利用人工的多核苷酸及其組合物來減少轉基因沉默的方法

2023-09-12 22:13:10

專利名稱：利用人工的多核苷酸及其組合物來減少轉基因沉默的方法
技術領域：
本發明與植物基因工程有關。更具體一點說，與構建人工多核苷 酸的方法和用於減少植物中轉基因沉默的方法相關。本發明也與含有 該人工多核普酸的植物細胞及從該細胞再生的植物相關，其中該植物 細胞是被轉化來表達該人工多核苷酸的。
背景技術：
異源基因可以從除了將要轉化進入的植物以外的來源分離得到或 者這些基因可以被修飾或設計來使其具有不同的或改良的性質。植物 基因工程的特別理想的目標性狀和性質包括但不局限於對於昆蟲，真 菌疾病及其它害蟲和能引發疾病的物質的抗性，對於除草劑的耐受性， 增強的穩定性或保存期，產量，環境壓力耐受性以及營養增強。
產生新的基因和蛋白的常規的分子生物學方法一般包括隨機或定 向的誘變。隨機誘變的一個例子是作為"DNA改組"已知的一種重組技 術，如在美國專利5， 605, 793; 5， 811， 238; 5， 830， 721; 5， 837， 458和國 際申請W098/31837, W099 / 65927中所/〉開的，此處將其整體引入作 為參考。 一種可供選擇的分子進化的方法包括體外誘變的交叉延伸過 程(StEP)和核酸分子序列的重組，如在美國專利5， 965， 408中公開 的，此處將其引入作為參考。定向誘變的例子是在多肽特定位點引入 點突變。
當異源基因是來自於非植物來源的時候可用的可供選擇的方案是 設計人工殺蟲基因，該基因使用玉米植物密碼子使用表中最常用的密碼子(Koziel等，1993, Biotechnology 11， 194-200 )。 Fischhoff 和Perlak (美國專利號5， 500， 365，此處將其引入作為參考)報導與 在農作物中相比，當多核苷酸序列被修飾來減少去穩定化序列的出現 之後蘇雲金芽孢桿菌(Bacillas thuringiensis ) ( Bt)殺蟲蛋白的 表達較高。在此處對於野生型的Bt多核苷酸序列的修飾是必要的，因 為全長的野生型Bt多核苷酸序列不能在植物中表達在農業上起作用的 足夠水平的殺蟲蛋白。
異源基因被克隆到適於轉化植物的載體中。將異源基因整合到植 物基因組中所用的轉化和再生技術在本領域中已經為人們所熟知。在 此之後基因可以在植物細胞中表達來展現附加的特徵或性狀。然而， 通常作為轉基因表達情況良好的異源基因當在同一植物中有超過一個 拷貝的同樣的基因表達的時候可能會發生基因沉默。這種情況可能發 生在第一個異源基因與植物中的一個內源基因DNA序列十分相似的時 候。其它的例子包括當一種轉基因植物隨後與其它含有相同或相似轉
因的植物表達盒再一次轉化的時候。相似的，如果性狀堆積使用相同 的遺傳因子基因沉默也會發生，這些遺傳因子是用於指導目標轉基因 表達的。為了堆積性狀，應該利用不同的基因和遺傳因子的組合建立 穩定的轉基因系來避免基因沉默。
N-膦醯甲基甘氨酸，也被稱為草甘膦，是一種為人熟知的在植物 物種中具有廣譜活性的除草劑。草甘膦是Roundup (Monsanto Co.) 的活性成分，是一種安全的除草劑在環境中具有所需的較短的半衰期。 當將其作用於植物的表面時，草甘膦會移動遍布植物。草甘膦由於其 抑制莽草酸途徑而具有植物毒性，該途徑提供合成芳族胺基酸的前體。 草甘膦抑制5-烯醇丙酮基-3-磷酸莽草酸合酶(EPSPS)。
草甘膦的耐受性也可以通過表達EPSPS的變體來達到，這些變體 具有低的與草甘膦的親和力並且因此在草甘膦存在的情況下保持其催 化活性(美國專利號5, 633, 435,此處將其引入作為參考)。植物組織 中能夠降解草甘膦的酶(美國專利號5， 463， 175 )也可以使植物獲得對 於草甘膦的細胞耐受性。這些基因被用來產生能夠耐受草甘膦的轉基 因農作物，因此可以使草甘膦用於有效地野草控制並且使其對農作物 的危害降到最低。例如草甘膦耐受性已經通過基因工程的方法加入玉米(美國專利號5, 554, 798 )，小麥(美國專利申請號20020062503 )， 大豆(美國專利申請號20020157139 )和canola (W09204449 )中，所 有這些被引入作為參考。草甘膦耐受性的轉基因和對其它除草劑耐受 性的轉基因，例如 6ar基因， (Toki 等 Plant Physiol.， 100: 1503-1507， 1992; Thompson 等 EMBO J. 6: 2519—2523， 1987， phosphinothricin acetyl transferase, BAR gene isolated from streptomyces; DeBlock等EMBO J. 6: 2513-2522, 1987, glufosinate herbicide )也可以用作選擇性標記或評價標記並且可以
提供一種對於連接有其它農業上有用的性狀的植物進行選擇的表型。 在本領域中所需要的是設計在植物中表達以改善農業上有用性狀
的基因的方法，該方法在多拷貝插入並與植物內源基因重組時避免基 因沉默。


圖l.將兩個人工的水稻EPSPS版本(OsEPSPS-AT，OsEPSPS-ZM) 和天然的水稻EPSPS ( 0sEPSPS—Nat)的多核苷酸序列上的變化進行的 堆積(pilenp)比較，每一個修飾的多肽都是草甘膦抗性的。
圖2.將天然的(ZmEPSPS-Nat )和人工的(ZmEPSPS —ZM )玉米EPSPS 的多核普酸序列進行的堆積(pilenp)比較，每一個修飾的多肽都是 草甘膦抗性的。
圖3.將天然的(GmEPSPS—Nat)和人工的(GmEPSPS —GM)大豆EPSPS 的多核苷酸序列進行的堆積(pilenp)比較，每一個修飾的多肽都是 草甘膦抗性的。
圖4.將天然的BAR基因(BAR1-Nat)和兩個人工的利用玉米 (Zeamays )密碼子偏倚性(BAR1 —ZM )和擬南芥(Arabidopsis thaliana)密碼子偏倚性(BAR1-AT)製成的版本的多核苷酸序列上的 變化進行的堆積比較。
圖5.將CTP2和CP4EPSPS的天然的(CTP2CP4—Nat)和人工的版本 (CTP2CP4-AT, CTP2CP4 —ZM，和CTP2CP4 — GM )的多核苷酸序列上的變 化進行的堆積比較。
圖6. pMON54949的質粒圖i普。
圖7. pMON54950的質粒圖譜。
圖8. pM0詣151的質粒圖譜。圖9. pMON59302的質粒圖i普。圖10.pMON59307的質粒圖譜。
圖11.pM0N42411的質粒圖謙。
圖12.pMON58400的質粒圖謙。
圖13.pMON58401的質粒圖i普。
圖14.pMON54964的質粒圖i普。
圖15.pMON25455的質粒圖譜。
圖16.pMON30152的質粒圖譜。
圖17.pMON54992的質粒圖i普。
圖18.pMON54985的質粒圖譜。
圖19.pMON20999的質粒圖譜。
圖20.pMON45313的質粒圖i普。
圖21.pMON59308的質粒圖語。
圖22.pMON59309的質粒圖譜。
圖23.pMON59313的質粒圖譜。
圖24.pMON59396的質粒圖譜。
圖25.pMON25496的質粒圖i普。
序列表簡述
SEQ ID NO: 1 OsEPSPS-TIPS 水稻的EPSPS蛋白序列經過修
飾使其具有草甘膦抗性並具有 葉綠體轉運肽。
SEQ ID NO: 2 OsEPSPS-Nat水稻天然EPSPS多核苷酸序
列，該多核苷酸序列經過修飾 來編碼草甘膦抗性蛋白。
SEQ ID NO: 3 OsEPSPS-AT —種水稻人工EPSPS多核苷酸
序列，該多核苷酸序列是利用擬 南芥屬(Arabidopsis )密碼子 使用表和本發明的方法獲得的， 並且進一步修飾使其編碼草甘 膦抗性蛋白。
SEQ ID NO: 4 OsEPSPS-ZM —種水稻人工EPSPS多核苷酸
序列，該多核苷酸序列是利用玉米密碼子使用表和本發明的方
法獲得的，並且進一步修飾使其 編碼草甘膦抗性蛋白。
SEQ ID NO: 5 GmEPSPS-IKS大豆的EPSPS蛋白序列經過修
飾使其具有草甘膦抗性並具有 葉綠體轉運肽。
SEQ ID NO: 6 GmEPSPS-Nat大豆天然EPSPS多核普酸序
列，該多核苷酸序列經過修飾來 編碼草甘膦抗性蛋白。
SEQ ID NO: 7 GmEPSPS — GM —種大豆人工EPSPS多核普酸
序列，該多核苷酸序列是利用大 豆(Glycine max)密碼子使用 表和本發明的方法獲得的，並且 進一步修飾使其編碼草甘膦抗 性蛋白。
SEQ ID NO: 8 ZmEPSPS — TIPS 玉米的EPSPS蛋白序列經過修
飾使其具有草甘膦抗性並具有 葉綠體轉運肽。
SEQ ID NO: 9 ZmEPSPS—Nat玉米天然EPSPS多核苷酸序
列，該多核苷酸序列經過修飾來 編碼草甘膦抗性蛋白。
SEQ ID NO: 10ZmEPSPS-ZM —種玉米人工EPSPS多核苦酸
序列，該多核苷酸序列是利用玉
米密碼子使用表和本發明的方
法獲得的，並且進一步修飾使其 編碼草甘膦抗性蛋白。
SEQ ID NO: 11CTP2 從擬南芥屬EPSPS基因得來的
葉綠體轉運肽2的蛋白序列。
SEQ ID NO: 12CTP2_Nat 從擬南芥屬EPSPS得來的葉綠
體轉運肽的多核苷酸序列。
SEQ ID NO: 13CTP2—AT 人工編碼CTP2的多核普酸序
列，該多核苷酸序列是利用擬南SEQ ID NO: 14 CTP2—ZM
SEQ ID NO: 15 CP4EPSPS
SEQ ID NO: 16 CP4EPSPS
SEQ ID NO: 17 CP4EPSPS
SEQ ID NO: 18 CP4EPSPS
SEQ ID NO: 19 BAR1
SEQ ID NO: 20 BARl一Nat
SEQ ID NO: 21 BARl一AT
SE(J ID NO: 22 BARl一ZM
說明書第6/108頁
芥屬密碼子使用表和本發明的 方法獲得的。
人工編碼CTP2的多核苷酸序 列，該多核苷酸序列是利用玉米 密碼子使用表和本發明的方法 獲得的。
從農桿菌屬(Agrobacterium) 菌抹CP4得來的草甘膦抗性 EPSPS蛋白的蛋白序列。
Nat 編碼CP4EPSPS蛋白的天然的 多核普酸的多核苷酸序列(美國 專利號5, 633, 435 )。
AT編碼CP4EPSPS的人工多核苷
酸的多核苷酸序列，該多核苷酸 序列是利用擬南芥屬密碼子使 用表和本發明的方法獲得的。
ZM編碼CP4EPSPS的人工多核苷
酸的多核苷酸序列，該多核苷酸 序列是利用玉米密碼子使用表 和本發明的方法獲得的。 膦絲菌素乙醯轉移酶的蛋白序列。
從鏈黴菌屬(Streptomyces ) 中分離的編碼膦絲菌素乙醯轉 移酶的天然多核苷酸的多核苷 酸序列。
編碼膦絲菌素乙醯轉移酶的人 工多核苷酸的多核苷酸序列，該 多核普酸序列是利用擬南芥密 碼子使用表和本發明的方法獲 得的。
編碼膦絲菌素乙醯轉移酶的人
9SEQ ID NO: 23 CP4EPSPS-Syn
SEO ID NO: 24
SEQ ID NO: 25
SEQ ID NO: 26
SE(J ID NO: 27
SE(J ID NO: 28
SEQ ID NO: 29
SEQ ID NO: 30
SEQ ID NO: 31
SEQ ID NO: 32
SEQ ID NO: 33
SEQ ID NO: 34
SEQ ID NO: 35
CP4EPSPS_AT—pi
CP4EPSPS—AT—p2
CP4EPSPS_ZM—pi
CP4EPSPS—ZM一p2
CP4EPSPS-Nat_pl
CP4EPSPS一Nat一p2
CP4EPSPS-Syn_pl
CP4EPSPS—Syn一pl
ZmAdhl引物1
ZmAdhl引物2
GNAGIAMKS
CTPEPSPSCP4_GM
工多核苷酸的多核苷酸序列，該 多核苷酸序列是利用玉米密碼 子使用表和本發明的方法獲得 的。
具有雙子葉植物密碼子偏倚性
的人工多核苷酸的多核苷酸序列。
用於診斷CP4EPSPS-AT多核 苷酸的DM引物分子。 用於診斷CP4EPSPS-AT多核 苷酸的DNA引物分子。 用於診斷CP4EPSPS — ZM多核 普酸的DNA引物分子。 用於診斷CP4EPSPS-ZM多核 苷酸的DNA引物分子。 用於it斷CP4EPSPS_Nat多 核苷酸的DNA引物分子。 用於診斷CP4EPSPS—Nat多 核苦酸的DNA引物分子。 用於診斷CP4EPSPS- Syn多 核苦酸的DNA引物分子。 用於診斷CP4EPSPS— Syn多 核苷酸的DNA引物分子。 用於診斷內源玉米Adhl基 因的對照引物1。 用於診斷內源玉米Adhl基 因的對照引物2。 為植物提供草甘膦抗 性的EPSPS基序。 利用大豆的密碼子使用表制 備的編碼CP4EPSPS蛋白的 人工的多核苷酸的多核苦酸序列。

發明內容
本發明提供了設計能編碼目標蛋白的人工多核苷酸序列的方法和 組合物，其中該人工多核苷酸是與植物中自然產生的多核苷酸或已經 作為轉基因轉入植物的多核苷酸基本不同的並且該人工多核苷酸和多 核普酸編碼基本相同的多肽。
本發明的人工多核苷酸能夠編碼能夠為含有DNA構建體的轉基因 植物提供在農業上可以應用的表型的蛋白，該DM構建體包括該人工 多核苷酸。在農業上有用的表型包括乾旱耐受性，提高的產量，寒 冷耐受性，對疾病的抗性，對昆蟲的抗性和對除草劑的耐受性，但不 局限於此。
本發明的另一個方面是能夠編碼除草劑抗性EPSPS蛋白，膦絲菌 素乙醯轉移酶蛋白，葉綠體轉運肽蛋白的人工多核苷酸。在本發明優 選的實施方案中，該人工多核苷酸分子選自SEQ IDNO: 3， SEQ ID NO: 4， SEQ ID NO: 6， SEQ ID NO: 7， SEQ ID NO: 10， SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14， SEQ ID NO: 17， SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22和SEQ ID NO: 35。
本發明提供的DNA構建體包括在植物中能起作用的啟動子分子， 該分子能夠可操作地連接於本發明的人工多核苷酸分子上，能夠可操 作地連接於轉錄終止區域，其中該人工多核苷酸選自SEQ ID NO: 3， SEQ ID NO: 4， SEQ ID NO: 6， SEQ ID NO: 7， SEQ ID NO: 10， SEQ ID NO: 13， SEQ ID NO: 14， SEQ ID NO.. 17， SEQ ID NO: 18， SEQ ID NO 21, SEQ ID NO: 22和SEQ ID NO: 35。
本發明進一步提供的DM構建體包括在植物中能起作用的啟動 子分子，該分子能夠可操作地連接於能夠編碼葉綠體轉運肽的人工多 核苷酸分子上，能夠可操作地連接於異源草甘膦抗性EPSPS，能夠可操 作地連接於轉錄終止區域，其中該人工多核苷酸與已知的能夠編碼同 樣的葉綠體轉運肽的多核苷酸在多核苷酸序列上是基本不同的。
本發明提供的DM構建體包括至少兩個表達盒，第一個表達盒包 括能夠在植物中起作用的啟動子分子，該分子能夠可操作地連接於本 發明的人工多核苷酸分子，能夠可操作地連接於轉錄終止信號區域， 第二個表達合包括包括能夠在植物中起作用的啟動子分子，該分子能夠可操作地連接於多核苷酸分子，該多核苷酸分子與提到的人工多核 苷酸編碼基本同樣的多肽但是在多核苷酸序列上與該人工多核苷酸的
相似性小於85%,且該分子能夠可操作地連接於轉錄終止信號區域。 本發明提供包含本發明的DNA構建體的植物細胞，植物或其後代。
令人特別感興趣的是選自小麥，玉米，水稻，大豆，棉花，馬鈴薯， canola，草碎草，森林樹，高粱，蔬菜作物，觀賞植物，伺料作物和 水果作物的後代植物。
本發明能夠減少在轉基因植物繁殖過程中基因沉默的方法包括以 下的步驟
a) 構建與已知的能夠編碼基本相同蛋白的多核苷酸基本不同的 人工多核苷酸，並且
b) 構建包括該人工多核苷酸分子的DM構建體，並且
c) 將該DM構建體轉化入植物細胞，並且
d) 使該植物細胞再生成轉基因植物；並且
e) 將該轉基因植物與能育的植物雜交，其中該能育的植物包括 能夠編碼與該人工多核普酸分子所編碼的蛋白基本相同的蛋白的多核 苷酸分子，並且其中該人工多核苷酸分子與該多核苷酸分子基本不同。
本發明的另一個方面是包括兩種多核苷酸的轉基因植物細胞，其 中至少一種多核苷酸是轉基因的並且兩種多核苷酸編碼基本相同的蛋 白而且在多核苷酸序列上兩者的相似性小於85%。
本發明的另一個方面是在轉基因植物生產的過程中減少基因沉默 的方法，包括以下的步驟
a) 構建與已知的能夠編碼基本相同蛋白的多核苷酸基本不同的 人工多核苷酸，並且
b) 構建第一個包括該人工多核苷酸分子的DNA構建體，並且
c) 將該DNA構建體轉化入植物細胞；並且
d) 使該植物細胞再生成轉基因植物；並且
e) 利用第二個包括多核苷酸分子的DNA構建體再次轉化來自於 該轉基因植物的細胞，其中多核苷酸分子能夠編碼與該人工多核苷酸 編碼的蛋白基本相同的蛋白並且該多核苷酸分子與該人工多核苷酸分 子在多核苷酸序列基本上不同；並且
f) 將步驟d中的該細胞再生成同時包含所提到的人工多核苷酸
12和提到的多核苷酸的轉基因植物。
本發明進一步提供選擇已經轉化了本發明的DNA構建體的植物的 方法，包括以下步驟
a) 利用本發明的DNA構建體轉化植物細胞，並且
b) 將該植物細胞在含有除草劑的選擇性培養基中培養來選擇性 地殺死沒有轉化該DNA構建體的細胞，其中該除草劑選自草甘膦和 草銨膦；並且
c) 將該植物細胞再生成能育的植物。
本發明的另一個方面是探測在轉基因植物細胞，植物或其後代中 的人工多核苷酸的方法，包括以下步驟
a) 利用DNA分子接觸從該植物細胞，植物或其後代中分離得到 的DNA樣品，其中該DNA分子包括一對DNA分子中的至少一個，該DNA 分子當用於核酸擴增的時候能夠產生可診斷人工多核苷酸分子的擴增 子，該人工多核苷酸分子選自SEQIDNO: 3， SEQ ID NO: 4， SEQ ID N0: 6, SEQ ID NO: 7， SEQ ID NO- 10， SEQ ID NO: 13， SEQ ID NO-14， SEQ ID NO: 17， SEQ ID NO: 18， SEQ ID NO: 21， SEQ ID NO: 22和SEQ ID NO: 35。
a) 進行核酸擴增反應，因此可以產生擴增子；並且
b) 檢測該擴增子。
進行上迷的檢測方法所需要的試劑包括但不局限於能夠特異性 地與人工多核苷酸分子雜交的DNA分子，該人工多核苷酸分子選自 SEQ ID NO: 3， SEQ ID NO: 4， SEQ ID NO: 6， SEQ ID NO: 7， SEQ ID NO: 10， SEQID NO: 13， SEQID N0: 14, SEQ ID NO: 17， SEQ ID NO.. 18， SEQ ID NO: 21， SBQ ID NO: 22;以及分離的DNA分子，該分離 的DNA分子選自SEQ ID NO: 24， SEQ ID NO: 25， SEQ ID NO: 26和 SEQ ID NO: 27。
本發明提供包括DNA分子的植物及後代，該DM分子選自SEQ ID NO: 3， SEQ ID NO: 4， SEQ ID N0: 6, SEQ ID NO: 7， SEQ ID NO: 10， SEQ ID NO: 13， SEQ ID NO: 14， SEQ ID NO: 17， SEQ ID NO: 18， SEQ ID NO: 21， SEQ ID N0: 22， SEQ ID N0: 24， SEQ ID NO: 25， SEQ ID N0: 26和SEQ ID N0: 27。
本發明提供成對的DNA分子，這些DNA分子對選自第一個DNA分子和第二個DNA分子，其中該第一個DNA分子是SEQ ID NO: 24或 其互補序列並且該第二個DM分子是SEQ ID NO: 25或其互補序列並 且該對DNA分子在用於DNA擴增方法中時能夠產生擴增子，以及另 一個 第一個DNA分子和第二個DNA分子，其中該第一個DM分子是SEQ ID NO: 26或其互補序列並且該笫二個DNA分子是SEQ ID NO: 27或其互 補序列並且該對DM分子在用於DNA擴增方法中時能夠產生擴增子， 其中該擴增子能夠診斷在轉移因植物的基因組中本發明的人工多核苷 酸的存在。
本發明提供植物及其後代，該植物及其後代通過DNA擴增的方法 鑑定在其基因組中含有DM分子，該DNA分子選自SEQ ID NO: 3， SEQ ID NO: 4， SEQ ID NO: 6， SEQ ID NO: 7， SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13， SEQ ID NO: 14， SEQ ID NO: 17， SEQ ID NO: 18， SEQ ID NO: 21， SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24， SEQ ID NO: 25， SEQ ID NO: 26和SEQ ID NO: 27。
本發明提供和預期DM檢測試劑盒，該試劑盒包括至少一個足 夠長以致能夠與人工多核苷酸特異性同源或互補的DM分子，其中該 人工多核苷酸選自SEQ ID NO: 3， SEQ ID NO: 4， SEQ ID NO: 6， SEQ ID NO: 7， SEQ ID NO: 10， SEQ ID NO: 13， SEQ ID NO- 14， SEQ ID NO: 17， SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21和SEQ ID NO: 22，其中 該DNA分子用作DNA探針或DNA引物；或者至少一個與DNA引物同源 或互補的DNA分子，該DM引物選自SEQ ID NO: 24， SEQ ID NO: 25， SEQ ID NO: 26和SEQ ID NO: 27。
本發明進一步提供檢測在DNA樣品中編碼草甘膦抗性EPSPS的人 工多核苷酸的存在的方法，該方法包括
a) 從植物中提取DNA樣品；並且
b) 利用標記的足夠長以致能夠與人工多核苷酸特異性同源或互 補的DNA分子來接觸該DM樣品，其中該人工多核香酸選自SEQ ID NO: 3， SEQ ID NO: 4， SEQ ID NO: 6， SEQ ID NO: 7， SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13， SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18， 其中該標記的DNA分子是DNA探針；並且
c) 使該樣品和DNA探針處於嚴格的雜交條件下；並且
d) 檢測雜交到該DNA樣品上的DNA探針。本發明提供分離的編碼EPSPS酶的多核苷酸，該EPSPS酶包括SEQ ID NO: 34的基序。本發明提供包含編碼具有SEQ ID NO: 34的基序的 EPSPS酶的多核普酸的DM構建體。作為表達具有SEQ ID NO: 34的基 序的EPSPS酶的結果，植物細胞，植物或其後代具有草甘膦耐受性也 是本發明的一個方面。
具體實施例方式
提供以下的定義以更好地定義本發明並且引導那些本領域技術人 員實踐本發明。除非另外的注釋，術語按照那些在相關領域技術人員 常規的用法來理解。分子生物學的普通術語的定義也可以在Rieger等， Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 第 5 版， Springer-Verlag: New York, (1991); 以及Lewin， Genes V， Oxford University Press: New York, (1994)中找到。所用的DNA鹼基的命名 法是在37 CFR§ 1.822提出的。所用的胺基酸殘基命名法是標準的單 字母或三字母命名法。
"胺基酸替代"，"胺基酸變體"優選是在蛋白的任意位置將單 個胺基酸殘基替代為另一個胺基酸殘基。替代，缺失，插入或其任何 的聯合使用可以聯合起來以獲得最終的構建體。
本發明所用的"人工多核苷酸"是按照本發明的方法設計的DNA 序列，並且作為分離的DNA分子來製造以用於DNA構建體中來在宿主 細胞中表達蛋白，並且用於克隆到合適的構建體或對於本領域技術人 員所知的其它應用。為了這些目的可以使用的電腦程式包括但不局 限於University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, WI 53711, Genetics Computer Group ( GCG ) Inc.的Sequence Analysis Software Package中的"BestFit"或者"Gap"程序。該人工多核苷 酸可以通過本領域中已知的一種或更多的方法構建，這些方法包括但 不局限於重疊PCR。 本發明的人工多核苷酸與編碼相同或幾乎相同的 蛋白的其它的多核苷酸基本不同。
術語"嵌和的"是指融合的核酸或蛋白序列。嵌合的核酸編碼序 列是由兩個或更多的序列按照閱讀框架連接在一起組成的並且可以編 碼嵌合蛋白。嵌合基因是指來源於包括基因在內的異源來源的多遺傳 因子。
短語"編碼序列，，，"可讀框，，和"結構序列，，指連續有序的編碼蛋白，多肽或肽序列的核酸三聯體區域。
"密碼子"是指限定特定胺基酸的三個核苷酸的序列。 "密碼子使用"或"密碼子偏倚性"是指在生物編碼序列中編碼
胺基酸的密碼子使用的頻率。
"互補性"和"互補"當用於核酸序列的時候是指在相反的DNA 或RNA鏈上腺噤呤對胸腺嘧啶(在RNA中為尿嘧啶)和胞嘧啶對鳥嘌 呤的特異性的結合。
"構建體"是指彼此可操作地連接在一起組成重組的DNA分子的 異源遺傳因子並且可以包括提供DNA多核苷酸分子在宿主細胞中表達 的因子以及維持該構建體的因子。
"C-末端區域"是指從肽，多肽或蛋白鏈的中間到具有游離的羧 基的胺基酸的末端的區域。
用於此處的術語"不同"是指對於編碼相同或基本相同的蛋白或 多肽的多核苷酸分子的比較。四字母遺傳密碼(A，G，C和T/U)構成指 導t-RNA按照mRNA模板將胺基酸組裝成多肽的三字母密碼子。對於同 一個胺基酸具有不止一個密碼子被稱為簡併。簡併密碼子被用來構建 編碼相同多肽的基本不同的多核苷酸，其中這些分子具有完全長度的 核苷酸序列，在該序列中它們的相同性小於8 5 %並且沒有超過2 3個核 苷酸的核苷酸序列是相同的。
術語"編碼DM" 是指編碼此處討論的任何蛋白的染色體DNA， 質粒DNA， cDNA或人工DNA多核普酸。
術語"內源"是指從生物或細胞中獲得的材料。
"內切核酸酶"是指在內部水解雙鏈DNA的酶。
"外源的"是指從生物或細胞外獲得的材料。這一般是指用於產 生轉化或轉基因宿主細胞和植物的核酸分子。
"外顯子"是指實際翻譯成蛋白的基因部分，即編碼序列 術語"表達"是指多核苷酸的轉錄或翻譯產生相應的基因產物， RNA或蛋白。
"片段"。基因片段是全長多核酸分子的一部分，該部分的最小 長度需要能夠轉錄成RNA，翻譯成肽或作為探針或引物用於DNA檢測方 法中。
術語"基因"是指染色體MA，質粒DNA， cDNA，人工DNA多核苷酸或其它能夠編碼肽，多肽，蛋白或RNA分'子的DNA以及在編碼序列 側面參與表達調節的遺傳因子。
術語"基因組"當用於病毒時包括所有的包含在病毒殼體中的核 酸序列。術語"基因組"當用於細菌時包含細菌宿主細胞中的染色體 和質粒。因此本發明中導入細菌宿主細胞的編碼核酸序列可以是染色 體整合的或質粒定位的。術語"基因組"當用於植物細胞時不僅包括 在核內發現的染色體DNA也包括在細胞內亞細胞成分中發現的細胞器 DNA。因此本發明中導入植物細胞的核酸可以是染色體整合的或細胞器 定位的。
術語"草甘膦"是指N-膦醯曱基甘氨酸及其鹽，草甘膦是Roundup 除草劑(Monsanto Co.)的活性成分。除非額外提到，利用"草甘膦，， 處理植物是指利用1101111(1叩@或Roundup Ultra⑧除草劑製劑處理植物。 草甘膦作為N-膦醯甲基甘氨酸及其鹽(沒有被製備為Roundup^除草劑) 是用來選擇具有草甘膦耐受性的細菌和植物或用來進行體外生化分析 確定酶抗性的合成的培養基的成分。
"外源DNA"序列是指從外界來源或物種獲得的多核苷酸序列，或 如果從相同的來源獲得，也是對該多核苷酸的起初的形式進行修飾而 獲得。
"內源DM" 是指從與受體細胞相同來源獲得的DM。 "雜交"是指一條核酸鏈通過鹼基配對與互補的鏈結合。雜交是 當兩條核酸鏈上的互補序列彼此結合時發生的。本發明的核酸探針和 引物是在嚴格的條件下與目標DNA序列進行雜交的。任何常規的核酸 雜交或擴增方法都可以用來鑑定在樣品中來自轉基因事件的DNA的存 在。在一定的環境下核酸分子或其片段能夠特異地與另外核酸分子進 行雜交。如此處用到的，如果兩個核酸分子能夠形成反向平行的雙鏈 核酸結構那麼可以說這兩個分子能夠特異性地相互雜交。如果一個核 酸分子與另 一個核酸分子能夠展現完全的互補性那麼它們被稱為"互 補"。如在此處所用的，當其中一個分子的每一個核普酸都與另一個 分子的核苷酸互補的時候這兩個分子被稱為展現"完全互補性"。如 果兩個分子能夠彼此雜交並具有足夠的穩定性的時候這兩個分子被稱 為"最小互補，，，其中足夠的穩定性是指至少在常規的"低嚴格性，， 條件下能夠使它們相互退火。相似地，如果分子能夠彼此雜交並具有足夠的穩定性的時候這兩個分子被稱為"互補'，，其中足夠的穩定性 是指至少在常規的"高嚴格性，，條件下能夠使它們相互退火。常規的
嚴格條件如在Sambrook等1989，和Haymes等，In: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC(1985)所描迷的一樣，此處將這些參考文獻整體引入作為參考。因 此與完全互補有一定的偏離是允許的，只要這樣的偏離沒有使這些分 子完全喪失形成雙鏈結構的能力。為了使核酸分子作為引物或探針起 作用，它只要在序列上有足夠的互補性以便在所使用的特定溶劑和鹽 濃度的情況下能夠形成穩定的雙鏈結構即可。
如此處所用，基本同源的序列是能夠特異性雜交到該核酸序列的 互補序列的核酸序列，並且是在高嚴格的條件下進行比較的。術語"嚴 格條件"是關於在使用特異的雜交方法使核酸探針與目的核酸雜交 (即，對於特定的目標核酸序列)的功能性定義，其中特異的雜交方 法在Sambook等1989，在9. 52-9. 55中有所討論。也可見，Sambrook 等，1989在9. 47-9. 52， 9. 56-9. 58此處將該參考文獻整體引入作為參 考；Kanehisa， (Nucl. Acids Res. 12: 203-213, 1984，此處將該參 考文獻整體引入作為參考)以及Wetmur及Davidson, (J, Mol. Biol. 31: 349-370， 1988，此處將該參考文獻整體引入作為參考)。因 此本發明的核苷酸序列可以由於其選擇性的與互補的一段DNA片段形 成雙鏈體分子的能力而得到應用。根據設想的應用的不同，可能需要 使用不同的雜交條件來達到探針對於目的序列的不同程度的選擇性。 對於需要高選擇性的應用， 一般需要使用相對嚴格的條件來形成雜交 物，例如，將會選擇相對低鹽和/或高溫的條件，例如可使用大約0. 02M 到大約0. 15M NaCl在大約501C到大約70匸的溫度下。嚴格的條件， 例如，為用高嚴格性洗滌緩衝液(0. 2X SSC， 0.1%SDS， 65C)洗滌 雜交濾器至少兩次。合適的嚴格性條件將會促進DNA雜交，例如，6. 0X 氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)在大約451C的溫度下雜交，之後利用2. 0XSSC 在50X:洗，這些合適嚴格性的條件對於本領域技術人員來說是眾所周 知的或者可以在Current Protocols in Molecular Biology ， John Wiley & Sons ， N. Y. (1989) ， 6. 3. 1-6. 3. 6中發現。例如，洗滌步驟中 鹽的濃度可以從低嚴格性的大約2. OX SSC 50匸到高嚴格性的大約0. 2X SSC在50t:中選擇。另外，洗滌步驟中的溫度可以從低嚴格性條件的
18室溫，大約221C，升高到高嚴格性條件的夭約651C。溫度和鹽可以同 時變化或者溫度或鹽濃度之一可以保持為恆定值而另一個發生變化。 即便這樣的選擇條件可以耐受探針與模板或目的鏈之間的錯配也只能 耐受很少的錯配。通過雜交來檢測DNA序列對於本領域技術人員來說 是眾所周知的，並且美國專利號4, 965, 188和5, 176, 995中的教導是 雜交分析方法中的示例。
"同一性"是指兩個多核酸或蛋白序列間的相似性程度。可以通 過適當的電腦程式對於兩個序列進行比對。得到廣泛應用和接受的 進行序列比對的電腦程式是CLUSTALW vl.6 (Thompson等，Nucl. Acid Res. ， 22: 4673-4680， 1994 )。匹配的鹼基或胺基酸的數目用 鹼基或胺基酸的總數來除，並且乘以IOO來得到百分比同一性。例如， 如果兩個580個鹼基對的序列中有145個鹼基匹配，它們有25%的同一 性。如果比較的兩個序列的長度不同，匹配的數目用兩個序列中短的 序列的來除。例如，在200和400個胺基酸的兩個蛋白中，有100個 胺基酸是匹配的，考慮到較短的序列它們具有50%的同一性。如果較短 的序列的長度少於150個鹼基或50個胺基酸，匹配的數目用150 (對 於核酸鹼基來說)或50 (對於胺基酸來說)來除，並且乘以100來獲 得百分比同一性。
如此處所描述的一個蛋白可以與其它相關蛋白是"基本同一的"。 這些具有基本的同一性的蛋白通常包括至少一個多肽序列，該多肽序 列與其相關的其它多肽序列具有至少98%的序列同一性。Genetics Computer Group, Inc.的WISCONSIN PACKAGE中的Gap程序10. O-UNIX 版本是基於Needleman和Wunsch的方法的(J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970 )，該方法利用一系列默認的參數來進行逐對的比較 (對於胺基酸序列比較產生缺口的罰分=8，延伸缺口的罰分=20); 或利用在BLAST 2. 2. l軟體包中的TBLASTN程序(Altschul等，Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 )，利用BL0SUM62矩陣(Henikoff和 Henikoff， Proc. Natl. Acad. Sci攀U.S.A. 89: 10915-10919, 1992 ) 和一系列默認的參數來進行逐對的比較(產生缺口得分-ll，延伸缺 口得分=1)。在BLAST中，E值，或期望值，代表具有與原始序列比 對得分S相等或更好的得分的不同比對的數目，該不同比對預期在數 據庫搜索中偶然地發生。E值越低，匹配越顯著。因為資料庫的大小是E值計算的一個要素，所以從公用資料庫利用"BLASTing"得到的E 值對於任何給定的查詢查/登錄項的匹配通常會隨時間而增加，其中 公用資料庫如GenBank。百分比同一性是指在利用BLAST算法比對的部
分序列長度中存在的完全匹配的胺基酸殘基的百分比。
"內含子"是指基因中不翻譯成蛋白的部分，即使它轉錄成了 RM。 "分離的，，核酸序列是從自然存在核酸的生物的細胞中的通常與 該核酸序列結合在一起的其它的核酸序列中基本分離或純化出來的核 酸序列，這些結合在一起的核酸序列即，其它染色體或染色體外DNA。 該術語包括利用生化手段純化來基本去除核酸汙染和其它細胞成分得 到的核酸。該術語也包括重組的核酸和化學合成的核酸。
"分離的""純化的，，"均一的，，多肽。如果多肽是從自然狀態 下伴隨其存在的細胞成分(核酸，脂類，糖類和其它多肽)中分離出 來的或它是化學合成的或重組的那麼稱該多肽為"分離的"。當樣品 重量中的至少60%由多肽組成，優選的90%或更多，更優選的95%或 更多，最優選的超過99%的時候可稱該單體多肽是分離的。蛋白純度 或均一性利用以下手段來顯示，例如，利用蛋白樣品的聚丙烯醯胺凝 膠電泳，之後將聚丙烯醯胺凝膠染色使單一的多肽的帶可見；高壓液 相層析；或其它常規的方法。蛋白可以通過本領域中已知的任何的手 段來純化，例如在Guide to Protein Purification, ed. Deutscher， Meth. Enzymol. 185， Academic Press, San Diego， 1990;和Scopes, Protein Purification: Principles and Pract ice， Springer Verlag， New York, 1982中描述的。
"標記"或"標記的"。現在有很多種常規的方法和試劑可以標 記多核苷酸和多肽及其片段。 一般的標記包括放射性同位素，配體或 配體受體，螢光團，化學發光劑和酶。標記的方法以及針對於不同目 的來選擇合適的標記的指南已經有所討論，例如在Sambrook等， Molecular Clonging: A Laboratory Manual ， Cold Spring Harbor Press (1989 )和Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel 等，Greene Publ ishing and Wi ley-Interscience, New York, ( 1992 )中。
"成熟蛋白編碼區"，這個術語是指加工後的蛋白產物的序列， 即在葉綠體轉運肽被移除之後的成熟的EPSP合酶。"天然，，，該術語"天然"通常是指天然存在("野生型")的 多核酸或多肽。然而，在本發明的上下文中，可能對分離的多核苷酸 或多肽進行一些修飾來提供具有特定的表型的多肽，例如，在草甘膦
敏感的EPSPS上的胺基酸替代來提供草甘膦抗性的EPSPS。在本發明中 為了比較的目的，分離的含有為了提供除草劑抗性的胺基酸修飾而進 行少數核苷酸替代的多核苷酸當與利用本發明的方法生成的基本不同 的多核苷酸比較的時候被稱為"天然的"多核苷酸。然而，照這種方 式修飾的該"天然的"多核苷酸關於正常發現的連接到天然存在的非 修飾多核苷酸的遺傳因子而言是非天然的。
"N-末端區域"是指從肽，多肽或蛋白鏈的含有游離的氨基的氨 基酸到鏈中間的區域。
"核酸，，是指脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。 核酸符號A-腺嘌呤；C-胞嘧啶；G-鳥嘌呤；T-胸腺嘧啶。 合成寡核苷酸所使用的符號N-等摩爾的A，C，G和T;I-脫氧肌苷；K -等摩爾的G和T; R-等摩爾的A和G; S-等摩爾的C和G; W-等摩爾 的A和T; Y-等摩爾的C和T。
"核酸片段"或"核酸分子片段"是從特定的物種的全基因組DM 中分離的核酸分子或合成的核酸分子。"核酸片段"術語包括DNA片 段，重組載體，質粒，粘粒，噬菌粒、噬菌體，病毒等等。
"核苷酸序列變體，，，技術人員可以利用熟知的方法方便地分別 製備基因和蛋白的核苷酸和胺基酸序列的變體。例如，本發明的"變 體"DNA分子是含有在EPSPS基因序列中的改變的DNA分子，這種改變 即包括EPSPS基因序列中的一個或更多的核苦酸被缺失，添加和/或 替代的改變，這樣EPSPS基因變體能夠編碼保留EPSPS活性的蛋白。 變體DNA分子可以通過，例如，標準的DM突變發生技術或化學合成 變體DNA分子或其一部分得到。化學合成核酸的方法已經有所討論， 例如，在Beaucage等，Tetra. Letts. 22: 1859 - 1862 ( 1981 )，和 Matteucci等，J. Am. Chem. Soc. 103: 3185 - ( 1981 )。化學合成 核酸可以通過，例如，自動寡聚核普酸合成儀來進行。這樣的變體優 選地不改變核酸蛋白編碼區的閱讀框並且優選地編碼的蛋白沒有改 變，或者只有少量的減少。
"可讀框(ORF )" 是指DNA或RNA編碼肽，多肽或蛋白的區域。"可搮作連接的"。當第一個核酸序列被以能起作用的關係連接 在第二個核苷酸序列時稱第一個核苷酸序列被"可操作地"連接到第
二個核苦酸序列。例如，如果一個啟動子能夠實現編碼序列的轉錄或 表達那麼該啟動子被可操作地連接到蛋白編碼序列上。通常，可操作
地連接的DM序列是連續的並且當需要的時候以同一閱讀框連接兩個 蛋白編碼區。
"超表達"是指表達由導入宿主細胞的DNA編碼的RNA或多肽或 蛋白，其中該RNA或多肽或蛋白是在宿主細胞中正常不存在的或者其 中該RNA或多肽或蛋白在該宿主細胞中存在的水平比由編碼該RNA或 多肽或蛋白的內源基因正常表達的水平要高。
術語"植物，，包括任何高等植物及其後代，包括單子葉植物(例 如，玉米，水稻，小麥，大麥等等)，雙子葉植物(例如，大豆，棉 花，canola，西紅柿，馬鈴薯，擬南芥屬，菸草等等)，棵子植物(松 樹，杉樹，雪松等等)並且包括植物的一部分，包括植物的繁殖單元 (例如，種子，鱗莖，塊莖，果實，花等等)或植物能夠繁殖的其它 部分或糹且織。
"植物表達盒，，是指包含可操作連接的用以提供在植物中轉基因
產物的表達的調節元件的嵌合DNA片段。
"質粒"是指環狀的，染色體外的，自我複製的DNA片段。 "多腺普酸化信號"或"polyA信號"是指定位在編碼區3'端
的能夠引起腺苷酸核苷酸加入到從編碼區轉錄得到的mRM的3，端的
核酸序列。
"聚合酶鏈反應(PCR)" 是指利用酶學技術來產生一個核酸序 列(擴增子)的多拷貝的DNA擴增的方法。DNA分子的拷貝是通過在兩 個擴增引物之間穿梭DNA聚合酶來獲得的。這種擴增方法的基礎是利 用溫度變化的多次循環，以用來變性然後重新退火擴增引物(DNA引物 分子)，然後延伸來合成位於兩側擴增引物之間的新的DNA鏈。核酸 擴增可以通過本領域中所知的任何的核苷酸擴增方法來完成，包括聚 合酶鏈反應(PCR)。本領域中所知的各種擴增方法特別在美國專利號 4， 683， 195和4， 683， 202和PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, ed. Innis等,Academic Press, San Diego， 1990中 有所描述。PCR擴增方法已經被發展可以用來擴增一直到22kb的基因組醒和一直到42kb的嗜菌體DNA( Cheng等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5695-5699， 1994 )。這些方法與本領域中已知的DM擴增的 其他方法都可以被用於本發明的實踐之中。
多核苷酸是指脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)分子的長 度大於二，它們被連接起來形成更大的分子。
多肽片段。本發明也包含缺少天然的全長蛋白的至少一個殘基但 基本保持蛋白活性的蛋白片段。
術語"啟動子"或"啟動子區域"是指一種多核酸分子，該分子 作為調節元件起作用，通常在編碼序列的上遊(5，)出現，通過提供 RNA聚合酶和/或其它轉錄在正確位點起始必須因子的識別位點來控 制信使RNA (mRNA)的合成進而控制編碼序列的表達。作為此處所預期 的，啟動子或啟動子區域包括通過連接各種調節序列的方法，隨機或 定向突變發生的方法和加入或重複增強子序列的方法獲得的啟動子的 變體。此處公開的啟動子區域和其生物學功能等價物在作為合適的重 組載體的一部分導入到宿主中時負責驅使編碼序列在其控制下轉錄， 如由其產生mRNA的能力所證實的。
"重組"。"重組"的核酸是通過將兩個本來分離的序列片段結 合在一起來獲得的，例如，通過化學合成，或者通過基因工程技術來 處理分離的核酸片段。
術語"重組DM構建體"或"重組栽體"是指任何製劑例如質粒， 粘粒，病毒，自主複製序列，噬菌體，或線狀或環狀的單鏈或雙鏈DNA 或RM核苷酸序列，該製劑源自任何來源，能夠進行基因組整合或自 主複製，包含一個或多個DNA序列已以功能性操作方式連接的DM分 子。這樣的重組DM構建體或載體能夠將5，調節序列或啟動子區域和 選擇的基因產物的DNA序列以這樣的方式引入細胞，從而該DNA序列 轉錄成一個功能性的mRNA並且被翻譯和因此得到表達。重組的DNA構 建體或重組載體可以被構建以便表達反義RMs來抑制特異的目標RNA 的翻譯。
"再生"是指從一個植物細胞(例如植物原生質體或外植體)長 成一個植物的過程。
"報告基因，，是指當在轉基因生物中表達的時候能夠產生可以利因產物。
"抗性"是指在毒素存在的時候能夠起作用的酶，例如，草甘膦
抗性II類EPSP合酶。 一種具有對於一種毒素抗性的酶具有使毒素解 毒的功能，例如，膦絲菌素乙醯轉移酶，草甘膦氧化還原酶，或者是 具有催化活性的突變的酶，該催化活性不受在野生型酶中破壞相同活 性的除草劑的影響，例如乙醯乳酸合酶，突變的I類EPSP合酶.
"限制酶"是指識別雙鏈DM上特殊回文核苷酸序列並剪切兩條 鏈的酶；也可以稱為限制性內切核酸酶。剪切一般發生在限制位點內。
"選擇性標記"是指編碼一種蛋白的多核酸分子，該種蛋白使得
具有該多核酸分子的細胞具有能夠方便鑑定的表型。選擇性標記包括 提供抗生素(例如，氨千青黴素，卡那黴素)抗性的，補充營養缺陷 的(例如，尿嘧啶，組氨酸，亮氨酸)，或者給於可見區別性特性的 (例如顏色變化或者螢光)基因。有用的顯性的選擇性標記基因包括 那些能夠編碼抗生素抗性基因(例如，新黴素磷酸轉移酶，aad);和 除草劑抗性基因(例如，膦絲菌素乙醯轉移酶，II類EPSP合酶，修飾 的I類EPSP合酶)的基因。可用的選擇除草劑抗性轉化體的策略已經 有所描述，例如在，Vasil， Cel 1 Culture and Somatic Cel 1 Genetics of Plants, Vols. I-III， Laboratory Procedures and Their Applications Academic Press, New York(1984)。
術語"對於(目的序列)…特異的"指DNA探針或DM引物在給 定的雜交條件下在含有目的序列的樣品中只與目的序列雜交。
術語"基本純化的，，，在此處是指將一個分子從天然狀態下與該 分子正常結合在一起的其它分子中分離出來。更優選地，基本純化的 分子在製劑中佔主要的部分。基本純化的分子可以是在自然的混合物 中大於60%,優選地75%,更加優選地90%地不含其它分子(除溶劑 之外)。術語"基本純化"不包含處於其天然狀態的分子。
"耐受的"或"耐受性"是指降低生物或非生物製劑對於生物和 植物成長和發育過程中的影響，該製劑例如害蟲或除草劑。
"轉錄，，是指從DM模板產生RNA拷貝的過程。
"轉化"是指將外源多核酸分子(如DNA構建體、重組多核酸分 子)導入細胞或原生質體的過程並且該外源多核酸分子被整合到染色 體中或者能夠自主複製。"轉化的"或"轉基因的"是指外源多核酸進入的細胞，組織，
器官或生物，這樣的外源多核酸例如DNA載體或重組多核酸分子。"轉 基因的"或"轉化的"細胞或生物也包括該細胞或該生物的後代以及
從育種程序得到的後代，該育種程序在雜交中使用這樣的"轉基因" 植物作為親本並且能表現由於該外來多核酸分子的存在而變化的表型。
術語"轉基因"是指轉化入細胞或生物的對於該細胞或生物非天 然的任何多核酸分子。"轉基因"也包括通過定向重組或位點特異性 突變將非天然的多核酸分子插入而修飾的天然植物基因中的組分。
"轉運肽"或"引導肽"分子，這些術語通常是指當將其連接到 目標蛋白的時候能夠指導該蛋白進入到特定的組織，細胞，亞細胞定 位，或細胞器中的肽分子。例子包括，葉綠體轉運肽，核導向信號和 液泡信號，但不局限於此。葉綠體轉運肽在本發明中具有能指導EPSPS 酶在葉綠體內表達的特定用途。
術語"翻譯"是指從mRM產生相應的基因產物，即，肽，多肽或 蛋白。
"載體"是指運栽外來DNA進入宿主生物的質粒，粘粒，噬菌體 或病毒。
多核苷酸
本發明的方法包括設計能夠為植物提供目標性狀的基因，其中該 植物是導入該基因的植物。農業上的目標轉基因能為農作物提供農業 上有益的性狀，例如包括包含除草劑抗性(美國專利號.5， 633， 435;美 國專利號.5， 463, 175 )，增加的產量(美國專利號.5, 716, 837 )，昆 蟲控制(美國專利號.6， 063, 597;美國專利號.6， 063， 756;美國專利 號.6， 093， 695;美國專利號.5， 942， 664;美國專利號.6， 110， 464 ), 真菌疾病抗性(美國專利號.5,516,671;美國專利號.5， 773， 696;美 國專利號.6， 121， 436; 美國專利號.6， 316， 407和美國專利 號.6, 506， 962 )，病毒抗性(美國專利號.5, 304, 730和美國專利 號.6， 013， 864 )，線蟲抗性(美國專利號.6, 228， 992)，細菌疾病抗性 (美國專利號.5，516，671)，澱粉產量(美國專利號.5， 750， 876和美 國專利號.6， 476, 295 )，修飾油產量(美國專利號.6， 444， 876 ),高 的油產量(美國專利號.5， 608，149和美國專利號.6， 476， 295 ) ， ^修飾脂肪酸含量(美國專利號.6, 537， 750 )，高蛋白產量(美國專利 號.6， 380, 466 )，果實成熟(美國專利號.5,512， 466 ),增加的動物 和人營養(美國專利號.5， 985， 605和美國專利號.6，171，640 )，生物 聚合體(美國專利號.5， 958， 745和美國專利
發明者S·弗拉辛斯基 申請人:孟山都技術有限公司