具有α-苯乙醇拆分活性的嗜熱脂肪酶、編碼基因及其應用的製作方法

2023-09-12 17:27:00

專利名稱：具有α-苯乙醇拆分活性的嗜熱脂肪酶、編碼基因及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種具有a-苯乙醇拆分活性的嗜熱脂肪酶及其編碼基因， 以及該嗜熱脂肪酶的製備方法和應用。
(二)
背景技術：
脂肪酶(lipase, E.C.3.1.1.3 )全稱為三醯基甘油水解酶(triacylglycerol), 是指能在油水界面上水解甘油三酯的酶。它是能催化酯水解和酯合成的水 解酶中最重要的一類。脂肪酶具有較寬的作用溫度、較強的底物專一性及 立體選擇性等特點，其催化的反應不需輔酶，反應條件溫和，副產物少， 因此已廣泛應用於食品加工、洗滌劑、造紙、皮革加工、製藥、汙水處理 等行業。由於^多數的工業反應都在超過45。C的溫度下操作，這就要求 酶具備專交好的熱穩、定性(Bonch隱Osmolovskaya, E.A.， Miroshnichenko, M丄.，Kostrikina, N.A.etal., Arch.Microbiol.， 154, 1990: 556~559。)， 來源於一些嗜熱菌的嗜熱脂肪酶不僅具有常溫酶的高效催化的優點，而且 在高溫條件下能保持很高的穩定性，對有機溶劑及變性劑有很強的抗性， 因此在許多領域，如食品工業、環境保護、能源以及石油開採等方面都具 有潛在的重要的應用價值。
隨著對手性藥物和中間體需求的增長，利用生物法或酶法拆分手性化 合物來合成單一對映體日益得到人們的重視。脂肪酶是目前生物催化中最 廣泛應用的酶類，其中手性化合物的拆分(Racemate resolution)是其主 要應用方向。脂肪酶對醇、羧酸、S旨、醯胺和胺等手性化合物均有較好的 立體選擇性，因此脂肪酶被廣泛地用來拆分外消旋醇和羧酸。拆分的主要途徑為立體選擇性水解、酯化或轉酯反應。通過篩選找到適用的具有高對 映體選擇性的新型脂肪酶酶以製備光學純的手性化合物已經成為研究熱 點。在同 一生物體內往往存在多種水解酶,但它們的立體選擇性存在差異， 因此利用微生物細胞或粗酶製品進行催化時會降低產物的光學純度
(Geun-Joong Kim, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 17， 2002: 29 38) 。 Fernandez-Lorente G等人把Aspergillus niger月旨肪酶純化後其 對0-2- 丁醯基-2-苯乙酸外消旋體的立體選擇性大大提高了
(Fernandez-Lorente G et al, Purification of different lipases from Jspergz7/MS w/ger by using a highly selective adsorption on hydrophobic supports, Biotechnol Bioeng, 2005, 92 (6) : 773-9)。由於大多數篩選獲得脂肪 酶產生菌活力較低，給分離純化造成了困難，因此需要通過基因克隆的手 段來獲得大量純化的具備高選擇性的脂肪酶以更好的滿足工業催化的要
求。 —
發明內容
本發明的目的是提供一種在高溫條件下顯示活性的嗜熱脂肪酶及其 編碼基因，同時提供了由重組菌抹製備脂肪酶的方法，以及純化的脂肪酶 在苯乙醇的手性拆分的應用。
本發明採用的技術方案是
一種具有a-苯乙醇拆分活性的嗜熱脂肪酶，所述嗜熱脂肪酶的氨基 酸序列與SEQIDNo.2所示胺基酸序列具有90%以上同源性。
優選的，所述嗜熱脂肪酶具有SEQ ID No.2所示的胺基酸序列。 本發明還涉及編碼所述嗜熱脂肪酶的基因。
優選的，所述基因具有SEQIDNo.l所示的核苷酸序列，該基因編碼
SEQ ID No.2所示的胺基酸序列。
本發明研究證明，嗜熱脂肪芽孢桿菌(Geok c"/ws WMraAwwop/z//^ )T2產生的脂肪酶作用溫度範圍為40 80°C, pH5 U,最佳溫度為55°C。 該脂肪酶在許多抑制劑如EDTA、 PMSF、 DTT和p-巰基乙醇的存在下都 能保持穩定，Triton-X100能較大地提高酶活。將脂肪酶與許多有機溶劑 如乙醇、曱醇、異丙醇、丙酮、DMSO共保溫後，酶活基本未損失，其 中乙醇還能明顯地提高酶活，說明該脂肪酶對有機溶劑具備良好的耐受 性。
本發明通過篩選獲得了具備脂肪酶活力的嗜熱脂肪芽孢桿菌 (GeoZ^c/〃w Wearc^wmop/n7ws ) T2,從上述菌抹中提耳又基因組DNA後， 通過PCR技術擴增得到了脂肪酶基因72，測序結果表明其長度為 1251bp,編碼一個由416個胺基酸組成的蛋白質。其核苷S吏序列如SEQ ID No.l所示，相應的氨基S^f列如SEQIDNo.2所示。應當指出，本發明 的脂肪酶不僅限是具有SEQIDNo.2所示的胺基酸序列組成的蛋白質，也 包括對序列2中的胺基酸進行一個或多個胺基酸殘基的取代、插入或缺失 且具有相同酶活性的蛋白質。
本發明還涉及一種製備所述嗜熱脂肪酶的方法，所述方法包括
(1) 構建含有編碼所述嗜熱脂肪酶基因(to")的表達載體；
(2) 將所述表達載體轉化到宿主菌抹中，得到表達菌林;
(3) 篩選陽性克隆，經^KS菱裙和誘導獲得所述嗜熱脂肪酶。
在已知所述嗜熱脂肪酶及其編碼基因序列的前提下，所述嗜熱脂肪酶
可按照本領域常規方法方便的獲得。所述宿主菌株可為大腸桿菌、枯草杆
菌或酵母菌。所述宿主菌林優選為大腸桿菌BL21(DE3),轉化得到含有
重組表達制粒plip-PET的大腸桿菌BL21(DE3)。
本發明可將基因72與克隆載體pMD18-T連接後轉化大腸桿菌
(Esc/zen'c/z/" co//) DH5a,成功後從菌林中提取含有脂肪酶基因的重組克隆載體，將此克隆載體與表達載體pET-28a ( + )分別用限制性內切酶處理後在T4 DNA連接酶的作用下形成包含有72的表達載體plip-PET,再用此重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)，獲得的即為重組酶的生產菌抹。37°C培養該菌抹至OD60。約0.7~0.8時，加入終濃度為0.1 0.4mmolIPTG誘導其高水平表達脂肪酶。
所述的嗜熱脂肪酶可用於水解外消旋乙酸a-苯乙酯製備R-苯乙醇。該脂肪酶能將R-乙酸苯乙酯分解成R-苯乙醇和乙酸，留下未反應的S-乙酸苯乙酯。然後可根據化學性質的不同將它們分離，得到光學純的R-苯乙醇。本發明建立的反應體系摸索了合適的反應緩沖液濃度、pH、反應時間和溫度、酶粉的添加量等，最後得到的e.e.p約為99°/。，產率大於45%。
涉及反應式如下
(RSH "phenyiethyl acetaie
具體的，所述應用為在50 500mmo1、 pH7~10的磷酸鹽緩沖液中，於20 50。C下以嗜熱脂肪酶水解外消旋乙酸a-苯乙酯6 24小時，製得所述R-苯乙醇。 —一
優選的，所述應用為在5Ommo1、 pH8.0的磷酸鹽緩沖液中加入終濃度50~80mg/mL的外消旋乙酸a-苯乙酯和終濃度0.05 0.5mg/mL的脂肪酶酶粉(純化後的脂肪酶酶粉)，於25"水解反應9小時，水解液按常規方法分離純化可得到所述R-苯乙醇。
本發明的有益效果主要體現在:提供了 一種具有立體選擇性的嗜熱脂肪酶及其編碼基因，該脂肪酶對有機溶劑具備良好的耐受性，並具有高選擇性，可用於選擇性水解外消旋乙酸a-苯乙酯製備光學純的R-苯乙醇，
7產率大於45%, e.e.p約為990/0。
(四)


圖1為本發明lip T2的PCR擴增電泳圖譜，其中1、DNAMarker( DL2000，Takara) ; 2、 lipT2片段；
圖2為本發明重組表達質粒pLIPT2-PET的BamH I和Nde I雙酶切分析圖譜，其中1、 pLIPT2-PET; 2、 pLIPT2-PET/BamH I+Nde I ; 3、DNA Marker (DL2000, Takara);
圖3為本發明重組菌經誘導培養後經細胞破碎後的SDS-PAGE圖譜，其中M表示蛋白質marker, 1為重組菌經IPTG誘導並繼續培養4小時後破碎細胞得到發酵液的上清，2為重組菌與1在同樣條件下培養但是未經IPTG誘導的發酵液上清；
圖4為本發明重組脂肪酶lip T2在大腸桿菌內的高效表達和產物純化後的SDS-PAGE圖語，其中M、蛋白質分子量標準(低，Takara) ; 1、表達產物經純化；2、脂肪酶的高效表達產物。
(五)
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述,但本發明的保護範圍並不僅限於此
實施例1:從嗜熱脂肪芽孢桿菌T2克隆LIPT2基因
根據已報導嗜熱芽孢桿菌脂肪酶基因的同源性設計簡併引物1和2。引物1序列5 ，-ARSRTGATGAAAKGCTGYCG-3 ，；引物2序列5 ，-TTAAGGSHSSAARCTYGCCA國3 ，
從實驗室保存的嗜熱芽孢桿菌(Geo6(3"7/w WearoAwmop/z//^ )中以CTAB法提取基因組DNA (嗜熱脂肪芽孢桿菌T2基因組DNA ),以此DNA為才莫板進行PCR擴增，PCR反應體系和反應條件如下所示:
反應體系
10xPCR buffer 2pL
dNTP Mix (各2.5mM) 0攀
Prime 1 ( 10|uM) l)iL
Prime 2 ( lOjuM) lpL
模板DNA ( 50ng/ jn L ) 0.2(iL
Taq酶 (5U/ in L ) 0.25jxL
ddH20 15.05pL
總計 20pL。反應條件
預變性95'C 5min
變性95。e-30s,退火60。C 90s,延伸72°C 60s, 30個循環延伸72 °C lOmin。
從0.7%瓊脂糖凝膠中回收出約1300bp的目的DNA片段(如圖l所示)，將其與pMD18-T (Takara,大連)連接後轉化大腸桿菌DH5a,在含有100ug/ml氨千青黴素的LB上進行篩選，培養12~16個小時後挑取陽性克隆用菌落PCR的方法來進一步驗證。最後從確定的陽性克隆中抽取重組質粒pLIPT2-T進行測序，序列如SEQ ID No.l所示，相應的胺基酸序列如SEQIDNo.2所示。
實施例2:基因工程菌抹的獲得
根據測序結果重新設計引物3和引物4,在引物3上添加BamH I位點，在引物4上添加Nde I位點。引物3序列GGAATTCCATATGATGAAATGCTGCCGGGTGATG引物4序歹'J: CGCGGATCCTTAAGGGTCCAAGCTCGCCAAC
再次以基因組DNA為模板擴增脂肪酶基因，將回收的目的DNA片斷和pET28a ( +) (Novagen)分別用BamH I和Nde I雙酶切5小時，從凝膠中分別回收後取5uL LIPT2片段，3uL線性pET28a ( + ) ， luL10x連接緩衝液，luL (2000U/ ja L ) T4DNA連接酶，混合均勻後在16。C反應16小時後轉化大腸桿菌DH5a，在含有30ug/mL卡鈉黴素的LB上進行篩選，從篩得的陽性克隆中提取重組質粒plip-PET進行BamH I和Nde I雙酶切分析鑑定，證明該重組載體含有目的片段(如圖2所示)。最後用plip-PET轉化大腸桿菌BL21(DE3)，從而得到重組脂肪酶的基因工程菌抹。
實施例3:脂肪酶的表達和純化
將含有plip-PET的大腸桿菌BL21(DE3)接種於10ml含有30ug/ml卡鈉黴素的LB液體培養基中，37。C震蕩培養過夜。得到的種子液按l: 50的體積比接種於新鮮的500mlLB培養基(置於2L三角瓶)中，培養至OD6oo約0.7-0.8時，加入終濃度為0.4mmo1的IPTG誘導，37。C繼續培養4小時後離心(4°C, 10000rpm， 10min )收集菌體。將菌體重懸於20mL50mmo1 Tris-HCl (pH 8.0)緩衝液中，超聲破碎。離心取上清以對硝基苯酚棕櫚酸酯為底物檢測酶活，酶活力為205U/ml。
同時取細胞碎片、上清、沉澱進行SDS-PAGE,檢測蛋白表達情況，結果如圖3所示，其中M表示蛋白質marker, 1為重組菌經IPTG誘導並繼續培養4小時後破碎細胞得到發酵液的上清，2為重組菌與1在同樣條件下培養但是未經IPTG誘導的發酵液上清。從圖中可以看出經誘導的樣品中明顯有一條較濃的約為44KD的條帶，這與預計的大小為43KD的目標條帶大小基本一致。所以可以基本判定目的蛋白在IPTG的誘導下得到了較好的表達。
利用pET28a ( + )帶有的6xHis標籤進行固定化金屬離子親和層析(IMAC ),填料使用的是Ni SepharoseTM 6 Fast Flow ( GE Healthcare,烏普薩拉，瑞典)。將含有可溶性脂肪酶的上清液經濾膜過濾後與結合緩衝液(50mmol磷酸鹽，500mmolNacl， pH7.4)—起上柱，洗掉雜蛋白後再以含有一定濃度咪唑的洗脫緩衝液(50mmol磷酸鹽，250mmol咪唑，pH8.2 )洗脫目的蛋白，最後在20mmo1磷酸鹽緩衝液中透析過夜除去咪唑。得到的酶液在SDS-PAGE上顯示一條帶(如圖4)，達到了電泳純。
實施例4:重組脂肪酶的在苯乙醇手性拆分中的應用
以純化的重組脂肪酶水解外消旋乙酸a-苯乙酯來獲得光學純的R-苯乙醇，對反應緩衝液濃度(50 500mmo1磷酸鹽)、反應pH ( 7~10 )、反應溫度(20~50°C)、反應時間(6h 24h)等反應條件進行了摸索，最後確定了在50mmol磷酸鹽緩衝液(pH8.0) , 25。C震蕩反應9h為最佳反應條件。在5Ommo1、 pH8.0的磷酸鹽緩衝液2mL中加入121mg的外消旋乙酸a-苯乙酯和0.2mg純化後的脂肪酶酶^l分，於25匸水解反應9小時，反應產物經手性柱CHIRALPAKIC HPLC(流動相為正己烷異丙醇=95:5 (V/V)，檢測波長220nm,流速1.0 ml/min,檢測溫度35。C)分析轉化率和產物的光學純度，分析圖譜可知得到R-苯乙醇的e.e.p約為99。/0,產率大於45%。SEQUENCE LISTING杭州師範大學
具有a-苯乙醇拆分活性的嗜熱脂肪酶、編碼基因及其應用

6
Patentln version 3.4
1 1251 DNA
Geobacillus stearothermophilus 1
atgatgaaat gctgccgggt gatggttgtg ttgctcggat tatggtttgg attcggccta 60tcggtcccag gaggggctga agcggcagct tcacgcgcca atgatgcacc catcgtgctt 120ctccatgggt ttaccggatg ggggcgagag gaaatgcttg gattcaagta ttggggcggc 180gtgcgcggcg atatcgaaca atggctgaac gacaacggat atcgaacgta tacgctggcg 240gtcggaccgc tctcgagcaa ctgggaccgg gcgtgtgaag cgtatgctca gcttgtcggc 300gggacggtcg attatggggc agcccatgcg gcaaagcacg gccatgcgcg gtttggccgc 360acttatcccg gcctgttgcc ggaattgaaa aggggtggcc gcatccatat catcgcccac 420agccaagggg ggcagacggc ccgcatgctt gtctcgctcc tagagaacgg aagccaagaa 480gagcgggagt acgccaaggc gcacaacgtg tcgttgtcac cgttgtttga aggtggacat 540cattttgtgt tgagtgtgac gaccatcgcc actcctcatg acgggacgac gcttgtcaac 600atggttgatt tcaccgatcg cttttttgac ttgcaaaaag cggtgttgga agcggcggct 660gtcgccagca acgtgccgta cacgagtcaa gtatacgatt ttaagctcga ccaatgggga 720ctgcgccgcc agccgggtga atcgttcgac cattattttg aacggctcaa gcgctcccct 780gtttggacgt cgacagatac cgcccgctac gatttatccg tttccggagc tgagaagttg 840aatcaatggg tgcaagcaag cccgaatacg tattatttga gctttgccac agaacggacg 900tatcgcggag cgctcacagg caactattat cccgaactcg gaatgaatgc attcagcgcg 960gtcgtatgcg ctccgtttct cggttcgtac cgcaatccga cgctcggcat tgacgaccgc 1020tggcttgaaa acgatggcat tgtcaatacg gtttccatga acggtccaaa gcgtggatca 1080agcgatcgga tcgtaccgta tgacggggcg ttgaaaaaag gggtttggaa tgacatggga 1140acgtacaatg tcgaccattt ggaaatcatc ggcgttgace cgaatccgtc atttgatatt 1200^gcgcct講atttgcgact tgccgagcag ttggcgagct tggaccctta a 1251
2 416 PRT
Geobacillus stearothermophilus 2
Met Met Lys Cys Cys Arg Val Met Val Val Leu Leu Gly Leu Trp Phe15 10 15
Gly Phe Gly Leu Ser Val Pro Gly Gly Ala Glu Ala Ala Ala Ser Arg20 25 30
Ala Asn Asp Ala Pro lie Val Leu Leu His Gly Phe Thr Gly Trp Gly35 40 45
Arg Glu Glu Met Leu Gly Phe Lys Tyr Trp Gly Gly Val Arg Gly Asp50 55 60
lie Glu Gin Trp Leu Asn Asp Asn Gly Tyr Arg Thr Tyr Thr Leu Ala65 70 75 80
Val Gly Pro Leu Ser Ser Asn Trp Asp Arg Ala Cys Glu Ala Tyr Ala85 90 95
Gin Leu Val Gly Gly Thr Val Asp Tyr Gly Ala Ala His Ala Ala Lys100 105 110
His Gly His Ala Arg Phe Gly Arg Thr Tyr Pro Gly Leu Leu Pro Glu115 120 125
Leu Lys Arg Gly Gly Arg lie His lie lie Ala His Ser Gin Gly Gly130 135 140
Gin Thr Ala Arg Met Leu Val Ser Leu Leu Glu Asn Gly Ser Gin Glu145 150 155 160formula see original document page 14 3 20 DNA Unknown

人工序列 3
arsrtgatga aakgctgycg 20
4 20 <212〉 DNA Unknown
<220〉
人工序列 4
ttaaggshss aarctygcca 20
5 34 <212〉 DNA Unknown

人工序列 5
ggaattccat atgatgaaat gctgccgggt gatg .34
6 31 DNA Unknown

人工序列 6
cgcggatcct taagggtcca agctcgccaa c 3權利要求
1. 一種具有α-苯乙醇拆分活性的嗜熱脂肪酶，所述嗜熱脂肪酶的胺基酸序列與SEQ ID No.2所示胺基酸序列具有90％以上同源性。
2. 如權利要求1所述的嗜熱脂肪酶，其特徵在於所述嗜熱脂肪酶具有SEQ ID No.2所示的氨基S臾序列。
3. 編碼權利要求1所述嗜熱脂肪酶的基因。
4. 如權利要求3所述的基因，其特徵在於所述基因具有SEQ IDNo.l所示的核苷S吏序列。
5. 製備如權利要求1所述嗜熱脂肪酶的方法，所述方法包括(1) 構建含有編碼所述嗜熱脂肪酶基因的表達載體；(2) 將所述表達載體轉化到宿主菌抹中，得到表達菌抹；(3) 篩選陽性克隆，經微生物發酵和誘導獲得所述嗜熱脂肪酶。
6. 如權利要求5所述的方法，其特徵在於所述宿主菌林為大腸桿菌、枯 草桿菌或酵母菌。
7. 如權利要求6所述的方法，其特徵在於所述宿主菌抹為大腸桿菌 BL21(DE3)。
8. 如權利要求1所述的嗜熱脂肪酶在水解外消旋乙酸苯乙酯製備R-苯乙 醇中的應用。
9. 如權利要求8所述的應用，其特徵在於所述應用為在50 500mmo1、 pH7 10的磷酸鹽緩衝液中，於20 50。C下以嗜熱脂肪酶水解外消旋乙 酸a-苯乙酯6 24小時，製得所述R-苯乙醇。
10. 如權利要求9所述的應用，其特徵在於所述應用為在50mmol、 pH8.0 的磷酸鹽緩衝液中加入外消旋乙酸a-苯乙酯和嗜熱脂肪酶酶粉，乙酸a-苯乙酯加入量為50 80mg/mL緩衝液，嗜熱脂肪酶酶粉加入量為,0.05 0.5mg/mL緩衝液，於25。C水解反應9小時，於水解液中得到所 述R-苯乙醇。
全文摘要
本發明提供了一種在高溫條件下顯示活性的嗜熱脂肪酶及其編碼基因，同時提供了由重組菌株製備脂肪酶的方法，以及純化的脂肪酶在苯乙醇的手性拆分的應用。所述嗜熱脂肪酶的胺基酸序列與SEQID No.2所示胺基酸序列具有90％以上同源性。本發明的有益效果主要體現在提供了一種具有立體選擇性的嗜熱脂肪酶及其編碼基因，該脂肪酶對有機溶劑具備良好的耐受性，並具有高選擇性，可用於選擇性水解外消旋苯乙酯製備光學純的R-苯乙醇，產率大於45％，e.e.P約為99％。
文檔編號C12N9/20GK101457217SQ20081016377
公開日2009年6月17日 申請日期2008年12月31日 優先權日2008年12月31日
發明者馮國棟, 昱 蔣, 陳振明 申請人:杭州師範大學