一種具有順鉑耐藥性的人胃癌細胞系及其建立方法和應用的製作方法
2023-10-23 09:19:42
一種具有順鉑耐藥性的人胃癌細胞系及其建立方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種具有順鉑耐藥性的人胃癌細胞系及其建立方法和應用，所述人胃癌細胞系保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO：C2013152。該人胃癌細胞系性狀穩定，可穩定多次傳代，成瘤率高，潛伏期短，均一性好，為胃癌研究提供新的更接近於臨床腫瘤生物學特性的實驗材料。該人胃癌細胞系具有成瘤性，而且產生的腫瘤具有順鉑耐藥性，與傳代親本腫瘤相比較，可用來分析體外、體內藥物敏感性及耐藥性的相關性，進而建立體外、體內兩個相關聯的藥物篩選平臺，是胃癌基礎研究和臨床前期應用的理想細胞系。CCTCC NO：C201315220131120
【專利說明】一種具有順鉑耐藥性的人胃癌細胞系及其建立方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物【技術領域】，特別涉及一種具有順鉬耐藥性的人胃癌細胞系及其建 立方法和應用。
【背景技術】
[0002] 胃癌是全球發病率最高的癌症之一，也是世界上第2位癌症死亡原因，僅次於肺 癌。同時，胃癌是亞洲最常見的惡性腫瘤之一，在東亞國家如中國和日本由於其高致死率 一直受到重視。根據中國抗癌協會臨床腫瘤協作中心（CSCO)列舉的數據，目前中國的胃癌 發病已佔全世界的42%。我國每年死於胃癌約30萬人，佔全部惡性腫瘤死亡的23. 2%，已 為惡性腫瘤死亡的第一位。因此，亟待新的治療策略來解決這個問題。
[0003] 在胃癌治療當中，鉬類聯合氟尿嘧啶類化療一直是一線且唯一的臨床推薦方案， 然而在最初顯示療效之後，耐藥現象的發生和高復發率仍然是胃癌化療中存在的最大問 題。其中存在的主要問題即是順鉬耐藥的發生。順鉬耐藥的產生有多個方面的因素，如腫 瘤細胞發生對順鉬導致凋亡的不敏感，或發生細胞內順鉬蓄積程度的降低。此外，近年的研 究還集中在巰基分子例如穀胱甘肽的鈍化，c-fos基因過度表達等方面，DNA修復狀態也和 順鉬的敏感程度息息相關。但到目前為止，順鉬耐藥的確切分子機制還不明確。考慮到順 鉬在胃癌臨床化療中的唯一性，無論是細胞的內在性或是獲得性的順鉬耐藥性，都使這種 藥物在腫瘤化療中的使用受到巨大限制。因此，取得合適的研究材料以加深對順鉬耐藥機 制的了解，有助於解決腫瘤化療中順鉬耐藥性的問題，從而大大提高順鉬腫瘤化療的療效， 對臨床治療腫瘤具有非常重大的意義。鑑於此，建立順鉬耐藥特性的胃癌細胞系，對於有效 指導臨床研究具有必不可少的重要作用。
【發明內容】
[0004] 本發明要解決的技術問題就是針對現有的人胃癌細胞系生物多樣性低，與臨床胃 癌的生物學性狀相差較大等不足，提供一種新的具有順鉬耐藥性的人胃癌細胞系及其建立 方法和應用。
[0005] 本發明解決上述技術問題所採用的技術方案之一是：一種人胃癌細胞系，其保藏 在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :C2013152。
[0006] 本發明所述人胃癌細胞系較佳地還包括如上所述的人胃癌細胞系的子代細胞。
[0007] 本發明解決上述技術問題所採用的技術方案之二是：如上所述的人胃癌細胞系在 製備使免疫缺陷小鼠產生胃癌的試劑中的用途。
[0008] 本發明所述的使免疫缺陷小鼠產生胃癌的試劑為本領域常規的試劑，該試劑的制 備方法較佳地為將本發明所述人胃癌細胞系混懸於各種溶劑中即得。其中所述溶劑為本 領域常規溶劑，較佳地為HBSS緩衝液，所述HBSS緩衝液的配方為：含500U/ml青黴素 G、 500 μ g/ml硫酸鏈黴素和1. 25 μ g/ml兩性黴素 B。
[0009] 本發明所述試劑較佳地用於製備胃癌動物模型。其中所述胃癌動物模型的製備方 法為本領域常規方法，較佳地包括以下步驟：將所述使免疫缺陷小鼠產生胃癌的試劑接種 於免疫缺陷小鼠進行飼養，獲得胃癌動物模型。其中所述免疫缺陷小鼠較佳地為裸小鼠或 嚴重聯合免疫缺陷小鼠（SCID小鼠），優選地為嚴重聯合免疫缺陷小鼠（SCID小鼠），其中 所述裸小鼠較佳地為NU/NU品系的裸小鼠。利用本發明所述細胞系製備的胃癌動物模型具 有順鉬耐藥性。
[0010] 其中所述的接種的方式為本領域常規使用的接種方式。所述接種方式較佳地包括 皮下穿刺接種，原位接種或者腎囊膜內接種，優選地為皮下穿刺接種。所述接種的細胞量較 佳地為I. 0?2X IO7個細胞，優選地為5. OX IO6個細胞。
[0011] 本發明所述胃癌動物模型的應用方法較佳地為，利用所得胃癌動物模型檢測待測 化合物的抑制胃癌活性，將待測化合物施用於胃癌動物模型，觀察和測量動物的體重與腫 瘤生長情況；施用後導致胃癌動物模型胃癌症狀改善或治癒的待測化合物具有抑制胃癌活 性。
[0012] 其中所述的待測化合物施用的方法為本領域常規的施用方法，較佳地包括：尾靜 脈注射、腹腔注射、灌胃、口服和腫瘤局部用藥中的一種或幾種方式施用於胃癌的荷瘤動 物。所述實驗中的對照例較佳地為：同時使用不含待測化合物的溶劑施用於胃癌的荷瘤動 物作為對照實驗組。
[0013] 本發明解決上述技術問題所採用的技術方案之三是：一種待測化合物抑制胃癌細 胞活性的體外檢測方法，該體外檢測方法包括以下步驟：將待測化合物施用於細胞模型中， 施用後抑制細胞增殖或導致細胞凋亡的待測化合物為具有抑制胃癌細胞活性的化合物，其 中所述的細胞模型是如上所述的人胃癌細胞系。
[0014] 其中所述體外檢測方法為本領域常規使用的方法，所體外檢測方法較佳地包括以 下步驟：
[0015] (1)將本發明所述人胃癌細胞系或其子代細胞接種於96孔細胞培養板孔中，培養 24小時；
[0016] (2)將測試化合物稀釋成不同濃度施用於細胞，化合物作用72小時後通過測定細 胞的活力，計算不同濃度的化合物對細胞的增殖抑制能力，計算化合物半數抑制濃度，用以 判斷測試化合物的抗腫瘤能力。
[0017] 其中步驟（1)所述人胃癌細胞系或其子代細胞的接種量較佳地為5000/孔。其中 步驟（2)所述半數抑制濃度檢測方法較佳地包括ATP生物發光法或MTT法，本發明所述檢 測方法優選地為ATP生物發光法。所述的ATP生物發光法是通過對細胞中的ATP進行定量 測定來檢測培養物中活細胞數目的一種均質檢測方法，其中所述的ATP是活細胞新陳代謝 的一個重要指標，所述ATP生物發光法可以利用市售檢測試劑盒進行。
[0018] 本發明解決上述技術問題所採用的技術方案之四是：一種如上所述人胃癌細胞系 的建立方法，該建立方法包括以下步驟：
[0019] (1)獲得新鮮的臨床人胃癌手術切除標本，剪切成小塊，皮下穿刺接種免疫缺陷小 鼠；
[0020] (2)穿刺接種70?90天後，將荷瘤動物處死，取出腫瘤組織，進行癌細胞的原代培 養和傳代培養。
[0021] 其中步驟（1)所述的新鮮的臨床人胃癌手術切除標本剪切而成的小塊的質量較 佳地為20?50mg。其中所述的免疫缺陷小鼠較佳地為嚴重聯合免疫缺陷小鼠（SCID小鼠） 或裸小鼠。其中所述的新鮮的臨床人胃癌切除標本更佳的處理方式為：用新鮮的HBSS緩衝 液（所述HBSS緩衝液較佳地包含500U/ml青黴素 G、500 μ g/ml硫酸鏈黴素和1. 25 μ g/ml 兩性黴素 B)漂洗。
[0022] 其中步驟（2)所述的原代培養方法是常規的哺乳動物細胞的原代培養方法；所述 的原代培養方法較佳地包括以下步驟：
[0023] 將腫瘤組織剪切成小塊，置入培養瓶中，於37°C孵箱5% CO2條件下培養；次日，將 培養瓶慢慢翻轉平放，向瓶內加入RPMI-1640培養液（含5%胎牛血清，lOOU/ml青黴素 G、 100 μ g/ml硫酸鏈黴素和0. 25 μ g/ml兩性黴素 B)，靜置培養。
[0024] 其中步驟（2)所述的傳代培養方法是常規的哺乳動物細胞的傳代培養方法；所述 的傳代培養方法較佳地包括以下步驟：待原代培養的細胞鋪展到70%滿時進行傳代培養 和純化，吸棄舊培養液，向瓶中加入新鮮的0. 05%胰蛋白酶溶液，待細胞脫落後，終止消化， 加入新鮮的RPMI-1640培養液，吹打使之脫離瓶壁形成細胞懸液；離心接種於新的培養瓶 繼續培養。
[0025] 所述傳代培養方法中較佳地還包括細胞純化的步驟，所述細胞純化的方法較佳地 包括以下步驟：利用腫瘤細胞和成纖維細胞貼壁速率的不同，在傳代接種於新的培養瓶20 分鐘後吸取上清轉移到新的培養瓶，多次重複，利用差速貼壁去除成纖維細胞。
[0026] 在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實 例。
[0027] 本發明所用試劑和原料均市售可得。
[0028] 本發明的積極進步效果在於：
[0029] 1、本發明建立的人胃癌細胞系性狀穩定，可穩定多次傳代，為胃癌研究提供新的 更接近於臨床腫瘤生物學特性的實驗材料；
[0030] 2、本發明建立的人胃癌細胞系在保留主要臨床生物學特徵的前提下，具有成瘤率 高，潛伏期短，均一性好等特點，可以成功製備胃癌動物模型，所製得的動物模型可以用於 基礎研究及藥物篩選，為基於中國人群遺傳背景開展的研究提供了有力的科研資料，也為 新藥臨床前研究體內實驗針對臨床抗癌藥物敏感性及耐藥性的測試提供新的試驗材料。
[0031] 3、本發明建立的人胃癌細胞系通過與裸小鼠體內傳代親本腫瘤相比較，可用來分 析體外、體內藥物敏感性及耐藥性的相關性，進而可以建立體外、體內兩個相關聯的藥物篩 選平臺，是人胃癌基礎研究和臨床前期應用的理想細胞系。
[0032] 4、本發明建立的人胃癌細胞系所成的裸鼠腫瘤還具有對胃癌臨床一線藥物順鉬 的耐藥性，是研究胃癌耐藥機制的良好試驗材料，具有很高的科研價值和開發意義。
[0033] 5、本發明建立的細胞系具高成瘤率，高均一性，又保持有臨床胃癌分子背景，同時 來源於中國人群，符合中國人的遺傳特徵，對研發適合國人的抗胃癌新藥具有十分重要的 理論和臨床意義。
[0034] 牛物材料保藏信息
[0035] 本發明的人胃癌細胞系，於2013年11月20日保藏在中國典型培養物保藏中 心（CCTCC)，保藏地址為：中國.武漢.武漢大學郵編：430072,培養物名稱為人胃癌細胞 GAXC023,保藏編號為 CCTCC NO :C2013152。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0036] 圖1為GAXC023細胞的形態學觀察（100倍視野）。
[0037] 圖2為GAXC023細胞的染色體分析（1000倍視野）。
[0038] 圖3為細胞免疫組化染色結果圖（DAB法，200倍視野）。其中圖3 (A)為陰性對照， 圖3(B)為細胞角蛋白（Cytokeratin)，圖3(C)為波形蛋白（Vimentin),圖3(D)為糖類抗 原 19-9 (CA19-9)，圖 3 (E)為癌胚抗原（CEA)。
[0039] 圖4為GAXC023細胞倍增時間曲線。
[0040] 圖5為GAXC023細胞周期分析結果圖。
[0041] 圖6為體外測試多個抗癌藥物對GAXC023細胞增殖的抑制作用。其中圖6 (A)為 氟尿嘧啶，圖6(B)為順鉬，圖6(C)為奧沙利鉬，圖6(D)為紫杉醇，圖6(E)為多西紫杉醇， 圖6(F)為伊立替康。
[0042] 圖7為GAXC023細胞的成瘤性檢測結果圖。
[0043] 圖8為GAXC023細胞在裸小鼠體內成瘤的病理組織切片圖（100倍視野圖）。
[0044] 圖9為體內測試順鉬對細胞裸小鼠模型的腫瘤生長抑制作用。
【具體實施方式】
[0045] 下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但並不因此將本發明限制在所述的實 施例範圍之中。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商 品說明書選擇。
[0046] 順鉬購買自江蘇豪森藥業，生理鹽水購買自浙江天瑞藥業有限公司，細胞培養試 劑均購買自美國Invitrogen公司。
[0047] 實施例1GAXC023細胞的製備
[0048] 從南通腫瘤醫院獲得新鮮的臨床胃癌切除標本（患者性別：女，年齡：73歲，民族： 漢，籍貫：江蘇省南通市。），臨床診斷結果為低分化胃腺癌。
[0049] 用新鮮的HBSS緩衝液（含500U/ml青黴素 G、500 μ g/ml硫酸鏈黴素和1. 25 μ g/ml 兩性黴素 B)漂洗後，切成20?50mg的小塊，皮下穿刺接種於免疫缺陷動物SCID鼠 （SCID 鼠購買自北京維通利華實驗動物技術有限公司）；穿刺接種70?90天後，將荷瘤動物處 死，取出腫瘤組織，進行癌細胞的原代培養和傳代培養。
[0050] 原代培養步驟為：將腫瘤組織剪切成小塊，置入培養瓶中，於37°C孵箱5% 0)2條 件下培養；次日，將培養瓶慢慢翻轉平放，向瓶內加入RPMI-1640培養液（含5%胎牛血清， 100U/ml青黴素 G、100 μ g/ml硫酸鏈黴素和0. 25 μ g/ml兩性黴素 B)，靜置培養；待細胞鋪 展到70%滿時進行傳代培養和純化。所述傳代培養包括以下步驟：吸棄舊培養液，向瓶中 加入新鮮的〇. 05%胰蛋白酶溶液，待細胞脫落後，終止消化，加入新鮮的RPMI-1640培養 液，吹打使之脫離瓶壁形成細胞懸液；離心接種於新的培養瓶繼續培養。
[0051] 所述純化的方法是利用差速貼壁法純化腫瘤細胞，即利用腫瘤細胞和成纖維細胞 貼壁速率的不同來進行的。純化方法包括以下步驟：將所得細胞懸液接種於新的培養瓶， 20分鐘後，吸取上清轉移到新的培養瓶，由於成纖維貼壁速率較快，在新的培養基中培養 20分鐘後，細胞懸液中的成纖維細胞大部分貼壁生長，所以細胞懸液中的腫瘤細胞得到了 純化，將上述步驟重複多次，即達到了純化腫瘤細胞的目的。
[0052] 本發明將來源於人胃癌組織的細胞系命名為人胃癌細胞GAXC023,於2013年11月 20日保藏在中國典型培養物保藏中心（CCTCC)，保藏編號為CCTCC NO :C2013152。提交保 藏的細胞系是傳代30代後的細胞系。
[0053] 實施例2GAXC023細胞的生物學特性及應用
[0054] 本發明採用RPMI1640培養並用差速貼壁法純化GAXC023細胞，使其能體外長期 生長和穩定傳代。當細胞傳至20代以上，細胞性狀逐漸穩定，進行相關的生物學、遺傳學 和組織來源鑑定，直至第50代都具有相同的穩定的性狀。經實驗觀察與驗證，體外生長的 GAXC023具有典型的上皮樣形態，主體為鋪路石樣，呈覆層生長，密度較大時可表現粘附性 聚集。遺傳學研究證實該細胞為異倍體，染色體數目和結構畸變嚴重，符合惡性腫瘤的遺傳 學特徵。該細胞能在裸小鼠體內可形成腫瘤，具有致瘤性。該細胞和其來源的臨床腫瘤標 本、裸小鼠體內傳代親本腫瘤形成對應關係，可為研究體外、體內和臨床抗癌藥物敏感性及 耐藥性的相關性提供新的試驗材料。具體如下：
[0055] a.形態學觀察
[0056] 將培養GAXC023細胞的培養瓶置於倒置顯微鏡下，在明視野下進行觀察，結果見 圖1 (圖1為GAXC023細胞的形態學觀察結果圖，100倍視野），可見GAXC023細胞主體呈鋪 路石樣，覆層生長，密度較大時可表現粘附性聚集。
[0057] b.染色體的鑑定
[0058] 將培養的GAXC023細胞置於4°C孵育12小時後，加入秋水仙素，使其終濃度為 0. 25μ g/ml，再於37°C孵箱中繼續培養4小時。採集分裂中期的細胞，用固定液進行固定， 然後將細胞懸液滴於預冷的載物片上，用Giemsa染色液染色，於顯微鏡下計數染色體數。 結果見圖2,可見GAXC023細胞連續傳代後，染色體仍保持人源性腫瘤細胞染色體的特徵， 染色體眾數（M)集中在37?42之間，佔70. 59%，表現為類二倍體，存在多數中央及亞中 央著絲粒染色體（圖2為GAXC023細胞的染色體分析圖，1000X);而裸小鼠的染色體數2n =40,且均為頂端著絲粒，據此可與人類染色體相區別。
[0059] c.短片段重複序列（STR)鑑定
[0060] 短串聯重複序列（short tandem repeat, STR)又稱為微衛星DNA，是指染色體上， 由數個鹼基對作為核心單位（2-6個鹼基對），串聯重複形成的一類DNA序列（重複次數為 10?60多次，基因片段在400鹼基對以下）；每個核心單位重複的次數會出現個體差異，從 而形成片段長度不同的等位基因。因此，一組STR序列的重複次數在不同個體中幾乎是唯 一的，是個體的基因身份特徵，也是細胞生物學對細胞身份和來源進行鑑定的主要方法。
[0061] 收集新鮮培養的GAXC023細胞，用AxyPr印基因組DNA小量試劑盒（購自Axygen 公司的 AxyPrep? Multisource Genomic DNA Miniprep Kit，貨號為 AP-MN-MS-GDNA)提取 細胞基因組DNA，用5'端螢光標記的引物進行PCR擴增，對所得產物進行測序，計算各個短 片段重複序列的重複數。結果：
[0062] 提取細胞的基因組DNA，對STR位點進行特異性擴增，通過測序分析包括 Amelogenin，TH01，TPOX，D13S317, vWA，D16S539, D5S818, CSFlPO 以及 D7S820 等各個 STR 位點的序列重複數，並和ATCC，DSMZ等細胞保存庫的資料庫進行查詢對比，未返回相同的 遺傳圖譜，可證明其獨一無二性，且在原代培養過程中未發生和其他細胞的交叉汙染，STR 位點的引物序列如序列表中SEQ ID NO: I-SEQ ID NO. 18所示，具體請參見表1和表2 : [0063] 表ISTR位點的引物序列
【權利要求】
1. 一種人胃癌細胞系，其特徵在於，其保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為 CCTCC NO ：C2013152〇
2. 如權利要求1所述的人胃癌細胞系的子代細胞。
3. 如權利要求1所述的人胃癌細胞系在製備使免疫缺陷小鼠產生胃癌的試劑中的用 途。
4. 如權利要求3所述的用途，其特徵在於，所述的免疫缺陷小鼠為SCID小鼠或裸小鼠。
5. -種待測化合物抑制胃癌細胞活性的體外檢測方法，其特徵在於，該體外檢測方法 包括以下步驟：將待測化合物施用於細胞模型中，施用後抑制細胞增殖或導致細胞凋亡的 待測化合物為具有抑制胃癌細胞活性的化合物，其中所述的細胞模型是權利要求1所述的 人胃癌細胞系。
6. -種如權利要求1所述人胃癌細胞系的建立方法，其特徵在於，該建立方法包括以 下步驟： (1) 獲得新鮮的臨床人胃癌手術切除標本，剪切成小塊，皮下穿刺接種免疫缺陷小鼠； (2) 穿刺接種70?90天後，將荷瘤動物處死，取出腫瘤組織，進行癌細胞的原代培養和 傳代培養。
7. 如權利要求6所述的建立方法，其特徵在於，步驟（1)所述的小塊的質量為20? 50mg〇
8. 如權利要求6所述的建立方法，其特徵在於，步驟（1)所述的免疫缺陷小鼠為SCID 小鼠或裸小鼠。
9. 如權利要求6所述的建立方法，其特徵在於，步驟（1)所述的新鮮的臨床人胃癌切除 標本用HBSS緩衝液漂洗後，再進行皮下穿刺接種，所述的HBSS緩衝液包含500U/ml的青黴 素G，500 ii g/ml的硫酸鏈黴素和1. 25 ii g/ml的兩性黴素B。
10. 如權利要求6所述的建立方法，其特徵在於，步驟（2)所述的細胞的原代培養包括 以下步驟：將腫瘤組織剪切成小塊，置入培養瓶中，於37°C孵箱5% C02條件下培養；次日 向瓶內加入RPMI-1640培養液，所述RPMI-1640培養液含5%胎牛血清，100U/ml青黴素G， 100 y g/ml硫酸鏈黴素和0. 25 y g/ml兩性黴素B，靜置培養；步驟（2)所述的細胞的傳代培 養包括以下步驟：吸棄舊培養液，向瓶中加入新鮮的〇. 05%胰蛋白酶溶液，待細胞脫落後， 加入新鮮的DMEM/F12培養液，仔細吹打，使之脫離瓶壁形成細胞懸液；收集全部細胞，離 心，分別接種於新的培養瓶繼續培養，所述百分比為質量百分比。
【文檔編號】A01K67/027GK104403997SQ201410499358
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年9月25日 優先權日:2014年9月25日
【發明者】強福林, 湯旭蓁, 胡剛, 張一心, 楊雪豔, 方後順, 謝付波, 秦宵然 申請人:上海睿智化學研究有限公司, 南通市腫瘤醫院