2闡釋此公開並要求權益的發明構思的可序貫遞送的可組合製劑。
[0013]圖3以圖形描繪擴增(amplification)改善造影劑成像穿透度。
[0014]圖4以圖形描繪隨頻率的I mm3組織中功率耗散(power dissipation)的變化。
[0015]圖5以圖形描繪隨頻率的加熱時間的變化。
[0016]圖6A以圖形描繪單個靶向脂質體的單階段擴增。靶向脂質體(I階段試劑)以黑色顯示。[0017]圖6B以圖形描繪單個靶向脂質體的第二階段擴增。單個靶向脂質體以黑色顯示，九個粘著性擴增脂質體(II階段試劑)以灰色顯示。形成最終粘著性簇的二十八個成像脂質體(III階段試劑)以空心圓顯示。
[0018]圖7a闡釋確立信號幅度和微氣泡結合之間關係的劑量反應曲線。圖7b中表格總結利用BIACORE ? XlOO光學生物傳感器(BIACORE? XlOO Optical Biosensor)進行的微氣泡多階段擴增。
[0019]圖8-10含暗相(dark phase)共焦顯微術的顯微照片,它們闡釋多階段複合體的活體外原位組裝。圖8闡釋I階段結合(即，靶向試劑的結合)，圖9闡釋II階段結合(即，擴增試劑的結合)，圖10闡釋III階段結合(即，成像試劑的結合)。
[0020]圖11含顯微照片，它們闡釋I階段靶向和II階段擴增的活體外組裝。
[0021]發明構思的詳細說明
在經示例性的附圖、試驗、結果和實驗室程序來詳細地闡明本發明構思的至少一個實施方案之前，應理解，本發明構思並不將其應用限於下文中所闡述的或者附圖、試驗和/或結果中所闡釋的構造細節和組分安排。本發明構思能有其它實施方案，或者能以多個不同方式來實踐或執行。因而，本文中所用語言意在以最寬的可能範圍和含義給出；且實施方案意在是示例性的而非窮舉性的。同樣，應理解，本文中所用措辭和術語是用於說明目的，不應被視為是限制性的。
[0022]除本文中另有定義外，此公開並要求權益的發明構思方面所用的科學和技術術語應具有本領域普通技術人員通常理解的含義。此外，除上下文另有要求外，單數術語應包括複數對象，複數術語應包括單數對象。一般，本文中所述細胞和組織培養、分子生物學和蛋白質以及寡或多核苷酸化學和雜交方面所用的命名法和技術是眾所周知和本領域通常使用的那些。對於重組DNA、寡核苷酸合成以及組織培養和轉化(例如，電穿孔、脂質轉染)，使用標準技術。酶促反應和純化技術根據製造商的說明書進行，或如本領域通常實行的或如本文所述的那樣來進行。前述技術和程序一般根據在本領域眾所周知的常規方法進行，以及如本說明書各處所提及和討論的各個一般和更具體參考文獻所述的那樣來進行。參見，例如，Sambrook 等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual (第 2 版，Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989),和Coligan等人，CurrentProtocols in Immunology (Current Protocols, Wiley Interscience (1994)),所述文獻通過引用併入本文。本文中所述分析化學、合成有機化學以及藥物和製藥化學方面所用的命名法以及實驗室程序和技術是眾所周知和本領域通常使用的那些。對於化學合成、化學分析、藥物製備、製劑和遞送、以及患者的治療，使用標準技術。
[0023]本說明書中提及的所有公開文件和專利申請反映本發明所屬領域技術人員的技術水平。所有公開文件和專利申請通過引用併入本文，其程度就如同每一件公開文件或專利申請被專門和逐一指出通過引用併入一樣。
[0024]借鑑於本公開，不經過度的試驗即可製造和執行所有在此公開並要求權益的組合物和/或方法。儘管利用優選實施方案對本發明組合物和方法進行描述，但對本領域技術人員顯而易見的是，在不背離本發明構思、精神和範圍的情況下，可以對本文中所述組合物和/或方法以及方法步驟或方法步驟次序施加變化。所有此類對本領域技術人員顯而易見的類似置換和改進視為處於如所附權利要求所定義的發明構思的精神、範圍和構思之內。
[0025]除另有指示外，依照本公開所使用的以下術語應理解為具有以下含義:
當和權利要求和/或說明書中的術語「包含」一起使用時，措詞「一」的使用可能意指「一個」，但它也符合「一或多個」、「至少一個」和「一或多於一個」的含義。權利要求中術語「或」的使用是用於意指「和/或」，除非明確地指出僅指備選方案或者備選方案是互斥的(儘管公開內容支持僅指備選方案以及「和/或」的定義)。在本申請各處，術語「約」是用於表明，一個值包括用於測定該值的裝置、方法的固有誤差變化，或者在那些研究受試者之間存在的變化。術語「至少一個」的使用應理解為包括一個，以及多於一個的任何數量，包括但不限於，2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、100個等。術語「至少一個」可延伸至100或1000個或更多，這取決於其所關聯的術語；此外，100/1000的數量不應理解為是限制性的，因為更高的邊界點也可能產生令人滿意的結果。
[0026]術語「約」是用於表明，一個值包括用於測定該值的裝置、方法的固有誤差變化，和/或在研究受試者之間存在的變化。
[0027]本說明書和權利要求中所用的措詞「包含」、「具有」、「包括」或「含」是非遍舉的或開放式的，並且不排除附加的未述及要素或方法步驟。
[0028]本文所用的術語「或它們的組合」指在該術語前所列項目的所有排列和組合。例如，「A、B、C或它們的組合」意在包括下列中的至少一種:A、B、C、AB、AC、BC或ABC，以及若在特定情況下次序很重要則還包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。進一步地，該例中還明確地包括含一或多個項目或術語重複出現的組合，諸如BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAAXABABB等等。本領域技術人員會理解，典型情況下，對於任何組合中項目或術語的數目沒有限制，除非從上下文中明顯看出並非如此。
[0029]本文所用的術語「可組合製劑」應理解為指根據具體程序製備並可用於一或多個特定應用的組分混合物。在此公開並要求權益的發明構思的某些實施方案中，可組合製劑的組分在給藥之前沒有組合在一起；相反地，組分是經單獨提供和連續或序貫遞送，從而原位形成製劑/複合體。
[0030]本文所用的術語「試劑」或「劑」應理解為指任何介質，其表面上能夠具有一或多個用於與受試者腔中的靶和/或另一試劑相互作用的結合位點。在某些實施方案中，「試劑」或「劑」可選自囊泡、脂質體、回波發生性(echogenic)脂質體、多模態回波發生性脂質體、微氣泡、微氣球(microballoons)、微球體、基質粒子、膠束、基於聚集的構建體、納米粒子、全氟化碳納米滴(nanodroplets)以及它們的組合。
[0031]本文所用的術語「造影劑」應理解為用於在成像分析期間提高解析度以突出器官或組織的物質。造影劑是用於在醫學成像中增強機體內結構或流體對比度的物質。
[0032]術語「靶向的造影劑」指附連有生物標誌物的造影劑，該生物標誌物使造影劑「靶向」與生物標誌物結合的靶位點。
[0033]本文所用的術語「靶」應理解為指腔壁表面上出現的任何結構部分，其中靶向試劑對之具有親合力並因此可與所述結構部分結合。「靶」可以是肽、多肽、蛋白質、表位、抗原、受體、複合體(即，MHC-肽複合體)以及它們的組合或衍生物。[0034]依照此公開並要求權益的發明構思使用的術語「結合位點」應理解為指對另一物質/結合位點具有結合親合力並能夠與之形成複合體、由此提供兩試劑/囊泡間親合力的任何生物分子。例如但非限制，結合位點可以是肽、蛋白、抗原、抗體、抗體片段、受體、配體、糖綴合物以及它們的組合或衍生物。在一個實施方案中，「結合位點」是互補對(例如但非限制，生物素-抗生物素蛋白、抗體-抗原等)的一方。材料一般應選自不會引發變態反應但並非測試腔內慣常存在的組群。可依照此公開並要求權益的發明構思利用的非靶向結合位點(即，被用於擴增、成像和/或治療試劑與先前靶向試劑或試劑複合體結合的下部結構結合位點(infrastructural binding sites))的示例包括但不限於:蛋白諸如但不限於肌酸酐-激酶-腦-型(CKBB)，或治療藥物諸如但不限於卡馬西平、皮質醇、妥布黴素、茶鹼、苯妥英、萬古黴素、洋地黃毒苷、地高辛、慶大黴素、苯巴比妥和丙戊酸，連同與它們相應的人源化抗體。
[0035]本文所用的術語「多肽」是通稱，指具有多肽序列的天然蛋白、片段或類似物。因此，天然蛋白、片段和類似物是多肽屬下的種類。
[0036]本文所用的術語「受體」應理解為包括一或多種特定種類的分子(B卩，配體)可與之附連的生物分子。在一個實施方案中，術語「受體」指在待靶向的器官/組織腔壁表面上表達並以容許與循環性靶向試劑相互作用的方式暴露的配體、任意的肽、蛋白質、糖蛋白、多糖或脂質；也就是說，在所述實施方案中，「受體」充當如上文詳述的「靶」。可是，應理解，本領域已知或本領域普通技術人員想得到的任何受體均可充當如上文所述的「結合位點」。
[0037]本文所用的應用於一物體的術語「天然存在的」指物體可在自然界中找到的事實。例如，存在於可從自然界來源分離出來的有機體(包括病毒)中並且沒有在實驗室經人或以另外方式刻意修飾的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
[0038]「抗體」或「抗體肽(一或多種)」指完整抗體，或為特定的結合而與完整抗體競爭的其結合片段。術語「抗體」以最廣義使用，且具體涵蓋了單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)和抗體片段(例如，Fab、F(ab』)2和Fv)，只要它們顯現所希望的生物活性即可。抗體(Ab)和免疫球蛋白(Ig)是具有同樣結構特徵的糖蛋白。儘管抗體顯現對特定抗原的結合特異性，免疫球蛋白既包括抗體又包括缺乏抗原特異性的其它抗體樣分子。抗體結合片段通過重組DNA技術產生，或通過完整抗體的酶促或化學裂解產生。結合片段包括Fab、Fab』、F (ab』)2、Fv和單鏈抗體。除「雙特異性」或「雙功能性」抗體以外的抗體應理解為其每一結合位點均相同。
[0039]「嵌合」抗體指由至少兩種不同來源的組分構成的抗體。在某些實施方案中，嵌合抗體包含與另一分子融合的源自第一物種的抗體的一部分，所述另一分子例如為源自第二物種的抗體的一部分。在某些此類實施方案中，嵌合抗體包含與源自人的抗體的一部分融合的源自非人動物的抗體的一部分。在某些此類實施方案中，嵌合抗體包含與源自人的抗體恆定區融合的源自非人動物的抗體可變區的全部或一部分。
[0040]當抗體是依照與此公開並要求權益的發明構思利用並向人給藥時，所述抗體可以「人源化」，以避免引發其免疫應答。「人源化」抗體指經修飾以致與人抗體更緊密匹配(在胺基酸序列中)的非人抗體。人源化抗體經改造以致移除其抗原性部分且替換為人抗體的類似部分，同時保留針對所希望表位的抗體親合力。這種改造可能僅涉及幾個胺基酸，或者可能包括抗體的部分或整個構架區、可變區和/或互補決定區(CDR)。因此，人源化抗體是一類嵌合抗體。使抗體人源化的眾多方法是本領域已知的，並公開於US專利6，180，370 (於2001年I月30日授權給Queen等人);6，054, 927 (於2000年4月25日授權給fcickell);5，869，619 (於 1999 年 2 月 9 日授權給 Studnicka)；5, 861，155 (於 1999 年 I 月 19 日授 權給 Lin);5, 712，120(於 1998 年 I 月 27 日授權給 Rodriquez 等人);5，225，539 (於 1993 年 7月6日授權給Winter);和4,816, 567(於1989年3月28日授權給Cabilly等人)，它們的說明書全部據此明確地通過引用以全文併入本文。此外，現有技術有很多與人源化抗體的生成或使用有關的公開論文。這些研究中有許多都教導了能夠與此公開並要求權益的發明構思一起使用的有用流程示例，諸如但不限於，Sandborn等人，Gatroenterology, 120:1330(2001);Mihara 等人，Clin.1mmunol.98:319 (2001);Yenari 等人，Neurol.Res.23:72(2001);Morales 等人，Nucl.Med.Biol.27:199(2000);Richards 等人，Cancer Res.59:2096 (1999);Yenari 等人，Exp.Neurol.153:223 (1998);和 Shinkura 等人，AnticancerRes.18:1217 (1998)，它們全部明確地通過引用以全文併入本文。此公開並要求權益的發明構思進一步包括全人單克隆抗體的使用；提供全人單克隆抗體的方法在本領域中是眾所周知的，並描述於以下文獻，例如但不限於:US專利5，545, 807 ;5，545, 806 ;5，569, 825 ；5，625，126 ;5，633，425 ;5，661，016 ;5，916，771 ;5，939，598 ；PCT 公開 WO 94/02602 ；以及如下非專利參考文獻=Kozbor 等人，Hybridoma, 2:7 (1983)；Cole 等人，PNAS 82:859 (1985)Cote 等人，PNAS 80:2026 (1983) ；Cole 等人，(1985) ；Marks 等人，J Biol.Chem.267:16007 (1992) ;Lonberg 等人，Nature, 368:856 (1994) ；Morrison, 1994 ;Fishwild 等人,Nature Biotechnol.14:845 (1996) ；Neuberger, Nat.Biotechnol.14:826 (1996);以及 Lonberg 和 Huszar, Int Rev Tmmunol.13:65 (1995)。
[0041]可是，應理解，本發明構思不限於上述流程，本領域普通技術人員已知的產生人源化抗體或全人抗體的其它流程可依照此公開並要求權益的發明構思來使用。
[0042]術語「有效量」指在按本發明構思方式使用時，在符合合理效益/風險比情況下足以顯現可測治療效果而無過度不良副作用(諸如毒性、刺激和變態反應)的生物學活性分子或者其綴合物或衍生物的量。治療效果可例如包括但不限於:抑制不希望的組織或惡性細胞的生長。對受試者的有效量將取決於受試者類型、受試者的尺碼和健康狀態、待治療病況的性質和嚴重程度、給藥方法、治療持續時間、並行治療(如果有的話)的性質、所採用的特定製劑等。因此，不可能預先規定精確的有效量。但是，用於指定情形的有效量可由本領域普通技術人員基於本文所提供的信息、使用常規試驗來確定。
[0043]當關係到本文中所述一或多種試劑的應用使用時，措詞「配合使用」表明，將所述試劑(一或多種)給藥以致它們在有機體上和/或與有機體結合的生理活性存在至少些許時間順序上的重疊。因此，所述試劑(一或多種)可序貫地給藥。在序貫給藥中，在給藥第二部分之前甚至可能存在些許實質性延遲(例如，數分鐘或者甚至數小時或數天)，只要在給藥第二給藥試劑和/或第二給藥試劑在有機體中變得有活性時，第一給藥試劑已對有機體產生了些許生理效應和/或保持與有機體的結合即可。
[0044]本文所用的術語「給藥」應理解為包括本領域已知的所有給藥途徑，包括但不限於:口服、局部、透皮、腸胃外、皮下、鼻內、黏膜、肌肉內和靜脈途徑，包括局部和全身性施用在內。此外，利用本領域眾所周知的製劑技術，可將給藥方法設計成能提供延遲或控制釋放。
[0045]本文所用的術語「腔」應理解為指生物學管狀結構的內部空間。依照此公開並要求權益的發明構思使用的腔的示例包括但不限於:血管腔、脊髓腔(spinal lumen)、淋巴管腔等。
[0046]術語「可藥用」指在符合合理利益/風險比情況下，適用於向人和/或動物給藥而無過分不良副作用諸如毒性、刺激和/或變態反應的化合物和組合物。
[0047]本文所用的「基本上純」意指目標種是存在的佔主導地位的種(即，按摩爾計，它比組合物中任何其它單獨的種豐度更高)，並且優選的是，基本上純化的部分是目標種佔所存在的所有大分子種的至少約50% (按摩爾計)的組合物。一般來說，基本上純的組合物包含的目標種佔組合物中所存在的所有大分子種的超過約80%，更優選超過約85%、90%、95%和99%。最優選，目標種純化至基本均質(通過常規檢測方法不能在組合物中測出雜質的種)，其中組合物基本上由單一大分子種組成。
[0048]術語「癌」或「癌性」指或描述哺乳動物的生理狀況，其典型特徵在於不受管制的細胞生長。癌的示例包括但不限於:癌瘤、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤和白血病。這些癌的更具體示例包括:鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、胰腺癌、惡性膠質瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝細胞瘤、乳腺癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、唾液腺癌、腎癌(kidney cancer )、腎癌(renal cancer )、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)和各種類型的頭頸癌。
[0049]本文所用的術語「轉移」應理解為指從原發性腫瘤至機體其它部分的癌的擴散。轉移是序貫的多步過程，其中腫瘤細胞自原發性腫瘤脫附(detach)、遷移穿越基底膜和細胞外基質、以及侵入淋巴系統和/或血液系統。這之後是遠距離位點上繼發性腫瘤的建立。
[0050]本文所用的術語「抗癌試劑」指能夠抑制癌細胞功能的分子或分子複合體。該試劑可抑制增殖或者可對細胞具有細胞毒性。可使用各種抗癌試劑，包括抑制蛋白質合成的抗癌試劑，以及抑制某些對細胞生長或存活而言關鍵的基因的表達的抗癌試劑。抗癌試劑包括導致細胞死亡的抗癌試劑，以及抑制細胞生長、增殖和/或分化的抗癌試劑。在一個實施方案中，抗癌試劑可以是對某些癌細胞類型具有選擇性毒性而對其它正常細胞無影響或效力較低的抗癌試劑。在另一實施方案中，抗癌試劑可同等地殺滅細胞，但較快生長的細胞被更快地殺滅。在進一步的實施方案中，抗癌試劑是抗腫瘤劑。
[0051]本文所用的術語「抗腫瘤劑」指具有抑制人或動物中腫瘤發展或進展的功能特性的試劑，所述腫瘤特別為惡性(癌性)病變，諸如癌瘤、肉瘤、淋巴瘤或白血病。抑制轉移常常是抗腫瘤劑的特性。
[0052]本文所用的術語「患者」包括人和獸類受試者。為治療目的的「哺乳動物」指任何被歸類為哺乳動物的動物，包括人、家畜和農畜、非人靈長類動物和任何其它具有乳腺組織的動物。
[0053]本文所用的術語「健康患者」應理解為指不具有在將要接受治療的其他患者中所研究的疾病/病況/病症的患者。
[0054]本文所用的術語「治療」指症狀嚴重程度和/或頻率的降低、症狀和/或根本原因的消除、對症狀和/或其根本原因出現的預防、以及損傷的改善或補救。因此，本文中所用的術語「治療」患者或個體的方法既包括對易感個體中病症的預防、減少症狀出現，也包括臨床有症狀個體中病症的治療。
[0055]「病症」是會受益於使用此公開並要求權益的發明構思的組合物進行治療的任何病況。這包括慢性和急性病症或疾病，包括令哺乳動物易感所述病症的那些病理學狀況在內。
[0056]本文所用的術語「治療癌」或「癌的治療」意指抑制癌的擴散、降低腫瘤尺寸、使機體內癌細胞縮小或數目減少、和/或改善或減輕與癌關聯的症狀。如果死亡率和/或發病率降低，或者疾病負擔降低(其表現為機體內惡性細胞數目減少)，則認為治療是有療效的。
[0057]「預防癌」或「癌的預防」意指防止癌疾病狀態的出現或復發。因而，阻礙、抑制或妨礙轉移、腫瘤生長或癌增殖的治療被視為預防性的。
[0058]本文所用的術語「控制癌」包括降低癌患者中癌復發機率、延長患者保持緩解的時間、減少有患癌風險的患者(例如，暴露於高量的福射或致癌材料的患者；感染了與癌出現關聯的病毒的患者；和具有癌遺傳易感性的患者)中的癌出現以及減少患前惡性(pre-mal ignant)癌或非惡性癌的患者中惡性癌的出現。
[0059]治療有效量或預防有效量的給藥意在提供疾病/病症/病況(諸如但不限於癌)的治療、預防或控制方面的治療學效益。具體的治療有效量可容易地由普通醫生確定，並且可依本領域已知因素:患者的歷史和年齡、疾病/病症/病況的類型和階段、其它治療學組合物的共同給藥等而有所變化。
[0060]本文所用的術語「聲致穿孔」應理解為指使用聲(典型情況下，超聲頻率)來改變細胞質膜滲透性。該技術常用於分子生物學和非病毒基因治療中，用以容許大分子諸如DNA攝入細胞中，由此增強向細胞的基因或藥物遞送。聲致穿孔利用微氣泡的聲空化(即，通過高作用力在液體中形成空穴以及其緊接的內爆)以增強這些大分子的遞送。此外，已證實，長時間暴露於低頻(〈MHz)超聲導致完全細胞死亡(破裂)。
[0061]本文所用的術語「聲輻射力」應理解為指由聲波與沿其路徑所置障礙的相互作用引起的物理現象。一般而言，對障礙施加的作用力會導致障礙的位移。聲輻射力被用作一種使自由流動造影劑向內皮移動和由此增強造影劑對靶表面附著的機制。
[0062]本文所用的術語「回波發生性脂質體」應理解為指包含氣體的脂質體；回波發生性脂質體反射高頻聲波，因此能夠通過超聲技術成像。聲輻射力可用於使回波發生性脂質體向內皮移動和由此增強它們對靶表面的附著。微氣泡是一類回波發生性脂質體，其中全氟化碳填充整個空穴。[0063]本文所用的術語「消融」應理解為指使用高強度聚焦超聲來精準靶向組織以進行治療(即，移除或破壞組織)。超聲消融技術的使用詳細地述於Halpern(2005)。簡言之，用高強度聚焦超聲(HIFU)消融來破壞組織的機理與過熱以及空化有關。如診斷成像中所用的低強度超聲能量無害地傳播穿過組織。高強度聚焦超聲消融將身體外的超聲源聚焦於特定靶組織。超聲能量無害地穿過在去緊密聚焦靶區域途中的上層組織。在靶組織處的快速的能量沉積速率遠超過熱消散速率，導致快速升溫。其它熱消融技術受限於熱向鄰近組織中的耗散，而用高強度超聲消融(0.5~1.0秒)所致的超聲能量快速聚焦沉積產生局部空化和65~100°C的溫度，同時極少加熱鄰近的組織。I秒高於56°C的溫度導致不可逆細胞死亡，連同清晰界定區域的組織壞死。高強度聚焦超聲聚焦和準確靶向病灶的能力(通過利用實時超聲或核磁共振成像引導)使得任何形狀的病灶能得以精準消融，而不損傷周邊組織。
[0064]現在轉到此公開並要求權益的發明構思，靶向的微氣泡是重要的和新出現的超聲分子成像和治療工具，其使造影劑的使用特異性增強。許多疾病狀態，諸如但不限於癌、炎症和血栓形成，具有獨特的血管腔表面上蛋白的表達。與造影劑附連的生物標誌物的使用增強指定位點上造影劑的積聚，由此提高該位點處的有效信號；此外，靶向造影劑的使用降低造影劑的清除速率，由此增大用於成像的有用臨床窗口。但是，現有技術靶向造影劑的當前狀態具有靈敏度有限的缺點:該技術受限於可用結合位點的數目(即，每一結合位點一個靶向成像試劑)。此外，典型的粘著率較低(約10個泡/微升)，即使加了聲輻射力(其典型情況下使粘著率加倍)也如此；因此，結合受限於靶向造影劑與腔上位點的相互作用。
[0065]儘管靶向的超聲造影劑表現出良好的疾病特異性，但是疾病狀態的診斷受限於成像技術可達到的靈敏度。當造影劑靶向特異性位點時，它們只限於腔內皮表面上可用的結合位點數目，因此一個結合位點僅容許單個微氣泡的結合。此外，微氣泡與內皮表面上位點的相互作用受限於穿經腔的血流所產生的剪切力；因此，微氣泡不能與它不接觸的表面結合。因此，利用微氣泡和 超聲的現有技術方法導致約10個微氣泡/微升的典型結合水平。其它成像模式存在類似的限制，其中同樣所述方法只限於每一結合位點一個成像囊泡，因此成像囊泡的數目由可用結合位點的濃度決定。
[0066]現有技術的進一步技術限制在於成像設備:對於超聲，存在深度和頻率依賴性衰減，並且在高功率成像下，高峰值負壓導致微氣泡爆裂。
[0067]此公開並要求權益的發明構思通過提高來自靶位點的信號而克服了這些現有技術缺點和缺陷。這具體是通過顯著提高結合微氣泡(或其它介質試劑)數目、由此顯著改善靶向成像靈敏度來實現。
[0068]此外，此公開並要求權益的發明構思的增強的靶向和擴增功能使得足夠數目的微氣泡(或其它介質試劑)能得以遞送，用於治療學超聲的更有效應用，諸如但不限於，定向組織加熱、聲致穿孔和消融。指定組織區域中靶向微氣泡數目的增加能實現靶向聲能介導的治療。組織區域中足夠數目的氣泡會將聲穿透區域中聲能向熱的轉化提高到大於周邊組織正常吸熱的程度。微氣泡的單位超聲吸收量大於正常組織的單位超聲吸收量。但是，只有當定域區域中存在高濃度微氣泡時，才出現足夠的超聲能量吸收來誘導過熱。然後，大的組織區域可經聲穿透，出現基於靶向氣泡濃度的差溫加熱效應。因此，通過分子水平上的靶向與定向超聲能量的組合，能夠使治療定域。
[0069]本文所用的術語「足夠數目的微泡」應理解為依諸如但不限於氣泡尺寸、接受超聲波(即，超聲波暴露)頻率和強度以及具體施用方法之類的因素而有所變化。例如但非限制，就成像靶向試劑而言，靶向氣泡數目的增加會提高反向散射信號、改善信噪比。指定體積內靶向氣泡數目加倍將使接受的反向散射聲信號接近加倍。擴增也能增強成像穿透度。該效果隨頻率而變。例如，在3 MHz時，靶向造影劑結合度的兩倍增長將實現額外的I釐米聲信號穿透度(參見圖3)。在另一非限制性示例中，在用氣泡使聲能轉化成熱能的治療學應用中，靶向氣泡數目須超過閾值，以克服聲能對周邊組織的自然加熱效應。基於用約3微米的平均氣泡直徑計算氣泡和組織的加熱效應，需要20~100個氣泡/微升來實現這一作用。依據上列物理因素，有可能需要更少或更多的氣泡。就靶向消融而言，靶向氣泡數目的增加會導致更強的消融效果。就靶向局部缺血而言，需要足夠數目的氣泡以在毛細管中導致實質性阻斷。例如但非限制，對於10微米直徑的毛細管和利用3微米脂質體，雙階段擴增可足以顯著地阻斷約6~8微米直徑的紅細胞的流動。隨著微氣泡尺寸的增大，獲得部分堵塞所需的步驟數目減少。並且，一般而言，脂質體將具有較小的直徑以使堵塞降至最低限度。
[0070]將組織加熱幾度能夠提高藥物活性和血流量，而不誘發永久性組織損傷。更高水平的加熱能夠誘發永久性組織損傷，這可能具有治療學效益。除提高加熱之外，增加靶向氣泡數目也可提高其它治療學效應諸如空化或氣泡潰滅(collapse)，這可用於消融組織或誘導聲致穿孔。聲致穿孔與增強的藥物和基因遞送以及治療學效益相關聯。
[0071]除超聲應用之外，此公開並要求權益的發明構思還改善其它成像模式(諸如但不限於，MRI和PET)，其獨特特性在於靶向試劑局限於腔。
[0072]此公開並要求權益的發明構思提供通用的多模態靶向和治療系統，其通過擴增克服了靶向材料數量的限制(參見圖1和2)。此公開並要求權益的系統兼具成像和治療應用。該系統的治療臂能實現向靶向位點遞送實質上更多的治療(諸如但不限於，能量、藥物和/或基因)的新的應用。具體示例包括但不限於:聲致穿孔和血腦屏障；炎症(即，克羅恩氏病)；靶向和定向化學療法；經熱提高的多種治療學組合物的活性；靶向和定向消融等。
[0073]如圖1和2所示，此公開並要求權益的發明構思涉及可序貫遞送的藥學試劑的複合體，其可用於經成像檢測腔中暴露的靶，其中複合體在腔中形成。所述複合體包含與靶結合(I階段結合)的至少一個靶向試劑(在本文中也稱作「I階段試劑」或「I階段囊泡」)、多個擴增試劑(在本文中也稱作「II階段試劑」或「II階段囊泡」)以及多個成像試劑(在本文中也稱作「III階段試劑」或「III階段囊泡」)。所述多個擴增試劑中的每一個與至少一個靶向試劑結合(II階段結合)，且多個成像試劑中的每一個與至少一個擴增試劑結合(III階段結合)。此外，Ι、Π和/或III階段試劑中的至少一個可通過成像模式測出，由此使得與靶結合的複合體能得以檢測。[0074]1、11和/或III階段試劑可包含用於經超聲進行檢測和/或操作的氣體。此外，靶向、擴增和/或成像試劑可含有能通過除超聲以外的成像模式檢測的材料。更進一步，此外，靶向、擴增和/或成像試劑可進一步包含摻入/包封於其中的治療學組合物。如下文更詳細所述，在藉助於I階段(靶向)試劑靶向後，治療學組合物可得以遞送、使用、釋放、活化和/或激發。所述釋放/活化/激發可能是對熱/超聲的暴露的響應。
[0075]本文中所用的術語「治療學組合物」應理解為包括任何產生生物效應並由此具備改變有機體生理系統能力的組合物。「治療學組合物」可經其自身官能度而具有生物學活性，或者所述組合物可基於其活化或抑制具有自身生物活性的分子的能力而具有生物學活性。可依照此公開並要求權益的發明構思使用的治療學組合物示例包括但不限於:藥物、小分子、核酸(DNA、RNA siRNA等)、蛋白/肽、綴合物、聚合物、聚合物綴合物、糖蛋白、糖蛋白綴合物、氣體、能量、以及它們的組合或衍生物。
[0076]在某些實施方案中，提供其上具有至少一個結合位點的試劑，藉此每一結合位點是互補對(例如但非限制，生物素-抗生物素蛋白、抗體-抗原、受體-配體等)的一方。I階段(靶向)試劑可包含一級結合位點和二級結合位點，而II階段(擴增)試劑可包含至少兩個結合位點，諸如但不限於三級結合位點和四級結合位點。擴增試劑的所述至少兩個結合位點可相同或不同。III階段(成像)試劑可包含至少一個結合位點，諸如但不限於，五級結合位點。在該示例中，靶向試劑的一級結合位點與靶形成第一結合複合體，靶向試劑的二級結合位點與擴增試劑的三級結合位點形成第二結合複合體，擴增試劑的四級結合位點與成像試劑的五級結合位點形成第三結合複合體。在一備選方案中，擴增試劑的三級和四級結合位點相同，並與祀向試劑的二級結合位點以及成像試劑的五級結合位點互補。在另一備選方案中，祀向試劑的二級結合位點與擴增試劑的四級結合位點相同，藉此祀向試劑的二級結合位點也可與成像試劑的五級結合位點結合形成第三結合複合體。
[0077]I階段(靶向)試劑包含所述靶/疾病狀態所特有的靶向配體；但是，擴增和成像試劑(即，II和III階段試劑)可以是通用的。也就是說，II和III階段試劑的試劑含量及其上銜接物/結合位點針對指定成像模式可以是相同的，且不依賴於靶/疾病狀態。II和III階段試劑可與同樣的互補對連接，而不依賴於所用的成像模式。此外，II和/或III階段試劑可以是多模態的，因此含與多重成像模式相關的組分(即，超聲、MR1、CR等等試劑的組合)。
[0078]在另一備選方案中，可使用多重成像試劑。在這一情況下，可提供具有針對兩個或更多個III階段試劑的結合位點的II階段試劑；這些結合位點可以是結合雙III階段試劑的單一結合位點，或可基於待使用的不同III階段試劑的數目提供多個不同結合位點。
[0079]1、11和/或III階段試劑僅僅由指定階段所要求的銜接物界定，而不依賴於它們的內容物(content)(參見圖2)。換句話說,該技術類似於包含輪轂(hub)和連接棍(peg)的結構玩具(tinker toy)。連接棍(即,銜接物)界定出階段；輪轂能含任何東西。
[0080]上文所述結合位點可以是對另一物質有結合親合力並能夠與之形成複合體、由此提供兩試劑/囊泡間親合力的任何生物分子。例如但非限制，結合位點可以是肽、蛋白、抗原、抗體、抗體片段、受體、配體、糖綴合物以及它們的組合或衍生物。
[0081]可依照此公開並要求權益的發明構思使用的具體靶位點示例包括但不限於:ICAM-1、P-選擇蛋白、MadCAM-1、VCAM-1卿，針對炎症的靶)；α ν β 3整聯蛋白和VEGFR2(本領域中已知針對血管發生的靶);和GP Ilb/IIIa (本領域中已知針對血栓的靶)。可用作一級結合位點的示例性抗體列表可見以下參考文獻:Paul Carter, Nature Reviews Cancer,Vol.1, pp.118-129 (2001年11月)；其全部內容據此明確地通過引用併入本文。
[0082]在另一實施方案中，此公開並要求權益的發明構思涉及可序貫遞送的藥學試劑的複合體，其可用於經成像檢測腔中暴露的靶，其中複合體在腔中形成。所述複合體包括附連有多個II階段(擴增)試劑的至少一個I階段(靶向)試劑，其中所述至少一個I階段(靶向)試劑與腔中暴露的靶結合。所述複合體可進一步包含多個III階段試劑，其中所述多個III階段試劑中的每一個包含暴露於其表面上的至少一個用於與II階段試劑結合的結合位點。所述III階段試劑上的至少一個結合位點也可能能夠與至少一個I階段(靶向)試劑結合。
[0083]此公開並要求權益的發明構思還涉及可序貫遞送的可組合製劑。所述製劑包含:第一可給藥組合物，其包含能夠與腔中暴露的靶結合的I階段(靶向)試劑；第二可給藥組合物，其包含II階段(擴增)試劑；和第三可給藥組合物，其包含III階段(成像)試劑。II階段試劑包含對I階段試劑具有親合力的第一結構部分，和對III階段試劑具有親合力的第二結構部分。Ι、Π和/或III階段試劑(一或多個)可通過成像模式測出，由此使得與靶結合的靶向試劑信號能得以擴增。所述結構部分包含前文所述的結合位點。
[0084]此公開並要求權益的發明構思進一步涉及增強的受試者機體影像的生成方法。所述方法包括以下步驟:向受試者機體給藥上文所述的可序貫遞送的可組合製劑，和生成至少一部分所述機體的超聲、磁共振、X射線或射線照相影像。
[0085]在上文或下文所述的任一方法中，可序貫遞送的可組合製劑可如下給藥:首先，向所述機體給藥第一可給藥組合物，隨後向所述機體給藥第二可給藥組合物，和隨後向所述機體給藥第三可給藥組合物。在某些實施方案中，給藥第一可給藥組合物之後，讓機體醞釀(incubate) —段時間，以容許I階段(靶向)試劑與腔中暴露的靶結合，以及從腔中實質性清除未結合的I階段試劑。然後，在給藥第二可給藥組合物之後，讓機體醞釀一段時間，以容許II階段(擴增)試劑與I階段試劑結合，以及從腔中實質性清除未結合的II階段試劑。此外，在給藥第三可給藥組合物之後，讓機體醞釀一段時間，以容許III階段試劑的結合，以及從腔中實質性清除未結合的III階段試劑。該方法中也可包括第一、第二和/或第三可給藥組合物的額外給藥(一或多次)。[0086]通過使用措辭「實質性清除」、「實質上消除」和「實質性洗出」，應理解，在給藥另一試劑之前，無須從腔/血流移除一試劑的全部。相反地，這些措辭簡明地表明已從腔/血流中清除/洗出足夠數目的頭一試劑，從而可見足夠的對比度和提供足夠的信噪比。
[0087]此公開並要求權益的發明構思進一步涉及可用於使腔中的靶成像的試劑盒。所述試劑盒可包括上文所述的可序貫遞送的可組合製劑。此外，試劑盒可進一步包括軟體模塊，其分析由檢測III階段試劑的影像遞送裝置所生成的信息。
[0088]此公開並要求權益的發明構思進一步涉及由與腔中的靶結合的III階段(成像)試劑所生成的信號的檢測裝置。該裝置可包括計算系統，以及檢測III階段試劑的影像遞送裝置。計算系統包含應用模塊和處理單元；所述應用模塊包含軟體模塊，其分析由影像遞送裝置所生成的信息，所述處理單元配置成執行軟體模塊。由影像遞送裝置檢測的III階段試劑與至少一個I階段(靶向)試劑以及多個II階段試劑複合，所述至少一個I階段(靶向)試劑與靶結合，所述多個II階段試劑與I階段(靶向)試劑結合。在某些實施方案中，影像遞送裝置還可充當能量遞送裝置，其向腔中與I/II/III階段試劑複合體結合的靶遞送定向能量。在特別的實施方案中，影像/能量遞送裝置可以是超聲影像/能量遞送裝置。能量遞送裝置還可用作聲輻射力來源。
[0089]此公開並要求權益的發明構思還涉及提高成像模式所檢測信號強度的方法。該方法包括:向受試者給藥有效量的I階段(靶向)試劑，其中I階段試劑穿越受試者系統並與受試者腔(即，腔壁)表面上暴露的靶結合。然後，向受試者給藥有效量的II階段(擴增)試劑，其中多個II階段試劑與已與靶結合的I階段試劑結合。隨後，向受試者給藥有效量的III階段試劑，其中III階段試劑與已經由I階段試劑與靶位點結合的II階段試劑結合。然後，經成像模式檢測III階段試劑所產生的信號。
[0090]在上文和下文所述的某些方法的實施方案中，可能希望的是，在給藥一試劑(gp，靶向/擴增/成像/治療試劑)之後，所述方法包括容許未結合的試劑從腔(即，血流)中實質性清除的步驟，然後再給藥後一試劑。
[0091]此公開並要求權益的發明構思進一步涉及診斷受試者中病況/病症的方法。在該方法中，向受試者給藥有效量的上文所述I階段(靶向)試劑；1階段試劑包含結合位點，該結合位點與對所述病況/病症特異的靶結合，並且，I階段試劑穿越受試者系統並與受試者腔表面上暴露的任意靶結合。隨後，向受試者給藥有效量的上文所述II階段(擴增)試劑，其中多個II階段試劑與已與靶位點結合的I階段試劑結合。隨後，向受試者給藥有效量的上文所述III階段(成像)試劑，其中III階段試劑與已經由I階段試劑與靶位點結合的II階段試劑結合。然後，經一或多種成像模式檢測由ι、π和/或III階段試劑(一或多個)產生的任何信號，如果檢測出信號則確定受試者具有所述病況/病症。
[0092]此公開並要求權益的發明構思進一步涉及治療受試者中病況/病症的方法。在所述方法中，向受試者給藥有效量的上文所述I階段試劑階段試劑包含結合位點，該結合位點與對所述病況/病症特異的靶結合，並且，I階段試劑穿越受試者系統並與受試者腔表面上暴露的任意靶結合。隨後，向受試者給藥有效量的上文所述II階段試劑，其中多個II階段試劑與已與靶位點結合的I階段試劑結合。隨後，向受試者給藥有效量的III階段(治療)試劑，其中III階段試劑與已經由I階段試劑與靶位點結合的II階段試劑結合。ι、π和III階段試劑的至少其一包括可有效治療所述病況/病症的治療試劑。一旦形成複合體，
1、11和/或III階段試劑中存在的所述治療試劑可有效治療所述病況/病症。或者，治療試劑可在與靶位點結合後激活，藉此活化的治療試劑有效治療所述病況/病症。
[0093]此公開並要求權益的發明構思進一步涉及向靶位點遞送治療學組合物的方法。在所述方法中，向受試者給藥有效量的上文所述I階段試劑階段試劑包含結合位點，該結合位點與對所述病況/病症特異的靶結合，並且，I階段試劑穿越系統並與受試者腔表面上暴露的任意靶結合。隨後，向受試者給藥有效量的上文所述II階段試劑，其中多個II階段試劑與已與靶位點結合的I階段試劑結合。隨後，向受試者給藥有效量的III階段試劑，其中III階段試劑與已經由III階段試劑與靶位點結合的II階段試劑結合。治療學組合物摻入/包封於1、II和III階段試劑的至少其一之內。在一個實施方案中，一旦與靶位點結合，治療學組合物就遞送給了靶位點。或者，所述方法可進一步包括以下步驟:激活Ι、π和/或III階段試劑，以釋放所述治療學組合物並因此將組合物遞送給靶位點。
[0094]治療學應用示例包括但不限於:過熱；將組織加熱幾度(這可提高藥物活性和/或提高血流量而無永久性組織損傷)；為治療學效益，將組織加熱至誘發永久性組織損傷的較聞水平；提聞空化和/或試劑潰滅；組織消融；誘導聲致穿孔；提聞藥物和基因遞送等。另一治療學應用包括誘導血管化組織的局部缺血/壞死，如下文進一步詳細描述。
[0095]上文所述的任一成像方法可進一步包括以下步驟:向受試者給藥有效量的治療試劑，其中所述治療試劑與已經由I階段試劑與靶位點結合的II階段試劑和III階段試劑的至少其一結合。此外，上文所述的任一成像方法可進一步包括以下步驟:向受試者給藥有效量的第二 III階段試劑，其中所述第二 III階段試劑與已經由I階段試劑與靶位點結合的II階段試劑和III階段試劑的至少其一結合。
[0096]上文或下文所述任一方法中所用的任一試劑可包含氣體(B卩，回波發生性脂質體)，因此聲輻射力可通過推使一或多類試劑(一或多個)靠著腔內表面來提高靶向效率。例如但非限制，當I階段試劑包含氣體時，超聲暴露推使I階段試劑靠著腔壁，提高I階段試劑與靶位點相互作用的可能性。任選地，當II階段試劑包含氣體時，超聲暴露推使II階段試劑靠著腔壁，提高II階段試劑與已與靶位點結合的I階段試劑相互作用的可能性。
[0097]在上文或下文所述的任一方法中，靶位點可暴露於血腦屏障、卵巢、胰腺、腎、肝、它們任一個的癌性組織和/或它們的供給組織的至少其一的表面上。靶位點可以是疾病特異性的。
[0098]上文或下文所述的任一方法中，其中使用的成像模式可選自:超聲、核磁共振成像(MRI)、計算機化斷層成像(CO、雙源CT (灌注成像)、彌散張量成像(DTI)、延遲增強成像、X射線和螢光透視(對比螢光透視)成像、計算機化SPECT、PET或PET-CT成像以及分子成像(放射性藥物)。
[0099]儘管在本文中描述了將1、II和/或III階段試劑中所布置的氣體與超聲一起使用，但應理解，此公開並要求權益的發明構思還包括將1、II和/或III階段試劑中所布置的其它組成物與其它成像/治療學模式一起使用。例如但非限制，可將釓螯合物衍生物(諸如但不限於，禮-二亞乙基-三胺-五乙酸(例如參見,Accardo等人,2009))與MRI模式一起使用，而可將放射性核素與X射線模式(即，放射療法)一起使用。
[0100]此外，任一 1、11和/或III階段試劑可以是多模態回波發生性脂質體一也就是說，所述試劑(一或多個)包含氣體以致所述試劑(一或多個)對聲輻射力敏感，並且還可包含如上文所述的第二成像模式 (即，MR1、CT、DT1、PET等)。因此，此公開並要求權益的發明構思的另一實施方案包括使用包含多模態回波發生性脂質體/微氣泡/囊泡的I階段(靶向)試劑。所述I階段試劑可在存在或不存在擴增的情況下使用。
[0101]此公開並要求權益的發明構思還涉及可序貫遞送的藥學試劑的複合體，其可用於經成像檢測腔中暴露的靶，其中複合體在腔中形成。複合體包含至少一個如上文所述的I階段試劑和多個如上文所述的III階段(成像)試劑。多個III階段試劑中的每一個與至少一個I階段試劑結合，其中I和/或III階段試劑可通過成像模式測出，由此使得與靶結合的複合體能得以檢測。
[0102]此公開並要求權益的發明構思進一步涉及靶向由成像模式可視化的信號的方法。在所述方法中，向受試者給藥有效量的I階段試劑，其中I階段試劑穿越受試者並與受試者腔表面上暴露的靶位點結合。隨後，向受試者給藥有效量的III階段(成像)試劑，藉此III階段試劑與I階段試劑結合。然後，由成像模式檢測I和/或III階段試劑(一或多個)所產生的信號。
[0103]在本文中所述的任一方法中，在腔中形成的複合體不實質性阻塞腔中流體流動(即，血流(blow flow))。這通過如下方式實現:通過序貫添加試劑、通過限制方法中所用各個試劑的尺寸(結構尺寸)和/或通過限制所用II階段試劑的量，從而由此形成的複合體的尺寸受到限制且因此不超出腔的尺寸。例如，可提供具有足夠小的直徑的靶向/擴增/成像試劑，由此三個直徑的總和不超出毛細管直徑(即，< 10 μ ;Dayton，2002)。
[0104]或者，在本文中所述的任一方法中，在腔中形成的複合體可實質性阻塞受試者腔中靶位點處的血流，由此對受試者的靶向部分(即，組織、器官、機體部分等)引起局部缺血。因此，此公開並要求權益的發明構思進一步涉及在受試者靶位點處產生血管化組織局部缺血和壞死的方法，如上文所述。在所述方法中，如上文所述給藥1、II和III階段試劑。然後，給藥多重劑量的II和/或III階段試劑(一或多個)，直至靶位點處的腔被實質性阻塞。因此，對於隨時間進行序貫添加的情況，III階段試劑還可充當「擴增試劑」用於阻塞腔。
[0105]在腔中形成的複合體可包括本文中所述試劑的任意組合(即，靶向和成像試劑；革巴向、擴增和成像試劑；祀向、擴增和治療試劑)。此外，當在腔中形成的複合體包括靶向、擴增和成像試劑時，可向受試者進一步給藥治療試劑(即，包括包封在其中的化學治療或其它細胞毒性物質)以致該治療試劑與成像試劑結合併向缺血性受損組織遞送細胞毒性物質，以提供額外的殺滅機制。任選地，可在給藥治療試劑之前從複合體上移除成像試劑，藉此後續給藥的治療試劑會與擴增試劑結合併隨後向缺血性受損組織遞送細胞毒性物質，以提供額外的殺滅機制。
[0106]在成像後、給藥後續試劑(諸如但不限於，另一成像試劑或治療試劑)之前從複合體上移除III階段試劑的這同一技術可在上文所述或在此設想到的任一方法中使用。用這種方式，由I階段試劑和一或多個II階段試劑所形成的複合體形成基礎結構/支架/橋狀網絡，基於它可實現多重應用(諸如但不限於，多重成像技術或者成像與治療學技術的組合)。任選地，基礎結構還容許隨著時間推移進行多重施用。以此方式，支架能夠根據需要來重複使用。
[0107]在另一備選方案中，可能需要的是，移除III階段試劑和II階段試劑(一或多個)，僅留下I階段試劑，以形成能重複使用的支架，用於多重應用或多重施用。
[0108]本文中所述的任一方法還可包括在流程(成像和/或治療流程)施行後降解複合體的至少一部分(或全部複合體)的步驟。降解可能涉及到使用能量、熱、化學方法(即，以獨特方式還原二硫鍵)、pH變化、添加競爭試劑(Ab)等。以此方式，當需要時可破壞靶向/擴增/成像/治療試劑中的一或多個(諸如但不限於，通過超聲)；此外，當不再需要複合體時可破壞所有試劑。例如但非限制，如果間隔物是具有由酶裂解的胺基酸序列的肽，則裂解所述間隔物，令複合體降解。酶可附連於所述介質之一上，且可能需要輔助因子或熱進行活化。
[0109]如下文更詳細描述，通過在囊泡構架上提供多重(B卩，至少兩個)附連/結合位點或點，製造依照此公開並要求權益的發明構思使用的I階段(靶向)試劑。對於I階段(靶向)試劑，用於與靶結合的一級結合位點經銜接物附連於囊泡構架上，而用於與II階段試劑結合的二級結合位點經另一銜接物附連於囊泡構架上。
[0110]通過在囊泡構架上提供多重附連點(B卩，多重結合位點)，製造依照此公開並要求權益的發明構思使用的II階段(擴增)試劑。多重附連點的使用將實現:(1)用於多模態成像的多重附連點；(2)多重施用(隨著時間推移);和/或(3)多重應用(諸如但不限於，成像和治療應用)。可提供具有三級和四級結合位點的擴增試劑(如上文所述)，並且其可進一步具有額外的結合位點，以容許與額外的成像/治療試劑(即，除與四級結合位點相互作用的成像/治療試劑外)的相互作用。
[0111]在一個實施方案中，可通過使用銜接物使三級和四級結合位點附連。如下文更詳細描述，利用銜接物混合物來製得擴增囊泡上的多個附連點。但是，應理解，對於三級和四級結合位點與擴增試劑的附連來說 ，銜接物不是必需的。[0112]通過在囊泡構架上提供至少一個附連點，製造依照此公開並要求權益的發明構思使用的成像/治療試劑。所述至少一個附連點可經銜接物附連於囊泡構架上；但是，應理解，對於五級結合位點與成像/治療試劑的附連來說，銜接物不是必需的。
[0113]依照此公開並要求權益的發明構思使用的靶向/擴增/成像/治療試劑的製造可從提供微氣泡、脂質體或其它類型囊泡作為構架開始，然後向其添加結合位點(即，銜接物/複合試劑(complexing agent))。可用於祀向/擴增/成像/治療試劑的一般性囊泡構架示例在本領域中眾所周知用於成像/治療應用(所述現有技術囊泡是在不存在用於製造本發明複合體支架的靶向試劑和/或銜接物/複合試劑的情況下產生的)。具體示例包括但不限於以下例子。US專利5，123,414 (1992年6月23日授權給Unger)公開了適合作為超聲造影劑的脂質體，所述試劑含各種類型的媒介，包括氣體、氣態前體和全氟化碳，其通過pH、溫度和/或壓力來激活。Unger等人(2004)公開了具有診斷和治療應用(包括能夠經超聲能量空化，以用於位點特異性地局部遞送生物活性材料和用於治療血管血栓形成)的微氣泡，所述微氣泡含有截留於脂質包衣內的全氟化碳氣體；該參考文獻還公開了，血腦屏障(BBB)可利用超聲可逆地開啟，超聲還使大腦微脈管系統內的微氣泡空化，以向腦遞送低和高分子量治療劑。Klibanov (2006)的綜述公開了，通過在微氣泡表面上提供靶向配體，將微氣泡造影劑用於靶向超聲成像和超聲輔助藥物遞送應用。Hernot和Klibanov (2008)描述了由超聲觸發的藥物和基因遞送中的微氣泡，其中微氣泡增強靶組織中超聲能量沉積，並充當空化核(用於提高細胞內藥物遞送)。Ferrante等人(2009)描述了全氟化碳填充的磷脂微氣泡造影劑，通過使聚乙二醇-生物素-鏈黴抗生物素蛋白橋與mAb MVCAM.A和/或sialyl Lewisx聚合物(PAA_sLex)偶聯,所述造影劑革巴向粘著分子P-選擇蛋白和VCAM-1。Liu等人(2006)公開了包封的超聲微氣泡以及它們在藥物遞送或基因治療中的應用，所述微氣泡表面附連有靶向配體。Suzuki等人(2007和2008)描述了含全氟丙烷的泡泡脂質體(其比常規微氣泡直徑小)以及它們在基因治療和超聲破壞技術中的用途。Tinkov等人(2009)公開 了用作超聲觸發藥物載體的微氣泡的製造和藥物加載方法。Jong等人(2009)描述了用以表徵超聲造影劑(UCA)的不同策略，包括聲學和光學方法在內。SchiOeder等人(2009)描述了超聲與脂質體的相互作用，以及利用低頻超聲(LFUS)自脂質體釋放藥物的機械原理，包括脂質體脂質組成的作用和物理化學特性及脂質體藥物釋放方面的LFUS參數，以及聲空化的用途。Huang (2008)公開了藉助於脂質體進行的經超聲控制的藥物釋放和經超聲增強的藥物遞送，所述脂質體含有截留於其中的氣體和/或藥物。上述每一專利和公開文件的全部內容據此明確地通過引用併入本文。
[0114]此外，可依照此公開並要求權益的發明構思使用的可市購超聲造影劑包括但不限
於:S0NAZ0ID?(GE Healthcare, Oslo, Norway)-參見 Otani 等人(2009)有關向其上
附連抗體的公開內容；DEFINITY? (Bristol-Myers Squibb Medical Imaging, Billerica,MA);和0PTIS0N ?(GE Healthcare, Oslo, Norway)?此外，可依照此公開並要求權益的發明構思使用的多種超聲造影劑由Targeson, Inc.(San Diego, CA)製造,包括但不限於，TARGESTAR-B?,其為一種生物素化微氣泡造影劑，用於生物素化配體的綴合。
[0115]一旦提供了囊泡構架，通過向其上附連結合位點，繼續進行所述製造方法；可通過利用銜接物，而使結合位點得以附連。每一銜接物包含複合試劑互補對中的一個成員。在I階段試劑/11階段試劑的結合中，I階段(靶向)試劑包含互補對的第一成員(即，二級結合位點)，而II階段(擴增)試劑包含所述互補對的第二成員(即，三級結合位點)。在擴增試劑/成像(或治療)試劑的結合中，擴增試劑包含另一互補對的第一成員(即，四級結合位點)，而成像(或治療)試劑包含所述互補對的第二成員(即，五級結合位點)。
[0116]依照此公開並要求權益的發明構思使用的銜接物在兩末端功能化。當兩末端用同一反應性結構部分活化時，銜接物稱為「同雙功能」銜接物，而如果存在的官能團不同，則銜接物稱為「異雙功能」銜接物。兩末端之一使銜接物附連於囊泡構架上，而另一末端包含複合試劑互補對的一個成員。當利用同雙功能銜接物時，在銜接物兩端使用同一類接頭，由此使銜接物連接至試劑的囊泡構架，並與複合試劑互補對的另一成員相互作用，以使靶向/擴增/成像/治療試劑與另一靶向/擴增/成像/治療試劑結合。同雙功能銜接物的非限制性示例是抗生物素蛋白-PEG-抗生物素蛋白(其很容易製造和/或可市購)。許多銜接物可能顯現多重結合位點。未經消化的抗體是雙齒的；抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白(neutravidin)各提供至多4個結合位點。多齒分子可代替同雙功能銜接物使用。
[0117]當利用異雙功能銜接物時，第一類接頭用於使銜接物連接到試劑的囊泡構架上，第二不同類接頭用於與靶位點和/或複合試劑互補對的另一成員相互作用，以使靶向/擴增/成像/治療試劑與另一靶向/擴增/成像/治療試劑結合。異雙功能銜接物的非限制性示例是抗生物素蛋白-PEG-抗體。可通過混合適當比例的同和異雙功能銜接試劑，製備靶向/擴增/成像/治療試劑，其中兩銜接試劑分享共同的接頭類型，其中所述共同的接頭類型是附連於基礎囊泡上的銜接物的互補對。然後，將混合物加入基礎囊泡中，以得到所需要的多重附連點。
[0118]銜接物可進一步包含栓系物(tether)或擴展物(extender)分子,諸如但不限於，肽或PEG。各個試劑的尺寸應足以經由銜接物最大限度地拴系兩試劑。拴系物/銜接物應長到足以使試劑結合達到最大限 度的程度，但不長到出現顯著拴系物/銜接物纏結的程度。
[0119]在I階段(靶向)試劑的製造中，使用異雙功能銜接物為I階段試劑附連上一級結合位點。例如但非限制，可提供抗生物素蛋白化脂質體/微氣泡(其很容易製造和/或可市購)，並使之與生物素-PEG-抗體相互作用，其中抗體可以是任何可市購或以另外方式為本領域已知的抗體。抗生物素蛋白化囊泡構架-生物素-PEG-的前體提供一通用前體，其可與任何結合分子一起使用以形成任何所希望的I階段試劑。例如，可提供所述前體，然後可將針對不同類型病症/疾病/癌的不同抗體附連其上。此外，可將多重抗體/結合分子用於一級結合位點。
[0120]然後，可使用異雙功能或同雙功能銜接物來使二級結合位點(用於與擴增試劑結合)附連於囊泡構架上。例如但非限制，可使用同雙功能銜接物——生物素-PEG-生物素，其中生物素形成二級結合位點並因此能與包含生物素化脂質體/微氣泡的擴增試劑相互作用，所述生物素化脂質體/微氣泡上附連有抗生物素蛋白-PEG-抗生物素蛋白銜接物(即，抗生物素蛋白形成與生物素二級結合位點相互作用的三級結合位點)。
[0121]在II階段(擴增)試劑的製造中，可通過本領域已知的任何方法使三級和四級結合位點附連於囊泡構架上。例如，II階段試劑可只是包含生物素化微氣泡，其中II階段試劑上的生物素包含三級和四級結合位點並與作為二級和五級結合位點的抗生物素蛋白相互作用。此外，II階段試劑可包含附連於囊泡構架上的額外的結合位點，其中所述額外的結合位點使囊泡變得多功能並因此容許多模態成像、多重施用和/或多重應用(成像和/或治療)。[0122]在II階段試劑的另一製造方法中，可使用同雙功能或異雙功能銜接物來使三級結合位點附連於囊泡構架上，並可使用至少一個額外的異雙功能銜接物來使四級結合位點附連於囊泡構架上。此外，II階段試劑可包含額外的結合位點，該結合位點經由異雙功能銜接物附連於囊泡構架上。這些額外的結合位點使囊泡變得多功能並因此容許多模態成像、多重施用和/或多重應用(成像和/或治療)。例如但非限制，II階段試劑可包含生物素化脂質體/微氣泡，所述生物素化脂質體/微氣泡上附連有抗生物素蛋白-PEG-抗生物素蛋白同雙功能銜接物以形成三級結合位點(其與I階段試劑的生物素二級結合位點相互作用)，II階段試劑進一步包含異雙功能銜接物，諸如但不限於抗生物素蛋白-PEG-生物素，其中該生物素形成與III階段試劑的五級結合位點相互作用的四級結合位點。此外，不與I階段試劑結合的附連於II階段試劑上的任何游離抗生物素蛋白-PEG-抗生物素蛋白銜接物可進一步作為額外的結合位點用於俘獲第二成像/治療試劑。
[0123]在III階段試劑的製造中，可通過本領域已知的任何方法使五級結合位點附連於囊泡構架上。例如但非限制，III階段試劑可只是包含生物素化微氣泡，其中III階段試劑上的生物素(即，五級結合位點)與附連於II階段試劑上的抗生物素蛋白(即，四級結合位點)相互作用。
[0124]在III階段試劑的另一製造方法中，可使用同雙功能或異雙功能銜接物來使五級結合位點附連於囊泡構架上。例如但非限制，可使用同雙功能銜接物一抗生物素蛋白-PEG-抗生物素蛋白，其中抗生物素蛋白形成五級結合位點並因此能與包含生物素化脂質體/微氣泡的II階段試劑相互作用(即，生物素形成與抗生物素蛋白五級結合位點相互作用的四級結合位點)。
[0125]此外，III階段試劑可進一步包含附連於囊泡構架上的額外的結合位點。這些額外的結合位點可用於容許額外的試劑與之結合(即，另一成像試劑或治療試劑)。例如但非限制，第一成像試劑(超聲造影劑)可包含額外的抗螢光素抗體附連於其上的結合位點。該第一成像試劑可與第二成像試劑一起使用，用於MRI檢測，其中第二成像試劑在其表面上帶有螢光素。可通過本領域已知的任何方法使這些額外的結合位點附連，包括但不限於，藉助於異雙功能銜接物進行附連。
實施例
[0126]下文提供實施例。但是，應理解，本發明的應用不局限於這些特定試驗、結果和實驗室方法。相反地，實施例只不過是作為多種實施方案之一，且意在是示例性而非窮舉性的。
[0127]實施例1:1階段試劑/11階段試劑/III階段試劑複合體的活體外形成。
[0128]在該實施例中，所提議的活體外試劑關鍵原材料(CRM)是螢光素化BSA和2H1 (螢光素抗體)。通過使BSA突光素化和隨後使突光素化BSA與聚苯乙烯(pH 8,碳酸氫鹽緩衝液(bicarb buffer))結合,製得聚苯乙烯結合表面。突光素化BSA充當I階段(祀向)試劑的一級結合位點的革巴。
[0129]製備I階段(祀向)試劑:獲得可市購生物素化微氣泡(即，靶向試劑，TargestarB,獲自Targeson, Inc.，San Diego, CA)和2H1抗體(其與突光素化BSA結合)。抗生物素蛋白-PEG-2H1 (即，靶向試劑上的一級結合位點)由異雙功能PEG製得，而抗生物素蛋白-PEG-抗生物素蛋白(B卩，靶向試劑上的二級結合位點)由同雙功能PEG製得。使抗生物素蛋白-PEG-2H1和抗生物素蛋白-PEG-抗生物素蛋白與生物素化微氣泡反應，以分別形成I階段(靶向)試劑的一級和二級結合位點。
[0130]製備II階段(擴增)試劑:在本實施例中，可市購生物素化微氣泡充當II階段試劑。生物素化位點充當II階段試劑的三級和四級結合位點。
[0131]製備III階段(成像)試劑:提供可市購生物素化微氣泡，並使之與抗生物素蛋白-PEG-抗生物素蛋白反應，以形成III階段試劑的五級結合位點。
[0132]形成I階段(祀向)試劑/靶複合體:使I階段(靶向)試劑與聚苯乙烯結合表面反應，靶向微氣泡上的抗生物素蛋白-PEG-2H1與聚苯乙烯結合表面上的螢光素化BSA結合。然後，洗滌聚苯乙烯結合表面以移除任何未結合的微氣泡。如有需要，在此時測量結合和超聲效果。
[0133]形成擴增複合體:使II階段(擴增)試劑與結合有I階段(祀向)試劑的聚苯乙烯結合表面反應，II階段(擴增)試劑上的生物素化位點(即，三級結合位點)與I階段(靶向)試劑上的抗生物素蛋白-PEG-抗生物素蛋白(即，二級結合位點)相互作用，由此II階段(擴增)試劑與已與聚苯乙烯結合表面結合的I階段(靶向)試劑結合。然後，洗滌結合表面以移除任何未結合的生物素化微氣泡(即，II階段(擴增)試劑)。如有需要，在此時測量結合和超聲效果。
[0134]形成成像複合體:使III階段試劑與結合有I/II階段試劑的聚苯乙烯結合表面反應，III階段試劑上的抗生物素蛋白(即，五級結合位點)與II階段(擴增)試劑上的生物素化位點(即，四級結合位點)相互作用。由此III階段試劑與II階段(擴增)試劑結合，其中所述II階段(擴增)試劑已與I階段(祀向)試劑結合，所述I階段(祀向)試劑已與聚苯乙烯結合表面結合。然後，洗滌結合表面以移除任何未結合的微氣泡(即，成像試劑)。
[0135]在此時測量結合和超聲效果，以證實超聲造影劑信號(CPS)的增強，以及驗證活體外氣泡加熱計算結果以證明氣泡聚集未受影響。
[0136]此外，用光學顯微術研究氣泡聚集，以證實所述三個階段的結合。
[0137]實施例2:靶向/成像試劑複合體的活體內超聲應用
製備祀向組分:首先，抗生物素蛋白化單層脂質體製劑根據Szoka和Papahadjopoulos(1978)所述程序製得，區別之處在於將磷脂抗生物素蛋白化。生物素-PEG3tl-抗體由獲自Thermo-Fisher的異雙功能交聯劑製得。此例中的抗體可採自以下文獻提供的列表=NatureReviews Cancer, Vol.1, pp.118-129 (2001 年 11 月)。生物素-PEG3tl-生物素由獲自Thermo-Fisher的同雙功能交聯劑製得。將生物素-PEG3tl-生物素和生物素-PEG3tl-抗體與抗生物素蛋白化單層脂質體混合，以製得靶向試劑。
[0138]製備成像組分:使用可市購生物素化微氣泡。抗生物素蛋白-PEG3tl-抗生物素蛋白由獲自Thermo-Fisher的同雙功能交聯劑製得。將生物素化微氣泡與抗生物素蛋白-PEG3tl-抗生物素蛋白混合，以得到成像組分。
[0139]在使用方法中，將靶向組分/脂質體製劑注入血流中，讓患者帶著所述組分醞釀足夠長的一段時間(諸如但不限於，約3~10分鐘)以便發生靶向以及循環性游離脂質體從血流中實質性洗出。然後，給患者注射有效量的成像組分，並讓患者帶著所述組分醞釀足夠長的一段時間(諸如但不限於，約3~10分鐘)以便發生二級靶向以及循環性游離微氣泡從血流中實質性洗出。隨後進行靶向試劑或靶向治療活性的診斷成像。
[0140]實施例3:祀向/擴增/成像試劑複合體的活體內超聲應用
製備IE向組分:首先，生物素化單層脂質體製劑根據Szoka和Papahadjopoulos( 1978)所述程序製得。抗生物素蛋白-PEG3tl-抗體由獲自Thermo-Fisher的異雙功能交聯劑製得。此例中的抗體可採自以下文獻提供的列表:Nature Reviews Cancer, Vol.1, pp.118-129(2001年11月)。抗生物素蛋白-PEG3tl-抗生物素蛋白由獲自Thermo-Fisher的同雙功能交聯劑製得。將抗生物素蛋白-PEG3tl-抗生物素蛋白和抗生物素蛋白-PEG3tl-抗體與生物素化單層脂質體混合，以製得靶向試劑。
[0141]製備擴增組分:生物素化單層脂質體製劑根據Szoka和Papahadjopoulos (1978)所述程序製得。
[0142]製備超聲成像組分:使用可市購鏈黴抗生物素蛋白超聲成像試劑(Targestar SA,獲自 Targeson, Inc., San Diego, CA)。[0143]在使用方法中，將靶向組分/脂質體製劑注入血流中，讓患者帶著所述組分醞釀足夠長的一段時間(諸如但不限於，約3~10分鐘)以便發生靶向以及循環性游離脂質體從血流中實質性洗出。然後，給患者注射有效量的擴增組分，並讓患者帶著所述組分醞釀足夠長的一段時間(諸如但不限於，約3~10分鐘)以便發生二級靶向以及循環性游離囊泡從血流中實質性洗出。然後，給患者注射有效量的成像組分，並讓患者帶著所述組分醞釀足夠長的一段時間(諸如但不限於，約3~10分鐘)以便發生二級靶向以及循環性游離囊泡從血流中實質性洗出。隨後進行靶向試劑或靶向治療活性的診斷成像。
[0144]實施例4:靶向/擴增/成像試劑複合體的活體內MRI應用
本實施例以與實施例3類似的方式進行，區別在於用MR成像組分代替超聲成像組分。MR成像組分如下製得:將造影劑截留於生物素化脂質體的內部含水間隙內；造影劑應具有高分子量以增強信號。造影劑示例包括但不限於:大分子釓(III)螯合物諸如樹狀聚體、線性聚合物、禮富勒烯(gadofullurenes)、禮納米管(gadonanotubes)和大的蛋白(例如參見，Accardo 等人，2009)。
[0145]將親脂性造影劑摻入進多層脂質體的脂雙層中。抗生物素蛋白-PEG3tl-抗生物素蛋白由獲自Thermo-Fisher的同雙功能交聯劑製得。將生物素化脂質體與抗生物素蛋白-PEG3tl-抗生物素蛋白混合，以得到MR成像組分。
[0146]Gd-DTPA是常見的MRI造影劑。典型劑量是0.17 mmol/kg體重。該分子的分子量為 0.56 kDa，直徑為 10.0 A (Higgins 等人，2006)。
[0147]0.17Χ10-3摩爾/kg X 100 kg/機體 X 6.022X IO23個分子/摩爾=1.02X IO23個分子/機體。
[0148]假定每一機體6升血，則在常規試劑劑量中，將有1.7X IO15個粒子/μ L血。血構成指定組織區域體積的約10%(5~14%，取決於組織類型)，因此一 μ L組織中約有1.7 X IO14個粒子。
[0149]造影劑分子的表面加載:半徑的球體表面積為4 Jir2。3 ym直徑的球體的表面積為 2.8Xl(Tn Hi2t5Gd-DTPA 分子的橫斷面積為 7.85X1(T19 m2。因此，約 36X IO6 個 Gd-DTPA粒子將會擬合圍繞著(fit around)每一球體的表面。
[0150]假定I μ L靶向區域中存在100個球體，則這將會提供以全粒子堆積圍繞每一球體的3.6 X IO9個靶向的Gd-DTPA粒子。這是常規劑量的約0.002%。
[0151]但是,在University of Wisconsin的一些研究中，產生了每一分子能夠結合100個Gd離子的抗體(Glazer等人,2004)。這項工作提及,低達0.1 μΜ的抗體濃度足以用於活體內成像。
[0152]0.1Χ10-6個分子/升 X IO-6^/μ L X 6.022X IO23個分子/摩爾=60.2X IO9抗體/μ L — 6.02X IO12 Gd 離子/μ L。
[0153]根據這項研究,約6Χ IO12 Gd配合物(complexes) / μ L應取得MRI影像。這需要在所述假定100個球體全粒子堆積例基礎上擴增超過1600倍。
[0154]因此，本實施例利用具有較好對比度的MRI試劑，以給靶向球體提供更多的靶向Gd-DTPA粒子。在一個實施方案中，PEG鏈提供額外的結合位點，這些額外的結合位點可大大提高與每一球體結合的Gd-DTPA粒子數目。
[0155]造影劑分子的體積加載:半徑r的球體的體積為4/3 π r3。3 μ m直徑球體的體積為 1.4X 1(T17 m3。Gd-DTPA 分子的體積為約 5.28X 1(T28 m3。因此，約 26 X IO9 個 Gd-DTPA 粒子應會擬合於每一球體體積內。令這 些分子懸浮或以某種方式束縛以便MRI反應達到最大限度。
[0156]按照革巴向10個球體/ μ L,將達到約260X IO9個Gd配合物(complexes) / μ L,其為MRI成像所需值(6Χ IO12個複合體/μ L)的約1/23。擴增23倍可達到MRI檢測限。更高擴增水平可放寬對須加載到球體上的Gd-DTPA粒子數目的要求。
[0157]提高祀向球體的體積以便能夠加載更多Gd配合物(complexes),這也會有所幫助。直徑增加10%將會導致Gd有效加載能力提高30%。
[0158]結論:通過使遞送至一區域的Gd配合物(complexes)數目提高到足以檢測的水平，擴增使得靶向MRI對比成像能得以實現。擴增的靶向MRI造影劑限制於血管腔。
[0159]實施例5:向機體內定域位點遞送熱以治療疾病狀態/微恙/癌的方法
提供抗體包被的一組脂質體，所述抗體祀向機體內定域位點。該組脂質體上還包被有複合試劑互補對的一個成員。
[0160]提供一組微氣泡，其中該組微氣泡上包被有複合試劑互補對的另一成員。該組微氣泡的每一個都填充了氣體。
[0161]給患者注射有效量的所述組的脂質體，並讓患者帶著所述脂質體醞釀足夠長的一段時間(諸如但不限於，約3~10分鐘)以便發生靶向以及循環性游離脂質體從血流中實質性洗出。然後，給患者注射有效量的所述組的微氣泡，並讓患者帶著所述微氣泡醞釀足夠長的一段時間(諸如但不限於，約3~10分鐘)以便發生二級靶向(即，擴增)以及循環性游離微氣泡從血流中實質性洗出。
[0162]隨後，向患者一定域部分施加超聲，由此超聲以適當的頻率和幅度施加以致聲能被材料所吸收並轉化為熱。以此方式，所述定域組織被加熱到發生壞死而最小限度損傷周邊組織的程度。
[0163]在該方法中，對氣泡尺寸進行選擇以使聲吸收達到最大限度而不阻斷血流。
[0164]實施例6:靶向/成像試劑複合體的活體內治療應用如實施例2中那樣製得靶向組分。
[0165]製備用於US和PET應用的治療組分:使用可市購生物素化微氣泡用於超聲應用。使用可市購生物素化放射性藥物用於PET應用。抗生物素蛋白-PEG3tl-抗生物素蛋白由獲自Thermo-Fisher的同雙功能交聯劑製得。將生物素化微氣泡與抗生物素蛋白-PEG3tl-抗生物素蛋白混合，以得到治療組分。
[0166]在使用方法中，將靶向組分/脂質體製劑注入血流中，讓患者帶著所述組分醞釀足夠長的一段時間(諸如但不限於，約3~10分鐘)以便發生靶向以及循環性游離脂質體從血流中實質性洗出。然後，給患者注射有效量的成像組分，並讓患者帶著所述組分醞釀足夠長的一段時間(諸如但不限於，約3~10分鐘)以便發生二級靶向以及循環性游離微氣泡從血流中實質性洗出。二級靶向游離氣泡活性可用成像模式進行監控。隨後進行靶向試劑和/或祀向治療活性的診斷成像。
[0167]一些常見的 PET 示蹤同位素是 nC、13N、150、18F、64Cu、62Cu、1241、76Br、82Rb 和 68Ga,以及18F0 PET掃描儀的典型靈敏度容許檢測10_n~10_12 mol/L濃度。本實施例還預期具有幾毫米數量級的解析度。
[0168]10-η 摩爾/L X 6.022 X IO23 個分子 / 摩爾 X KT6L/μ L = 6 X IO6 個分子 / μ L 假定在I μ L靶向區域中存在100個靶向球體，則每一靶向球體中需要約60，000個同
位素粒子。
[0169]由5 nm厚的磷脂醯膽鹼雙層組成的100 nm (0.1 μπι)直徑單層脂質體含
【權利要求】
1.一種可序貫遞送的藥學試劑的複合體，其可用於經成像檢測腔中暴露的靶，其中所述複合體在腔中形成，所述複合體包含: 至少一個I階段試劑，其與靶結合； 多個II階段試劑； 多個III階段試劑； 其中所述多個II階段試劑中的每一個與至少一個I階段試劑結合，且其中所述多個III階段試劑中的每一個與至少一個II階段試劑結合，且其中I階段、II階段和III階段試劑中的至少一個可通過成像模式測出，由此使得與靶結合的複合體能得以檢測。
2.權利要求1的複合體，其中I階段、II階段和III階段試劑中的至少一個選自囊泡、脂質體、回波發生性脂質體、多模態回波發生性脂質體、微氣泡、微氣球、微球體、基質粒子、膠束、基於聚集的構建體、納米粒子、全氟化碳納米滴以及它們的組合。
3.權利要求1的複合體，其中I階段、II階段和III階段試劑中的至少一個包含氣體。
4.權利要求1的複合體，其中I階段、II階段和III階段試劑中的至少一個進一步包含摻入/包封於其中的治療學組合物。
5.權利要求4的複合體，其中，在藉助於I階段試劑靶向後，治療學組合物得以遞送、釋放、活化和/或激發。
6.權利要求5的複合體，其中釋放/活化/激發是對熱、超聲和化學方法中至少一種的暴露的響應。
7.權利要求1的複合體，其中: (a)I階段試劑進一步限定為包含一級結合位點和二級結合位點； (b)II階段試劑進一步限定為包含三級結合位點和四級結合位點； (c)III階段試劑進一步限定為包含五級結合位點； (d)其中，I階段試劑的一級結合位點與靶形成第一結合複合體，I階段試劑的二級結合位點與II階段試劑的三級結合位點形成第二結合複合體，II階段試劑的四級結合位點與III階段試劑的五級結合位點形成第三結合複合體。
8.權利要求7的複合體，其中下述情形中至少一種: (a)II階段試劑的三級和四級結合位點相同，並與I階段試劑的二級結合位點以及III階段試劑的五級結合位點互補；和 (b)I階段試劑的二級結合位點與II階段試劑的四級結合位點相同，藉此I階段試劑的二級結合位點也可與III階段試劑的五級結合位點結合以形成第三結合複合體。
9.權利要求8的複合體，其中一級、二級、三級、四級和五級結合位點各自選自肽、蛋白、抗原、抗體、抗體片段、受體、配體、糖綴合物以及它們的組合或衍生物。
10.權利要求1的複合體，其中II階段試劑與多個III階段試劑結合，且其中複合體進一步包含至少第二 III階段試劑。
11.權利要求10的複合體，其中所述至少兩個III階段試劑是相同的。
12.權利要求10的 複合體，其中所述至少兩個III階段試劑是不同的。
13.一種可序貫遞送的藥學試劑的複合體，其可用於經成像檢測腔中暴露的靶，其中所述複合體在腔中形成，所述複合體包含: 附連有多個II階段試劑的至少一個I階段試劑，其中所述至少一個I階段試劑與腔中暴露的靶結合。
14.權利要求13的複合體，其中III階段試劑上的至少一個結合位點也能夠與I階段試劑結合。
15.—種可序貫遞送的可組合製劑，該製劑包含: 第一可給藥組合物，其包含能夠與腔中暴露的靶結合的I階段試劑； 第二可給藥組合物，其包含II階段試劑； 第三可給藥組合物，其包含III階段試劑； 其中II階段試劑包含對I階段試劑具有親合力的第一結構部分，和對III階段試劑具有親合力的第二結構部分，且其中I階段、II階段和III階段試劑中的至少其一可通過成像模式測出，由此使得與靶結合的I階段試劑能得以檢測。
16.一種生成增強的受試者機體影像的方法，該方法包括以下步驟: 向所述機體給藥權利要求15的可序貫遞送的可組合製劑；和 生成至少一部分所述機體的超聲、磁共振、X射線或射線照相影像。
17.權利要求16的方法，其中所述給藥步驟進一步限定為: 向所述機體給藥第一可給藥組合物；和隨後 向所述機體給藥第二可給藥組合物；和隨後 向所述機體給藥第三可給藥組合物。
18.權利要求17的方法，其中所述給藥步驟進一步限定為: 向所述機體給藥第一可給藥組合物； 讓機體醞釀一段時間，以容許I階段試劑與腔中暴露的靶結合，以及從腔中實質性清除未結合的I階段試劑； 向所述機體給藥第二可給藥組合物； 讓機體醞釀一段時間，以容許II階段試劑與I階段試劑結合，以及從腔中實質性清除未結合的II階段試劑； 向所述機體給藥第三可給藥組合物；和 讓機體醞釀一段時間，以容許III階段試劑的結合，以及從腔中實質性清除未結合的III階段試劑。
19.一種可用於使腔中的靶成像的試劑盒，該試劑盒包含: 第一可給藥組合物，其包含能夠與腔中暴露的靶結合的I階段試劑； 第二可給藥組合物，其包含II階段試劑； 第三可給藥組合物，其包含III階段試劑； 其中II階段試劑包含對I階段試劑具有親合力的第一結構部分，和對III階段試劑具有親合力的第二結構部分，且其中I階段、II階段和III階段試劑中的至少其一可通過成像模式測出，由此使得與靶結合的I階段試劑能得以檢測。
20.權利要求19的試劑盒，其進一步包含軟體模塊，該軟體模塊分析由檢測一或多個I階段、II階段和/或III階段試劑的影像遞送裝置所生成的信息。
21.檢測與腔中的靶結合的一或多個I階段、II階段和/或III階段試劑所生成的信號的裝置，該裝置包含: 計算系統，其包含應用模塊和處理單元，所述應用模塊包含軟體模塊，該軟體模塊分析由影像遞送裝置所生成的信息，且所述處理單元配置成執行所述軟體模塊；和 檢測一或多個I階段、II階段和/或III階段試劑的影像遞送裝置，其中III階段試劑與至少一個與靶結合的I階段試劑以及至少一個與I階段試劑結合的II階段試劑複合。
22.權利要求21的裝置，其中影像遞送裝置還充當能量遞送裝置，其向腔中與I階段試劑/11階段試劑/III階段試劑複合體結合的靶遞送定向能量。
23.權利要求22的裝置，其中影像/能量遞送裝置是超聲影像/能量遞送裝置。
24.一種提高成像模式所檢測信號強度的方法，該方法包括以下步驟: 向受試者給藥有效量的I階段試劑，其中I階段試劑穿越受試者並與受試者腔壁表面上暴露的靶結合； 向受試者給藥有效量的II階段試劑，其中多個II階段試劑與已與靶結合的I階段試劑結合； 向受試者給藥有效量的III階段試劑，其中III階段試劑與已經由I階段試劑與靶位點結合的II階段試劑結合；和 經成像模式檢測I階段、II階段和III階段試劑中的至少其一所產生的信號。
25.—種診斷受試者中病況/病症的方法，該方法包括以下步驟: 向受試者給藥有效量的I階段你 試劑，其中I階段試劑包含結合位點，該結合位點與對所述病況/病症特異的靶結合，且其中I階段試劑穿越受試者並與受試者腔壁表面上暴露的任意IE結合； 向受試者給藥有效量的II階段試劑，其中多個II階段試劑與已與靶位點結合的I階段試劑結合； 向受試者給藥有效量的III階段試劑，其中III階段試劑與已經由I階段試劑與靶位點結合的II階段試劑結合；和 經成像模式檢測由I階段、II階段和III階段試劑中的至少其一產生的任何信號；和 如果檢測出信號則確定受試者具有所述病況/病症。
26.一種治療受試者中病況/病症的方法，該方法包括以下步驟: 向受試者給藥有效量的I階段試劑，其中I階段試劑包含結合位點，該結合位點與對所述病況/病症特異的靶結合，且其中I階段試劑穿越受試者並與受試者腔壁表面上暴露的革巴結合; 向受試者給藥有效量的II階段試劑，其中多個II階段試劑與已與靶位點結合的I階段試劑結合；和 向受試者給藥有效量的III階段試劑，其中III階段試劑與已經由I階段試劑與靶位點結合的II階段試劑結合，且其中ι、π和III階段試劑中的至少其一包含治療學組合物。
27.—種向靶位點遞送治療學組合物的方法，該方法包括以下步驟: 向受試者給藥有效量的I階段試劑，其中I階段試劑包含結合位點，該結合位點與對所述病況/病症特異的靶結合，且其中I階段試劑穿越系統並與受試者腔壁表面上暴露的靶結合； 向受試者給藥有效量的II階段試劑，其中多個II階段試劑與已與靶位點結合的I階段試劑結合；和 向受試者給藥有效量的III階段試劑，其中III階段試劑與已經由I階段試劑與靶位點結合的II階段試劑結合，且其中所述1、II和III階段試劑中的至少其一包含摻入於其中的治療學組合物。
28.一種在受試者中誘導靶向位點處血管化組織的局部缺血和壞死的方法，該方法包括以下步驟: (a)向受試者給藥有效量的I階段試劑，其中I階段試劑包含結合位點，該結合位點與對所述病況/病症特異的靶結合，且其中I階段試劑穿越受試者並與受試者腔壁表面上暴露的任意祀結合； (b)向受試者給藥有效量的II階段試劑，其中多個II階段試劑與已與靶位點結合的I階段試劑結合； (C)向受試者給藥有效量的III階段試劑，其中III階段試劑與已經由I階段試劑與靶位點結合的II階段試劑結合；和 (d)重複步驟(b)和(C)的至少其一，直至靶位點處的腔被實質性阻塞。
29.權利要求24~28中任一項的方法，其中在給藥有效量的I階段試劑的步驟中，所述I階段試劑包含氣體。
30.權利要求29的方法，其進一步包括以下步驟:在給藥I階段試劑後將受試者暴露於超聲，藉此，超聲暴露推使I階段試劑靠著腔壁，並提高I階段試劑與靶位點相互作用的可能性。
31.權利要求24~30中任一項的方法，其中所述II階段試劑包含氣體。
32.權利要求31的方法，其進一步包括以下步驟:在給藥II階段試劑後將受試者暴露於超聲，藉此，超聲暴露推使II階段試劑靠著腔壁，並提高II階段試劑與已與靶位點結合的I階段試劑相互作用的可能性。
33.權利要求24~32中任一項的方法，其中所述III階段試劑包含氣體。
34.權利要求33的方法，其進一步包括以下步驟:在給藥III階段試劑後將受試者暴露於超聲，藉此，超聲暴露推使III階段試劑靠著腔壁，並提高III階段試劑與已與靶位點結合的II階段試劑及I階段試劑中的至少其一相互作用的可能性。
35.權利要求24~34中任一項的方法,其中祀位點暴露於血腦屏障、卵巢、胰腺、腎、肝、它們任一個的癌性組織和/或它們的供給組織的至少其一的表面上。
36.權利要求35的方法，其中靶位點是疾病特異性的。
37.權利要求24~36中任一項的方法，其中I階段試劑/11階段試劑/III階段試劑複合體不實質性阻塞腔中流體流動。
38.權利要求24~37中任一項的方法，其中成像模式選自:超聲、核磁共振成像(MRI)、計算機化斷層成像(CO、雙源CT (灌注成像)、彌散張量成像(DTI)、延遲增強成像、X射線和螢光透視(對比螢光透視)成像、計算機化SPECT、PET或PET-CT成像以及分子成像(放射性藥物)。
39.權利要求24~38中任一項的方法，其中所述受試者是人類或獸類受試者。
40.權利要求24~39中任一項的方法，其進一步包括以下步驟:向受試者給藥有效量的第二 III階段試劑，其中所述第二 III階段試劑與已經由I階段試劑與靶位點結合的II階段試劑和III階段試劑中的至少其一結合，且其中所述第二 III階段試劑包含成像試劑和治療試劑中的至少其一。
41.權利要求25或26的方法，其中所述病況/病症選自卵巢癌、胰腺癌、腎癌、肝癌、炎症(克羅恩氏病)、血管發生和血栓形成。
42.權利要求26的方法，其進一步包括以下步驟:激活III階段試劑以治療所述病況/病症。
43.權利要求24~42中任一項的方法，其進一步包括以下步驟:降解I階段/11階段/III階段複合體的至少一部分。
44.權利要求24~43中任一項的方法，其進一步包括以下步驟: 從複合體上移除III階段試劑，由此留下與靶位點附連的I階段試劑/11階段試劑支架； 向受試者給藥有效量的第二 III階段試劑，由此所述第二 III階段試劑與已經由I階段試劑與靶位點結合的II階段試劑結合。
45 .權利要求24~43中任一項的方法，其進一步包括以下步驟: 從複合體上移除擴增和III階段試劑，由此留下與靶位點附連的I階段試劑支架； 向受試者給藥有效量的第二 III階段試劑，由此所述第二 III階段試劑與I階段試劑結合 ?
46.權利要求44或45的方法，其中所述第二III階段試劑包含成像試劑和治療試劑中的至少其一。
47.權利要求46的方法，其中所述第二III階段試劑包含成像試劑，且其中所述方法進一步包括以下步驟:經第二成像模式檢測由第二 III階段試劑所產生的任何信號。
48.一種靶向由成像模式可視化的信號的方法，該方法包括以下步驟: 向受試者給藥有效量的I階段試劑，其中I階段試劑穿越受試者並與受試者腔上暴露的靶位點結合；和隨後 給藥有效量的II階段試劑，其中多個II階段試劑與I階段試劑結合；和 由成像模式檢測I階段和II階段試劑中的至少其一所產生的信號。
49.權利要求48的方法，其中在給藥有效量的I階段試劑的步驟中，所述I階段試劑包含氣體。
50.權利要求49的方法，其進一步包括以下步驟:在給藥I階段試劑後將受試者暴露於超聲，藉此，超聲暴露推使I階段試劑靠著腔壁，並提高I階段試劑與靶位點相互作用的可能性。
51.權利要求48~50中任一項的方法,其中祀位點暴露於卵巢、胰腺、腎、肝、它們任一個的癌性組織和/或它們的供給組織的至少其一的表面上。
52.權利要求51的方法，其中靶位點是疾病特異性的。
53.權利要求48~52中任一項的方法,其中成像模式選自:超聲、核磁共振成像(MRI)、計算機化斷層成像(CO、雙源CT (灌注成像)、彌散張量成像(DTI)、延遲增強成像、X射線和螢光透視(對比螢光透視)成像、計算機化SPECT、PET或PET-CT成像以及分子成像(放射性藥物)。
54.權利要求48~53中任一項的方法，其中所述受試者是人類或獸類受試者。
55.一種成像組合物，其在暴露於聲輻射力後具有增強的結合，所述成像組合物包含與靶結合的多模態回波發生性脂質體，其中所述多模態回波發生性脂質體包含氣體和第二成像模式。
56.權利要求55的成像組合物，其中第二成像模式選自:核磁共振成像(MRI)、計算機化斷層成像(CO、雙源CT (灌注成像)、彌散張量成像(DTI)、延遲增強成像、X射線和螢光透視(對比螢光透視)成像、計算機化SPECT、PET或PET-CT成像、分子成像(放射性藥物)以及它們的組合。
57.一種生成受試者機體影像的方法，該方法包括以下步驟: 向所述機體給藥權利要求55或56的成像組合物； 在給藥所述成像組合物後將受試者暴露於超聲，藉此，超聲暴露推使成像組合物靠著腔壁，並提高I階段試劑與靶位點相互作用的可能性；和 利用成像組合物的第二成像模式，生成所述機體至少一部分的影像。
58.一種可用於使腔中的靶成像的試劑盒，該試劑盒包含權利要求55或56的成像組合物。
【文檔編號】A61K9/127GK103648484SQ201180055777
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2011年9月26日 優先權日:2010年9月28日
【發明者】L.奧彭海默, I.古拉卡爾 申請人:美國西門子醫療解決公司