中華硬蜱神經肽及其製備方法和應用的製作方法

2023-10-11 03:27:29

專利名稱：中華硬蜱神經肽及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明提供一種中華硬蜱神經肽及其製備方法和應用，屬於生物醫學技術領域。
背景技術：
蜱是一類對家畜危害最大的吸血寄生蟲，對人類而言，它是僅次於蚊子的第二大類病源傳播媒介。蜱廣泛地分布於世界各地，共有800多種，僅我國就有110多種。其可以分為硬蜱、軟蜱和納蜱三大類。蜱是許多病原體例如細菌、真菌、病毒、螺旋體、立克次氏體和原蟲的重要載體。蜱可寄生於兩棲、爬行、鳥類和哺乳動物，且經常更換宿主，所以還可將許多人畜共患病傳染給人類，給人類公共衛生安全帶了巨大危害，而經蜱傳播的萊姆病(又稱「第二愛滋」)、Q熱以及森林腦炎等人類疾病更是嚴重地威脅著人類的健康。
鑑於蜱的巨大危害，尋找有效、安全的蜱類防治措施已勢在必行。目前，對蜱類主要通過「毒死蜱」等化學農藥來進行防治，但這也帶來了食品和環境汙染等安全問題以及蜱類的抗藥性問題。近來，許多研究者都試圖通過「疫苗」來防治蜱，而這必需從分子水平上深入地了解蜱、病原體與宿主之間的相互關係。
作為許多病原體的載體，而硬蜱本身卻未受到這些病原體的傷害，研究表明，在蜱的血淋巴中除含有溶菌酶和外源凝集素外，蜱本身也產生許多抗菌物質來保護自身。硬蜱吸附在其宿主皮膚上的血餐過程可持續兩周左右，在這麼長的吸血周期中，宿主將有足夠長的時間激活其先天和後天免疫反應，硬蜱將遭遇到宿主的防疫和免疫排斥反應。而在長期的進化過程中，硬蜱已進化出一套有效的保護機制借來逃避宿主的防禦反應，從而完成其吸血過程。目前，已經從蜱的唾液腺中發現了大量的具有生理、藥理活性的生物活性分子例如前列腺素、抗凝因子、免疫抑制物質和抗炎蛋白等來克服宿主的防禦反應，最新的研究結果顯示，蜱的唾液腺還具有抗補體活性的蛋白質，它們通過抑制補體的激活來抑制宿主的免疫反應，然而其蛋白成分及序列還不清楚。
中華硬蜱是我國常見的一種硬蜱，針對其的研究還很少，從分子水平上對其的研究還未見報導，儘快的對其展開研究不僅能夠使我們深入了解硬蜱的生理機制及其與病原體、宿主間的關係，而且還可為我國蜱類的防治工作提供有價值的參考資料。
發明人將從中華硬蜱神經節中分離純化出的神經肽在蛋白質資料庫中搜索比較，未發現有任何相同的小肽。

發明內容
本發明的目的旨在現有技術的基礎上，提供一種新的具有很強鎮痛活性的中華硬蜱神經肽及其製備方法和其在醫學領域中的應用。
本發明的技術方案為中華硬蜱神經肽是我們首次從中華硬蜱神經節中分離得到的一種單鏈小肽，分子量1005.22道爾頓，等電點8.59，小肽全序列一級結構為亮氨酸-纈氨酸-纈氨酸-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-蘇氨酸-賴氨酸(NH2-WEKLGSMETL-COOH)。
中華硬蜱神經肽的製備方法(1)將飢餓的雌雄中華硬蜱成蟲粘於表面皿的底部並置於冰上20min，隨後沿背側緣切開硬蜱取出神經節，將神經節轉移到0.1M的乙酸中，衝洗三次，最後置於0.1M的乙酸中並於-20℃保存；(2)將從10,000個中華硬蜱中分離到的神經節於3ml含有30μl蛋白酶混合抑制劑的0.1M的乙酸中勻漿，勻漿液於5000轉/min離心5min，收集上清並用3kDa的膜過濾，濾液通過5mm×300mm hypersil ODS2 5μm RP-HPLC；(3)過柱程序為首先用含有0.1％三氟乙酸的無菌水平衡柱子6min，流速為0.7ml/min，每次上樣200μl，接著在50min內用含有0.1％三氟乙酸的乙氰在15-50％的梯度衝洗柱子，最後用100％的含有0.1％三氟乙酸的乙氰衝洗柱子，樣品通過觀察紫外280的吸收來收集，收集所出現的峰；將有鎮痛活性峰經同樣的程序再次過RP-HPLC，收集具有相應活性的峰即為中華硬蜱神經肽。
本發明採用基質輔助雷射解吸離子化-飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)測定分子量，用等電聚焦電泳測定小肽的等電點，通過Edman降解法測定胺基酸序列結構。
中華硬蜱神經肽作為製備鎮痛藥物的應用。
下面我們用本發明的中華硬蜱神經肽的動物試驗結果來說明本發明的鎮痛作用採用熱板法來測定樣品的鎮痛作用。實驗小鼠(雄性，22±2g)購於昆明試驗動物中心，飼養於室溫為25±2℃，光照周期為12/12的籠內，自由採食和供給充足的飲水，試驗時隨機分組，每組20隻。
將濃度分別為0.2μM、0.4μM、0.6μM小肽的生理鹽水20μl注射到實驗組小鼠後足足底內側，參照組小鼠分別注射20μl的生理鹽水。注射樣品後將小鼠放在50℃恆溫的鐵板上觀察其疼痛相關行為(舔足，抖足，縮足)的發生的頻率。所有的試驗都重複4次。數據分析採用單尾Student’s t-test，P＜0.05被認為差異顯著。結果見圖1。由圖可見，中華硬蜱神經肽具有很強的鎮痛作用，其顯著降低了疼痛相關行為的發生頻率(P＜0.05)，而且鎮痛作用隨著劑量的遞增而增強。
本發明的中華硬蜱神經肽是一種首次從中國常見的硬蜱中得到的具有很強鎮痛活性的新的小肽。


圖1為本發明中華硬蜱神經肽的鎮痛作用結果圖。
圖2為本發明中華硬蜱神經肽的第一次RP-HPLC圖。
圖3為本發明中華硬蜱神經肽的第二次RP-HPLC圖。
圖4為本發明中華硬蜱神經肽的基質輔助雷射解吸離子化-飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)圖。
具體實施例方式1、製備中華硬蜱神經肽把飢餓的雌雄中華硬蜱成蟲粘於表面皿的底部並置於冰上20min，接著沿背側緣切開硬蜱取出神經節。將神經節轉移到0.1M的乙酸中，衝洗三次，最後置於0.1M的乙酸中並於-20℃保存。
將從10,000個中華硬蜱中分離到的神經節於3ml含有30μl蛋白酶混合抑制劑(Sigma)的0.1M的乙酸中勻漿，勻漿液於5000轉/min離心5min，收集上清並用3kDa的膜(Millipore)過濾。將濾液通過5mm×300mm hypersil ODS2 5μm RP-HPLC(大連伊利特)。過柱程序為首先用含有0.1％三氟乙酸的無菌水平衡柱子6min，流速為0.7ml/min，每次上樣200μl，接著在50min內用含有0.1％三氟乙酸的乙氰在15-50％的梯度衝洗柱子，最後用100％的含有0.1％三氟乙酸的乙氰衝洗柱子，樣品通過觀察紫外280的吸收來收集。收集所出現的峰，將有鎮痛活性峰經同樣的程序再次過RP-HPLC，收集具有相應活性的峰即為中華硬蜱神經肽。
2、分子量採用基質輔助雷射解吸離子化-飛行時間質譜(matrix-assisted laserdesorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)測定，溶解介質為含有a-氰基-4-羥基肉桂酸的已氰。
3、用等電聚焦電泳測定小肽的等電點，通過Edman降解法測定胺基酸序列結構。
通過上述製備方法，我們首次從中華硬蜱神經節中分離得到了中華硬蜱神經肽，其為一種具有10個胺基酸的單鏈小肽，分子量為1005.22，等電點8.59，小肽全序列一級結構為亮氨酸-纈氨酸-纈氨酸-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-蘇氨酸-賴氨酸(NH2-LVVYPWTK-COOH)。
中華硬蜱神經肽經實驗表明其具有很強的鎮痛活性，可作為製備鎮痛藥物的應用。
權利要求
1.中華硬蜱神經肽，其特徵為該神經肽是從中華硬蜱神經節中分離得到的一種單鏈小肽，分子量1005.22道爾頓，等電點8.59，小肽全序列一級結構為亮氨酸-纈氨酸-纈氨酸-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-蘇氨酸-賴氨酸。
2.權利要求1所述中華硬蜱神經肽的製備方法，其特徵在於該方法步驟如下(1)將飢餓的雌雄中華硬蜱成蟲粘於表面皿的底部並置於冰上20min，隨後沿背側緣切開硬蜱取出神經節，將神經節轉移到0.1M的乙酸中，衝洗三次，最後置於0.1M的乙酸中並於-20℃保存；(2)將從10,000個中華硬蜱中分離到的神經節於3ml含有30μl蛋白酶混合抑制劑的0.1M的乙酸中勻漿，勻漿液於5000轉/min離心5min，收集上清並用3kDa的膜過濾，濾液通過5mm×300mm hypersil ODS2 5μm RP-HPLC；(3)過柱程序為首先用含有0.1％三氟乙酸的無菌水平衡柱子6min，流速為0.7ml/min，每次上樣200μl，接著在50min內用含有0.1％三氟乙酸的乙氰在15-50％的梯度衝洗柱子，最後用100％的含有0.1％三氟乙酸的乙氰衝洗柱子，樣品通過觀察紫外280的吸收來收集，收集所出現的峰；將有鎮痛活性峰經同樣的程序再次過RP-HPLC，收集具有相應活性的峰即為中華硬蜱神經肽。
3.權利要求1所述的中華硬蜱神經肽作為製備鎮痛藥物的應用。
全文摘要
本發明涉及一種中華硬蜱神經肽及其製備方法和應用，屬於生物醫學技術領域。中華硬蜱神經肽是從中國節肢類動物中華硬蜱神經節中分離得到的一種單鏈小肽，分子量1005.22道爾頓，等電點8.59，小肽全序列一級結構為NH
文檔編號A61P25/04GK1683392SQ20051001066
公開日2005年10月19日 申請日期2005年2月23日 優先權日2005年2月23日
發明者賴仞, 李健許, 徐學清, 楊海龍 申請人:中國科學院昆明動物研究所