提高細胞生存能力的方法

2023-10-10 22:37:14 2

專利名稱：提高細胞生存能力的方法
背景技術：
細胞移植(例如，器官)目前廣泛用於多種人類疾病的治療。例如，已對具有心臟缺陷的病人進行常規的心臟移植。然而，移植中的一個主要障礙是用於移植的高質量組織的缺乏。許多細胞(例如，器官)由於採集後的不良存活率而最終未能移植。因此非常需要提高移植的細胞生存能力的方法。
可用移植的一個疾病實例為帕金森氏症(Parkinson′s disease)。帕金森氏症(PD)是一種影響一百萬至一百五十萬美國人的中樞神經系統病症。PD可以在任何年齡出現，但是發展為PD的風險隨著年齡而增加。此外，PD在世界各處存在，且影響男性比女性稍微更常見些。PD的症狀可包括僵直、顫抖、運動徐緩、步行困難和/或平衡困難。患PD的人通常不會經歷所有的這些症狀，而更多是這些症狀的部分。
PD的確切病因是未知的。一般認為PD由遺傳易感性和至今未經確認的環境觸發機制的組合引起。當PD出現時，在腦中稱為黑質，其產生多巴胺的區域內發現退行性病變。多巴胺是一種能使人正常和自如運動的化學物質。PD以多巴胺的嚴重不足為特徵。一般認為多巴胺的不足引起PD的症狀。
在PD患者中人胚胎多巴胺神經元的移植目前已在臨床試驗中評估(A.Bjrklund等.，Nat.Neurosci.3537-544，2000.)。雖然已有報導說少數PD患者顯示出腦中多巴胺含量的正常化且在神經移植後恢復至正常的生活(J.H.Kordower等.，J.Comp.Neurol.370203-230，1996；P.Piccini等.，Nat.Neurosci.21137-1140，1999)，大多數移植患者呈現不完全的症狀康復(C.R.Freed等.，N.Engl.J.Med.344710-719，2001；Lindvall，O.，Cell Transpl.4393-400，1995)。一些因素可能導致了該限制。其中，移植的多巴胺神經元的損失為實現臨床改善的一個主要障礙。許多動物試驗和臨床研究表明當利用細胞懸浮技術將多巴胺神經元移植入腦中時(P.Brundin等.Prog.Brain Res.71293-308，1987；N.Nakao等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9112408-12412，1994；H.Sauer等.，Restor.Neurol.Neurosci.2123-135，1991；H.Sauer等.，Exp.Brain Res.9054-62，1992；G.S.Schierle等.，Nat.Med.597-100，1999；A.Zuddas等.，Eur.J.Neurosci.372-85，1991)移植的多巴胺神經元的存活率僅約10％。
在最近的綜述中，據估計對於顯著的臨床效果估計需要最少80,000多巴胺神經元(A.Bjrklund等.，Nat.Neurosci.3537-544，2000)。然而，一些臨床研究證實腦中存活的多巴胺神經元數目遠遠少於患者抽樣中的數目(C.R.Freed等.，N.Engl.J.Med.344710-719，2001)。因此多巴胺神經元存活率的提高成為一個適當的論題(P.Brundin等.，Cell Transplant.9179-195，2000)。此外，多巴胺神經元存活率的改進可繞過人胚胎多巴胺組織受限制的可利用性，其為神經移植臨床應用中的一個障礙。
有確實證據表明凋亡在移植的多巴胺神經元損失中起作用(M.Emgard等.，Exp.Neurol.160，279-288，1999；T.J.Mahalik等.，Exp.Neurol.12927-36，1994；G.S.Schierle等.，Nat.Med.597-100，1999；W.M.Zawada等.，Brain Res.786，96-103，1998)。此外，在移植後最初的幾天內通常發生凋亡(M.Emgard等.，Exp.Neurol.160，279-288，1999；G.S.Schierle等.，Nat.Med.597-100，1999；W.M.Zawada等.，Brain Res.786，96-103，1998)。在一體外研究中，發現與多巴胺神經元的損失相關的凋亡主要在最初的24小時期間發生，且約50％的多巴胺神經元已在最初的8小時內喪失(R.L.Branton等.，Exp.Neurol.16088-98，1999)。這些研究提供了對於上述觀察到的移植後黑質移植物中立即出現大多數細胞死亡的可能的解釋(R.A.Barker等.，Exp.Neurol.14179-93，1996；W.-M.Duan等.，Exp.Brain Res.104227-242，1995)。
由於PD患者中人胚胎多巴胺神經元的神經移植呈現不完全的症狀康復，因此仍舊有減少患者中移植細胞損失的需求。這些需求不僅可應用於PD的神經元移植，還可用於其他的移植應用。
發明概述本發明提供提高移植入受體中的移植細胞群生存能力的方法。優選受體為人受體，且提高移植細胞群的生存能力包括將該移植細胞群與選自親水膽汁酸，其鹽，其類似物，和其組合的有效量的化合物接觸。
移植細胞群的細胞可包括，例如，已分化細胞和前體細胞。此外，移植細胞群的細胞可包括自體細胞、異種細胞或異體細胞。另外，移植細胞群的細胞可包括自體組織、異種組織或異體組織的至少一部分。對於某些實施方案，該細胞群可以是器官的形式，或其部分，例如肝臟、心臟、腎、肺和胰腺。優選該細胞群為人細胞群。
接觸可在體外、體內和其組合進行。如此處使用的，體外不同於體內。體外指要處理的移植細胞群的人為環境場所，如在組織培養皿中的細胞培養。體內指要處理的細胞群的自然環境場所，如在哺乳動物體中。
本發明的一個方面提供一種包括在移植細胞群移植入受體前將該移植細胞群與化合物接觸的方法。此可以在移植細胞群從供體取出之前(體內)或之後(體外)進行。或者，此可以在該移植細胞群已經移植入受體後進行。
另外或可選擇地，本發明提供一種包括用化合物處理將接受移植細胞群的受試者的方法。例如，用化合物處理受體可包括在移植細胞群移植入受體之前將化合物給予受體。另外，如上所述，用化合物處理受體可包括在移植細胞群移植入受體之後將化合物給予受體。在後一實施例中，受體可以在移植細胞群移植入受體之前已經用化合物處理過。優選處理受體包括用化合物經腸胃外或口服處理受體。
本發明還提供用選自親水膽汁酸，其鹽，其類似物，和其組合的化合物處理移植細胞群的供體和/或受體的方法。如此處所述的，用於本發明的親水膽汁酸可包括，但不限於熊去氧膽酸和/或牛磺熊去氧膽酸。
本發明的一個方面提供一種包括用化合物處理移植細胞群的供體的方法。此可以在移植細胞群從供體取出之前(體內)、期間(體內)或之後(體外)進行。另外地或除此之外，本發明提供一種包括用化合物處理移植細胞群的受體的方法。此可以在移植細胞群移植入受體之前(體內/體外)、期間(體內)或之後(體內)進行。
本發明的另一個方面是一種用於治療患有需要細胞置換的疾病的受體，優選人的方法。例如本發明可提供一種用於治療患有帕金森氏症的受體，優選人的方法。該方法可包括將移植細胞群與選自熊去氧膽酸，其鹽，其類似物，和其組合的有效量的化合物接觸而提高該移植細胞群的生存能力。該方法隨後進一步包括將該移植細胞群移植入受體。
熊去氧膽酸的類似物的一個實例包括綴合(conjugated)衍生物，其中該綴合衍生物可以是牛磺熊去氧膽酸。在一個具體的實施例中，本發明的方法可包括治療患有帕金森氏症的人，其中該方法包括體外將移植細胞群與和藥學可接受載體組合的有效量的牛磺熊去氧膽酸接觸，其中該移植細胞群為已分化細胞。該方法隨後進一步包括將該移植細胞群移植入人。
如上所述，用於患有帕金森氏症人的移植細胞群可包括已分化細胞和前體細胞。此外，移植細胞群的細胞可包括自體細胞、異種細胞或異體細胞。另外，移植細胞群的細胞可包括自體組織、異種組織或異體組織的至少一部分。接觸步驟可在體外、體內和其組合進行。在一個實施方案中，該細胞群為人細胞群。
附圖簡述


圖1為概括TUDCA(50μM/ml)對TH-陽性神經元(陰影柱)以及中腦腹面(VM)組織培養物中總細胞(空白柱)存活率影響的條形圖。柱代表每個培養條件下四個孔的三個獨立實驗的平均值±S.E.M.。 *p＜0.01，與7DIV+TUDCA培養的顯著差異(用事後Scheffé’s F檢驗的單-因素方差分析)。
圖2為表明在VM組織培養物中TUDCA(50μM/ml)對凋亡影響的條形圖。柱代表每個培養條件下四個孔的三個獨立實驗的平均值±S.E.M。*p＜0.01，與2DIV和7DIV+TUDCA培養的顯著差異(用事後Scheffé’s F檢驗的單-因素方差分析)。
圖3為表明對對照組和TUDC處理組超過90分鐘試驗時間的淨同側安非他明-誘導的旋轉不對稱性(每分鐘(min)對側向損毀側的完全旋轉減去同側向損毀側的旋轉)的柱狀圖。大鼠在移植前和移植後2個和6個星期檢測。每個柱代表組平均值而誤差線表示S.E.M。*當與移植前的值比較時p＜0.01(成對Student t檢驗)而當與對照組比較時p＜0.05(用事後Scheffé’s F檢驗的單-因素方差分析)。符號 當與移植前的值比較時p＜0.01(成對Student t檢驗)。
圖4A-4E為通過移植的紋狀體經TH-免疫細胞化學處理的冠狀面顯微照片。照片顯示移植後六個星期TUDCA-處理組(A、C和E)和對照組(B和D)中樣本鼠的典型移植。(A)和(B)表明低放大率下移植腦的概貌。靠近移植物的宿主紋狀體區通過來自移植神經元的TH-免疫陽性纖維而進行神經移植。標尺在B中＝1mm，在D中＝100μm而在E中＝25μm。
圖5為對照組和移植後六個星期TUDCA-處理組中TH-免疫陽性細胞平均數和移植物體積的條形圖。每個柱代表組平均值±S.E.M。*當與TUDCA-處理組比較時p＜0.01(用事後Scheffé’s F檢驗的單-因素方差分析)。
圖6為表明對照組和移植後4天的TUDCA-處理組移植區中凋亡細胞平均數的柱狀圖。TUDCA-處理組中移植區中凋亡細胞的數目明顯少於對照組。星號表明與對照組相比p＜0.01(用事後Scheffé’s F檢驗的單-因素方差分析)。誤差線代表S.E.M。
例證性實施方案的詳細說明目前，需要有效的處理以提高用於治療各種醫學病症的移植細胞群的生存能力。本發明提供用於提高移植細胞群生存能力的所述方法。該方法可包括將移植細胞群與選自親水膽汁酸，其鹽，其類似物，和/或其組合的有效量的化合物在移植細胞群移植入受體之前、期間或之後接觸。
如此處使用的″提高″移植細胞群的生存能力包括維持、延長和/或改善將要移植的，或已經移植入受體的移植細胞群的存活率和/或增殖。此外，術語″生存能力″指一般在體內維持移植細胞群中細胞的正常功能，然而該術語也包括在體外。
術語″延長″指相比未經過所述處理的類似移植細胞群，用於移植的移植細胞群通過用本發明的方法處理而保存。雖然不希望被特定的理論所束縛，但是一般認為將用於移植的移植細胞群與本發明的化合物接觸抑制了凋亡，由此延長了該移植細胞群的生存能力。
如此處使用的，″移植細胞群″包括，但不限於，已經或可移植入受體的單獨的細胞群和存在於組織和/或器官中的細胞群。同樣地，移植細胞群的細胞可包括在組織和/或器官中發現的基質結構(例如，蛋白、多糖、多肽及其他分子)。如此處使用的″一個，″，″″至少一個，″和″一個或多個″可互換使用。
具有能通過提高的移植細胞群生存能力而改善的醫學病症的患者包括那些患有神經變性疾病如帕金森氏症和阿爾茨海默氏病；亨廷頓氏疾病；多發性硬化；肌萎縮性側索硬化；小腦共濟失調；溶酶體貯藏變質；癌症；先天缺陷；那些需要器官和/或組織移植的；脊髓損傷；缺血性損傷如中風、缺血性腎病和心臟病；燒傷；自主免疫疾病；糖尿病；炎症性疾病如骨關節炎和類風溼性關節炎的患者。然而該列舉並不是窮盡的，其他已知的可通過用於移植的移植細胞群提高的生存能力而改善的醫學病症也認為在本發明的範圍之內。
對於測定移植細胞群生存能力的提高，如此處定義的，可通過測定該移植細胞群中細胞的ATP水平和蛋白質合成能力而評估。ATP水平在移植期間和之後影響能量的產生。蛋白質合成能力是細胞生存能力的常規指標，因為蛋白質合成需要一些複雜生化途徑的整合。
優選移植細胞群可包括用於移植入受體的獲自供體的移植細胞群。移植細胞群可來源於兒童、成人或胎兒組織。優選移植細胞群可包括，但不限於，來源於血液及其所有組分，包括紅血球、白血球、血小板、血清、造血幹細胞；中樞神經組織，包括腦和脊髓組織、神經元、神經膠質和神經幹細胞；外周神經組織，包括神經節、垂體後葉腺、腎上腺髓質和松果體；結締組織，包括皮膚、皮膚幹細胞、韌帶、腱和成纖維細胞；肌肉組織，包括骨胳、骨骼肌幹細胞、平滑肌和心臟組織或其中的細胞；內分泌組織，包括垂體前葉腺、甲狀腺、甲狀旁腺、腎上腺皮質、胰腺和其亞單元(例如，胰島細胞)、睪丸、卵巢、胎盤和每個這些組織部分的內分泌細胞；血管，包括動脈、靜脈、毛細血管和來自這些血管的細胞；肺組織；心臟組織；腦組織；心臟瓣膜；肝臟；腎；腸；骨；免疫組織，包括血細胞、骨髓和脾臟；脂肪組織，包括來源於脂肪組織的成體祖細胞(例如，成體幹細胞)；眼睛和其部分；生殖道組織和泌尿組織的細胞群體。完整的器官為移植細胞群的常見形式。
如此處使用的術語″器官″是指包括完整的多-細胞器官如腎、肝臟、腦或心臟的整個或一部分；來源於多-細胞器官的細胞懸液；以及血細胞或造血祖細胞的懸液。如此處使用的″組織″是指包括移植細胞群和其相關的胞內基質(例如，膠原、蛋白、多糖等等)的集合體。移植細胞群還可以包括已分選的和/或分離自其來源的組織和/或器官的單個細胞。
對於那些包括已分選的和/或分離的細胞的移植細胞群，該用於移植入受體的移植細胞群可包括已分化細胞和/或前體細胞(例如，未分化細胞)。舉例來說，已分化細胞可包括，但不限於此處所述的細胞，包括但不限於，心肌細胞、肌細胞、平滑肌細胞、表皮細胞、包括多巴胺神經元的神經元、胰腺細胞、骨髓細胞、肝和非肝細胞。舉例來說，前體細胞可包括，但不限於幹細胞、多能幹細胞、胚胎幹細胞和成體幹細胞。
優選用於本發明的移植細胞群的細胞包括，但不限於，自體細胞、異源細胞、異體細胞或其組合。如上所述，細胞還可以包括那些形成組織和/或器官的一部分的細胞。所以，對於本發明，細胞可包括自體組織、異源組織、異體組織和/或其組合的至少一部分，其中該組織可移植入受體。
如此處使用的，「受體」可包括哺乳動物。優選此處所用的受體為人。如此處使用的″供體″可包括用作生物材料來源的哺乳動物，如用於移植入受體的細胞群(包括器官)的一部分或所有。供體可包括，但不限於，人、豬、非-人靈長類、牛或其組合。此外，供體在細胞群捐贈期間可以是活的。
此外，可以理解的是如此處定義的用於移植的移植細胞群可來源於任何種類。本發明可用於保存在同種移植中用於受體如人及其他人供體(同種異體移植和自體或異源移植)或例如從另一物種如羊、豬、母牛或非-人靈長類(異種移植)移植至人受體的移植細胞群。所述用於移植的移植細胞群包括，但不限於，心臟、肝臟、腎、肺、胰腺、胰島、腦、角膜、骨、腸、皮膚、血液和來自上述器官和組織的細胞。
優選將該移植細胞群與本發明有效量的一個或多個化合物接觸可在體外和/或體內完成。例如，移植細胞群可在將該移植細胞群移植入受體之前在體內與本發明的化合物接觸。完成此的一個優選方法包括用本發明的一個或多個化合物處理移植細胞群的供體。
在本發明的一個方面中，移植細胞群的供體可在該移植細胞群從供體取出之前(體內)、期間(體內)或之後(體外)用本發明的化合物處理。因此，移植細胞群可與本發明的化合物接觸而仍然在供體中(體內)。或者，移植細胞群可在取出期間或該移植細胞群從供體取出時與本發明的化合物接觸。對於部分器官的供體，例如，有益於供體可通過在該器官部分取出之前和/或之後給予本發明的化合物而實現。優選該移植細胞群被灌注和/或浸潤或在該移植細胞群的收穫、儲存、培養和/或移植期間與本發明的化合物接觸。
此外，本發明的化合物可用於在體內處理接受移植細胞群的受體。此可以在移植細胞群移植入受體之前(體內/體外)、期間(體內)或之後(體內)進行。因此，接受移植細胞群的受體也接受用本發明的化合物處理是可能的。例如，受體可用化合物通過在該移植細胞群移植之前(即，前-細胞群移植)、期間(即，在移植該移植細胞群的同時)和/或之後(即，後-細胞群移植)將本發明的化合物給予受體而全身或局部處理。
在另一個實施例中，移植細胞群可在將該移植細胞群移植入受體之後在體內與本發明的化合物接觸。因此，一旦移植細胞群已植入受體，該移植細胞群可與本發明的化合物接觸。此外，可以將本發明的化合物用於此處所述的體內/體外處理方式的不同組合中。
在一個具體的實施例中，從移植前的預定時間開始，受體可服用免疫抑制藥物以增強移植接受性。移植之前受體可立即服用本發明的一個或多個化合物。隨後供體的異源移植細胞群可用包含至少一種本發明化合物，例如牛磺熊去氧膽酸(TUDCA)的溶液衝洗。經標準的外科手術移植後，受體通常用常規的免疫抑制藥物和任選地，用本發明的化合物維持。在與免疫應答有關的臨床徵象和症狀基礎上，可降低免疫抑制劑劑量。
如此處使用的術語″有效量″包括本發明化合物可有效提高移植細胞群生存能力的有效劑量水平。雖然發明人不想被任何理論所束縛，一般認為″有效量″是有效防止、降低、抑制或阻遏將移植的細胞和/或已經移植的細胞凋亡的量。此處所述的所需化合物的有效劑量可通過在動物模型中比較其體外活性和體內活性而確定。小鼠及其他動物至人的有效劑量的推測方法是本領域已知的。
然而可以理解的是，用於任何具體受體(或供體)和/或移植細胞群的特定「有效量」將取決於多種因素，包括所用特定化合物的活性；移植細胞群；移植細胞群收穫、分離、儲存和/或當移植細胞群在體外維持時孵育的條件；以及當用於體內時的年齡、體重、總的健康狀況、性別、飲食、給藥時間、給藥途徑、排洩率、藥物組合和將處理的受體(或供體)醫學病症的嚴重程度。
優選移植細胞群在保存期間與本發明的化合物接觸。移植細胞群的保存可包括移植細胞群維持的條件。或者，移植細胞群的保存還可以包括促進移植細胞群生長和增殖的移植細胞群所處的條件。任何一種情況下，移植細胞群可與有效量的本發明化合物接觸。
為了提高移植細胞群在移植前的存活率，可將本發明的化合物和用於移植入受體的細胞的培養的細胞培養基一起使用。化合物的濃度取決於多種因素，包括溶解性和活性。
優選本發明的方法涉及使用親水膽汁酸、其鹽、其類似物或其組合。如此處使用的，親水膽汁酸比脫氧膽酸(DCA)更加親水。此可通過用更傾向於水的更親水的膽汁酸評估在水和辛醇間的分配係數而確定。或者，更親水的膽汁酸在高效液相色譜法的反-相柱上具有更早的保留時間。一種特別優選的親水膽汁酸包括熊去氧膽酸。親水膽汁酸類似物的實例包括膽汁酸的綴合衍生物。雖然不是所有的親水膽汁酸在本發明的所有方法中均有用，但是其可以很容易地通過利用已知誘導凋亡的試劑在細胞培養中檢驗其抑制凋亡的能力而評估。兩個特別優選的綴合衍生物包括甘氨-和牛磺-熊去氧膽酸。
熊去氧膽酸(UDCA)是一種在過去幾十年中臨床用於治療多種肝臟疾病的內源膽汁酸。UDCA的綴合衍生物包括熊去氧膽酸3-硫酸鹽、熊去氧膽酸7-硫酸鹽、熊去氧膽酸3，7-焦硫酸鹽、牛磺熊去氧膽酸(TUDCA)和甘氨熊去氧膽酸。
一般對於優選的實施方案，此處所述的化合物可配製成藥物組合物。隨後按照本發明的方法，移植細胞群可隨後與包含本發明化合物的藥物組合物接觸。此外，包含本發明化合物的藥物組合物可以適合所選給藥途徑的多種形式而施予受體，一般為哺乳動物如人受體。製劑包括那些適於體外細胞培養以及經口服、直腸、陰道、局部、鼻、眼、腸胃外(包括皮下、肌內、腹膜內、靜脈內、鞘內、心室內、直接注射入腦組織，等等)施予的。
製劑可以很方便地以單元劑型存在且可通過藥劑學領域熟知的任何方法製備。通常所述方法包括將活性物質與載體結合的步驟，其可包括一種或多種輔助組分。通常，製劑通過將活性物質均勻和緊密地加入液體載體、精細粉碎的固體載體或兩者中，隨後如有必要，將產品定型為所需劑型而製備。
本發明適於口服的劑型可以是分散的單元如片劑、錠劑、膠囊、糖錠、薄片或扁囊劑，每個包含預定量的凋亡限制化合物，其為以顆粒狀結合入脂質體內的粉末，或在水相液體或非水液體如糖漿、酏劑、乳劑或牽引劑中的溶液或懸浮液。
片劑、錠劑、丸劑、膠囊等等還可包含以下一種或多種結合劑如黃蓍樹膠、阿拉伯膠、玉米澱粉或凝膠；賦形劑如磷酸二鈣；崩解劑如玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、藻酸等等；潤滑劑如硬脂酸鎂；甜味劑如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴特；以及天然的或合成的香味料。當單元劑型為膠囊劑時，其可進一步包含液體載體，如植物油或聚乙二醇。各種其他的材料可以包衣或另外改變該固相單元劑型的物理形式而存在。例如，片劑、丸劑或膠囊可以包被凝膠、蠟、蟲膠、糖等等。糖漿劑或酏劑可包含一種或多種甜味劑、防腐劑如甲基-或羥苯丙酯、延遲糖結晶的試劑、提高任何其他組分溶解度的試劑如多元醇，比如甘油或山梨糖醇、染料以及調味劑。用於製備任何單元劑型的材料在所用量基本無毒。如果需要，該化合物可以結合入維持-釋放製劑和裝置中。
適於在本發明方法中使用的化合物還可以作為添加劑、補充劑等等直接加入受體飲食的食物中。由此，本發明進一步提供一種食品。雖然加工食品已用作營養添加或增強的來源，但任何食物都適合該目的，如麵包、穀物、乳等等適合用於該目的。
適於方便腸胃外投藥的劑型包括所需化合物的無菌水製劑或包括該化合物的無菌粉末懸浮液，其優選與受體的血液等滲。可包含在液體藥劑中的等滲試劑包括糖、緩衝液和鹽如氯化鈉。所需化合物的溶液可在水中製備，任選與無毒的表面活性劑混合。所需化合物的懸浮液可在水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、液態聚乙二醇等等)、植物油、甘油酯和其混合物中製備。最終的劑型是無菌的、液體的且在生產和保存條件下是穩定的。必要的流動性可例如通過利用脂質體、通過應用在懸浮情況下合適的粒子大小或通過利用表面活性劑而實現。液體藥劑的滅菌可通過任何保留所需化合物生物活性的便利方法，優選通過過濾滅菌而實現。用於製備粉劑的優選方法包括該無菌可注射溶液的真空乾燥和冷凍乾燥。其後的微生物汙染可利用各種抗微生物劑例如，包含對羥苯甲酸、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、乙基汞硫代水楊酸鈉等等的抗菌劑抗病毒劑和抗真菌劑而防止。所需化合物超過一定延長時期的吸收可通過包含延緩試劑例如，單硬脂酸鋁和凝膠而實現。
鼻噴劑型可包含所需化合物和防腐劑以及等滲試劑的純化水溶液。上述劑型優選調節至與鼻黏膜相適應的pH和等滲壓狀態。眼用劑型通過和鼻噴劑型類似的方法製備，除了pH和等滲條件優選調節至與眼睛相匹配。直腸或陰道給藥的劑型可以是帶有合適載體如可可脂或氫化脂肪或氫化脂肪羧酸類的栓劑。
此外，本發明的化合物可通過合適的功能性而修飾以提高其選擇性生物學特徵。所述修飾在本領域已知且包含那些提高進入給定的生物系統(例如，血液、淋巴系統、中樞神經系統、腦)的生物學穿透作用、提高口服利用率、提高溶解度以允許通過注射給藥、改變代謝作用和改變利用率的修飾。此外，化合物可以改變成前體藥物形式以使所需的化合物在受體體內作為對該前體藥物的代謝作用或其他生化過程的結果而產生。前體藥物形式的一些實例包括含有酮或醛基化合物的縮酮、縮醛、肟和腙的形式。
本發明的化合物可經體內投遞時，化合物的劑量水平取決於投遞該化合物的路徑。例如，當經口服投遞時，本發明化合物的劑量水平優選每天每公斤體重約10毫克或更多、15毫克或更多或50毫克或更多左右。此外，在一優選的實施方案中，用於口服投遞的本發明化合物的劑量水平優選每天每公斤體重約100毫克或更少、50毫克或更少或15毫克或更少左右。優選用於口服投遞的本發明化合物的劑量水平在每天每公斤體重約10毫克至約100毫克左右的範圍內。在一個實施例中，通過口服給藥的有效量在每天每個受體約500毫克至約1000毫克左右。
在另外的一個實施例中，當本發明的化合物經靜脈內投遞時，本發明化合物的劑量水平優選高於經口服投遞的。例如，當靜脈內投遞時，本發明化合物的劑量水平可在每天每公斤體重約10毫克或更多、15毫克或更多或100毫克或更多左右。此外，在一優選的實施方案中，用於靜脈內投遞的本發明化合物的劑量水平優選每天每公斤體重約200毫克或更少、100毫克或更少、50毫克或更少或15毫克或更少左右。優選用於靜脈內投遞的本發明化合物的劑量水平在每天每公斤體重約10毫克至約200毫克左右的範圍內。
高於或低於此處所述的劑量水平也是可行的。當本發明化合物投遞至受體時，該化合物可以單次或多次用於注射、輸液和/或口服的劑量投遞。
提高用於移植入受體的移植細胞群的生存能力將會很有用的一個實例是患有帕金森氏症(PD)患者的治療。PD中，在黑質發現退行性病變。黑質是產生多巴胺，一種能使人正常和自如運動的化學物質的腦區。PD以多巴胺的嚴重不足為特徵。一般認為多巴胺的不足引起PD的症狀。雖然此處所述的化合物被認為在肝和非肝細胞中對調節凋亡閾值起作用，意想不到的是由於黑質退行性病變的未知原因，其可用於PD的治療。同樣地，意想不到的是由於其涉及在移植細胞群移植所需時間期間該移植細胞群的凋亡，其可用於提高移植細胞群的生存能力。換言之，令人驚訝的是本發明的化合物和所用化合物的量可以抑制移植細胞群的凋亡足夠久以使移植細胞群的移植髮生在受體。此外，意想不到的是由於與移植的多巴胺神經元損失有關的未知原因，其可用於提高移植細胞群的生存能力。
確實證據表明在體外和體內，凋亡在多巴胺神經元的損失中起作用。因此，本發明可用於維持將要移植入受體的細胞的生存能力的一個實例為施予有效量的親水膽汁酸、其鹽、其類似物或其組合以在培養物和移植體中阻斷凋亡通路而引起多巴胺神經元存活率的增強和黑質移植物功能的改善。抗-凋亡試劑可在移植前或移植後最初的幾天期間用於移植細胞群的製備以防止凋亡和提高移植物的存活率。
優選熊去氧膽酸(UDCA)、其鹽、其類似物(例如，綴合衍生物牛磺熊去氧膽酸(TUDCA))和其組合可用於提高用於治療PD患者的移植細胞群的生存能力。例如，通過本領域標準方法獲得的人胚胎多巴胺神經元懸浮液可經本發明的方法處理而用於受體的神經移植。例如作為體外治療，可擴充人多巴胺神經元(自體重建)或來源於單獨的其他受體(異源重建)的多巴胺神經元而用於PD的治療或預防。如此處公開的，TUDCA呈現抗-凋亡特性，其中TUDCA在移植前添加至細胞懸液可引起黑質移植物存活率的提高。此證實細胞懸液用TUDCA的預處理可降低凋亡且提高已移植細胞的存活率，引起行為康復的改善。
本發明的優點通過下列實施例說明。然而，實施例中所述的具體原料和用量以及其他條件和細節將解釋為本領域中所廣泛應用的，而不應解釋為不適當地限制本發明。
實施例在下列實施例中，進一步表徵了親水膽汁酸對神經網絡中細胞凋亡的作用以及描述了牛磺熊去氧膽酸(TUDCA)-誘導的神經元保護作用的本質和機制。具體地，TUDCA的處理引起多巴胺神經元細胞死亡和退化的顯著降低。此外，脫氧核苷酸轉移酶(TdT)-介導的2′-脫氧尿苷5′-三磷酸鹽(dUTP)-生物素缺刻末端標記(TUNEL)測定法表明TUDCA-處理的培養物中凋亡細胞的數目顯著小於對照培養物中的。
另外，當與移植前的值相比時，含有TUDCA的細胞懸液顯示安非他明-誘導的旋轉計分的明顯降低。移植後6星期當與對照相比較時，對於TUDCA-處理組，在神經移植物中酪氨酸羥化酶(TH)-陽性細胞的數目有顯著的提高(大約3倍)。移植後4天，TUDCA-處理組中移植區中凋亡細胞的數目明顯少於對照組。這些數據證實細胞懸液用TUDCA的預處理可降低凋亡且提高已移植細胞的存活率，引起行為康復的改善。
材料和方法實驗設計對於本發明，進行細胞培養和移植實驗。體外和體內試驗中，胚胎14天時在所述的無菌條件下(A.Bjrklund等.，Acta.Physiol.Scand.Suppl.5229-18；1983；P.Brundin等.，InConn，P.M.ed.Methods in Neurosciences，Lesions and transplantation.Academic Press，San Diego，Vol7，1991305-326；E.M.Grasbon-Frodl等.，Brain Res.Bull.39341-347；1996)解剖Sprague-Dawley(SD)(Charles River Labs，Wilmington，MA)大鼠胚胎的中腦腹面(VM)組織。對於每個試驗，獲得的組織切片均等分為兩個實驗組對照組和TUDCA-處理組。該研究經過明尼蘇達大學的動物管理委員會批准且在研究動物資源(美國協會批准的進行實驗動物管理認證的機構)的贊助下進行。
細胞培養實驗為了檢驗TUDCA在無血清條件下在VM組織培養物中對多巴胺神經元的凋亡和存活率的影響以及確定TUDCA的合適劑量，從SD大鼠胚胎的VM組織製備初級神經元培養物且在有和沒有TUDCA(Calbiochem，La Jolla，CA，游離鹼，溶解在0.15M(其中″M″為摩爾濃度)NaHCO3緩衝液中)添加時孵育。實驗中，研究TUDCA的劑量-應答效應且發現50μM(微-摩爾)的濃度是合適的。因此，當體外兩天後培養基轉為無血清條件時，TUDCA以終濃度50μM加至培養基中。通過計數體外兩或七天的培養物中TH-陽性細胞和TUNEL-陽性細胞而測定神經存活率和凋亡。進行總共三個不同系列的細胞培養實驗。
移植實驗在試驗開始時總共24個稱重約250克的成年雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠被用作神經移植的受體。其中，12隻大鼠經受mesostriatal多巴胺(DA)系統的大規模單側6-羥多巴胺(6-OHDA)損傷而另12隻是正常的。
6-OHDA損傷的大鼠和正常大鼠分別隨機分配至TUDCA-處理組(每個組中n＝6)或對照載體(vehicle)組(每個組中n＝6)。在12小時晝夜循環和無限制取食和飲水下，安排每籠2隻大鼠。其按照公布的國立衛生研究院指南培養和處理。
對於TUDCA-處理的大鼠，當黑質組織經胰蛋白酶化且分離後，加入50μM濃度的TUDCA。包含TUDCA的兩微升細胞懸液隨後立體定向注射入SD大鼠的紋狀體中。對於對照動物，相同量的載體溶液加入培養基中。在第一個系列的移植實驗中，接受神經移植的正常大鼠在移植後4天處死且製備用於脫氧核苷酸轉移酶(TdT)-介導的dUTP-生物素缺刻末端標記(TUNEL)測定法的腦切片以測定該移植區中的凋亡。在第二個系列的移植實驗中，利用安非他明-誘導的旋轉試驗評價移植前6-OHDA損傷的完全性，且在移植後兩個和六個星期重複以監測神經移植物的功能作用。在最後的旋轉行為測試期後處死大鼠且處理腦組織用於酪氨酸羥化酶(TH)-免疫細胞化學。移植存活率通過計數移植物中的TH-陽性神經元而評估。
中腦腹面的組織培養對於每個系列試驗，收集自24-32個胚胎的VM組織在0.1％胰蛋白酶(Sigma，St.Louis，MO)/0.05％DNase(Sigma，St.Louis，MO)中37攝氏度(℃)孵育20分鐘，且用1毫升(ml)Gilson移液管機械分離。分離後，細胞以每分鐘600轉(rpm)離心5分鐘且沉澱重懸於Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium(DMEM)(Gibco，Carlsbad，CA)中。分離細胞的細胞數目和生存能力用血細胞計數器利用臺盼藍染料排除法評估。以100,000細胞/cm2(每孔178,000個細胞)的數目塗布到用每毫升10毫克(毫克/毫升)聚-右旋賴氨酸(Sigma，St.Louis MO)預塗的四-孔腔載玻片上(Nunc，Rochester，NY)。分離細胞的生存能力超過95％。細胞培養物在補充10％胎牛血清的DMEM中37℃在95％空氣/5％CO2的溼潤大氣中孵育2天。體外2天後，培養基轉為無血清的N2培養基，其由DMEM/Ham′s F12(1∶1)的混合物(Gibco，Carlsbad，CA)組成。
在該時間點，給一些培養物補充TUDCA。
單側的6-羥多巴胺損傷如前所述(W.-M.Duan等.，Neuroscience 57261-274；1993)，在氯化鎂合劑麻醉下(0.3ml/100g體重i.p.)將6-OHDA(鹽酸鹽，Sigma，St.Louis MO)兩次注射入右側上行mesostriatal DA通路中。簡言之，第一次2.5微升(μl)6-OHDA(0.2mg/ml抗壞血酸鹽-鹽水中的3微克/微升(μg/μl)游離鹼的注射在下列位點進行前囟後4.4毫米(mm)；中線外側1.2毫米；硬膜腹側7.8毫米；齒槽(tooth-bar)設置低於耳間線2.4mm。第二次2μl 6-OHDA的注射在下列位點進行前囟後4.0毫米(mm)；中線外側0.8毫米；硬膜腹側8.0毫米；齒槽設置高於耳間線3.4毫米。6-OHDA以1μl/min的速度推進，且拔出前在注射位保留導管4分鐘。
安非他明-誘導的旋轉試驗在損傷手術兩個至三個星期後，大鼠給以每公斤5毫克(mg/kg)鹽水中的右旋安非他明硫酸鹽(Sigma，St.Louis MO)，i.p.且用自動旋轉流量計筒監測其旋轉行為90分鐘(U.Ungerstedt等.，BrainRes.24485-493；1970)。選擇呈現每分鐘7次完整的同側向損傷側旋轉的淨旋轉不對稱性的十二隻大鼠且根據淨旋轉不對稱性計分(對側向損傷側的旋轉次數減去同側向損傷側的旋轉次數)的平衡而分成兩個組。隨後在實驗設計中提及的兩個不同時間點重複旋轉測試。顯示旋轉不對稱性降低至小於移植前值50％的大鼠被認為具有有功能的移植物。
黑質組織製備和移植如前所述(A.Bjrklund等.，Acta.Physiol.Scand.Suppl.5229-18；1983；P.Brundin等.，InP.M.Conn，ed.，Methods in Neurosciences，Lesions and Transplantation，Academic Press，San Diego，Vol7，1991305-326)利用細胞懸液技術進行神經移植。簡言之，從腦蓋-至-臀部長度13-14毫米，相當於14天胚胎胎齡的胚胎獲得VM組織。該供體組織的解剖和製備在無菌條件下Hank′s平衡鹽溶液(HBSS)Gibco，Carlsbad，CA)中進行。子宮角通過動物在深度水合氯醛麻醉下(250mg/kg，i.p.)的子宮切除而取出且置於含有HBSS的塑料試管中。胚胎從子宮取出且胚胎腦分別轉入黑色背景的petri-平皿中。在解剖顯微鏡下利用虹膜切除剪刀和精細的表匠鉗子從每個腦中解剖出VM。收集該解剖的切片且在0.1％胰蛋白酶(Sigma，St.Louis MO)/0.05％DNase(Sigma，St.Louis MO)/HBSS中37攝氏度孵育20分鐘。在用0.05％DNase/HBSS漂洗4-5遍後，利用具有0.5-1.0毫米內徑焙火-打磨的巴斯德移液管逐漸解離組織至單個細胞和小的細胞凝集體的混合物。調整細胞懸液的終溶液以使五微升HBSS加入至每個VM組織解剖切片。移植前後，通過臺盼藍染料排他法評估細胞懸液的生存能力。該研究中所有細胞懸液的生存能力均超過95％。
細胞懸液的兩微升保存物(包含大約100,000細胞，相當於VM的三分之一)立體定向移植入固定在Kopf立體定向儀中的氯化鎂合劑(3ml/kg，i.p.)麻醉的受體大鼠右側紋狀體中。利用10微升的裝有鋼套(內徑＝0.25mm，外徑＝0.47mm)的Hamilton微量注射器(Hamilton Co.，Reno，NV)，在下列位點進行注射前囟嘴側1.0mm；中線外側3.0mm；硬膜表面腹側4.5mm，齒槽設置為零。進行超過2分鐘的注射且拔出前留針2-4分鐘。
免疫細胞化學該抗生物素蛋白-生物素複合的免疫過氧化物酶技術用來顯影如前所述的免疫細胞化學染色(W.-M.Duan等.，Neuroscience100521-530；2000)。對於細胞培養實驗，培養物用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS，0.2摩爾，pH7.4)漂洗一次，隨後用4％甲醛室溫下固定20分鐘。隨後培養物進行處理用於免疫細胞化學。對於移植實驗，大鼠用水合氯醛以致死劑量(500mg/kg體重，i.p.)進行深度麻醉且用0.1摩爾PBS經胃灌注隨後用冷的4％甲醛處理。隨後取出腦，在同樣的固定劑中固定4小時，且在20％蔗糖中4攝氏度放置直至沉降。切片在冷凍滑動式切片機上冠狀切為30微米厚。在移植物的全部區域，收集四個緊鄰的系列切片於四個小玻璃管中。下列一抗用於抗TH(1∶500 Pel-Freez，Rogers AR)。生物素化的羊抗-兔(大鼠-吸收的)免疫球蛋白(1∶200)(Vector Laboratories，Inc.，Burlingame，CA)用作二抗。切片在ABC溶液中孵育(Vectastain ABC Elite kit，Vector Laboratories Inc.)，隨後用3，3′-二氨基聯苯胺溶液(Vectastain DAB kit，Vector Laboratories Inc.)顯影至可見免疫活性產物。染色後，切片裝制在過冷的顯微載玻片上(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)，通過遞增梯度濃度的酒精二甲苯脫水，且用DPX封固劑(Fluka，Switzerland)封片。
末端脫氧核苷酸轉移酶-介導的dUTP-生物素缺刻末端標記測定法如前所述(W.-M.Duan等.，Neuroscience100521-530；2000)，TUNEL測定法通過利用原位凋亡檢測試劑盒(以商業名稱ApopTag銷售)根據廠家的方案(Intergen，Purchase，NY)進行。簡言之，移植後4天從每個移植動物選擇包含移植物組織的3-4個切片。將其裝制在過冷的載玻片上(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)用於下列的染色方案。切片首先在3％過氧化氫的PBS中淬滅以除去內源過氧化物酶，隨後在TdT酶和過氧化物酶-綴合的抗地高辛抗體溶液的工作濃度中孵育。3，3′-二氨基聯苯胺(Sigma，St.Louis MO)用作生色團以顯現反應產物。用甲基綠復染後，切片在酒精中脫水二甲苯中澄清且用Permount封固劑(Fisher Scientific，FairLown，NJ)封片。
形態學評估為了避免對該結果解釋的主觀偏見，所有的形態學評估以盲的方式在用對染色切片明視野照明的顯微鏡下進行(W.-M.Duan等.，Neuroscience100521-530；2000)。
細胞計數對於細胞培養實驗，如前所述(E.M.Grasbon-Frodl等.，BrainRes.Bull.39341-347；1996)，在×20和×40放大倍數下，藉助400μm正方形的網格線分別評估TH-陽性細胞的數目和細胞總數。為了以系統的方式採樣每個培養孔的代表性區域，選擇八個視野。採樣的區域覆蓋每個孔總區域的1-3％。對於移植實驗，在Nikon光學顯微鏡(Nikon，Japan)下利用10×物鏡對每個第四個切片計數移植物中TH陽性神經元。只有當其呈現至少一個軸突或具有明顯細胞核時進行細胞計數。利用20×物鏡用嵌入的網格測定TH-免疫活性細胞的平均直徑後，通過按照Abercrombie公式(M.Abercrombie，Anat.Rec.94239-247；1946)用校正係數(2.8)乘以原始計數計算TH-免疫活性神經元的總數。
TUNEL-陽性細胞計數對於細胞培養實驗，藉助400-μm正方形網格線在×400放大倍數評估TUNEL-陽性細胞的數目。以系統的方式每個培養孔選擇六個視野。對於移植實驗，每個動物計數3-4個切片的移植物區域的TUNEL-陽性細胞。計算TUNEL-陽性細胞的平均數而代表單個動物的值。
體積分析如前所述(W.-M.Duan等.，Eur.J.Neurosci.102595-2606；1998)利用計算機輔助圖象分析系統分析紋狀體內神經移植物的體積。簡言之，在Nikon光學顯微鏡(Nikon，Japan)下，其與一種高解析度數字式攝象機(COOLPIX 950，Nikon，Japan)相連接利用1×物鏡將移植物的所有TH-免疫染色切片數位化。首先收集圖像且保存在CompactFlash卡中。隨後通過利用與Pentium III PC(Dell，Dimension XPS T700r，USA)相連的CompactFlash讀卡機，閱讀該CompactFlash卡且利用軟體包(Scion Image，Version Beta4.0.2，ScionCorporation，Frederick，MD)分析圖像。每個切片中，移植物在顯示屏上手工標出且測定表面積。像素值隨後轉化成平方毫米。以移植物區域、截面厚度和頻率計算移植物體積。
統計分析上文和圖中的數據表示為平均數±SEM。利用二因素方差分析(ANOVA)進行參量統計比較；在對組-方式比較的單-因素方差分析後進行事後Scheffé’s F檢驗或Student′s t檢驗。統計顯著性水平設為p＜0.05。
結果細胞培養實驗多巴胺神經元存活率。體外2天，經過短暫處理的TH-陽性細胞表明其處於早期的發育階段。一些經過與在其附近(數據沒有顯示)的其他細胞的接觸處理。體外7天時，多巴胺神經元表現出更成熟的形態。其顯出一些具有明顯曲張的長的隆起(數據沒有顯示)。在該時間點，一些細胞體和隆起在反相下呈現顆粒狀，可能表明其正在退化。在7DIV對照培養中具有TH-陽性神經元和總細胞的顯著細胞損失(p＜0.01，用事後Scheffé’s F檢驗的單-因素方差分析)。事實上，TH-免疫陽性神經元的數目僅是2DIV培養物值的30％。在7DIV口TUDCA-處理的培養物中未觀察到該嚴重的細胞損失(數據沒有顯示)。在2DIV培養物和TUDCA-處理的培養物之間沒有發現TH-陽性細胞數目的差異(p＞0.05)(
圖1)。TUDCA以劑量-依賴的方式發揮神經保護作用。
凋亡。如圖2圖解的，7DIV對照培養物中TUNEL-陽性細胞數目明顯高於2DIV對照和7DIVTUDCA-處理的培養物中的(p＜0.01，用事後Scheffé’s F檢驗的單-因素方差分析)。
移植實驗旋轉行為。安非他明-誘導的旋轉不對稱性計分概括在圖3中。移植後2星期時，6隻TUDCA-處理大鼠的4隻與移植前的值比較表現出至少50％淨運動不對稱性的降低。相反，沒有對照動物顯示出50％運動不對稱性的降低。移植後6星期時，對照和TUDCA-處理組的所有大鼠表現出＞50％運動不對稱性計分的降低。
二-因素方差分析揭示淨旋轉計分在整個測試階段顯著的組×時間的相互作用(F(1，2)＝43.83，p＜0.001)，表明TUDCA-處理的大鼠表現出比對照大鼠更快的行為康復。事實上，移植後2星期淨旋轉值的平均數與移植前的值比較，在TUDCA-處理組中(p＜0.01，配對斯氏t檢驗法)而不是在對照組中(p＞0.05)顯著降低。此外用事後Scheffé’s F檢驗的單-因素方差分析表明TUDCA-處理組在移植後2星期表現出比對照組降低的淨不對稱性值(F(1，10)＝5.51，p＜0.05)。手術後6星期，兩組均具有顯著降低的運動不對稱性計分(配對Student′s t檢驗，p＜0.05)且兩組之間不再有任何差異(單-因素方差分析，p＞0.05)。
移植物存活率。大多數移植物在紋狀體中心是可見的且為橢圓形。其包含許多TH-免疫活性神經元和纖維(圖4)。一些移植物錯放入覆面胼胝體和沿著針管路徑的額葉皮層中。圖5概括了移植後6星期對照和TUDCA-處理組中移植物的TH-免疫活性神經元平均數。TUDCA-處理組中移植物中TH-免疫活性神經元的平均數顯著高於對照組中的。相比對照組，在TUDCA-處理組中觀察到超過三倍的移植物中TH-免疫活性神經元平均數的提高(單-因素方差分析後的事後Scheffé’s F檢驗，F(1，10)＝6.65，p＜0.05)。TUDCA-處理組中移植物體積也顯著大於對照組中的(p＜0.05，單-因素方差分析後的事後Scheffe′s F-檢驗後的單-因素方差分析，F(1，10)＝8.22)。移植後6星期，對照動物中的移植物表現出黑質移植物的典型形態。大多數TH-免疫陽性神經元位於移植物周邊，而移植物中心的相對缺少TH-免疫反應性(圖4D)。然而，看起來在該時間點，TUDCA-處理動物中的移植物缺乏黑質移植物的典型形態。大多數TUDCA-處理動物在移植區域呈現TH-免疫活性神經元的均勻分布(圖4C)。TH-免疫活性神經元具有含有一些清晰染色軸突的多極細胞體(圖4E)。發現在TUDCA-處理組中經移植物神經移植的宿主紋狀體區域大於對照組中的(圖4A和B)。
凋亡圖6概括了移植後4天對照和TUDCA-處理組中移植物區域TUNEL-陽性細胞的平均數。TUDCA-處理組中凋亡細胞的數目顯著少於對照組中的(p＜0.01，post-hocScheffe′s F-檢驗後的單-因素方差分析，F(1，10)＝20.06)。對照組中細胞核DNA片段化的大量凋亡細胞聚集且定位在移植物內(數據沒有顯示)。TUDCA-處理組中觀察到只有少數凋亡細胞在移植物內的一些小塊中(數據沒有顯示)。有時，兩組中在移植物的宿主組織周圍發現一些散布的凋亡細胞。
上述實例顯示了TUDCA在體外和體內促進多巴胺神經元存活的應用。此外，TUDCA可在VM組織培養物中和移植物內顯著降低凋亡，其提示TUDCA主要通過抗-凋亡機制對多巴胺神經元的存活發揮有益作用。與對照組相比時，TUDCA-處理組中移植物存活三倍的提高引起行為不對稱性的快速康復。這些結果證實且進一步提供對非-結合理論的支持證據，即凋亡是多巴胺神經元損失的一個原因。如果抗-凋亡試劑用於組織製備物或移植後立即使用，該顯著的細胞損失可以得到預防。
通過中腦培養中血清剝奪誘導神經元死亡的培養系統作為一種誘導凋亡的體外模型是大家所熟知的。該體外模型已廣泛用於檢驗抗-凋亡試劑和神經營養因子對VM組織培養中發生的凋亡和多巴胺神經元存活的作用(R.L.Branton等.，Exp.Neurol.16088-98；1999；E.D.Clarkson等.，Neuroreport 7145-149；1995；E.D.Clarkson等.，Cell Tissue Res.289207-210；1997；G.S.Schierle等.，Nat.Med.597-100；1999；W.M.Zawada等.，Exp.Neurol.14060-67；1996)。以上呈現的數據表明在培養基轉換為無血清條件後存在多巴胺神經元的細胞喪失。TUNEL測定法的結果提示大多數細胞損失可能是凋亡的結果。這些數據還表明TUDCA添加至培養物引起凋亡細胞數目的降低以及多巴胺神經元數目的增加，提示TUDCA主要通過抗-凋亡機制發揮對多巴胺神經元的神經保護作用。
早先的研究已經表明約80-95％的移植物DA神經元隨著移植而死亡(P.Brundin等.，Prog.Brain Res.71293-308，1987；N.Nakao等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9112408-12412，1994；H.等.，Restor.Neurol.Neurosci.2123-135，1991；H.Sauer等.，Exp.Brain Res.9054-62，1992；G.S.Schierle等.，Nat.Med.597-100，1999；A.Zuddas等.，Eur.J.Neurosci.372-85，1991)。最近發現神經移植物中的細胞死亡發生在移植過程的四個時期(P.Brundin等.，Cell Transplant.9179-195；2000.)。然而，證據表明大多數細胞損失發生在移植後的最初幾天內(M.Emgard等.；Exp.Neurol.160；279-288；1999；G.S.Schierle等.；Nat.Med.597-100；1999；W.M.Zawada等.；Brain Res.786；96-103；1998)。
已經證實一些因素導致細胞死亡。移植過程中機械損傷、缺氧和營養不足可以引起隨即的細胞死亡以及活性氧類型的產生。各種自由基可隨後引起移植的多巴胺神經元經受程序性細胞死亡。移植入紋狀體的黑質移植物是異位移植。紋狀體中的新環境未必利於黑質移植物的存活且該神經移植物可能缺乏足夠的神經營養支持。細胞懸液製備期間所用的TUDCA補充性培養基提高了神經移植物存活大約三倍且該移植物的功能也得到改善。雖然不希望被理論所束縛，這些數據提供了移植物中大多數細胞損失與凋亡密切相關的證據(G.S.Schierle等.，Nat.Med.597-100，1999；W.M.Zawada等.，Brain Res.786，96-103；1998)。此外，抗氧化劑和抗-凋亡試劑，如TUDCA可組合用於提供預防移植的黑質移植物細胞死亡的額外作用。
處理組中出現行為作用的早期發作且所有大鼠表現出淨運動不對稱性的＞50％的降低。雖然行為康復很快進行背後的機制需要進一步評估，但一種可能而並非限制的解釋是抗-凋亡試劑和神經營養因子的給予促進了移植的多巴胺神經元快速成熟。此外，以前研究證實需要一定數量的紋狀體內TH-陽性移植神經元以誘導50％的行為康復且在超過2000紋狀體內TH-陽性移植神經元的範圍內發現略超過100％的平臺期康復水平。這些現象反映出這樣的事實，即當一定量的多巴胺神經元在移植後早期時間點存活時，同樣數量的已移植多巴胺神經元將維持至更遲的時間點(W.-M.Duan等.，Exp.Brain Res.104227-242，1995；W.-M.Duan等.，Neuroscience 100521-530，2000)。這些觀察突出了應用神經保護策略以在神經移植中移植後的早期時間點而不是更遲的時間點預防細胞損失的價值。另一種對於細胞數目和行為間明顯差異的可能解釋為需要一定水平的多巴胺神經分布以誘導行為矯正。該水平在用TUDCA處理的移植物中較早的時間點實現，因為移植細胞具有更高的存活。相比用TUDCA處理的細胞，無-TUDCA處理的細胞以另外過程起始且使神經分布於宿主紋狀體，其最終也將提供達到矯正運動不對稱性的神經分布水平，但時間與TUDCA處理的細胞相比要晚。
級聯活性被認為在凋亡中起作用(G.S.Salvesen等.，Cell 91443-446，1997)。級聯活化作用的一種通路涉及線粒體(D.R.Green等.，Science 2811309-1312，1998；G.Kroemer等.，Nat.Med.6513-519，2000)。TUDCA已被顯示阻止線粒體腫脹和線粒體外膜的破裂。膜穩定性可抑制前-凋亡分子，細胞色素C的釋放並且引起細胞色素C-介導的下遊事件，如級聯活性的改變。現在認為TUDCA在紋狀體組織培養中顯著降低了3-硝基丙酸(3-NP)-介導的神經元細胞死亡。此外，在3-NP-損傷的Huntington′s疾病大鼠模型中(C.D.Keene等.，Exp.Neurol.171；351-360，2001)，TUDCA的全身給藥可主要通過抗-凋亡機制降低紋狀體的退化且改善神經缺陷。
因大多數移植的多巴胺神經元移植後立即死亡，嘗試已集中在移植物存活的提高上以獲得最佳的移植效果。事實上，許多實驗研究以表明行為康復的程度與移植物的存活及其相關(P.Brundin等.，InS.B.Dunnett和A.Bjrklund，eds.，Functional neural transplantation，New York Raven Press；19949-46；N.Nakao等.，Pfoc.Natl.Acad.Sci.USA 9112408-12412，1994；H.Sauer等.，Exp.Brain Res.9054-62，1992)。此外，帕金森氏症中神經移植的臨床研究也證實移植後症狀改善的程度與神經移植物的存活以及移植物的神經再分布程度密切相關(P.Brundin等.，Brain1231380-1390，2000；J.H.Kordower等.，J.Comp.Neurol.370203-230，1996；P.Piccini等.，Nat.Neufosci.21137-1140，1999)。大量的移植多巴胺神經元通常引起更顯著的臨床改善。然而，最近Freed等進行的工作引起了有關適於臨床改善所需的移植多巴胺神經元數目的爭論(P.Brundin等.，Nat.Med.7512-513，2001；S.B.Dunnett等.，Nat.Rev.Neurosci.2365-369，2001；C.R.Freed等.，N.Engl.J.Med.344710-719，2001)。在其用於帕金森氏症的胚性組織移植物的雙盲安慰劑-對照臨床試驗中，報導了小比例的移植受體最終發展為張力障礙和運動障礙且認定該副作用可能是由於在移植位點持續的纖維派生，導致受體腦中相對過量多巴胺的產生。他們因此建議移植更少的組織以解決未來臨床試驗中的該問題。然而，在該研究中報導僅少量的多巴胺神經元在兩個死後屍檢的案例中存活。另外，其他因素，例如組織製備、移植技術以及移植位點可導致該移植相關副作用的產生。
作為另一個實例，TUDCA在降低體外2天後的胰島細胞的凋亡中也是有效的。在無-處理的對照中TUNEL-陽性細胞數目為大約29，而在暴露於TUDCA的細胞中僅為12。超過50％的凋亡的降低在分離過程中細胞暴露於TUDCA期間，隨之在體外培養期間用膽汁酸孵育後實現。
此處引用的所有專利、專利文件以及出版物的全部公開內容整體引入作為參考。上述詳細說明以及實施例僅用於更清楚的理解。從中不應理解出不必要的限制。本發明不限於呈現和描述的詳細細節，對於本領域技術人員來說很顯然的改變也將包含在權利要求限定的本發明範圍內。
權利要求
1.一種提高移植細胞群生存能力的方法，包括將該移植細胞群與選自親水膽汁酸，其鹽，其類似物，和其組合的有效量的化合物接觸。
2.權利要求1的方法，其中移植細胞群的細胞為已分化細胞。
3.權利要求1的方法，其中移植細胞群的細胞為前體細胞。
4.權利要求1的方法，其中接觸在體外進行。
5.權利要求1的方法，其中接觸在體內進行。
6.權利要求5的方法，其中接觸在移植細胞群的供體中進行。
7.權利要求1的方法，其中將移植細胞群與化合物接觸包括在移植細胞群移植入受體前將該移植細胞群與化合物接觸。
8.權利要求7的方法，其中受體為人。
9.權利要求7的方法，其進一步包括用化合物處理受體。
10.權利要求9的方法，其中用化合物處理受體包括在移植細胞群移植入受體前將化合物給予受體。
11.權利要求10的方法，其中用化合物處理受體包括在移植細胞群移植入受體後將化合物給予受體。
12.權利要求9的方法，其中用化合物處理受體包括在移植細胞群移植入受體後將化合物給予受體。
13.權利要求9的方法，其中處理受體包括用化合物經腸胃外處理受體。
14.權利要求9的方法，其中處理受體包括用化合物經口服處理受體。
15.權利要求1的方法，其中將移植細胞群與化合物接觸包括將移植細胞群與藥學可接受載體的相組合。
16.權利要求1的方法，其中移植細胞群的細胞包括自體細胞、異種細胞或異體細胞。
17.權利要求1的方法，其中移植細胞群的細胞包括自體組織、異種組織或異體組織的至少一部分。
18.權利要求1的方法，其中該移植細胞群為器官。
19.權利要求18的方法，其中器官為肝臟、腎、心臟、肺或胰腺。
20.權利要求18的方法，其進一步包括在將移植細胞群移植入受體後用化合物處理受體。
21.權利要求1的方法，其進一步包括在將移植細胞群移植入受體後用化合物處理受體。
22.一種治療患有帕金森氏症的人的方法，該方法包括體外將移植細胞群與和藥學可接受載體相組合的有效量的牛磺熊去氧膽酸接觸，其中該移植細胞群為已分化細胞；並且移植該移植細胞群入人中。
23.一種治療患有帕金森氏症的受體的方法，該方法包括將移植細胞群與選自熊去氧膽酸、其鹽、其類似物和其組合的有效量的化合物相接觸來提高該移植細胞群的生存能力；並且移植該移植細胞群入受體中。
24.權利要求23的方法，其中該熊去氧膽酸類似物包括綴合衍生物。
25.權利要求24的方法，其中綴合衍生物為牛磺熊去氧膽酸。
26.權利要求23的方法，其中受體為人。
27.權利要求23的方法，其中細胞為已分化細胞。
28.權利要求23的方法，其中細胞為前體細胞。
29.權利要求23的方法，其中接觸在體外進行。
30.權利要求23的方法，其中接觸在體內進行。
31.權利要求30的方法，其中接觸在移植細胞群的供體中進行。
32.權利要求23的方法，其中將移植細胞群與化合物接觸包括在移植細胞群移植入受體前將移植細胞群與化合物接觸。
33.權利要求32的方法，其進一步包括用化合物處理受體。
34.權利要求33的方法，其中用化合物處理受體包括在將細胞移植入受體前將化合物給予受體。
35.權利要求34的方法，其中用化合物處理受體包括在將細胞移植入受體後將化合物給予受體。
36.權利要求33的方法，其中用化合物處理受體包括在將細胞移植入受體後將化合物給予受體。
37.權利要求23的方法，其中處理受體包括用化合物經腸胃外處理受體。
38.權利要求23的方法，其中處理受體包括用化合物經口服處理受體。
39.權利要求23的方法，其中將移植細胞群與化合物接觸包括將移植細胞群與藥學可接受載體相組合。
40.權利要求23的方法，其中細胞包括自體細胞、異種細胞或異體細胞。
41.權利要求23的方法，其中細胞包括自體組織、異種組織或異體組織的至少一部分。
42.一種方法，其包括用選自親水膽汁酸、其鹽、其類似物和其組合的化合物處理移植細胞群的供體。
43.權利要求42的方法，其中親水膽汁酸包括熊去氧膽酸，並且處理供體包括用熊去氧膽酸處理供體。
44.權利要求42的方法，其中親水膽汁酸包括牛磺熊去氧膽酸，並且處理供體包括用牛磺熊去氧膽酸處理供體。
45.權利要求42的方法，其中移植細胞群的供體是活的。
46.權利要求42的方法，其中處理供體包括在移植細胞群從供體取出前用化合物處理供體。
47.權利要求42的方法，其中處理供體包括在移植細胞群從供體取出期間用化合物處理供體。
48.權利要求42的方法，其中處理供體包括在移植細胞群從供體取出後用化合物處理供體。
49.權利要求42的方法，其中移植細胞群為供體器官的至少一部分。
50.權利要求49的方法，其中器官的至少一部分為供體的完整器官。
51.權利要求42的方法，其中處理供體包括用化合物經腸胃外處理供體。
52.權利要求42的方法，其中處理供體包括用化合物經口服處理供體。
53.權利要求42的方法，其中用化合物處理供體包括將移植細胞群與藥學可接受載體相組合。
54.一種方法，其包括用選自親水膽汁酸、其鹽、其類似物和其組合的化合物處理移植細胞群的受體。
55.權利要求54的方法，其中親水膽汁酸包括熊去氧膽酸，並且處理受體包括用熊去氧膽酸處理受體。
56.權利要求54的方法，其中親水膽汁酸包括牛磺熊去氧膽酸，並且處理受體包括用牛磺熊去氧膽酸處理受體。
57.權利要求54的方法，其中處理受體包括將移植細胞群移植入受體前用化合物處理受體。
58.權利要求54的方法，其中處理受體包括將移植細胞群移植入受體期間用化合物處理受體。
59.權利要求58的方法，其中處理受體包括在受體中處理移植細胞群。
60.權利要求54的方法，其中處理受體包括將移植細胞群移植入受體後用化合物處理受體。
61.權利要求54的方法，其中移植細胞群為器官的至少一部分。
62.權利要求61的方法，其中器官的至少一部分為完整器官。
63.權利要求54的方法，其中處理受體包括用化合物經腸胃外處理受體。
64.權利要求54的方法，其中處理受體包括用化合物經口服處理受體。
65.權利要求54的方法，其中用化合物處理受體包括將移植細胞群與藥學可接受載體相組合。
全文摘要
通過給予親水膽汁酸，如熊去氧膽酸(UDCA)，其鹽，和其類似物(例如，甘氨熊去氧膽酸和牛磺熊去氧膽酸)而提高移植細胞群生存能力的方法。
文檔編號A01N1/02GK1770975SQ03826252
公開日2006年5月10日 申請日期2003年4月2日 優先權日2003年4月2日
發明者C·J·斯蒂爾, W·C·洛 申請人:明尼蘇達大學評議會