人絲氨酸/蘇氨酸激酶Ⅱ編碼序列、其編碼的多肽及製備方法

2023-09-12 14:00:55

專利名稱：人絲氨酸/蘇氨酸激酶Ⅱ編碼序列、其編碼的多肽及製備方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說，本發明涉及人絲氨酸/蘇氨酸激酶II(簡稱為STK2)的cDNA序列，該蛋白是Rac蛋白的同系物。本發明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產方法。
Rac蛋白激酶是絲氨酸/蘇氨酸激酶大家族中的Rho家族的一部分。它被認為參與信號分子傳導過程。Rac蛋白激酶還與調節肌動蛋白活動，使肌動蛋白構成細胞骨架的組成部分並參與各種細胞運動。Rac蛋白是一類小型的GTP酶，它的N端是保守的pleckstrin同源區，C端是絲氨酸蘇氨酸激酶活性區。它是信號傳導級聯反應的一個中間環節，當它結合了GTP後，就成為活性狀態，使多種蛋白磷酸化而被激活，產生各種細胞反應。Rac蛋白廣泛參與細胞生長、分裂、遷移、趨化、超氧化物形成等活動，和神經生長中的肌動蛋白骨架的組織、表皮細胞的細胞極性和形態的確立以及胚胎發育的細胞遷移直接相關。另外，在淋巴肥大細胞中，Rac蛋白具有調節肥大細胞的分泌作用的功能(Curr.Biol.5(1)68-73，1995)。Rac下遊的一個效應物變異與免疫系統異常的Wiskott-Aldrich綜合症直接相關(Curr.Biol.6(1)70-75，1996)。
對於Rac蛋白，最早由瑞典Jones等人於1991年從人MCF-7和WI38細胞株cDNA文庫中克隆得到的兩個高度同源的基因(Proc.Natl.Acad.Sci.88(10)4171-4175，1991；Cell Regul.2(12)1001-1009，1991)。1994年日本的Konishi等人在大鼠的精巢細胞cDNA庫中分離得到Rac基因在鼠中的同源物Racα和Racβ(Biochem.Biophys.Res.Commun.205(1)817-825，1994)，並於1995年從大鼠的腦細胞cDNA文庫中克隆得到Rac的第三個成員Racγ基因(Biochem.Biophvs.Res.Commun.216(2)526-534，1995)。在本發明之前，尚沒有任何人公開過本申請中涉及的另一個人類Rac家族成員STK2。
本發明的一個目的是提供一種新的多核苷酸序列，該多核苷酸序列編碼Rac同源蛋白，本發明的Rac同源基因被命名為人STK2。
本發明的另一個目的是提供一種新的蛋白，該蛋白被命名為人STK2。
本發明的再一個目的是提供一種利用重組技術生產所述的新的人STK2蛋白的方法。
本發明還提供了這種人STK2編碼序列和多肽的應用。
在本發明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人STK2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸48-1487位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.6中從核昔酸48-1487位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.7所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO.6中從核苷酸49-1487位的核苷酸序列。
在本發明的另一方面，提供了一種分離的STK2蛋白多肽，它包括具有SEQID NO.7胺基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.7序列的多肽。
在本發明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發明的另一方面，提供了一種所述載體轉化的宿主細胞。
在本發明的另一方面，提供了一種產生具有STK2蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有STK2蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連於表達調控序列，形成STK2蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸48-1487位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，形成STK2蛋白的重組細胞；(c)在適合表達STK2蛋白多肽的條件下，培養步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有STK2蛋白活性的多肽。
在本發明的一個具體實施方案中，本發明的分離的多核苷酸全長為1706個核苷酸，其詳細序列見SEQ ID NO.6，其中開放讀框位於48-1487位核苷酸。
在本發明中，「分離的」、「純化的」或「基本純的」DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態下位於其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組份分開，而且已經與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。
在本發明中，術語「STK2蛋白(或多肽)編碼序列」指編碼具有STK2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.6中48-1487位核苷酸序列及其簡併序列。該簡併序列是指，位於SEQ ID NO.6序列的編碼框48-1487位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同胺基酸的簡併密碼子所取代後而產生的序列。由於密碼子的簡併性，所以與SEQ ID NO.6中48-1487位核苷酸序列同源性低至約70％的簡併序列也能編碼出SEQ ID NO.7所述的序列。該術語還包括能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.6中從核苷酸48-1487位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，更佳地能在高度嚴緊條件下與SEQ ID NO.6中從核苷酸48-1487位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。此外，該術語還包括與SEQ ID NO.6中從核苷酸48-1487位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術語還包括能編碼具有與人STK2相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.6序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5』和/或3』端添加數個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。
在本發明中，「基本純的」蛋白質或多肽是指其至少佔樣品總物質的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按乾重或溼重計)。純度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度。基本純的多肽基本上不含天然狀態下的伴隨其的組分。
在本發明中，術語「STK2蛋白多肽」指具有STK2蛋白活性的SEQ ID NO.7序列的多肽。該術語還包括具有與人STK2相同功能的、SEQ ID NO.7序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括STK2蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴謹度條件下能與STK2 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗STK2多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含STK2多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了STK2多肽的可溶性片段。通常，該片段具有STK2多肽序列的至少約10個連續胺基酸，通常至少約30個連續胺基酸，較佳地至少約50個連續胺基酸，更佳地至少約80個連續胺基酸，最佳地至少約100個連續胺基酸。
發明還提供STK2蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然STK2多肽的差別可以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露於誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同於天然L-胺基酸的殘基(如D-胺基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的胺基酸(如β、γ-胺基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽並不限於上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙醯化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露於進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。
本發明還包括STK2多肽編碼序列的反義序列。這種反義序列可用於抑制細胞內STK2的表達。
本發明還包括一種探針分子，該分子通常具有STK2多肽編碼序列的8-100個，較佳地15-50個連續核苷酸。該探針可用於檢測樣品中是否存在編碼STK2的核酸分子。
本發明還包括檢測STK2核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然後檢測探針是否發生了結合。較佳地，該樣品是PCR擴增後的產物，其中PCR擴增引物對應於STK2多肽的編碼序列，可位於該編碼序列的兩側或中間。引物長度一般為20-50個核苷酸。
在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體。
在本發明中，術語「宿主細胞」包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如CHO細胞、COS細胞等。
另一方面，本發明還包括對STK2 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這裡，「特異性」是指抗體能結合於STK2基因產物或片段。較佳地，指那些能與STK2基因產物或片段結合但不識別和結合於其它非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合併抑制STK2蛋白的分子，也包括那些並不影響STK2蛋白功能的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的STK2基因產物結合的抗體。
本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行製備。例如，純化的STK2基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用於動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達STK2或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來製備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，InMonoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發明的抗體包括能阻斷STK2功能的抗體以及不影響STK2功能的抗體。本發明的各類抗體可以利用STK2基因產物的片段或功能區，通過常規免疫技術獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法製備或利用多肽合成儀合成。與STK2基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯後修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
在本發明中，人STK2的cDNA核苷酸序列是如此獲得的，以人腦λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，合成正向引物C15』-GTTGTCATGTATGAAATGATGTG-3』和反向引物C25』-GTCTGAGCTGTAAATTCTTCATC-3』，進行PCR，獲得334bp的目的片段。然後標記該片段，以該標記片段為探針與擴增後的人腦λgt11cDNA文庫雜交，挑取陽性克隆，經同樣的探針及篩選過程對得到的陽性克隆進行復篩後，最終得到若干陽性單克隆。再以這些陽性克隆為模板，用C1、C2與λgt11左右臂上的引物S1及S2(S15′-GTTCAACATCAGCCGCTACA-3′；S25′-CACCAGACCAACTGGTAATG-3′)進行搭配擴增，產物作為探針與擴增後的人腦λgt11cDNA文庫雜交，再次得到若干陽性克隆。以它們為模板，用寡核苷酸R5』-ACCATAGAACGTGTGCGGTCC-3』和S1、S2分別搭配，作為引物進行PCR擴增，挑選向5』端或3』端延伸最長的3個片段進行測序，最後用電腦軟體拼接順序，獲得全長cDNA序列，共1706bp，詳細序列見SEQ ID NO.6。
Rac蛋白是一類小型的GTP酶。我們克隆了一個新的人類基因STK2，該基因與鼠Racγ基因高度同源，這表明它是Rac家族在人中的一個同源基因，並且具有和Rac家族其它成員相似的生物學功能。Rac蛋白的N端是保守的pleckstrin同源區，C端是絲氨酸蘇氨酸激酶活性區。它是信號傳導級聯反應的一個中間環節，當它結合了GTP後，就成為活性狀態，使多種蛋白磷酸化而被激活，產生各種細胞反應。其中最重要的下遊效應物是磷脂醯肌醇-4-磷酸-5-激酶(PIP5K)，PIP5K被活化後催化磷脂醯肌酸-4，5-二磷酸(PIP2)的形成(Curr.Opin.Cell Biol.986-92，1997；Curr.Opin.Gene Dev.863-67，1998)。PIP2可誘導肌動蛋白絲纖維頂端帽蛋白的脫落和纖維的延伸，並且加速肌動蛋白結合蛋白和肌動蛋白絲的聯繫，最終導致片狀足等結構的形成和細胞膜的皺摺。PIP2可以和含pleckstrin同源區的蛋白結合，活化它們的激酶活性，幫助它們在細胞膜上分布，並促進Ca2+的流動。PIP2對Rac蛋白也有逆效應。Rac蛋白廣泛參與細胞生長、分裂、遷移、趨化、超氧化物形成等活動，和神經生長中的肌動蛋白骨架的組織、表皮細胞的細胞極性和形態的確立以及胚胎發育的細胞遷移直接相關。另外，在淋巴肥大細胞中，Rac蛋白具有調節肥大細胞的分泌作用的功能(Curr.Biol.5(1)68-73，1995)。Rac下遊的一個效應物變異與免疫系統異常的Wiskott-Aldrich綜合症直接相關(Curr.Biol.6(1)70-75，1996)。本發明的多肽為該病症的病理研究和治療提供一種途徑。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1STK2的cDNA序列的克隆和測定1.引物擴增以人腦λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用寡核苷酸C15』-GTTGTCATGTATGAAATGATGTG-3』(SEQ ID NO.1)和寡核苷酸C25』-GTCTGAGCTGTAAAT TCTTCATC-3』(SEQ ID NO.2)為反向引物，進行PCR，PCR條件為93℃3分鐘，隨之以93℃1分鐘、62℃1分鐘和72℃1.5分鐘進行40個循環，最後72℃延伸5分鐘。電泳檢測得到的334bp目的片段。
2.探針及其標記以C1、C2為引物，用α-32P-dATP(DuPont公司)對步驟1得到的目的片段進行PCR法標記，條件同步驟1，得到探針。
3.cDNA文庫擴增及印跡標記(篩選文庫)將人腦λgt11cDNA文庫進行擴增，克隆數達50萬個，然後將擴增好的cDNA文庫印跡到Hybond TM-N+尼龍膜上(Amersham)，再將標記好的探針變性後與印跡膜雜交，洗膜，放入帶增感屏的片夾，與FUJI MEDIAI X光膠片於-80℃下進行放射自顯影，72小時後衝片。
4.挑取克隆及初篩克隆的復篩通過上述雜交篩選獲得多個初篩陽性克隆，用上述相同的探針雜交和篩選過程對這些陽性克隆進行復篩，最終得到12個陽性單克隆。
5.單克隆的鑑定和測序以上述步驟4中得到的單克隆噬菌體為模板，用上述步驟1的兩個正反引物分別與λgt11左右臂上的引物S15′-GTTCAACATCAGCCGCTACA-3′(SEQ ID NO.3)及S25′-CACCAGACCAACTGGTAATG-3′(SEQ ID NO.4)進行搭配擴增，然後進行瓊脂糖凝膠電泳，以判斷每個克隆從探針出發向5′或3′步移(延伸)的長度，從中選出向5′延伸最長和向3′延伸最長的克隆。將這個克隆S1-S2擴增產物與pGEM-TTM載體(Promega)連接，轉化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對插入片段進行定向系列缺失，然後用PCR對缺失子進行快速鑑定及排序。用SwquiTherm EXCELTMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對依次截短的缺失子進行測序。用SequiThermEXCELTMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對依次截短的缺失子進行測序，最後用電腦軟體拼接順序，獲得部分cDNA序列。
6.全長的獲得仿照步驟3，以C1S1和C2S2為混合探針再雜交以人腦λgt11cDNA文庫，得到26個陽性克隆。以這26個克隆為模板，用寡核苷酸R5』ACCATAGAACGTGTGCGGTCC-3』(SEQ ID NO.5)和寡核苷酸S1、S2分別搭配，作為引物進行PCR擴增，PCR條件為93℃3分鐘，隨之以93℃1分鐘、64℃1分鐘和72℃2分鐘進行35個循環，最後72℃延伸5分鐘。挑選向5』端或3』端延伸最長的3個片段進行測序，最後用電腦軟體拼接順序，獲得全長cDNA序列，共1706bp，詳細序列見SEQ ID NO.6，其中開放讀框位於49-1487位核苷酸。
根據得到的cDNA序列推導出STK2的胺基酸序列，共479個胺基酸殘基，其胺基酸序列詳見SEQ ID NO.7。
實施例2同源比較用STK2的全長cDNA序列及其編碼蛋白在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB資料庫及Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR資料庫中用BLAST進行核酸和蛋白同源檢索。結果發現STK2與小鼠RACγ基因及其編碼蛋白具有極高同源性，用PCGENE軟體比較發現它們在核酸和蛋白水平上的同一性分別達到了85.3％和98.9％。這表明，它們屬於同一個家族，而且STK2具有相似或相同的功能。
Rac蛋白是一類小型的GTP酶，是絲氨酸/蘇氨酸激酶大家族中的Rho家族的一個組成部分。Rac的N端是保守的pleckstrin同源區(pH域)，該區域由大約100個胺基酸組成，顯示以下共同特徵它由兩個互相垂直的反平行β-摺疊組成，後續一個C-末端的親水螺旋。連接兩個β-摺疊的環狀結構在各種PH域中長度有很大的不同，而且在PH域中還沒有完全保守的胺基酸殘基存在，使得PH域相對較難被識別。本發明中對應的PH區域為SEQ ID NO.7中第1位至第109位胺基酸。Rac蛋白的C端是絲氨酸蘇氨酸激酶活性區(L/I/V/M/F/Y/C)X(H/Y)XD(L/I/V/M/F/Y)KX2N(L/I/V/M/F/Y/C/T)3，其中(L/I/V/M/F/Y/C)表示所列7種胺基酸中任選一種，Xn表示n個任意胺基酸，本發明中對應的序列為SEQ ID NO.7中第267位至第289位胺基酸。這進一步確定了本發明的STK2是Rac家族的一員，並且具有該家族蛋白的相關功能。
Rac蛋白是信號傳導級聯反應的一個中間環節，當它結合了GTP後，就成為活性狀態，使多種蛋白磷酸化而被激活，產生各種細胞反應。其中最重要的下遊效應物是磷脂醯肌醇-4-磷酸-5-激酶(PIP5K)，PIP5K被活化後催化磷脂醯肌酸-4，5-二磷酸(PIP2)的形成(Curr.Opin.Cell Biol.986-92，1997；Curr.Opin.Gene Dev.863-67，1998)。PIP2可誘導肌動蛋白絲纖維頂端帽蛋白的脫落和纖維的延伸(Cell82643-653，1995)，並且加速肌動蛋白結合蛋白和肌動蛋白絲的聯繫，最終導致片狀足等結構的形成和細胞膜的皺摺(EMBO J.153778-3786，1996)。PIP2可以和PH域的蛋白結合(Science 371168-170，1994)，活化它們的激酶活性，幫助它們在細胞膜上分布，並促進Ca2+的流動。PIP2對Rac蛋白也有逆效應，可能對其在特定條件下的轉移、活化是必需的。Rac蛋白可通過PIP5K的作用廣泛參與細胞生長、分裂、遷移、趨化、超氧化物形成等活動。果蠅中的同源基因研究表明Rac和神經生長中的肌動蛋白骨架的組織(Genes Dev.81787-1802，1994)、表皮細胞的細胞極性和形態的確立(J.Cell.Biol.131151-164，1995)以及胚胎發育的細胞遷移直接相關(J.Cell.Biol.133617-630，1996)。另外，在淋巴肥大細胞中，Rac蛋白被發現能捕獲從外層釋放的內源纖絲成分，從而證明了其具有調節肥大細胞的分泌作用的功能(Curr.Biol.5(1)68-73，1995)。Rac下遊的一個效應物變異與免疫系統異常的Wiskott-Aldrich綜合症直接相關。該病症表現為血小板和T細胞形態異常及微絨毛數量減少，從而導致血小板數量減少，減弱免疫反應(Curr.Biol.6(1)70-75，1996)。本發明的多肽可以為該病症的病理研究和治療提供一個途徑。
實施例3STK2在大腸桿菌中的表達在該實施例中，將編碼STK2的cDNA序列用對應於該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物在人腦λgt11cDNA文庫進行擴增，獲得STK2 cDNA作為插入片段。
PCR反應中使用的5′寡核苷酸引物序列為5』-TCCGGTCGACATGAGCGATGTTACCATTG-3′(SEQ ID NO.8)，該引物含有SalI限制性限制性內切酶的酶切位點，在該酶切位點之後是由起始密碼子開始的STK2編碼序列的19個核苷酸；3′端引物序列為5』-GTTGTCGACTTATTCTCGTCCACTTGCAG-3』(SEQ ID NO.9)，該引物含有SalI限制性限制性內切酶的酶切位點、翻譯終止子和STK2的部分編碼序列。
引物上的限制性內切酶的酶切位點對應於細菌表達載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內切酶酶切位點，該質粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個細菌複製起點(ori)、一個IPTG-可調啟動子/操縱子(P/O)、一個核糖體結合位點(RBS)、一個6-組氨酸標記物(6-His)以及限制性內切酶克隆位點。
用SalI分別消化pQE-9載體與插入片段，隨後將插入片段連接到pQE-9載體並保持開放讀框在細菌RBS起始。隨後用連接混合物轉化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質粒pREP4，其表達lacI阻遏物並攜帶卡那黴素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養皿上篩選轉化子，抽提質粒，用BamHI酶切鑑定插入片段大小及方向，並測序驗證STK2的cDNA片段已正確插入了載體。
在補加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養基中過夜培養(O/N)含所需構建物的陽性轉化子克隆。過夜(O/N)培養物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然後接種到大體積培養基中，培養細胞生長至600光密度(OD600)為0.4-0.6時，加入IPTG(「異丙基硫代-β-D-半乳糖苷」)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導啟動P/O導致基因表達水平提高。繼續培養細胞3-4小時，隨後離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細胞並將細胞沉澱溶於6M的鹽酸胍中。澄清後，通過在能使含6-His標記物蛋白緊密結合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的STK2。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫STK2。可用幾種方法從鹽酸胍中變性沉澱蛋白。或者使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出純化蛋白，純化後的蛋白可以結合到第二個柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結合到該柱時蛋白質變性，隨後用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最後，將可溶的蛋白質用PBS進行透析，然後將蛋白質保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑑定表達蛋白的分子量大小為約56KDa。
此外，用常規方法對達蛋白的N端和C端各10個胺基酸長度的胺基酸進行測序，發現與SEQ ID NO.7的序列一致。
實施例4STK2在真核細胞(CHO細胞株)中的表達在該實施例中，將編碼STK2的cDNA序列，用對應於該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進行擴增，獲得STK2 cDNA作為插入片段。
PCR反應中使用的5′寡核苷酸引物序列為5』-TCGGGAATTCATGAGCGATGTTACCATTG-3′(SEQ ID NO.10)該引物含有EcoRI限制性限制性內切酶的酶切位點，在該酶切位點之後是由起始密碼子開始的STK2編碼序列的19個核苷酸；3′端引物序列為5』-GTTGGGCCCTTATTCTCGTCCACTTGCAG-3』(SEQ ID NO.11)該引物含有ApaI限制性限制性內切酶的酶切位點、一個翻譯終止子和STK2的部分編碼序列。
引物上的限制性內切酶的酶切位點對應於CHO細胞表達載體pcDNA3上的限制性內切酶酶切位點，該質粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個噬菌體複製起點(f1 ori)、一個病毒複製起點(SV40 ori)、一個T7啟動子、一個病毒啟動子(P-CMV)、一個Sp6啟動子、一個SV40啟動子、一個SV40加尾信號和相應的polyA順序、一個BGH加尾信號和相應的polyA順序。
用EcoRI和ApaI分別消化pcDNA3載體和插入片段，隨後將插入片段連接到pcDNA3載體。隨後用連接混合物轉化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養皿上篩選轉化子，在補加Amp(100μg/ml)的LB液體培養基中過夜培養(O/N)含所需構建物的克隆。抽提質粒，用BamHI酶切鑑定插入片段大小及方向，並測序驗證STK2的cDNA片段已正確插入了載體。
質粒轉染CHO是用脂轉染法，採用Lipofectin試劑盒(GiBcolife)進行。轉染48小時後，經2-3周的持續G418加壓篩選，收集細胞及細胞上清測定表達蛋白酶活力。去G418，連續傳代培養；對混合克隆細胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細胞亞克隆。按常規方法大量培養上述陽性亞克隆。48小時後，開始收集細胞及上清，用超聲裂解方法破碎細胞。以含0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經預平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液為洗脫液進行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然後以PBS(pH7.4)為透析液對表達蛋白溶液進行透析。最後凍幹保存。
用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑑定表達蛋白的分子量大小為56KDa。
此外，用常規方法對達蛋白的N端和C端各10個胺基酸長度的胺基酸進行測序，發現與SEQ ID NO.7的序列一致。
實施例5製備抗體將實施例3或4中獲得的重組蛋白用來免疫動物以產生抗體，具體如下。重組分子用層析法進行分離後備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，並用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內注射。14天後，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進行腹膜內注射以加強免疫。每隔14天進行一次加強免疫，至少進行三次。獲得的抗血清的特異反應活性用它在體外沉澱STK2基因翻譯產物的能力加以評估。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特徵(A)長度23鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.1GTTGTCATGT ATGAAATGAT GTG23(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特徵(A)長度23鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.2GTCTGAGCTG TAAATTCTTC ATC 23(2)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特徵(A)長度20鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.3GTTCAACATC AGCCGCTACA 20(2)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特徵(A)長度20鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.4CACCAGACCA ACTGGTAATG 20(2)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特徵(A)長度21鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.5ACCATAGAAC GTGTGCGGTC C 21(2)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特徵(A)長度1706bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO.61 TCACAAAGTACCATTTCTTCAAGTTGGGGGCTCAGAGGGGAGTCATCATGAGCGATGTTA61 CCATTGTGAAAGAAGGTTGGGTTCAGAAGAGGGGAGAATATATAAAAAACTGGAGGCCAA121 GATACTTCCTTTTGAAGACAGATGGCTCATTCATAGGATATAAAGAGAAACCTCAAGATG181 TGGATTTACCTTATCCCCTCAACAACTTTTCAGTGGCAAAATGCCAGTTAATGAAAACAG241 AACGACCAAAGCCAAACACATTTATAATCAGATGTCTCCAGTGGACTACTGTTATAGAGA301 GAACATTTCATGTAGATACTCCAGAGGAAAGGGAAGAATGGACAGAAGCTATCCAGGCTG361 TAGCAGACAGACTGCAGAGGCAAGAAGAGGAGAGAATGAATTGTAGTCCAACTTCACAAA421 TTGATAATATAGGAGAGGAAGAGATGGATGCCTCTACAACCCATCATAAAAGAAAGACAA481 TGAATGATTTTGACTATTTGAAACTACTAGGTAAAGGCACTTTTGGGAAAGTTATTTTGG541 TTCGAGAGAAGGCAAGTGGAAAATACTATGCTATGAAGATTCTGAAGAAAGAAGTCATTA601 TTGCAAAGGATGAAGTGGCACACACTCTAACTGAAAGCAGAGTATTAAAGAACACTAGAC661 ATCCCTTTTTAACATCCTTGAAATATTCCTTCCAGACAAAAGACCGTTTGTGTTTTGTGA721 TGGAATATGTTAATGGGGGCGAGCTGTTTTTCCATTTGTCGAGAGAGCGGGTGTTCTCTG781 AGGACCGCACACGTTTCTATGGTGCAGAAATTGTCTCTGCCTTGGACTATCTACATTCCG841 GAAAGATTGTGTACCGTGATCTCAAGTTGGAGAATCTAATGCTGGACAAAGATGGCCACA901 TAAAAATTACAGATTTTGGACTTTGCAAAGAAGGGATCACAGATGCAGCCACCATGAAGA961 CATTCTGTGGCACTCCAGAATATCTGGCACCAGAGGTGTTAGAAGATAATGACTATGGCC1021 GAGCAGTAGACTGGTGGGGCCTAGGGGTTGTCATGTATGAAATGATGTGTGGGAGGTTAC1081 CTTTCTACAACCAGGACCATGAGAAACTTTTTGAATTAATATTAATGGAAGACATTAAAT1141 TTCCTCGAACACTCTCTTCAGATGCAAAATCATTGCTTTCAGGGCTCTTGATAAAGGATC1201 CAAATAAACGCCTTGGTGGAGGACCAGATGATGCAAAAGAAATTATGAGACACAGTTTCT1261 TCTCTGGAGTAAACTGGCAAGATGTATATGATAAAAAGCTTGTACCTCCTTTTAAACCTC1321 AAGTAACATCTGAGACAGATACTAGATATTTTGATGAAGAATTTACAGCTCAGACTATTA1381 CAATAACACCACCTGAAAAATATGATGAGGATGGTATGGACTGCATGGACAATGAGAGGC1441 GGCCGCATTTCCCTCAATTTTCCTACTCTGCAAGTGGACGAGAATAAGTCTCTTTCATTC1501 TGCTACTTCACTGTCATCTTCAATTTATTACTGAAAATGATTCCTGGACATCACCAGTCC1561 TAGCTCTTACACATAGCAGGGGCACCTTCCGACATCCCAGACCAGCCAAGGGTCCTCACC1621 CCTCGCCACCTTTCACCCTCATGAAAACACACATACACGCAAATACACTCCAGTTTTTGT1681 TTTTGCATGAAATTGTATCCGGAATT(2)SEQ ID NO.7的信息(i)序列特徵(A)長度479個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO.71 Met Ser Asp Val Thr Ile Val Lys Glu Gly Trp Val Gln Lys Arg16 Gly Glu Tyr Ile Lys Asn Trp Arg Pro Arg Tyr Phe Leu Leu Lys31 Thr Asp Gly Ser Phe Ile Gly Tyr Lys Glu Lys Pro Gln Asp Val46 Asp Leu Pro Tyr Pro Leu Asn Asn Phe Ser Val Ala Lys Cys Gln61 Leu Met Lys Thr Glu Arg Pro Lys Pro Asn Thr Phe Ile Ile Arg76 Cys Leu Gln Trp Thr Thr Val Ile Glu Arg Thr Phe His Val Asp91 Thr Pro Glu Glu Arg Glu Glu Trp Thr Glu Ala Ile Gln Ala Val106 Ala Asp Arg Leu Gln Arg Gln Glu Glu Glu Arg Met Asn Cys Ser121 Pro Thr Ser Gln Ile Asp Asn Ile Gly Glu Glu Glu Met Asp Ala136 Ser Thr Thr His His Lys Arg Lys Thr Met Asn Asp Phe Asp Tyr151 Leu Lys Leu Leu Gly Lys Gly Thr Phe Gly Lys Val Ile Leu Val166 Arg Glu Lys Ala Ser Gly Lys Tyr Tyr Ala Met Lys Ile Leu Lys181 Lys Glu Val Ile Ile Ala Lys Asp Glu Val Ala His Thr Leu Thr196 Glu Ser Arg Val Leu Lys Asn Thr Arg His Pro Phe Leu Thr Ser211 Leu Lys Tyr Ser Phe Gln Thr Lys Asp Arg Leu Cys Phe Val Met226 Glu Tyr Val Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His Leu Ser Arg Glu241 Arg Val Phe Ser Glu Asp Arg Thr Arg Phe Tyr Gly Ala Glu Ile256 Val Ser Ala Leu Asp Tyr Leu His Ser Gly Lys Ile Val Tyr Arg271 Asp Leu Lys Leu Glu Asn Leu Met Leu Asp Lys Asp Gly His Ile286 Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Cys Lys Glu Gly Ile Thr Asp Ala301 Ala Thr Met Lys Thr Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro316 Glu Val Leu Glu Asp Asn Asp Tyr Gly Arg Ala Val Asp Trp Trp331 Gly Leu Gly Val Val Met Tyr Glu Met Met Cys Gly Arg Leu Pro346 Phe Tyr Asn Gln Asp His Glu Lys Leu Phe Glu Leu Ile Leu Met361 Glu Asp Ile Lys Phe Pro Arg Thr Leu Ser Ser Asp Ala Lys Ser376 Leu Leu Ser Gly Leu Leu Ile Lys Asp Pro Asn Lys Arg Leu Gly391 Gly Gly Pro Asp Asp Ala Lys Glu Ile Met Arg His Ser Phe Phe406 Ser Gly Val Asn Trp Gln Asp Val Tyr Asp Lys Lys Leu Val Pro421 Pro Phe Lys Pro Gln Val Thr Ser Glu Thr Asp Thr Arg Tyr Phe436 Asp Glu Glu Phe Thr Ala Gln Thr Ile Thr Ile Thr Pro Pro Glu451 Lys Tyr Asp Glu Asp Gly Met Asp Cys Met Asp Asn Glu Arg Arg466 Pro His Phe Pro Gln Phe Ser Tyr Ser Ala Ser Gly Arg Glu(2)SEQ ID NO.8的信息(i)序列特徵(A)長度29鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.8TCCGGTCGAC ATGAGCGATG TTACCATTG29(2)SEQ ID NO.9的信息(i)序列特徵(A)長度29鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.9GTTGTCGACT TATTCTCGTC CACTTGCAG 29(2)SEQ ID NO.10的信息(i)序列特徵(A)長度29鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.10TCGGGAATTC ATGAGCGATG TTACCATTG29(2)SEQ ID NO.11的信息(i)序列特徵(A)長度29鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.11GTTGGGCCCT TATTCTCGTC CACTTGCAG 29
權利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特徵在於，它包括編碼具有人STK2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸48-1487位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.6中從核苷酸48-1487位的核苷酸序列雜交。
2.如權利要求1所述的DNA分子，其特徵在於，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.7所示的序列。
3.如權利要求1所述的DNA分子，其特徵在於，該序列具有SEQ ID NO.6中核苷酸48-1487位的序列。
4.一種分離的STK2蛋白多肽，其特徵在於，它包括具有SEQ ID NO.7胺基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權利要求4所述的多肽，其特徵在於，該多肽是具有SEQ ID NO.7序列的多肽。
6.一種載體，其特徵在於，它含有權利要求1所述的DNA。
7.一種用權利要求6所述載體轉化的宿主細胞。
8.如權利要求7所述的宿主細胞，其特徵在於，該細胞是大腸桿菌。
9.如權利要求7所述的宿主細胞，其特徵在於，該細胞是真核細胞。
10.一種產生具有STK2蛋白活性的多肽的方法，其特徵在於，該方法包括(a)將編碼具有STK2蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連於表達調控序列，形成STK2蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸48-1487位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，形成STK2蛋白的重組細胞；(c)在適合表達STK2蛋白多肽的條件下，培養步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有STK2蛋白活性的多肽。
11.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，該序列為SEQ ID NO.6中從核苷酸48-1487位。
12.一種能與權利要求4所述的STK2蛋白多肽特異性結合的抗體。
13.一種核苷酸分子，其特徵在於，它是權利要求1所述DNA分子的反義序列。
14.一種探針分子，其特徵在於，它含有權利要求1所述的DNA分子中約8-100個連續核苷酸。
全文摘要
本發明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說,本發明涉及一種新的人絲氨酸/蘇氨酸激酶STK2的cDNA序列,該蛋白是Rac蛋白的同系物。本發明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽,這些多核苷酸和多肽的應用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生產方法。
文檔編號C12N1/21GK1246537SQ98111040
公開日2000年3月8日 申請日期1998年8月31日 優先權日1998年8月31日
發明者餘龍, 戴方彥, 畢安定, 範玉新, 趙壽元 申請人:復旦大學