高效液相色譜法測定複合維B+雙氯芬酸鈉片中維生素B₁₂含量的方法

2023-04-23 07:16:51 1

專利名稱：高效液相色譜法測定複合維B+雙氯芬酸鈉片中維生素B12含量的方法
技術領域：
本發明涉及藥物含量測定領域，具體涉及一種高效液相色譜法測定複合維B+雙氯芬酸鈉片中維生素B12含量的方法。
背景技術：
複合維B+雙氯芬酸鈉片產品為外貿出口品種，主要市場在非洲大陸奈及利亞等國家，在當地是一國際名牌產品，每年銷量5000萬片以上，價格上有強勁優勢。但由於該產品在國內外均沒有現成的法定檢驗標準，按照外國公司提供的內部標準檢驗只能檢出維生素&與維生素 及雙氯芬酸鈉的含量，維生素B12的含量沒有方法檢測和做鑑別的要求。由於沒有方法檢驗出複合維B+雙氯芬酸鈉片中維生素B12的含量，本申請人曾發生過出口產品被奈及利亞國家海關扣封的事件。於是，本申請人痛定思痛，決定對該產品檢驗技術進行技術攻關，填補該標準上維生素B12檢驗的空白。本處方製劑最主要的難點是維生素B12在處方中用量極少(50 μ g/510mg)，理論上僅有可能做色譜鑑別或者理化辨別。維生素B12及其製劑在CP2005、BP2009、USP31中均收載有檢驗方法，但均是以單方和規格量較大形式建立的法定標準，且最小單元重量合理，便於檢驗上樣品純化處理，檢驗方法相對成熟。上述標準中的方法經過試驗結果不好，一是量小檢不出，如果加大稱樣量，樣品溶液非常難純化處理，不符合微量分析思維邏輯；二是雖然客服了操作方法純化處理好樣品溶液，但維生素仏與維生素 及雙氯芬酸鈉有幹擾峰出現，無法給維生素B1定位和計算含量。試驗成功希望渺小。花高價請上級部門藥檢所和國外藥檢實驗機構做維生素B12鑑別或含量，均檢測不出維生素B12。

發明內容
本發明的目的在於，提出一種高效液相色譜法測定複合維B+雙氯芬酸鈉片中維生素B12含量的方法，以準確可靠地測定複合維B+雙氯芬酸鈉片中維生素B12的含量。為了實現上述目的，本發明提出的高效液相色譜法測定複合維B+雙氯芬酸鈉片中維生素B12含量的方法包括(1)在避光條件下往維生素B12對照品中加流動相溶解製備對照品溶液(2)在避光條件下將複合維B+雙氯芬酸鈉片樣品除去包衣，研細後加入流動相併用超聲波溶解，搖勻後離心沉澱，取上清液，稱定重量，加熱煮沸後放冷，再滴加流動相至煮沸前的重量，搖勻，過濾，製得供試品溶液(3)色譜條件色譜柱選用十八烷基矽烷鍵合矽膠柱；以甲醇和0.05moL/L磷酸二氫鉀溶液體積比為22 78作為流動相，磷酸二氫鉀溶液的PH值為6.4 ；柱溫為:35°C;
檢測波長為36 Inm;流速為 1. OmL/min ；進樣量為20 μ L。本發明方法對複合維B+雙氯芬酸鈉片中維生素B12含量的測定結果準確、可靠，方法簡便、科學，試驗時間短，無幹擾峰，分離度、拖尾因子、不對稱度均符合中國藥典求，檢測結果良好。
具體實施例方式1.儀器與試藥採用LC-lOATvp日本島津高效液相色譜儀，SPD-lOAvp紫外檢測器，美國製造P/ N(7725i)手動進樣器，浙江大學N-2000數據工作站，柱溫箱，電子天平為十萬分之一分析天平，DD80型超聲脫氣機，800型離心機。維生素^2對照品從中國藥物生物製品檢定所購買(批號100248-200802，供HPLC法含量測定，含量95.5% )，複合維B+雙氯芬酸鈉片樣品自產(批號為091011)，甲醇為一級色譜純(產地天津四友精細化學品有限公司出品)， 水為雙蒸餾水(自製)，其他試劑為分析級試劑。2.色譜條件色譜柱選用十八烷基矽烷鍵合矽膠柱，尺寸為4. 60mmX 250mm，填料為Hypersil 0DS2，填料的粒徑為5 μ m。以甲醇和0. 05moL/L磷酸二氫鉀溶液體積比為22 78作為流動相，用10%磷酸溶液或者2moL/L氫氧化鉀溶液把磷酸二氫鉀溶液的PH調為6. 4，流動相使用前先用超聲脫氣機超聲脫氣處理30分鐘，以去除流動相中的氣泡，柱溫為35°C，紫外檢測器的檢測波長為361nm，流速為1. OmL/min，進樣量為20 μ L。對於流動相的選擇，進行了幾次摸索試驗，先以甲醇和0. 028mol/L磷酸氫二鈉溶液的體積比為26 74作為流動相，用磷酸把磷酸氫二鈉溶液的PH值調為3. 5，維生素B12 的出峰時間提前在10分鐘左右，而且不能和同類水溶性維生素B1與 有效分離開，結果不是很理想。後選擇以甲醇和0. 05mol/L磷酸氫二鉀溶液的體積比為35 65作為流動相， 用10%磷酸溶液或2mol/L氫氧化鉀溶液把磷酸氫二鉀溶液的PH值調為6. 4，維生素B12的出峰時間仍在前面，有類似幹擾。最後再把流動相中甲醇和0.05mol/L磷酸氫二鉀溶液的體積比調為22 78，用10%磷酸溶液或2mol/L氫氧化鉀溶液把磷酸氫二鉀溶液的PH值調為6. 4，能夠有效分開幹擾峰，試驗結果滿意。對於紫外檢測器的檢測波長選擇，用線性項下3mL置20mL量瓶中的溶液用紫外分光光度計在200-400nm波長段掃描，發現在361nm波長處均有最大的吸收值，故選擇該波長為檢測波長。3.樣品含量測定對照品溶液的製備精密稱取維生素B12對照品2. 5mg置IOOmL量瓶中，加流動相溶解並稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為25 μ g/mL的對照品溶液。供試品溶液的製備取複合維B+雙氯芬酸鈉片樣品20片除去包衣，研細，精密稱取細粉5. 0849g置50mL量瓶中，精密加20mL流動相用超聲波溶解，搖勻後用離心機離心沉澱，取上清液置50mL乾燥燒杯中，稱定重量，加熱煮沸後放冷，再滴加流動相至煮沸前的重量，搖勻，過濾，即得供試品溶液。
對照品溶液和供試品溶液均在避光條件下製備。在上述色譜條件下，取對照品溶液和供試品溶液各20 μ L，注入高效液相色譜儀， 記錄色譜圖，再經分析計算得出維生素A2的含量，結果測得複合維B+雙氯芬酸鈉片樣品中的維生素B12含量95. 49%。本方法測定複合維B+雙氯芬酸鈉片樣品中的維生素B12含量方法簡單且科學，含量測定準確可靠。4.專屬性試驗對照品溶液的製備精密稱取維生素B12對照品2. 5mg置IOOmL量瓶中，加流動相溶解並稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為25 μ g/mL的對照品溶液。供試品溶液的製備取複合維B+雙氯芬酸鈉片樣品20片除去包衣，研細，精密稱取細粉5. OOOg (相當於B12O. 5mg)置50mL量瓶中，精密加20mL流動相用超聲波溶解，搖勻後用離心機離心沉澱，取上清液置50mL乾燥燒杯中，稱重，加熱煮沸後放冷，再滴加流動相至煮沸前的重量，搖勻，過濾，即得濃度為25 μ g/mL的供試品溶液。對照品溶液和供試品溶液均在避光條件下製備。按複合維B+雙氯芬酸鈉片處方製得不含維生素B12的陰性樣品顆粒，按上述供試品溶液的製備方法製成空白樣品溶液，按上述色譜條件，精密吸取對照品溶液、供試品溶液及空白樣品溶液各20 μ L，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，結果表明空白樣品溶液不幹擾供試品的含量測定。5.線性考察儲備溶液的製備精密稱取維生素B12對照品7. 5mg置IOOmL量瓶中，加流動相溶解並稀釋至刻度，搖勻，得到儲備溶液。避光操作製備儲備溶液。分別精密吸取儲備溶液0. 5mL、l. OmL,3. OmL,5. OmL,7. OmL,9. OmL 置 20mL 量瓶中，
加流動相至刻度搖勻，得到各濃度溶液。分別精密吸取20 μ L，注入高效液相色譜儀，測定。 每一濃度溶液分別各進樣二次，求峰面積平均值，再以系列峰面積進行線性考察。以維生素 B12的濃度C(mg/mL)為橫坐標，峰面積Y為縱坐標進行線性回歸，結果表明維生素B12進樣量在1. 875 33. 75 μ g範圍內呈現良線性關係，回歸方程為Y = 20M04X-99700，相關係數 r = 0. 9994。6.檢測限及最低檢測濃度精密吸取線性關係試驗項下0. 5mL置20mL量瓶中的溶液lmL，置IOmL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，為樣品溶液，進樣量為20 μ L。當峰信號噪音與基線噪音比約為 3 1時得最小檢測濃度為0. 1875 μ g/mL，最小檢測量為3. 75ng。7.精密度試驗(避光操作)以線性關係項下7. OmL到20mL量瓶中的溶液為樣品溶液，連續進樣6次，求取峰值面積，計算RSD = 0.57% (n = 6)，表明該方法精密度良好。8.重現性試驗(避光操作)對照品溶液的製備精密稱取維生素B12對照品2. 5mg置IOOmL量瓶中，加流動相溶解並稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。供試品溶液的製備取複合維B+雙氯芬酸鈉片樣品20片除去包衣，研細，精密稱取細粉5. OOOg (相當於B12O. 5mg)置50mL量瓶中，精密加20mL流動相用超聲波溶解，搖勻後用離心機離心沉澱，取上清液置50mL乾燥燒杯中，稱重，加熱煮沸後放冷，再滴加流動相至煮沸前的重量，搖勻，過濾，即得供試品溶液。取對照品溶液和供試品溶液，按色譜條件各進樣20 μ L，測定維生素B12的含量， RSD = 0. 9% (n = 5)。表明本發明方法測定維生素B12的含量能達到真實、準確的分析要求。9.穩定性試驗(避光操作)對照品溶液的製備精密稱取維生素B12對照品2. 5mg置IOOmL量瓶中，加流動相溶解並稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。供試品溶液的製備取複合維B+雙氯芬酸鈉片樣品20片除去包衣，研細，精密稱取細粉5. OOOg (相當於B12O. 5mg)置50mL量瓶中，精密加20mL流動相用超聲波溶解，搖勻後用離心機離心沉澱，取上清液置50mL乾燥燒杯中，稱重，加熱煮沸後放冷，再滴加流動相至煮沸前的重量，搖勻，過濾，即得供試品溶液。取照品溶液和供試品溶液，按色譜條件項下方法操作，每隔池進樣檢測，分別求取面積值，RSD為1. 3% (n = 5)。表明供試品溶液在他內穩定性良好。10.回收率試驗精密稱取維生素B12對照品6份，分別精密加入一定量處方中混合均勻的空白輔料顆粒，按含量方法測定，按外表一法計算回收率。結果表明維生素B12回收率平均為 99. 80%，RSD為1.84%，回收率良好。結果如表1所示。表1回收率試驗結果(n = 6)
權利要求
1.高效液相色譜法測定複合維B+雙氯芬酸鈉片中維生素B12含量的方法，包括(1)在避光條件下往維生素B12對照品中加流動相溶解製備對照品溶液(2)在避光條件下將複合維B+雙氯芬酸鈉片樣品除去包衣，研細後加入流動相併用超聲波溶解，搖勻後離心沉澱，取上清液，稱定重量，加熱煮沸後放冷，再滴加流動相至煮沸前的重量，搖勻，過濾，製得供試品溶液(3)色譜條件色譜柱選用十八烷基矽烷鍵合矽膠柱；以甲醇和0. 05moL/L磷酸二氫鉀溶液體積比為22 78作為流動相，磷酸二氫鉀溶液的PH值為6. 4 ；柱溫為:35°C ；檢測波長為36 Inm ；流速為 1. OmL/min ；進樣量為20 μ L。
2.根據權利要求1所述的高效液相色譜法測定複合維B+雙氯芬酸鈉片中維生素B12含量的方法，其特徵在於，用10%磷酸溶液或者2moL/L氫氧化鉀溶液調節磷酸二氫鉀溶液的 PH值。
3.根據權利要求2所述的高效液相色譜法測定複合維B+雙氯芬酸鈉片中維生素B12含量的方法，其特徵在於，所述色譜柱的尺寸為4. 60mmX 250mm,填料粒徑為5 μ m。
4.根據權利要求3所述的高效液相色譜法測定複合維B+雙氯芬酸鈉片中維生素B12含量的方法，其特徵在於，所述流動相在使用前先超聲脫氣處理。
5.根據權利要求4所述的高效液相色譜法測定複合維B+雙氯芬酸鈉片中維生素B12含量的方法，其特徵在於，所述水為雙蒸餾水。
全文摘要
本發明涉及一種高效液相色譜法測定複合維B+雙氯芬酸鈉片中維生素B12含量的方法，包括(1)在避光條件下製備對照品溶液(2)在避光條件下將複合維B+雙氯芬酸鈉片樣品除去包衣，研細後加入流動相併用超聲波溶解，搖勻後離心沉澱，取上清液，稱定重量，加熱煮沸後放冷，再滴加流動相至煮沸前的重量，搖勻，過濾，製得供試品溶液(3)色譜條件色譜柱選用十八烷基矽烷鍵合矽膠柱；以甲醇和0.05mol/l磷酸二氫鉀溶液體積比為22∶78作為流動相，磷酸二氫鉀溶液的pH值為6.4；柱溫為35℃；檢測波長為361nm；流速為1.0ml/min；進樣量為20μl。本發明測定結果準確、可靠，方法簡便、科學，符合中國藥典求，檢測結果良好。
文檔編號G01N30/36GK102226795SQ201110082370
公開日2011年10月26日 申請日期2011年3月31日 優先權日2011年3月31日
發明者孫偉東, 艾建高 申請人:寧波雙偉製藥有限公司