一種xanthone類化合物及其單晶的製備方法與作為抗海分枝桿菌藥物的應用與流程

2023-10-11 10:24:29 1

本發明涉及一種xanthone類化合物及其單晶的製備方法與作為抗海分枝桿菌藥物的應用，特別是涉及一種對海分枝桿菌(mycobacteriummarinum)具有極強的抑制作用的xanthone類化合物及其單晶製備方法與應用。

背景技術：

結核分枝桿菌導致的結核病仍然是全球公共衛生的嚴重威脅。據who最新報導，在2014年，約有960萬新病例發生，150萬人死於該病，有48萬人發展為多重抗藥性結核病。我國佔有全世界人口的20%，結核病對我國亦構成極大的威脅。然而，研究結核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis)的感染機制是困難的，原因是結核分枝桿菌生長緩慢，需較高的生物安全措施，成本高，動物模型少等。海分枝桿菌(mycobacteriummarinum)為一種腐生性非典型分枝桿菌，天然宿主為魚類、兩棲類，人類感染屬機會感染。基因組比較分析表明海分枝桿菌(m.marinum)與結核分枝桿菌(m.tuberculosis)的親緣關係很近，這兩種病原菌引起的疾病特徵在某些方面也很相似，如肉芽腫。利用海分枝桿菌對結核分枝桿菌發病機理的決定性因素研究是一種優良模型，且安全係數高。現如今，隨著在家庭中通過魚缸養殖觀賞魚的流行，感染海分枝桿菌的機率也在增加，其導致人類慢性的皮膚損傷，膿毒性關節炎等。臨床上大多數有效的抗海分枝桿菌治療為聯合使用利福平、克拉黴素等抗生素，且需立即用藥。由於海分枝感染還不是很普遍，加上多樣化的臨床表現，往往會導致誤診或者延遲治療，導致病情惡化而難以治癒。因而尋找更高效的抗海分枝桿菌藥物尤其是結構新穎的抗海分枝桿菌藥物已成為急需解決的課題。海洋微生物獨特的生存環境(高壓、高鹽、缺氧、避光等)，促使海洋微生物代謝產生大量結構新穎、活性很好的化合物，為開發新型抗海分枝桿菌藥物或者潛在的抗結核藥物提供了重要來源。但是關於海洋微生物來源的具有抗海分枝桿菌活性的化合物的報導還相當少，尤其是具有潛在開發成為抗結核藥物的海洋來源化合物的報導。(who.globaltuberculosiscontrol2015.robinl.;lalitar.,currentopinioninmicrobiology(2008),11(3),277-283.stinear,t.p.;seemann,t.,etal.genomeresearch(2008),18(5),729741.rieraj.;conesax.,etal.archivesoforthopaedicandtraumasurgery(2016),136(1),131134.babamahmoodif.;nikkhahanb.;babamahmoodia.,iranianredcrescentmedicaljournal(2014),16(2),e10120.fengy.m.;xuh.s.,etal.diagnosticmicrobiologyandinfectiousdisease(2011),71,267272.cheungj.p.;fungb.,etal.journaloforthopaedicsurgery(2010),18(1),98103.andpreviousannualreports)。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供一種來源於海洋真菌的xanthone類化合物及其單晶的製備方法與作為抗海分枝桿菌活性的應用，它能滿足現有技術的上述需求。菌種保藏信息：保藏單位名稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏單位地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所；保藏日期：2014年4月3日；保藏編號：cgmcc8994；分類命名：penicilliumsp.本發明提供式i化合物1和2或其藥學上可接受的鹽：或其藥學上可接受的鹽。

本發明提供式i化合物1和2的製備方法，其特徵在於先在菌種培養基中對真菌penicilliumsp.(ta33-1)進行菌種培養，再在發酵培養基中對該真菌進行發酵培養，將所得菌絲體用氯仿-甲醇混合液(1:1)浸提3次減壓濃縮後，用乙酸乙酯萃取3次得粗浸膏；乙酸乙酯相粗浸膏分別進行正相矽膠柱層析、sephadexlh-20凝膠柱層析後，再經hplc高效液相製備色譜，將所得洗脫液濃縮，即為化合物1和2。

上述製備方法中菌種培養基優選含有葡萄糖0.1%–5.0%(重量百分比，下同)、酵母膏0.01%–1%、蛋白腖0.01%–1%、瓊脂0.1%–3.0%、氯化鈉0.05%–5%，其餘為水，培養溫度優選為0–30°c，培養時間優選為3–15天；發酵培養基優選含有大米1.0%–80.0%(重量百分比，下同)、氯化鈉0.05%–5%，其餘為水，培養溫度優選為0–30°c，培養時間優選為20–100天；所述的正相矽膠柱層析採用的固定相優選200–300目矽膠，流動相優選體積比為20%–100%的乙酸乙酯-石油醚混合溶劑；所述sephadexlh-20凝膠柱層析採用的流動相優選體積比為氯仿:甲醇=1:1的混合溶劑；所述hplc高效液相製備色譜中採用的色譜柱：常規odsc18柱，優選為kromasil10×250mm,5μm，流速優選為1.0–5.0ml/min，流動相優選體積比為20%–70%的甲醇-水混合溶劑。

本發明的另一實施方案提供式ⅰ化合物1的晶體，晶體數據：空間群為p-1，晶胞參數為a=7.123(4)å,b=8.069(4)å,c=11.596(6)å,α=93.86(3)º,β=93.56(3)º,γ=102.58(3)º,v=646.99(505)å3,z=2,dc=1.593g/cm3,f(000)=324,μ=1.144mm–1。

本發明的另一實施方案提供上述式i化合物1晶體的製備方法，其特徵在於將式i化合物1溶於甲醇、乙醇、水、四氫呋喃或丙酮中的任一種或幾種，靜置緩慢結晶即可得到式i化合物1的晶體。

上述晶體的製備方法中靜置緩慢結晶的條件優選在0–30oc下，靜置1–30天。

本發明從海洋真菌中獲得xanthone類化合物對海分枝桿菌具有強的抑制活性，可用作抗海分枝桿菌藥物，應用前景廣闊。

本發明的另一實施方式中提供一種抗海分枝桿菌藥物，其特徵在於包括式ⅰ化合物1和2或其藥學上可接受的鹽作為有效成分。

本發明中術語「藥學上可接受的鹽」是指非毒性的無機或有機酸和/或鹼的加成鹽。可參見「saltselectionforbasicdrugs」,int.j.pharm.1986,33,201–217。

附圖說明

圖1為式i化合物1的xrd圖。

上述的xanthone類化合物在製備抗海分枝桿菌藥物中的應用。

具體實施方式

為了便於對本發明的進一步理解，下面提供的實施例對其做了更詳細的說明。但是這些實施例僅供更好地理解發明而並非用來限定本發明的範圍或實施原則，本發明的實施方式不限於以下內容。

實施例1

(1)花柳珊瑚內生真菌penicilliumsp.(ta33-1)的菌種培養

菌種培養所用的培養基含有葡萄糖1.0%(重量百分比，下同)、酵母膏0.2%、蛋白腖0.2%、瓊脂1.0%、氯化鈉3.0%，其餘為水，使用時製成試管斜面，真菌菌株在30°c下培養3天。

(2)花柳珊瑚內生真菌penicilliumsp.(ta33-1)的發酵

發酵培養所用的培養基含有大米40.0%(重量百分比，下同)、氯化鈉3.0%，其餘為水；真菌菌株於28°c培養90天。

(3)式i化合物1和2的提取分離

取60瓶步驟(2)得到的菌絲體，用氯仿-甲醇混合液(1:1)浸提3次減壓濃縮後，用乙酸乙酯萃取3次得粗浸膏；乙酸乙酯相粗浸膏分別進行正相矽膠柱層析(固定相為200–300目矽膠；流動相為100%乙酸乙酯溶劑)、sephadexlh-20凝膠柱層析(氯仿：甲醇=1：1的混合溶劑，體積比)後，再經hplc高效液相製備色譜分離(色譜柱為kromasil10×250mm，5μm，流速為2.0ml/min，流動相為35%的甲醇-水混合溶劑，體積比)，將所得洗脫液濃縮，得黃色結晶，即為式i化合物1和2。

式i化合物1和2的結構確證數據：

化合物1:黃色晶體；1hnmr(500mhz,acetone-d6,δ,ppm,j/hz):13.60(1h,s,h-8),6.80(1h,s,h-4),6.28(1h,d,j=1.5hz,h-5),6.17(1h,d,j=1.5hz,h-7),2.78(3h,s,h-11).13cnmr(125mhz,acetone-d6,δ,ppm,j/hz)183.5(c,c-9),165.1(c,c-6),164.8(c,c-8),158.1(c,c-10a),153.5(c,c-4a),152.6(c,c-3),141.8(c,c-2),125.7(c,c-1),112.5(c,c-1a),103.9(c,c-9a),100.9(ch,c-4),98.5(ch,c-7),93.6(ch,c-5),13.9(ch3,c-11).

化合物2:黃色晶體；1hnmr(500mhz,acetone-d6,δ,ppm,j/hz):13.58(1h,s,h-8),6.32(1h,d,j=2.0hz,h-5),6.16(1h,d,j=2.0hz,h-7),2.73(1h,s,h-1),13cnmr(125mhz,acetone-d6,δ,ppm,j/hz):183.1(c,c-9),164.1(c,c-8),163.8(c,c-6),157.1(c,c-10a),141.7(c,c-2),115.4(c,c-1a),111.2(c,c-1),103.1(c,c-9a),97.6(ch,c-7),92.9(ch,c-5),12.3(ch3,c-11).

實施例2

(1)花柳珊瑚內生真菌penicilliumsp.(ta33-1)的菌種培養

菌種培養所用的培養基含有葡萄糖0.1%–5.0%(重量百分比，下同)、酵母膏0.01%–1%、蛋白腖0.01%–1%、瓊脂0.1%–3.0%、氯化鈉0.05%–5%，其餘為水，使用時製成試管斜面，真菌菌株在0–30°c下培養3–15天。

(2)花柳珊瑚內生真菌penicilliumsp.(ta33-1)的發酵

發酵培養所用的培養基含有大米1.0%–80.0%(重量百分比，下同)、氯化鈉0.05%–5%，其餘為水，真菌菌株於0–30°c培養20–100天。

(3)式i化合物1和2的提取分離

取10–60瓶步驟(2)所得的將所得菌絲體用氯仿-甲醇混合液(1:1)浸提3次減壓濃縮後，用乙酸乙酯萃取3次得粗浸膏；乙酸乙酯相粗浸膏濃縮後分別進行正相矽膠柱層析(固定相為本領域常規正相矽膠，流動相為50%–100%的乙酸乙酯-石油醚混合溶劑，體積比)、sephadexlh-20凝膠柱層析(流動相為氯仿:甲醇=1:1的混合溶劑，體積比)後，再經hplc高效液相製備色譜(色譜柱為本領域常規odsc18柱，流速為1.0–5.0ml/min，流動相為20%–70%的甲醇-水混合溶劑，體積比)，將所得洗脫液濃縮，得黃色結晶，即為式i化合物1和2。

其中式ⅰ化合物1和2的結構確證數據與實施例1中相應數據一致。

實施例1–2中未具體指明的其他菌種培養、發酵條件，以及正相矽膠柱色譜分離、sephadexlh-20凝膠柱層析分離、高效液相色譜分離等其他實驗操作條件均為本領域常規的實驗操作條件，本領域的技術人員可以根據實際需要，進行合理的選擇。

實施例3

取式ⅰ化合物11.5mg溶解在裝有500μl甲醇、乙醇、水、四氫呋喃或丙酮中任一種的小瓶中，於0°c下靜置30天後，緩慢結晶即得式i化合物1的晶體。

實施例4

取式ⅰ化合物13mg溶解在裝有1000μl甲醇、乙醇、四氫呋喃或丙酮中任一種或幾種的小瓶中，於30°c下靜置1天後，緩慢結晶即得式ⅰ化合物1的晶體。

上述晶體的晶體數據：空間群為p-1，晶胞參數為a=7.123(4)å,b=8.069(4)å,c=11.596(6)å,α=93.86(3)º,β=93.56(3)º,γ=102.58(3)º,v=646.99(505)å3,z=2,dc=1.593g/cm3,f(000)=324,μ=1.144mm–1。

實施例5

在菌種培養基中對海洋真菌penicilliumsp.(ta33-1)進行菌種培養，再在發酵培養基中對該真菌進行發酵培養，將所得發酵液過濾，除去菌體，將濾液濃縮後，用乙酸乙酯萃取；萃取液濃縮後分別進行正相矽膠柱層析、sephadexlh-20凝膠柱層析後，再經hplc高效液相製備色譜，將所得洗脫液濃縮，得黃色晶體，即為式ⅰ化合物1和2，其結構確證數據與實施例1中相應數據一致。其中所述菌種培養基中含有葡萄糖、酵母膏、蛋白腖、瓊脂、粗海鹽、水，所述發酵培養基中含有大米、粗海鹽、蛋白腖、水；所述的色譜分離為正相矽膠柱色譜分離、sephadexlh-20凝膠柱層析和高效液相色譜分離。

為了探索更廣泛的適用於製備本發明式ⅰ化合物1和2的方法，本實施例中菌種培養基、發酵培養基中各成分的添加，均按本領域中常規比例添加或按任意比例添加，色譜分離時所用矽膠的規格、sephadexlh-20凝膠的規格、色譜柱的型號及洗脫溶劑的選擇，均為本領域的常規選擇。實驗結果表明，上述常規選擇的製備方法，均能得到發明的黃色晶體，即式ⅰ化合物1和2，其結構確證數據與實施例1中相應數據一致，僅僅存在個別化合物在純度及收率方面的微小差異。

實施例1–3的結果表明，按照本領域常規的菌種培養、發酵條件，常規的正相矽膠柱色譜分離、sephadexlh-20凝膠柱色譜分離、高效液相色譜分離的條件對海洋真菌penicilliumsp.(ta33-1)進行菌種培養、發酵、分離純化，均能得到本發明式ⅰ結構的化合物1和2。本發明式ⅰ化合物1和2的製備方法，優選實施例1–2中記載的方法。

實施例6

本發明式ⅰ化合物1和2的抗海分枝桿菌活性按照如下文獻測試方法測試：wangc,wangj,huangy,chenh.,liy.,zhongl.,cheny.,chens.,wangj.,kangj.,pengy.,yangb.,liny.,shez.,laix.,anti-mycobacterialactivityofmarinefungus-derived4-deoxybostrycinandnigrosporin.molecules,2013,18(2):17281740.

試驗結果顯示，本發明製備的式i化合物1和2對海分枝桿菌感染具有很強的抑制作用，其mic分別為40.75μm和50.61μm，陽性藥利福平為2.34μm。

實驗表明，本發明的xanthone類化合物1和2對海分枝桿菌感染具有很強的抑制活性，可將其製成抗海分枝桿菌藥物，甚至抗結核桿菌藥物，並且花柳珊瑚內生真菌penicilliumsp.(ta33-1)可進行大規模發酵生產，保證了式i化合物1和2的天然來源，具有廣闊的應用前景。