製備對映體純對羥基苯甘氨酸的方法

2023-10-10 05:14:09

專利名稱：製備對映體純對羥基苯甘氨酸的方法
技術領域：
本發明涉及一種製備對映體純對羥基苯甘氨酸的新方法。
背景技術：
對映體純對羥基苯甘氨酸是半合成β-內醯胺抗生素的重要側鏈，用於合成羥氨苄青黴素、頭孢羥氨苄、頭孢哌酮、頭孢羅奇以及頭孢羥胺唑等。目前對映體純對羥基苯甘氨酸的生產國內外大都採用如下兩種方法一種是用對氧基苯甲酸法、對羥基苯甲醛法或乙醛酸法合成外消旋對羥基苯甘氨酸，然後對外消旋體進行拆分；其中外消旋體的合成工藝成熟，外消旋體的拆分為技術難度大的關鍵步驟。迄今，拆分對羥基苯甘氨酸的方法有化學法、誘導結晶法和酶法，其中化學法和結晶法有步驟多，成本高、收率低等弊端，酶法因其反應條件溫和、高效、高選擇性及成本低而頗受青睞；另一種方法是用海因酶催化對羥基苯海因開環水解成N-氨甲醯-D-對羥基苯甘氨酸，後者經亞硝酸水解成相應的對映體純對羥基苯甘氨酸。該法已被廣泛採用，所用的酶價格昂貴，且亞硝酸的使用帶來較嚴重的環境汙染問題。因此，研究開發對羥基苯甘氨酸拆分新工藝具有重大的實踐意義。
近年來，離子液替代易造成環境汙染的有機溶劑作為新興的綠色反應介質已成為研究的熱點。離子液具有可忽略的蒸氣壓、高穩定性，可溶解許多極性或非極性的有機、無機化合物，易於與其它物質分離，可循環利用等優良特性。研究結果表明，許多酶如蛋白酶、脂肪酶在離子液中具有較高的催化活性、選擇性及穩定性(Trends Biotechnol.2003，21131-138)。因此，離子液作為反應介質用於有機合成、生物催化與生物合成等領域中有著廣泛的應用潛力。

發明內容
本發明的目的在於針對現有技術工藝存在的問題，提供一種離子液中酶促對羥基苯甘氨酸酯不對稱水解的方法，利用木瓜蛋白酶催化對羥基苯甘氨酸甲酯的高效不對稱水解製備高對映體純度的對羥基苯甘氨酸，該方法使用離子液1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽(BMIM·BF4，可與水相混溶)和磷酸緩衝液的混合體系作反應介質，對環境汙染小，易從反應混合體系中方便地分離出產物。由於離子液具有可忽略的蒸氣壓，在減壓的條件下進行水解反應，可在線分離出副產物甲醇，提高對羥基苯甘氨酸的產率和對映體純度。
本發明的製備對映體純對羥基苯甘氨酸的方法，包括如下步驟(1)在反應器中依次加入離子液BMIM·BF4、磷酸緩衝液(pH7.0，50mmol/L)、對羥基苯甘氨酸甲酯、木瓜蛋白酶；離子液在混合體系中的含量為0-40％，底物對羥基苯甘氨酸甲酯濃度為50-500mmol/L，酶量為120-840Units；(2)在溫度為25-60℃、振蕩速度為130-220rev./min、常壓-0.04MPa下反應22-36小時後，超濾除掉反應混合物中的懸浮顆粒和酶，分離得到產物L-對羥基苯甘氨酸。
本發明的較佳方案包括如下步驟(1)在反應器中依次加入離子液BMIM·BF4、磷酸緩衝液(pH7.0，50mmol/L)、對羥基苯甘氨酸甲酯、木瓜蛋白酶；離子液在混合體系中的含量為0-20％，底物對羥基苯甘氨酸甲酯濃度為100-400mmol/L，酶量為360-840Units；(2)在溫度為40-60℃、振蕩速度為160-200rev./min、常壓-0.6MPa)下反應24-32小時後，超濾除掉反應混合物中的懸浮顆粒和酶，分離得到產物L-對羥基苯甘氨酸。
最佳方案是將4ml含12.5％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩衝液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然後加入0.6mmol對羥基苯甘氨酸甲酯和500mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在減壓條件下(壓力約0.04MPa)，置於45℃、160rev./min的水浴恆溫振蕩器內振蕩，反應24h。分離獲得L-對羥基苯甘氨酸的產率高達49.8％，對映體純度高達98％。
所述分離產物L-對羥基苯甘氨酸的方法可以是常規的分離方法。發明人經過探索性試驗，提供的分離產物L-對羥基苯甘氨酸的方法包括如下步驟——加入乙酸乙酯，萃取殘留的未反應的D-對羥基苯甘氨酸甲酯，真空蒸餾，在NaOH(1.0mol/L)水溶液中水解成D-對羥基苯甘氨酸；——加入濃鹽酸(8.0mol/L)於離子液/水混合體系中，pH值降至2.0左右，振蕩數分鐘後，產物L-對羥基苯甘氨酸沉澱下來，過濾、乾燥，就可獲得對映體純對羥基苯甘氨酸。
本發明與現有技術相比具有如下優點反應條件溫和、環境汙染小、反應過程簡單易控、產物易分離；反應體系中木瓜蛋白酶的催化活性、對映體選擇性及穩定性均很高；在減壓條件下，L-對羥基苯甘氨酸的產率49％以上，對映體純度98％以上。
具體實施例方式
實施例1將4ml含0％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩衝液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然後加入0.4mmol對羥基苯甘氨酸甲酯和300mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常壓下，置於40℃、160rev./min的水浴恆溫振蕩器內振蕩，反應24h後，加入乙酸乙酯，萃取殘留的未反應的D-對羥基苯甘氨酸甲酯，真空蒸餾，在NaOH(1.0mol/L)水溶液中水解成D-對羥基苯甘氨酸；加入濃鹽酸(8.0mol/L)於離子液/水混合體系中，pH值降至2.0左右，振蕩數分鐘後，產物L-對羥基苯甘氨酸沉澱，過濾、乾燥獲得對映體純對羥基苯甘氨酸的產率38.5％，對映體純度95％。
實施例2將4ml含10％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩衝液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然後加入0.4mmol對羥基苯甘氨酸甲酯和300mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常壓下，置於40℃、160rev./min的水浴恆溫振蕩器內振蕩，反應24h後，獲得L-對羥基苯甘氨酸的產率44.7％，對映體純度95.1％。
實施例3將4ml含12.5％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩衝液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然後加入0.4mmol對羥基苯甘氨酸甲酯和300mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常壓下，置於40℃、160rev./min的水浴恆溫振蕩器內振蕩，反應24h後，分離獲得L-對羥基苯甘氨酸的產率47.2％，對映體純度95.7％。
實施例4將4ml含15％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩衝液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然後加入0.4mmol對羥基苯甘氨酸甲酯和300mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常壓下，置於40℃、160rev./min的水浴恆溫振蕩器內振蕩，反應24h後，分離獲得L-對羥基苯甘氨酸的產率45.7％，對映體純度92.9％。
實施例5將4ml含20％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩衝液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然後加入1.6mmol對羥基苯甘氨酸甲酯和700mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，壓力為0.6MPa下，置於60℃、200rev./min的水浴恆溫振蕩器內振蕩，反應32h後，加入乙酸乙酯，萃取殘留的未反應的D-對羥基苯甘氨酸甲酯，真空蒸餾，在NaOH(1.0mol/L)水溶液中水解成D-對羥基苯甘氨酸；加入濃鹽酸(8.0mol/L)於離子液/水混合體系中，pH值降至2.0左右，振蕩數分鐘後，產物L-對羥基苯甘氨酸沉澱下來，過濾、乾燥獲得對映體純對羥基苯甘氨酸的產率43.8％，對映體純度92.4％。
實施例6將4ml含40％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩衝液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，在常壓下，然後加入0.4mmol對羥基苯甘氨酸甲酯和300mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常壓下，置於40℃、160rev./min的水浴恆溫振蕩器內振蕩，反應24h後，分離獲得L-對羥基苯甘氨酸的產率18.6％，對映體純度56.3％。
實施例7將4ml含12.5％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩衝液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然後加入0.2mmol對羥基苯甘氨酸甲酯和300mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常壓下，置於40℃、160rev./min的水浴恆溫振蕩器內振蕩，反應32h後，分離獲得L-對羥基苯甘氨酸的產率46.5％，對映體純度95.3％。
實施例8將4ml含12.5％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩衝液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然後加入0.6mmol對羥基苯甘氨酸甲酯和300mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常壓下，置於40℃、160rev./min的水浴恆溫振蕩器內振蕩，反應24h後，分離獲得L-對羥基苯甘氨酸的產率47.9％，對映體純度96.2％。
實施例9將4ml含12.5％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩衝液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然後加入0.8mmol對羥基苯甘氨酸甲酯和300mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常壓下，置於40℃、160rev./min的水浴恆溫振蕩器內振蕩，反應30h後，分離獲得L-對羥基苯甘氨酸的產率45％，對映體純度93.6％。
實施例10將4ml含12.5％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩衝液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然後加入2.0mmol對羥基苯甘氨酸甲酯和300mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常壓下，置於40℃、160rev./min的水浴恆溫振蕩器內振蕩，反應36h後，分離獲得L-對羥基苯甘氨酸的產率17.3％，對映體純度80.2％。
實施例11將4ml含12.5％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩衝液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然後加入0.6mmol對羥基苯甘氨酸甲酯和100mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常壓下，置於40℃、160rev./min的水浴恆溫振蕩器內振蕩，反應24h後，分離獲得L-對羥基苯甘氨酸的產率18.4％，對映體純度96.3％。
實施例12將4ml含12.5％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩衝液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然後加入0.6mmol對羥基苯甘氨酸甲酯和500mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常壓下，置於40℃、160rev./min的水浴恆溫振蕩器內振蕩，反應24h後，分離獲得L-對羥基苯甘氨酸的產率47.9％，對映體純度96.6％。
實施例13將4ml含12.5％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩衝液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然後加入0.6mmol對羥基苯甘氨酸甲酯和700mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常壓下，置於40℃、160rev./min的水浴恆溫振蕩器內振蕩，反應24h後，分離獲得L-對羥基苯甘氨酸的產率48.1％，對映體純度96.1％。
實施例14將4ml含12.5％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩衝液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然後加入0.6mmol對羥基苯甘氨酸甲酯和500mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常壓下，置於25℃、160rev./min的水浴恆溫振蕩器內振蕩，反應36h後，分離獲得L-對羥基苯甘氨酸的產率47.5％，對映體純度95.6％。
實施例15將4ml含12.5％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩衝液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然後加入0.6mmol對羥基苯甘氨酸甲酯和500mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常壓下，置於45℃、160rev./min的水浴恆溫振蕩器內振蕩，反應24h後，分離獲得L-對羥基苯甘氨酸的產率48.4％，對映體純度96.9％。
實施例16將4ml含12.5％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩衝液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然後加入0.6mmol對羥基苯甘氨酸甲酯和500mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常壓下，置於60℃、160rev./min的水浴恆溫振蕩器內振蕩，反應22h後，分離獲得L-對羥基苯甘氨酸的產率35.2％，對映體純度83.3％。
實施例17將4ml含12.5％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩衝液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然後加入0.6mmol對羥基苯甘氨酸甲酯和500mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常壓下，置於40℃、130rev./min的水浴恆溫振蕩器內振蕩，反應24h後，分離獲得L-對羥基苯甘氨酸的產率45.0％，對映體純度95.4％。
實施例18將4ml含12.5％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩衝液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然後加入0.6mmol對羥基苯甘氨酸甲酯和500mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常壓下，置於40℃、220rev./min的水浴恆溫振蕩器內振蕩，反應24h後，分離獲得L-對羥基苯甘氨酸的產率47.3％，對映體純度96.4％。
實施例19將4ml含12.5％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩衝液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然後加入0.6mmol對羥基苯甘氨酸甲酯和500mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在減壓條件下(壓力約0.04MPa)，置於45℃、160rev./min的水浴恆溫振蕩器內振蕩，反應24h後，分離獲得L-對羥基苯甘氨酸的產率49.8％，對映體純度98％。
權利要求
1.一種製備對映體純對羥基苯甘氨酸的方法，其特徵在於包括如下步驟(1)在反應器中依次加入離子液BMIM·BF4、磷酸緩衝液(pH7.0，50mmol/L)、對羥基苯甘氨酸甲酯、木瓜蛋白酶；離子液在混合體系中的含量為0-40％，底物對羥基苯甘氨酸甲酯濃度為50-500mmol/L，酶量為120-840Units；(2)在溫度為25-60℃、振蕩速度為130-220rev./min、常壓-0.04MPa下反應22-36小時後，超濾除掉反應混合物中的懸浮顆粒和酶，分離得到產物L-對羥基苯甘氨酸。
2.根據權利要求1所述的製備對映體純對羥基苯甘氨酸的方法，其特徵在於包括如下步驟(1)在反應器中依次加入離子液BMIM·BF4、磷酸緩衝液(pH7.0，50mmol/L)、對羥基苯甘氨酸甲酯、木瓜蛋白酶；離子液在混合體系中的含量為0-20％，底物對羥基苯甘氨酸甲酯濃度為100-400mmol/L，酶量為360-840Units；(2)在溫度為40-60℃、振蕩速度為160-200rev./min、常壓-0.6MPa)下反應24-32小時後，超濾除掉反應混合物中的懸浮顆粒和酶，分離得到產物L-對羥基苯甘氨酸。
3.根據權利要求1或2所述的製備對映體純對羥基苯甘氨酸的方法，其特徵在於分離產物L-對羥基苯甘氨酸的方法包括如下步驟——加入乙酸乙酯，萃取殘留的未反應的D-對羥基苯甘氨酸甲酯，真空蒸餾，在NaOH(1.0mol/L)水溶液中水解成D-對羥基苯甘氨酸；——加入濃鹽酸(8.0mol/L)於離子液/水混合體系中，pH值降至2.0左右，振蕩數分鐘後，產物L-對羥基苯甘氨酸沉澱下來，過濾、乾燥就可獲得對映體純對羥基苯甘氨酸。
4.根據權利要求4所述的製備對映體純對羥基苯甘氨酸的方法，其特徵在於將4ml含12.5％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩衝液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然後加入0.6mmol對羥基苯甘氨酸甲酯和500mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在減壓條件下(壓力約0.04MPa)，置於45℃、160rev./min的水浴恆溫振蕩器內振蕩，反應24h後，分離獲得L-對羥基苯甘氨酸。
全文摘要
本發明涉及一種製備對映體純對羥基苯甘氨酸的方法，包括在反應器中依次加入離子液BMIM·BF
文檔編號C12P13/04GK1693471SQ20041005191
公開日2005年11月9日 申請日期2004年10月25日 優先權日2004年10月25日
發明者宗敏華, 婁文勇, 許若 申請人:華南理工大學