泰國型α-地中海貧血的基因檢測試劑盒的製作方法

2023-06-11 20:23:51 1

專利名稱：泰國型α-地中海貧血的基因檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及到一種在臨床樣本中快速檢測泰國型α -地中海貧血基因型的試劑盒。
背景技術：
α -地中海貧血「thalassemia」(簡稱α -地貧)是一種常染色體隱性遺傳病，是世界上最常見的人類單基因遺傳病之一，被世界衛生組織列入危害人類健康的6種常見病。該疾病是由於珠蛋白基因序列的缺失或突變，導致α-珠蛋白肽鏈合成障礙，使α-珠蛋白肽鏈合成減少或不能合成引起的，使組成珠蛋白的α鏈和β鏈合成失去平衡而導致的溶血性貧血病。人類α珠蛋白基因簇位於16號染色體ρ13. 3，長約40kb，每條染色體各有2個α珠蛋基因，一對染色體共有4個α珠蛋白基因；大多數α地貧是由於α珠蛋白基因的缺失所致，少數由基因點突變造成。就一個單倍體個體而言，根據α珠蛋白合成減少的程度，可將α地貧分為兩類缺陷一類為α地貧1(α°_地貧)，特點是缺失2個α基因，α珠蛋白合成完全受阻，我國較常見的為東南亞缺失型地貧(一SEA); 二類為α地貧2(α+_地中海貧血)，由一個α基因發生突變或缺失引起的。我國大約80%的α地中海貧血是由編碼α蛋白的基因(02或/和0 1)缺失所致；最常見的缺失類型為-037、-042、--砠3種。隨著α -地貧機制的進一步闡明，一些新的基因缺失類型相繼被發現，例如一111、-α 2_4、-α 2_7、菲律賓型α地貧(一m)、泰國型α地貧(一Thai)和(香港型α地貧)HK α α等。自從Boonsa等報導了(一Thai)以來，陸續有病例被檢出。泰國型α-地貧基因缺失片段比東南亞基因缺失地貧(一SEA)片段還要長，在臨床上可以形成中重型α地中海貧血，即泰國型缺失的HbH病和泰國型缺失的巴氏水腫胎。由於泰國型的血液學特徵與東南亞缺失型α地貧一致，均表現出小細胞低色素，MCV降低和MCH降低等，因而可能造成誤診和漏診，繼而造成泰國型缺失的HbH病和泰國型缺失的巴氏水腫胎兒的出生。因此，開展泰國型α -地貧(--Thai)檢測對遺傳諮詢及產前診斷具有重要意義。現有α-地貧檢測技術主要有血常規檢測、紅細胞脆性檢測、血紅蛋白電泳等，這些方法的缺陷是只能對患者進行初步的地貧篩查，無法對患者基因型進行確診，而且對輕型地貧容易漏診，造成下一代重症地貧患兒的出生。近年來出現了根據α-地貧基因確診的方法，檢測方法有Southern雜交、多重Gap-PCR、多重連接酶依賴探針擴增技術(MLPA)、實時螢光定量PCR、反向點雜交、直接測序技術等方法，各基因診斷方法簡述如下(l)Southern雜交技術Southern印記雜交技術和放射性同位素標記的α、β珠蛋白基因探針進行雜交，根據圖譜，可鑑別診斷^-地貧1、^-地貧2、冊!1病、8&1^' s水腫胎等。該方法雖然準確性較高但操作繁瑣、費時費力、DNA需求的量大、需要放射性標記，且不能應用於非缺失基因的檢測，因而一般只適合研究使用，不適於臨床的推廣應用。(2)依賴探針連接擴增技術(MLPA) :MLPA是2002年發展起來的常用於α地貧缺失基因的檢測，但由於檢測成本高，操作繁瑣，耗時較長，檢測流程長達16小時，且需要特殊的儀器設備，一般只用於研究使用，不便於分子篩查方法的推廣應用。(3)測序技術測序技術直接對DNA序列的分析，一直被認為是臨床檢測的金標準；目前測序技術面臨著標本的處理(核酸提取)、擴增標準化認證問題，信號檢測、測序平臺特異的出錯和糾錯問題，以及生物信息學方面可能出現的問題，臨床驗證程序和標準化問題等，一直沒有有效的解決，因此還未能在臨床中推廣應用。(4)反向點雜交(Reverse Dot Blot，RDB):本法是在PCR擴增的基礎上，將已標記在引物上的PCR產物與固定在膜條上的特異性探針雜交，再通過激發螢光或一系列顯色反應觀察結果。這種方法靈敏，但耗時較長，一般用於點突變檢測。(5) Gap-PCR及其改進的技術80年代PCR技術發明以來，由於其操作簡單，此技術廣泛用於地貧的分子診斷，在缺失區域兩端設計一對引物，正常情況下兩引物擴增產物很長不屬於擴增的範圍，而出現缺失區域的時候能出現特異性的擴增。1990年Lebo等應用PCR技術檢測α -地貧1，Dode和Baysal等應用PCR技術檢測α -地貧2。目前市場上以Gap-PCR開發的試劑盒只能檢我國最常見的3種缺失型a地貧(-α 3_7、- α 4 2和--SEA)。(6)實時螢光定量PCR (Taqman探針法)實時螢光定量PCR是目前臨床診斷系統最受歡迎的檢測平臺，在PCR反應體系中加入螢光基團，利用螢光信號累積，實時監測PCR進程及連續分析擴增產物相關的螢光信號，最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。在地中海貧血檢測中，局限於一種基因型的檢測，工作量大；探針需要螢光標記，檢測成本高。現有產品及專利相關專利為《用於診斷地中海貧血的DNA晶片及其製備方法》、《診斷α-地中海貧血的核酸膜條及試劑盒》和《用於診斷地中海貧血的核酸雜交膜條及試劑盒》，這些專利與本申請發明專利不屬於同一個技術平臺，與本申請發明相關的已經公開或者有權的專利的相關統計對比見表I。表I
權利要求
1.一種泰國型α-地中海貧血的基因檢測試劑盒，其特徵在於，包括PCR反應液，所述PCR反應液包括上遊引物THAI-F和下遊引物THAI-R，所述引物為針對泰國型α -地貧的斷裂點位置上遊10724-10725位置，下遊1219-1220位置，在斷裂點上遊5』端和下遊3』端分別設計的引物。
2.根據權利要求I所述的泰國型α-地中海貧血的基因檢測試劑盒，其特徵在於，所述上遊引物THAI-F的核苷酸序列為SEQ ID NO : 1，所述下遊引物THAI-R的核苷酸序列為SEQID NO 2ο
3 根據權利要求2所述的泰國型α-地中海貧血的基因檢測試劑盒，其特徵在於，所述PCR反應液中上遊引物THAI-F和下遊引物THAI-R的濃度相等為O. 1-1 μ M，MgCl2濃度為I. 5mM-5mM, dNTP的濃度為100nM_300nM，DNA聚合酶的濃度為1-5U/反應。
4.根據權利要求I所述的泰國型α-地中海貧血的基因檢測試劑盒，其特徵在於，所述的PCR反應液各組分含量為去離子水10μ L ;·5 X Q buffer 5 μ L ；10XCoralLoad PCR Buffer :2.5 μ L ;·2. 5mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP 的等體積混合液2μ L ；ΙΟμΜ 引物 THAI-F:0.5yL;ΙΟμΜ 引物 THAI-R:0.5yL;5U/ μ L Hotstar Taq 0. 5 μ L。
全文摘要
本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及到一種在臨床樣本中快速檢測泰國型α-地中海貧血基因型的試劑盒。本發明的技術方案為提供一種泰國型α-地中海貧血的基因檢測試劑盒，包括PCR反應液，所述PCR反應液包括上遊引物THAI-F和下遊引物THAI-R，所述引物為針對泰國型α-地貧的斷裂點位置上遊10724-10725位置，下遊1219-1220位置，在斷裂點上遊5』端和下遊3』端分別設計的引物。本發明的試劑盒可以降低普通血液篩查法造成的α-地貧的漏查，減少或避免重型α-地貧患兒的出生，為更全面的地貧篩選創造了條件。本發明的試劑盒使用方便、準確度高，能對地貧高發區產生良好的社會效益和經濟效益。
文檔編號C12Q1/68GK102943116SQ20121051219
公開日2013年2月27日 申請日期2012年12月4日 優先權日2012年12月4日
發明者李長遠, 梁少明, 劉晶晶, 任維 申請人:亞能生物技術(深圳)有限公司