殺死不想要的靶細胞的方法

2023-09-16 17:14:55

專利名稱：殺死不想要的靶細胞的方法
技術領域：
本發明涉及從一個細胞群體中有選擇性地清除靶細胞的方法，該方法通過將此細胞群體暴露於兩種或多種免疫毒素的組合中而得以實現。
所謂的自體幹細胞移植物包括來自癌症患者血液或骨髓的分離細胞，分離的細胞經過預處理，再回輸進病人的血液中，細胞是從該病人的血液中收穫的。很快或經過一段較長的時間之後，病人就包含有足夠數量的未成熟前體血液和免疫細胞以重建無功能性骨髓的功能。
用抗體淨化自體造血移植物在本領域中是已知的，此時移植物代表的是未篩選的骨髓樣品。這樣的淨化方法由Myklebust,A T.,Godal,A.,Juell,S.和Fodstad,φ.等發表，「從人骨髓細胞中清除乳腺癌細胞的兩種基於抗體的方法的比較」。《癌症研究》(USA)1994,54/1(209-214),以及Myklebust,A.T.,Godal,A.,Pharo,A.,Jerll,S.和Fodstad,φ。「用免疫毒素從人骨髓中清除小細胞肺癌細胞」，《癌症研究》(USA)1993,53(16),3784-88。在兩篇文章中都用到免疫毒素，即抗體連接到一種毒素上。原則是在將細胞懸浮液重新注射給病人之前殺滅收穫的骨髓細胞中的惡變細胞。
近年來正是在改進的方法中此原則事實上正好相反。人們試圖用所謂的幹細胞移植充滿自信地從血液或骨髓中篩選一個正常的細胞亞群，當此細胞重注入病人之後，它們能恢復正常骨髓的功能。這些「幹細胞」由血細胞和免疫細胞的最不成熟的前體以及更進一步分化細胞的混合物組成。收穫這些細胞可通過所謂的外周血的單採血液成分術(apharesis)來實現，此過程要一到幾天，或通過本領域中技術人員知道的不同的技術從血或骨髓中免疫吸收/篩選CD34+細胞(未成熟先祖細胞)。
Stray,K.M.等，「用親和素、生物素、免疫吸收從骨髓或外周血中清除癌細胞」見P.G.Adrian,G.Samuel和A.w-w.Diana(編)，《骨髓淨化和處理方法進展》97～103頁，Orlando:Willelis Inc.,1994，描述了從外因血中淨化骨髓細胞或單採血液成分術產物。此過程是為了清除病人體內的淋巴瘤以及病人體內的乳腺癌。此方法包括在純化B細胞或乳腺癌細胞之前用一個所謂的親和柱對CD34+細胞進行富集。此處的淨化是間接進行的，細胞懸液起初與結合乳腺癌細胞的初級抗體共孵育，細胞懸液經過清洗，再一次和結合初級抗體的抗體共孵育。此鼠抗體是生物素標記的，即連接到一個分子上，該分子與親和素結合力很強。當此細胞懸液最終裝柱，柱中是結合了親和素的小珠，通過初級的生物素標記抗體和二級的抗體親和素反應造成的細胞間結合，則腫瘤細胞就將被捕獲。用此系統淨化的結果至多可以使惡變細胞下降3.2個對數值(3.2log)。此原理非常費時而且麻煩，因為細胞懸液在此柱之前必須經過幾步處理，包括與抗體共孵育及兩次清洗。這樣，很難避免對幹細胞的損害，柱子對幹細胞也可能有非特異性的捕獲，導致對恢復正常的骨髓功能來說至關重要的細胞的不幸丟失。
Tyer,C.L.等，「用免疫磁學技術可以從外周血先祖細胞中有效清除乳腺癌細胞」。國際血液治療和移植工程學會第一次會議摘要，Orlando FL,1993，描述了一種免疫磁學方法類似於上述Myklebust等的發表物中所用的方法。然則此方法是用於外周血細胞。其原理也完全不同於應用免疫毒素，模型試驗中惡變細胞淨化效率在3.3到4.8個對數單位中間變動。摘要中沒有提到此間接系統—用初級抗體孵育，接著洗滌，又與連接有結合初級抗體的抗體的小珠共孵育—的任何其他用途，但這是一個值得進一步推敲的設想。此過程包含額外的可能是對正常細胞有害的處理，而且有時間要求。其效率有限而且摘要中未提及任何關於清除CD34+細胞種群的內容，但在此方法中CD34+細胞種群將是一個主要問題，因為篩選CD34+細胞是費時費力的。這樣，在多數情況下免疫磁學原理是用於CD34+細胞本身篩選，在本例中隨後有一或兩個免疫磁學步驟用於淨化之目的。因此，如果一個方法需要持續長的過程，費用又高，則會有相當大的風險導致細胞破壞和細胞丟失。
對分離用於移植的幹細胞而言，主要目標之一是，將要用於再注入病人的細胞需按以下方法進行選擇性分離，分離的途徑即是要保證移植物中不含有任何惡變細胞。現有技術最近表明這樣製備的幹細胞在所控測的例數中相當多的時候出人意外地包含有惡變細胞。迄今為止，選擇性地除去或殺死這些移植物中的惡變細胞，這樣的嘗試還非常有限。這要部分歸因於本領域的技術人員沒有看到其必要性，也因為期望現實中已知的方法不是特異性的，如此也就能夠殺滅或除去脆弱的幹細胞。而且，病人提供骨髓或活化的外周血不是簡單的和不受限制的，這樣一個淨化幹細胞移植物的方法必須在很短的時間內完成，而且不能複雜化，為的是避免對正常細胞can的丟失和破壞。這樣，如上所述，用幹細胞移植物的原因由部分是移植物應該完全沒有癌細胞，部分是骨髓功能的重建要比用未篩選骨髓進行移植者快。結論是絕對有必要發明一種方法，它可以使易損壞的正常幹細胞保持完整，且在實際中可以和幹細胞分離程序聯合實施。
本發明的目標因而是提供一種方法以淨化幹細胞移植物，且不包含上述的缺點。
這些目標在以所包括的權利要求為特徵的本發明中都達到了。
本發明涉及從實體瘤病例收穫的幹細胞群體的淨化，該方法中細胞群體暴露於兩種或多種連接到細菌毒素的抗體的組合物中。所用的抗體都指向靶細胞相關抗原。
下邊將用一個例子更詳細地描述本發明，即淨化從外周血中收穫的幹細胞移植物，除去其中的乳腺癌細胞。
收穫細胞的已知技術包括從血或骨髓中免疫吸收/篩選外周血幹細胞(PBSC)或CD-34+細胞。然而，尚未知無害和足夠有效的技術以清除這些細胞群中的腫瘤細胞。顯然甚至在這些未成熟細胞中也有惡變細胞，按照以前的知識這些惡變細胞不應有CD34受體。重要的是，本發明如下的敘述將會令人驚奇地將癌細胞也清除掉而不對正常前體產生毒性。
在從外周血中收穫幹細胞移植體之前，必須用本領域中已知的方法以化學治療或生長素處理而從骨髓中活化幹細胞。幹細胞的收穫可以按照一種或多種方法進行，根據需要什麼種類的細胞而定。外周血幹細胞用一種方法收集。其執行可安排病人在接受高劑量的化療和全身放療之後給予G-CSF(10μg/kg/d)在第10天和11天耐受白細胞提取。血流率可用CS-300加血細胞分離器固定在例如70ml/min(BaxterHealthcare Corporation,Fenwal Division,Deerfield,IL,USA)。此過程中處理到一個二腔中心靜脈導管中的平均血容可以是10升左右，持續21/2小時。可以收集50ml PBSC，用磷酸鈉緩衝液(PBS)、1％人血清白蛋白(HSA)在一個Processor 2991管中洗滌以除去血小板。用在本發明中，細胞濃度(2～4×1010/單採血液成分)可調至1×108/ml以用免疫毒素進行陰性篩選(淨化)。
如果需要CD-34+細胞，可用ISOLEX 50或ISOLEX 300(Baxter)進行陽性篩選來獲得。在此方法中，來自單採血液成分術或骨髓的產物，約4×1010～6×1010個細胞，可以混和在一起，與抗-CD34+-單克隆抗體9C5共孵育，條件是在溫和震蕩器上於4℃作用30min，抗體的量是0.5μg/1×106細胞。經處理的細胞用含1％HSA的PBS在CobeProcessor上洗滌以除去未結合抗體。DYNAL珠M-450被加到CD34+部分，比例是0.5個小珠對1個有核細胞，4℃作用30分鐘。從非靶細胞磁力分離玫瑰花形聚集物，可用含1％HSA的PBS洗2～3次以除去未結合細胞。然後，為使CD34+細胞從Dynal小珠上釋放，可加進例如ChymoCell-R(木瓜凝乳蛋白酶)達終濃度200 pKat/ml室溫作用15分鐘。這樣，CD34+細胞可通過用含5％檸檬酸鈉的PBS洗滌而收集。其他篩選幹細胞/早期前體細胞的程序也是已知的。
多個抗體與乳腺癌細胞系及腫瘤物質的結合曲線已經其他作者調查出來，部分得到我們驗證。那些和很大比率乳腺癌細胞相結合卻不和血及骨髓中重要的未成熟正常細胞結合的抗體，和假單胞外毒素A(PE)相連，其殺死培養的乳腺癌細胞的能力。主要在集落產生分析中得到了檢驗。基於那些抗體的結合曲線，本發明人生產了所有5種不同的免疫毒素1．MOC31-PE此結合物與所有乳腺癌細胞中一個很高百分比的部分相結合，在模型試驗中非常有效，在實際作用濃度下對正常的造血先祖細胞只有邊緣毒性。
2．NrLu10-PE結合如上的抗原，也結合其他的表位。活性稍稍低於MOC31-PE。
3．BM7-PE結合主要發現於乳腺癌細胞中的粘蛋白抗原的蛋白部分。此抗原存在於很高百分比的乳腺癌細胞中，但不是全部都有。此免疫毒素對癌細胞顯示高特異性，但不像前兩個免疫毒素一樣有效。
4．BM2-PE結合BM7-PE相同抗原的含糖表位。此免疫毒素顯示與BM7-PE大抵相同的效應，對正常細胞毒性很低。
5．MLuCl-PE結合一個完全不同的抗原，即Lewisy-抗原。此免疫毒素較前一個活性輕微降低，對正常細胞也顯示中等毒性。
根據1,2,5所說的免疫毒素在模型試驗中已分別或聯合試用以清除規則骨髓樣品中的癌細胞(MyKlebust等，癌症研究，1994)。正如前邊提到的，用幹細胞移植物有一個很大的優點就是只需要一個較短的時間間隔就可以重新獲得正常的骨髓功能(那更安全的程序)。然而，不管期望的是什麼，這些移植物已被癌細胞所汙染，有必要應用能殺死移植物中所有癌細胞而又不嚴重影響正常細胞的免疫毒素。
尋找比MLuCl-PE對乳腺癌更特異的更適宜於乳腺癌清除的免疫毒素的工作開始了。
本研究中令人驚訝地發現聯合應用MOC31-PE和BM7-PE的效果超過單獨應用這兩種免疫毒素的總和。如下面的表1所示。對抗體和細胞系兩者之間結合的進一步研究顯示聯合使用導致了比單一抗體更強的結合。
MOC31結合大多數乳腺癌細胞，包括那些分化程度較低者。BM7識別相當一部分乳腺癌細胞都表達的一種粘蛋白抗原，也包括表達於那些分化程度更高的細胞上者。MrLu 10和BM 2分別結合被MOC31和BM7識別的抗原，記住這一點就會明白它們不大可能在聯合使用MOC31和BM7免疫毒素時有所貢獻。MLuCl-PE在理論上的意義在於它結合的抗原不同於上邊所述的免疫毒素。然則，MLuCl-PE對正常細胞有毒，模型試驗未顯示在聯合應用中包括它有任何明顯的好處。
在下邊的例子中，敘述的是淨化外周幹細胞移植物(單採血液成分術之產物)。另外，發明者用MOC31-PE和BM7-PE組合物進行了數個試驗，在試驗中於免疫磁學法陽性篩選CD34+細胞之前將癌細胞加到收穫的外周幹細胞中。一個這樣試驗的結果示於表2。用兩種不同細胞系，顯示出僅僅用陽性篩選CD34+(沒有其他任何形式的清除)則從初始收穫的細胞群中除去高達3.8個Log的癌細胞。在其他試驗中CD34篩選的「淨化」效率變化於2～3log，這些在文獻中亦有提及。當免疫毒素處理用於已經經過了陽性篩選的CD34細胞群體時，則對兩個細胞系的整體淨化效率都超過4.7log(表2)。此處超過4.7log意味著所有可檢測到的癌細胞皆已除去。在其他試驗中我們經分離分析發現，經1小時免疫毒素處理的CD34+群體/中可減少成熟腫瘤細胞和正常的先祖細胞。在這些試驗中我們觀察到，腫瘤細胞被殺死或在處理之後很快死去，而未淨化的對照群體中腫瘤細胞生長產生集落，和/或以細胞粘附型培養物的形式繁殖。正常幹細胞不受此處理的影響，所以在三個不同的檢測系統中正常先祖細胞的存活僅僅發生無關緊要的降低。表3顯示了一個類似試驗，CD34+細胞與免疫毒素37℃共孵育2小時，顯示出幹細胞基本上可經免疫毒素處理而存活。
表1包含PE免疫毒素殺滅PM1乳腺癌細胞的效果
表2 單獨及與抗-乳腺癌MOC31和BM7免疫毒素聯合使用的趨向性免疫磁珠篩選的淨化效果，在模型試驗中用1％的PM1和T-47D乳腺癌細胞與外周血幹細胞混合。
表3IT對從活化外周血中篩選的CD34+細胞的集落存活的效應。約×105CD34+細胞與免疫毒素於37℃共孵育2小時，在CFU-GM和CFU-GEMM(5×103/盤)培養物中選種，而後如舉例的「材料與方法」中所述進行分析
a．從所觀察到的集落數目計算得到，把平皿接種的效率考慮在內，放入這種處理所殺死的細胞數目。b．獨立試驗結果的均數，每個試驗重複三次。c．MOC31-PE和BM7-PE免疫毒素的作用濃度均為1μg/ml。
很奇怪的是，用兩種抗體殺死惡變細胞都沒有對從外周血和骨髓中收穫的正常幹細胞造成任何損壞，依據本發明，這兩種抗體針對的是上皮細胞表達的抗原，每種抗體都和假單胞外毒素A細菌外毒素相聯合。本領域的人知道細胞可以被細菌外毒素殺死，而且將毒素連接到針對靶細胞表達表位的抗體則殺滅效應會增強。然而，還知道的是如果未成熟細胞暴露於一種或幾種免疫毒素則極有可能的是這種處理將殺滅該細胞群體中的正常幹細胞。更進一步，這些正常幹細胞對伴隨機械損傷和溫度改變的體內處理敏感。本發明中的細胞群體，例如從外周血中收穫的一幹細胞移植物，暴露於兩種抗體的組合物，兩種抗體均結合於PE。由於其中的一種免疫毒素的活性非常強，很奇怪顯示的結果是用結合到一種細菌毒素的兩種抗體的組合物其淨化效果看起來好像比單獨使用兩種免疫毒素的效應的總和還要強。此協作效應顯示於表4，本發明用連接到假單胞外毒素A的抗體BM7和MOC31殺滅PM1人乳腺癌細胞揭示出這一點。所指的免疫毒素都是針對腫瘤相關抗原的單克隆抗體，都連接到細菌毒素假單胞外毒素A。其中一個抗體識別被GA733-2基因編碼的上皮抗原，該抗原表達於大多數癌細胞，因此可用於包含癌的所有病例(例如乳腺癌，直腸癌，前列腺癌，卵巢癌，腫瘤和胰腺癌)。另一個抗體針對粘蛋白，一種類型的癌與另一類型的癌其粘液蛋白有輕微區別。一般情況下其抗原可被描述成基因MUC-1,MUC-2和MUC-3編碼的蛋白。上邊提及的單克隆抗體的例子是MOC31和BM7。
抗體和毒素的連接可用已知的不同方法進行。
篩選組合物中偶聯細菌外毒素的兩或多種抗體是按下述方法進行的。即抗體結合針對的是大多數靶細胞表達的表位，而正常細胞不表達這些表位。現有技術的問題是惡變細胞和正常血細胞均在細胞表面表達公共抗原。本發明包含的例子中用到兩種單克隆抗體MOC31和BM7。這些抗體的形成都是針對外周血中發現的惡變的上皮細胞的。其抗原(整個蛋白)是由基因GA733-2編碼的。然而，此抗原有數個表位，重要的是指向表達最豐富最充分的表位。
BM7抗體是針對MUC1基因表達抗原的一個表位的抗體之一。有數個基因編碼類似的抗原，例如(MUC2,MUC3)。
細菌毒素假單胞菌外毒素A對正常幹細胞和惡變細胞有相對中等的毒性效應。然而，當該毒素連接到針對表達於靶細胞的抗原的抗體時則對這些細胞的毒性效應是很顯著的。表5顯示的是本發明中免疫毒素的混合物，即使孵育時間短至60分鐘，也可殺死T-47D細胞，MCF7細胞和PM1細胞，比現有技術中的其他方法的效率高得多。這樣這兩種免疫毒素的聯合使用就給出了如人們所期望的同時又令人驚奇的結果，由於其選擇效率，簡單性以及對正常先祖細胞僅有邊緣毒性。
或許有人指出已知有由假單胞外毒素A連接到三種不同抗體而組成數種免疫毒素的應用，見MyKlebust等1993和1994。其中一種抗體(MOC31)和本發明的用法相類似，目的是淨化未篩選的骨髓細胞。然而，所用的其他抗體似乎不是最理想的，在其他抗體中因為有一種是指向與MOC31相同的抗原，而且另一種(MLuCl)與正常細胞交叉反應，因而連接到這種抗體的免疫毒素很容易對最不成熟的幹細胞產生毒性。本發明淨化幹細胞製備物過程中我們製備了另一種單克隆抗體，它增強MOC31的效應，而且觀察到這兩種抗體的組合物用作免疫毒素給出了極為令人驚奇的結果。
由於所發現的免疫毒素有高度特異的活性，看來有可能對罹患不同類型癌症的病人給予該混和物以進行體內治療。如果腫瘤是局限性的則有可能靜脈注射或輸入其中一種或其混和物，例如當顯示疾病已擴散至骨髓時。進一步還有可能對疾病進一步擴散、已有腹部液體(腹水)或胸膜滲出物的病人單獨或聯合注射免疫毒素。第三種可能性是治療腫瘤已擴散到中樞神經系統的病人。在這種情況下免疫毒素可直接注射進腫瘤組織，注射進腦脊液或給腦供血的動脈。
除了MOC31-PE已經被用於小細胞肺癌的薄腦膜腫瘤模型以外，尚未見這些免疫毒素用於體內的情況。BM7-PE在文獻中根本沒有述及。
體內應用免疫毒素的一個重要問題是，它們的半壽期一般都很短，即腫瘤內的濃度還沒有達到足夠高時免疫毒素就被破壞和清除出血液。在US PS 5322678中，Morgan等已申請了一個專利，即對免疫毒素的抗體部分進行修飾，以減少體內半壽期短的問題。本發明提出了對毒素部分進行類似修飾，此程序是前所未知、前所未行的。
實施例1從外周血幹細胞收穫物中用免疫毒素有效清除乳腺癌細胞。介紹以自體造血幹細胞輔助的高劑量化學放射治療用於治療各種惡性腫瘤患者的使用頻率在上升(1,2)。此方法不成功的病例，最普遍的原因是疾病的復發，而非毒力，感染和增強移植作用的缺乏(3)。重要的是，有過硬的證據說明在接受高劑量治療的病人，重注入含有集落生成的腫瘤細胞的自體移植物會對舊病復發起促進作用，且影響預後(4)。自體移植細胞的基因標記研究已顯示，存留在回輸骨髓(BM)中的腫瘤細胞對疾病的復發有一定促進作用(5)。此結論被下述結果進一步證實，即在濾泡淋巴瘤的病人有效的BM淨化提高了病癒存活(6)。
應用靈敏的免疫細胞化學技術在組織學上正常的骨髓自體移植物中能觀察到腫瘤細胞汙染，這種情況在經高劑量處理的乳腺癌病人中的發生範圍是37％～62％(7)。用造血生長因子和化學治療預處理，之後用單採血液成分術收集外周血幹細胞(PBSC)自體移植物，此方法的應用範圍在擴大，由於相信這些產物汙染腫瘤細胞的可能性低。然而，近來發現，雖然比之BM收集物PBSC自體移植物中腫瘤細胞包含率的廣泛性較低，而在乳腺癌病人的活化PBSC收集物中仍然經常發現惡變細胞(4,7)。另外，近來的發現顯示，不論病人以前有或沒有在骨髓中發現可檢測到的腫瘤細胞，化療和/或生長因子都將會活化腫瘤細胞進入外周血(7,8)，結果是進一步增加PBSC移植物中腫瘤細胞汙染的危險性。
為了避免重輸入惡變細胞，有必要體外清除PBSC自體移植物中的乳腺癌細胞。此處我們報告一個實用、快速的淨化方法，顯示在一個60分鐘的孵育過程中，ITs直接加入血液單成分提取物中將選擇性地殺死超過5log的腫瘤細胞。
材料和方法細胞系。PM1乳腺癌細胞系由我們實驗室建立，它是從一個病情惡化的病人的腹水建成的。MCF7和T-47D細胞系來自美國典型培養物保藏中心(Rockwille,MD)(分別為ATCC HTB 22和ATCC HTB133)。細胞培養的條件是37℃,5％CO2室氣，RPMT 1640培養基(RPMI)含10％熱滅活胎牛血清(FCS)和抗生素(100U/ml青黴素，100μg/ml鏈黴素)培養基和補充物購自GIBCO(Paisley,UK)。
人骨髓和外周血先祖細胞。BM細胞來自健康的志願捐獻者。BM單核細胞(MNC)部分獲自Lymphoprep試劑盒(Nycomed Pharma,Oslo,Norway)，試驗應用之前用磷酸緩衝液(PBS)洗滌兩次。PBSCs來自非-何杰金淋巴瘤病人。為了活化PBSCs，病人經化療加造血生長因子(G-CSF,Neupogen,Amgen/Hoffman-La Roche,Basel,Switzerland)預處理。化療之後11到12天。當外周血中CD34+細胞的數目高的時候，就用CS-3000 Plus血細胞分離器收集幹細胞(Baxter,Healthcare,Corp.,Fenwal Division,Deerfield,IL)。
毒素，抗體，及免疫毒素的構建。抗-MUC1(9)抗體BM7(IgGl)由S.Kaul(Frauenklinik，海登堡大學，德國)贈送，抗-EGP2(10)抗體MOC-31(IgG2a)由L.de Leij(University of Groningen，荷蘭)和MCA Development(Groningen)善意提供。PE來自瑞士血清與疫苗研究所(伯爾尼，瑞士)。每一種抗體都通過一個硫醚鍵連接到PE，此鍵的形成如前所述(11)用磺基-琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-羧酸鹽(Sulfo-succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-l-carboxylate(Pierce,Rockford,IL)。
免疫毒素治療。IT治療對集落生成乳腺癌細胞存活的效應測定是將含FCS的RPMI中處在指數生長期的2×106腫瘤細胞與指示濃度的ITs共孵育，於37℃輕微振蕩(100rpm，於環形孵化器上(Gallenkamp,Leicestershire,UK))不同長度的一段時間，視每次試驗而定。用於集落形成分析篩檢之前以含1％FCS的PBS洗滌兩次細胞。
在一些試驗中，10％的腫瘤細胞與BM單核細胞或PBSCs混合，與ITs共孵育，而後洗滌，並對腫瘤細胞或造血先祖集落形成細胞的存活進行效應評估。
腫瘤和造血先祖細胞的集落分析。用於腫瘤細胞的集落生成軟瓊脂分析以前已有敘述(12)。三份重複培養物在37℃,5％CO2,5％O2,90％N2中孵育14天，超過50個細胞的集落將在一座Zeiss立體顯微鏡下計數。
經處理和未經處理的正常先祖細胞的集落形成能力是經CFU-GEMM分析評估的(13)，此分析中每ml 5×104PBSCs分別培養於IMDM培養基(GIBCO)中標準的甲基纖維素培養物內(HCC-4433Methocult,Terry Fox Labs,Vancouver,BC)。19天孵育之後，BFU-E和CFU-GM集落在倒置相差顯微鏡下計數。每個分析都用三份平行培養物進行，在1ml 35mm的小碟中，於37℃，在5％CO2,100％溼度的空氣中。
結果人乳腺癌細胞在軟瓊脂中的生長。在數個試驗中，觀察到種下的腫瘤細胞數和形成的腫瘤集落數目之間存在一個線性關係。PM1細胞系的克隆效率的範圍是20％到30％(未顯示)。在T-47D和MCF7細胞系的試驗中，與PEs的線性關係以前報導的(14)分別是27％和22％，試驗證實了這一點。這些資料被用來計算通過這種處理獲得的乳腺癌細胞衰竭的效率。
單獨和混和使用免疫毒素殺滅乳腺癌細胞的功效。在模型試驗中每種工廠都使用了三種不同的濃度。如表4所示，在兩個較低濃度BM7結合物僅有邊緣效應，而在1.0μg/ml時殺滅細胞達到2.5log，看到近3log細胞被殺死，在最高濃度(1μg/ml)功效最低達5logs，在本分析中估計可能是最高效應(14)。兩種ITs的混合物，每種都用所指的濃度，在濃度為0.1μg/ml時所有的癌細胞都已被殺死(表4)。結果顯示這兩種ITs的混合物可以非常有效地殺滅乳腺癌細胞，資料還提示聯合使用兩種結合物可獲得加和效果。用其他兩種乳腺癌細胞系檢測ITs的功效也獲得了類似的結果(未顯示)。由於靶細胞上抗原表達有預期的異質性，將IT聯合物用於將會進一步發展起來的適合於臨床應用的方法，這看來是符合邏輯的。
表4包含假單胞菌外毒素A的免疫毒素在殺滅PM1人乳腺癌細胞中的功效。PM1細胞和免疫毒素共孵育，37℃2h，在軟瓊脂，集落形成的估計如「材料和方法」中所述。
a.從觀察到的集落數計算得到，考慮到塗板效率，最終由處理所殺滅的細胞數目的對數確定下來。b.結果的均數來自獨立的軟瓊脂試驗，每試驗重複三次。c.各免疫毒素均用指定濃度。
孵育時間的影響。在上述試驗中，與ITs的孵育時間用的是120min。在臨床情況下，為了實用的原因，用甚至更短的孵育時間將會有好處。為了研究是不是暴露於ITs的時間可以縮短而不影響殺死特定的腫瘤細胞，兩種結合物的混和物，每種所用的濃度均為1μg/ml，與三種乳腺癌細胞系孵育不同的時間以檢測之。在所有這幾種情況下，與ITs作用120分鐘者導致了所有腫瘤細胞的根除。重要的是，當孵育時間減少到90min甚至60min時，該處理同樣有效(表5)，而且資料顯示在所用的IT濃度下最短的孵育時間足以殺死腫瘤細胞培養物中出現的所有的集落形成腫瘤細胞。
表5孵育時間對MOC-31和BM7免疫毒素混和物殺滅乳腺癌細胞功效的影響單獨的腫瘤細胞(2×106/ml)或與外周血前體細胞混合(比例1∶10)(總數1×107細胞/ml)與ITs於37℃共孵育指定的時間長度，用軟瓊脂篩選，作分析如表4。
a.每種IT的應用濃度1μg/ml。b.結果來自用T-47D和PM1細胞進行的兩個獨立試驗，及用MCF7細胞進行的一個試驗。
為了檢測在高數目的正常造血細胞存在時對乳腺癌細胞的毒性是否會改變，進行了這樣的試驗，即將腫瘤細胞按1∶10的比例混合於用血液單成分提取法收穫的PBPCs中。如表5所示，在正常細胞存在的情況下僅孵育60min之後ITs還是已經殺死了超過5logs的PM1腫瘤細胞。由於對所有三種細胞繫結果都一樣，資料表明該IT程序在臨床情況下應用可能有效。
孵育條件和細胞濃度的影響。為了檢驗在類似於臨床應用的條件下IT程序的功效，試驗中PM1腫瘤細胞將以1∶10的比例與PBPCs混合，其中在與ITs共孵育之前直接取自血液單成分提取包中的未洗滌細胞用含ACD的生理鹽水(貯存液包，R2220,Baxter Healthcare Corp.,Fenwal Division)重懸。其結果與初始試驗中的相比較，後者的細胞經洗滌，是用含10％FCS的RPMI重懸的。發現(表6)兩種情況下用ITS處理60min均殺死所有PM1細胞，表明臨床應用中ITs可以直接注射進血液單成分提取包中，該條件下的低pH不會影響ITs的細胞毒性。
表6 孵育條件對免疫毒素MOC-31和BM7混和物殺滅PM1乳腺癌細胞與外周血前體細胞混合(比例為1∶10)物的功效的影響，外周血先祖細胞以血細胞單成分提取術分離。從血液單成分提取包得到的細胞被置於3試管中，每管含1×108個細胞。在兩個試管中，細胞(體積500～700μl)以含20％ACD和1％人白蛋白的PBS稀釋到終體積1ml。其中一隻試管用作對照，用作IT孵育(A組)。第三隻試管中的細胞經洗滌，用含10％FCS的RPMI重懸至1ml(B組)。在處理組中，細胞與每種含量為1μg/ml的IT在37℃孵育1h，洗滌，以軟瓊脂分析法篩檢，如表1進行計算。未處理的對照培養物的平皿接種效率為20％～30％。<
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在單採血液成分包中細胞總數將會非常高，可以想像到在這樣高的細胞濃度下，相對於模型研究條件下該程序的功效可能會下降。然而，在檢測此可能性的試驗中，當總體細胞濃度從每毫升1×107上升到5×107，而後又上升到1×108，均未觀察到功效上的差異(表6)。
ITs對正常造血先祖細胞的毒性。ITs對CFU-GM和BFU-E存活的影響在如上所述的孵育條件下進行了研究。發現(表7)有核PBPCs與IT混合物的孵育甚至達120min也不降低前體細胞的存活，不論是在經洗滌後用含10％FCS的RPMI重懸細胞的情況下測定，還是用未洗滌的細胞重懸於含ACD的生理鹽水中。
由於在臨床情況下經處理的細胞在回輸給病人之前要經過冷凍和解凍，這些過程對先祖細胞的影響也經過了研究。發現冷凍和解凍僅僅輕微減少CFU-GM和BFU-E的數目(表7)。值得注意的是，IT處理本身並不一定減少前體細胞的存活，而且細胞集落平均數的輕微降低也在細胞經低pH條件處理的組中見到。資料顯示，在60min的孵育中腫瘤細胞被有效根除的ITs濃度僅對經過了兩次這種處理的正常集落形成細胞的存活產生無足輕重的影響。
表7 免疫毒素MOC-31和BM7的混合物對新鮮的人PBPCs中CFU-GM和BFU-E的毒性，新鮮的人PBPCs是經G-CSF活化後收集的。孵育條件和冷凍程序的影響。
對照和處理組同表6。有核PBPCs與每種濃度1μg/ml的ITs於37℃共孵育2h，後用「材料和方法」中所述的分析篩選出來(5×104細胞/碟)。
a．均數±SD的結果來自兩次獨立試驗中的三次重複培養。
討論循環造血幹細胞的自體移植由於其與BM移植相比的優越性，最近已引起了相當大的興趣(15,16)。於骨髓功能的快速重建之外，PBSCs的應用還被猜測可以除去回輸汙染了腫瘤細胞的移植物的風險。然而，也已顯示腫瘤細胞汙染的問題是減少了但並未消滅(4)。還應指出的是高劑量的化療包括應用集落刺激因子可能會使外周血細胞中的腫瘤細胞復原(7,8)。因此，一種淨化單採血液成分術產物的快捷、實用的程序是人們高度期盼的。
已有數種從BM中除去乳腺癌細胞的方法報導，包括化學-免疫分離，免疫磁珠程序，以及免疫毒素的運用(14,17,18,19)。相比之下，僅有極少的淨化PBSC製備物的研究被提及(20,21)，但一種用核糖體失活蛋白製備的ITs(22,23)已用於殺滅增添到製備自BM的CD-34+細胞收集物中的淋巴腫瘤細胞(24)。在後一個研究中，在以CD34篩選程序獲得的3log非直接純化作用之外，還獲得了2logs的淨化功效。本研究的目標是發展一種安全的IT程序以從PBSCs中清除乳腺癌細胞。模型試驗中獲得的結果顯示，與兩種均為1μg/ml的結合物共孵育60min，每種結合物均包含抗腫瘤抗體和PE，將有效殺死混合到PBSCs的所有腫瘤細胞，且對正常前體細胞沒有毒性。重要的是，該方法容許ITs直接加到血液單成分提取術的產物中，孵育之後細胞經洗滌，離心，可以冷凍。特別是因為其簡單性和功效，該方法用於如下用途將是有吸引力的，即聯合應用高劑量化療配合PBSCs的移植處理乳腺癌病人的篩選組時。我們的程序的高選擇性功效或許可以表述成下述因素第一，被MOC31抗體識別的抗原已知表達於幾乎所有經檢測的乳腺癌標本的大部分細胞(10)。而BM7抗體，識別MUC-1基因表達的核心蛋白，也結合於很大一部分乳腺癌細胞(25)。這兩種單抗一起，好像在相當的程度上覆蓋了在乳腺癌中發現的抗原表達的異質性。第二，我們以前已證實，構建ITs時，用與所用抗體般配的一種毒素是重要的(11)。我們已發現PE結合物包含若干單抗，包括此處應用的那些，是非常有效的(14)。而且，伴PE的ITs通常比等分子濃度的游離PE毒性更強(11,18)，表明了這些ITs的特異性。
淨化過程必須是有效和安全的，該方法也必須是實用的，可應用於臨床水平。ITs可直接加至單採血液成分包中，在此優點之外，我們的方法包括僅用60min孵育時間即可殺死所有的集落生成腫瘤細胞。而且，此處理對正常的造血先祖細胞沒有毒性，且在BM淨化試驗中甚至高得多的IT濃度也可以很好地耐受(14)。我們也顯示經ITs處理的PBSCs的冷凍和解凍不引起額外的毒性，值得一提的是IT過程不包含非特異性的細胞丟失，而在其他方法中則可能要經歷細胞丟失，包括用免疫小珠或免疫吸附的方法除去腫瘤細胞。
我們以前計算過，洗滌之後存留在經IT處理BM中的結合物的數量是加入的整體數量的0.75％左右(26)。在臨床情況下，對PBSCs的處理，包含大約2×1010個單核細胞，推薦濃度是2μg IT/ml(1×108細胞)，則結果可期望在經產物中有至多3μg的IT。這表示比理論計算中游離毒素的最大耐受劑量要低100～150倍(26)。這樣，回輸經淨化的PBSCs將不會出現任何系統性的毒性。
克服高劑量治療配合自體造血前體細胞移植物的不是可能更多地依靠系統性處理的功效而非淨化移植物的效率(1)。不過，清除可能存在於自體移植物中的腫瘤細胞是符合邏輯的，來自研究其他腫瘤類型的最近證據表明了淨化之重要性(16)。在乳腺癌中，我們建議用一種簡單，安全和有效的步驟，正如此處所述的這種。實施例2由於乳腺癌細胞對免疫毒素可以顯示不同的敏感性，例如BM7和MOC31的淨化活性對來自不同病人的乳腺癌細胞可能不同，以前用PM1乳腺癌細胞進行的同樣的試驗(例1)用另一個細胞系MA11進行了重複。結果發現，與PM1細胞相比對MA11細胞而容免疫毒素處理的效果同樣好或者甚至更好(表4)。結果證實了免疫毒素淨化處理的高度特異性的活性。
在單獨的試驗中研究了免疫毒素細胞殺滅活性的動力學，該試驗中PM乳腺癌細胞加入到外周血前體細胞中(比例1∶100)。孵育兩小時之後，混合的細胞懸浮液被冷凍，隨後在細胞選種之前被解凍，乳腺癌細胞和正常前體細胞的生活力通過平行試驗估算出來。發現乳腺癌細胞很快發生中毒，且在大約72小時之內所有腫瘤細胞都死了。通過對比，在免疫毒素處理和未處理細胞培養中，未發現在同樣的時間長度內正常血液前體的生活力出現差異。實施例3-4
擴散到骨或骨髓，到胸膜腔和腹腔，到大腦和脊髓組織，到尿生殖道的癌細胞，可以被免疫毒素選擇性地殺死，方法是將免疫毒素注入腫瘤、注入上述體液，或者有系統地，例如導向諸如血液，骨及骨髓等組織的轉移性腫瘤細胞。實施例3MA-11人乳腺癌細胞被注射進免疫缺陷大鼠的左心室。未治療的對照動物發展了骨髓壓迫症狀，在細胞注射後34～37天必須被殺死。經靜脈注射單一劑量的MOC31-PE(20μg/鼠)治療的動物出現了延長的無症狀存活，其中一些動物存活超過50天。
同一個模型的另一個試驗證實了此結果，在此例中一些動物在整個觀察時間的110天中均存活。在這些試驗中，一組大鼠經由結合於PE的針對EGF-受體的425.3抗體組成的免疫毒素治療。此組中所有動物均存活。
此模型的第三個試驗中，對照大鼠顯示索壓迫症狀，必須在細胞注射之後的40～60天被殺死。此試驗中包括三個治療組，其一用20μg425.3-PE；一組接受兩種免疫毒，每種均用10mg。兩種免疫毒素單獨應用都得到無疾病存活期的有效的延長，MOC31-PE和425.3-PE分別使存活時間延長6％和8％。在組合使用試驗中，所有動物無疾病存活。
此模型的第四個試驗中，MOC31-PE的效果將與順鉑及阿黴素相對比。此試驗中所有MOC31-PE治療的動物存活超過70天，而阿黴素僅顯示邊緣效果，而順鉑處理大鼠不比生理鹽水處理的對照動物活得長。這些資料令人信服地證明，所用的免疫毒素在殺死乳腺癌轉移方面遠遠優於臨床最常應用的兩種藥物，阿黴素和順鉑。實施例4人乳腺癌細胞系MT-1被用於兩種不同的試驗中。在第一個試驗中，細胞被注入左心室，由於骨髓壓迫症狀，對照動物在平均19天時間以後就必須殺死。細胞注射一天以後靜脈給予425.3-PE處理的動物全部存活。在另一個試驗中，MT-1腫瘤細胞被直接注射進鼠脛骨之骨髓腔。所有未治療的動物由於脛骨瘤的生長都必須在20天之後獻出生命，然而在細胞注射一天之後靜脈給予20mg 425.3-PE治療的大鼠所有均存活100天以上。
此外，在MT-1腫瘤細胞直接注射進大鼠脛骨骨髓腔的模型中，於第1天或第7天給予BM7-PE，其效果與425.3-PE的作了對比，後者所用動物組的處理時間與BM7-PE在同一天。而且，在第7天和第14天靜脈給予阿黴素(鹽酸阿黴素)的效果也進行了研究。發現兩種免疫毒素均治癒了80％的鼠，不論其給藥是在第1天或第7天。當每種免疫毒素以一半濃度聯合使用時所有動物均活存。對比之下，阿黴素的效率明顯要低，90天之後僅剩下35％的動物活存。而對照動物在注射細胞20天之後就不得不獻身，同前邊的試驗一樣。該資料證實了如前所示的425.3-PE的效果，重要的是，BM7-PE被發現與425.3-PE同樣有效。兩種試劑在功效方面明顯超過阿黴素，後者是治療乳腺癌最常用的臨床藥物之一。而且，這兩種免疫毒素的聯合使用治癒了所有患病的動物。
實施例5在兩套試驗中檢測了重組生產的針對erbB2-基因產物的與重組生成的PE的變異體相連的免疫毒素的功效。在例4所述的模型中，重組免疫毒素的最高濃度有效地延長了動物的生存期限，35％的鼠活存。在一個模型中MT-1乳腺癌細胞被靜脈注入免疫缺陷大鼠，重組免疫毒素的治療也經靜脈給予(於第1,2和3天)，結果導致動物生存期限的有效延長。此效應是劑量依賴性的，該免疫毒素的兩種不同劑量使動物的生存期限增加，從10,6天(生理鹽水處理的對照)到23,4天以及32,8天。在最高劑量，20％的鼠存活。由於即便是最高的免疫毒素劑量也未觀察到毒性，故指望最適宜劑量的效應甚至會更好。
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權利要求
1．殺滅一個細胞群體中不想要的靶細胞的方法，其中該細胞群體包括從外周血收集的有核細胞，或從上述有核細胞中篩選的CD-34+細胞，或從骨髓抽吸物收穫的CD-34+細胞，或來自骨髓或包含多功能幹細胞的血液的其他未成熟/早期先祖細胞，或由正常基質細胞支持的惡變細胞，其特徵在於，該細胞群體被暴露於一或多種免疫毒素，其中的每一種免疫毒素是由抗體和細胞毒素偶聯物，抗體片段和毒素，或重組生產的抗體，毒素，免疫毒素或其片段組成的。
2．根據權利要求1的方法，其特徵在於，該細胞群體暴露於兩種或多種免疫毒素。
3．根據權利要求1的方法，其特徵在於，該細胞群體暴露於一種免疫毒素，例如MOC31-PE或BM7-PE。
4．根據權利要求1的方法，其特徵在於，該細胞群體是從外周血中收穫。
5．根據權利要求1的方法，其特徵在於，其幹細胞/早期先祖細胞是從骨髓中收穫的。
6．根據權利要求1-2的方法，其特徵在於，其細胞群體是與2-3種物質混和物共孵育，優選地是2種指向靶細胞相關抗原的特異性抗體或其片段，每種抗體偶聯於相同或不同的細胞毒素。
7．根據權利要求4的方法，其特徵在於，應用了針對上皮細胞抗原的抗體。
8．根據權利要求7的方法，其特徵在於，應用了針對主要表達於上皮細胞的表位的抗體。
9．根據上述權利要求之一的方法，其特徵在於，在所用的抗體中至少有一種是針對基因GA733-2表達的抗原EGP2上的表位，而且至少有一種是針對基因MUC1,MUC2或MUC3，或其組表達的抗原上的表位。
10．根據上述權利要求之一的方法，其特徵在於，所用的抗體是MOC31和一個針對由基因MUC1,MUC2,MUC3或其組合編碼的抗原的抗體。
11．根據權利要求6的方法，其特徵在於，所用的抗體是MOC31和BM7，或其片段。
12．根據權利要求6的方法，其特徵在於，所用的抗體是MOC31和BM2或12H12，或其片段。
13．根據權利要求6的方法，其特徵在於，所用的抗體是MOC31和595A6，或其片段。
14．根據上述權利要求之一的方法，其特徵在於，免疫毒素所用的毒素部分是天然的或重組假單胞菌外毒素A，或其片段。
15．根據上述權利要求之一的方法，其特徵在於，所用的毒素是天然的或重組的相思豆毒素，蓖麻蛋白，gelonin，黑桿菌素或美洲商陸抗病素蛋白，皂草素，ebulin或其片段。
16．根據上述權利要求之一的方法，其特徵在於，該細胞群體是從外周血收穫的有核細胞，靶細胞是上皮起源的惡變細胞。
17．根據上述權利要求之一的方法，其特徵在於，該細胞群體包含作為一個基本部分的CD-34+細胞，或用其他表面標記例如P-糖蛋白篩選的類似的早期先祖細胞。
18．根據權利要求8的方法，其特徵在於，其靶細胞是腫瘤細胞，例如乳腺癌細胞，直腸癌細胞，前列腺癌細胞，卵巢癌細胞，胰腺癌細胞和肺癌細胞。
19．根據權利要求2,3的方法，其特徵在於，該細胞群體是在體內暴露於特異性免疫毒素。
20．根據權利要求19的方法，其特徵在於，免疫毒素直接注入腫瘤或胸腔和腹腔。
21．根據權利要求19的方法，其特徵在於，免疫毒素是全身給藥，尤其是在惡變細胞擴散到的如骨和骨髓這樣的組織。
22．根據權利要求1中的方法殺死細胞的免疫毒素，其特徵在於，它包含一或多種針對呈現於惡變細胞表面的抗原的免疫毒素。
23．根據權利要求22的免疫毒素，其特徵在於，抗體選自MOC31和BM7,595,BM2,12H12或它們的組合，毒素是假單胞菌外毒素A。
24．應用根據權利要求22的混和物生產癌症治療劑。
25．執行根據權利要求1的方法的試劑盒，其特徵在於，它包括藥學上可接受的製劑中的一或多種免疫毒素製品。
全文摘要
描述了一種方法,從一個細胞群體中殺死不想要的靶細胞,該群體包括:從外周血中獲取的有核細胞,或CD－3文檔編號A61K39/00GK1218411SQ97194599
公開日1999年6月2日 申請日期1997年3月12日 優先權日1996年3月13日
發明者奧伊斯坦·福德斯塔德, G·克瓦爾黑姆, S·朱爾, 王孟瑜, O·恩格布雷藤 申請人:奧伊斯坦·福德斯塔德