修飾的因子Ⅷ的製作方法

2023-10-04 16:02:49

專利名稱：修飾的因子Ⅷ的製作方法
技術領域：
本發明涉及尤其是向人施用的且特別是用於治療用途的多肽。該多肽是修飾的多肽，所述修飾導致該多肽當給予人被試者時具有減少的引起免疫反應的傾向。本發明具體地涉及對人因子VIII(FVIII)進行修飾，從而導致當體內應用時與任何未修飾的對應物相比基本無免疫原性或具低的免疫原性的因子VIII蛋白質。本發明還涉及來源於所述未修飾的蛋白質的T細胞表位肽，通過這些肽可以構建具有降低的免疫原性的FVIII修飾變體。
背景技術：
有許多關於治療性蛋白質的功效受對該治療性蛋白質有害的免疫反應限制的例子。幾種小鼠單克隆抗體已顯示出有希望用作許多人類疾病情形的治療劑，但在某些情況下由於引起顯著程度的人抗-鼠抗體(HAMA)反應而失敗[Schroff，R.W.等人(1985)Cancer Res.45879-885；Shawler，D.L.等人(1985)J.Immunol.1351530-1535]。對於單克隆抗體已發展了許多技術來試圖減少HAMA反應[WO8909622；EP0239400；EP0438310；WO9106667]。這些重組DNA方法通常減少最終抗體構建體中小鼠的遺傳信息，同時增加最終構建體中人的遺傳信息。但是，在幾種情況下，結果所得的「人源化」抗體仍然在患者中引起免疫反應[Issacs，J.D.(1990)Sem.Immunol.2449，456；Rebello，P.R.等人(1999)Transplantation681417-1420]。
抗體不是唯一一類作為治療劑給藥而可產生免疫反應的多肽分子。即使人來源的且與人體內存在的蛋白質具有相同胺基酸序列的蛋白質也可誘導人體內免疫反應。顯著的例子包括粒細胞巨噬細胞集落刺激因子[Wadhwa，M.等人(1999)Clin.Cancer Res.51353-1361]和幹擾素α2[Russo，D.等人(1996)Bri.J.Haem.94300-305；Stein，R.等人(1988)New Engl.J.Med.3181409-1413]等的治療應用。在這些人蛋白質具有免疫原性的情況下，原本在這些個體中起作用的針對這些蛋白質的免疫耐受性，推測將被破壞。
這種將人蛋白質用作替代療法的情形是不同的，例如用在所說蛋白質天然不足的遺傳性疾病的治療中，諸如血友病、Christmas病、Gauchers病之類疾病以及許多其它例子中。在這樣的情況中，治療用的替代蛋白質從開始就可起到免疫學上外源分子的作用，並且當個體能對治療劑產生免疫應答時，治療的效力有可能被顯著降低。
無論所說的蛋白質治療劑是否被宿主免疫系統認作外源分子，或現存的對這些分子的耐受性是否被克服，對這些蛋白質的免疫反應性的機制是相同的。誘發免疫應答的關鍵是在這些蛋白質內存在能通過呈遞於II型MHC分子上而刺激T細胞活性的肽，即，所謂的「T細胞表位」。這樣的T細胞表位通常被定義為能結合II型MHC分子的任何胺基酸序列。言外之意，「T細胞表位」指當結合MHC分子時能被T細胞受體(TCR)識別並至少在原則上能通過結合TCR促進T細胞應答而引起這些T細胞活化的表位。
II型MHC分子是一組在輔助T-細胞的選擇和活化中起重要作用的高度多態的蛋白質。人類DR類白細胞抗原(HLA-DR)是該組蛋白質的主要同種型，然而同種型HLA-DQ和HLA-DP也發揮相似的功能。在人類群體中，每個個體攜帶2-4個DR等位基因、2個DQ和2個DP等位基因。對於DR同種型來說約存在70種不同的同種異型，對於DQ是30種不同的同種異型，對於DP是47種不同的同種異型。許多DR分子的結構已得到了解析，這些結構顯示為具有許多疏水口袋的開放式(open-ended)肽結合溝，這些疏水口袋與肽的疏水殘基(口袋殘基)嚙合[Brown等人Nature(1993)36433；Stern等人(1994)Nature368215]。MHC DR分子由在C末端插入細胞膜的α鏈和β鏈組成。每個異二聚體都具有能結合9-20個胺基酸長度的肽的配體結合域，但是結合溝最大能容納11個胺基酸。最近的研究顯示DQ分子具有同源結構，而且預期DP家族蛋白質將非常相似。確立不同II型MHC分子同種異型的多態性造成了肽結合溝中多種多樣的不同肽結合表面，且在群體水平上確保了能夠最大的靈活度地識別外源蛋白質及對病原體生物產生免疫反應。
對治療性蛋白質的免疫反應通過II型MHC肽呈遞途徑進行。在此，外源蛋白質被吞入並經加工以與DR、DQ或DP類的II型MHC分子結合進行呈遞。II型MHC分子是由專門的抗原呈遞細胞(APC)，如巨噬細胞和樹突細胞等表達的。II型MHC肽複合物與T-細胞表面上關連T-細胞受體的結合，加上某些其他共同受體如CD4分子的交互結合可誘導T-細胞內的活化狀態。該活化導致細胞因子的釋放，從而進一步活化其他淋巴細胞如B細胞以產生抗體，或者活化T殺傷細胞而形成完全的細胞免疫反應。
T-細胞表位的鑑定是表位消除的第一步，然而在本領域中幾乎沒有清楚的案例將鑑定表位和去除表位整合在單個方案中。WO98/52976和WO00/34317講授了鑑定多肽序列的計算穿線(computational threadingapproach)方法，該多肽序列具有與人II型MHC DR同種異型亞型結合的潛力。在這些講授中，預測的T-細胞表位通過在目的蛋白質中應用合理的胺基酸替代而去除。然而利用該方案和其他鑑定表位的基於計算的程序[Godkin，A.J.等人(1998)J.Immunol.161850-858；Sturniolo，T.等人(1999)Nat.Biotechnol.17555-561]，預測能夠與II型MHC分子結合的肽可能並不會在所有情況下，特別是在體內(由於加工途徑或其他現象)發揮T-細胞表位的功能。此外，這些預測T-細胞表位的計算方法通常不能夠預測具有DP或DQ限制性的表位，儘管這些系統的表位識別通常相互重疊。
除計算技術之外，存在測量合成的肽與II型MHC分子結合能力的體外方法。一種示例性的方法應用具有限定的MHC同種異型的B-細胞系作為II型MHC結合表面的來源，且可應用於II型MHC配體的鑑定中[Marshall K.W.等人(1994)J.Immunol.1524946-4956；O』Sullivan等人(1990)J.Immunol.1451799-1808；Robadey C.等人(1997)J.Immunol.1593238-3246]。然而，這種技術不適用於篩選可針對廣泛多樣的MHC同種異型的多重潛在表位，且它們也不能證實結合的肽能否發揮T-細胞表位的功能。
最近採用重組MHC分子與合成的肽的可溶性複合物的技術已得到應用[Kern，F.等人(1998)Nature Medicine4975-978；Kwok，W.W.等人(2001)TRENDS in Immunol.22583-588]。這些試劑和方法可用於鑑定來自人或實驗動物被試者的外周血液樣品中是否存在能夠結合特定的MHC-肽複合物的T-細胞克隆，但這些方法和試劑也不適用於篩選可針對廣泛多樣的MHC同種異型的多重潛在表位。
T-細胞活化的生物學測定法可提供實際的選擇方案，通過該方案可讀出所檢測的肽或整個蛋白質序列引起免疫反應的能力。該類方法的例子包括Petra等人的工作，該工作對細菌蛋白質葡萄球菌激酶應用T-細胞增殖測定，隨後用合成的肽刺激T-細胞系以對表位進行作圖[Petra，A.M.等人(2002)J.Immunol.168155-161]。類似地，應用合成的破傷風毒素蛋白質的肽進行的T-細胞增殖測定導致對毒素中免疫優勢表位的確定[Reece J.C.等人(1993)J.Immunol.1516175-6184]。WO99/53038公開了所測試蛋白質的T-細胞表位可用分離的人免疫細胞亞群進行確定的方法，其中細胞分離後，促進其在體外分化並在合成的目的肽存在時進行細胞培養，在培養的T-細胞中對任何誘導的增殖進行測量。相同技術也由Stickler等人[Stickler，M.M.等人(2000)J.Immunotherapy23654-660]描述，其中在兩種情況下該方法應用於在細菌枯草桿菌蛋白酶中探測T-細胞表位。這種技術需要仔細地應用細胞分離技術和利用多種細胞因子補充物進行細胞培養以便獲得想要的免疫細胞亞群(樹突細胞、CD4+和/或CD8+T-細胞)，且不利於應用多個供體樣品的快速通量篩選。
如上所述，由此期望從給定的原則上有治療價值但最初為免疫原性的肽、多肽或蛋白質中鑑定並去除或至少減少T-細胞表位。這種治療上有價值的分子之一是FVIII。本發明提供除去了一個或多個T細胞表位的修飾形式的人FVIII。
FVIII是固有的血液凝固途徑中的一個凝血因子。FVIII是因子IXa的輔因子，其在鈣離子和磷脂存在的條件下將因子X轉變成活化形式Xa。現已對FVIII的分子遺傳學有了很好的研究，相當重要的原因是當X-連鎖基因中缺乏FVIII時會導致A型血友病。FVIII基因編碼兩種可選擇剪切的轉錄產物，可產生A同種型的大糖蛋白FVIII和較小的B同種型。在天然狀態下可鑑別到來源於A同種型前體的多種降解或加工形式，且特定的功能活性已被定位於特定的片段。FVIII分子被劃分為6個結構域三個A結構域(A1、A2、A3)，一個富碳水化合物且非必需的中央結構域(B-結構域)和兩個C結構域(C1、C2)。FVIII的凝血酶和因子Xa蛋白水解位點在殘基372、740和1689之後。Xa與活化的蛋白質C一道的裂解位點發生在殘基336之後。
FVIII蛋白質在功能上可定義為能矯正A型血友病患者血漿中凝血缺陷的因子。為了治療A型血友病，已生產來自人或豬血漿的純化形式的FVIII，最近還通過重組DNA技術生產FVIIII。1984年，人FVIII基因被至少兩個獨立的實驗小組分離和表達於哺乳動物細胞中[Toole，J.J.等(1984)，Nature312342-347；Gitschier，J.等(1984)，Nature312326-330；Wood，W.I.等(1984)，Nature312330-337；Vehar，G.A.等(1984)，Nature312337-342；WO87/04187；WO88/08035；WO88/03558；US4757006]。從cDNA中推知了其胺基酸序列並已開發了治療用量的FVIII的重組生產，例如US4965199公布了一種用於在哺乳動物宿主細胞中生產FVIII和純化人FVIII的方法。已有關於在CHO(中國倉鼠卵巢)細胞和BHKC(幼倉鼠腎細胞)中表達人FVIII的報導，而最近FVIII已被修飾成缺失部分或全部的B結構域[美國專利申請4868112]，且這樣的分子已在臨床試驗中顯示出了功效[Lusher，J.M.等(2003)Haemophilia938-49]。這一分子事實上已獲得了應用許可-Refacto是遺傳研究所和Pharmacia Upjohn合作在CHO細胞中製備的。
儘管可以得到治療量的FVIII，仍然繼續需要具有增強特性的FVIII類似物。期望達到的增強作用包括蛋白質表達和純化的可選擇方案和形式，還有尤其是對蛋白質生物學特性的改進。在用作治療劑時特別需要增強其體內特性。在這方面，非常期望的是提供減少或缺失在人受試者體內誘發免疫應答的潛力的FVIII。預期這樣的蛋白質會呈現出在人受試者體內循環時間增加且對慢性和復發性疾病尤其有益，諸如A型血友病，尤其是在血友病患者可能對外源重組因子VIII敏感且原本產生會限制其治療效力的抗因子VIII抗體的情況下尤其有益。
其它文獻也提供了FVIII分子和特別是重組修飾FVIII[US4757006；US5633150；US5668108]，但它們之中無一認識到T細胞表位對於該蛋白質免疫原性的重要，也無一考慮到按本發明的方案以特異且受調控的方式直接影響這些特性。
本領域中關於FVIII修飾的許多例子中包括US5948407，為了產生對治療用蛋白質抗原的抑制性T細胞全部組分，此文獻中公布了用於產生能經黏膜(如口腔)施用該蛋白質的製劑的方案。
其它文獻也試圖修飾FVIII以達到提高其在受試血友病患者體內的半衰期的目的，例如US6037452描述的聚(環氧烷)因子VIII綴合體。
在A型血友病治療中的一種特殊的併發症是在某些病人中誘發針對所施用FVIII製品的抑制性抗體。現已提出幾種策略來克服血友病患者中對FVIII的免疫學應答。耐受性誘導治療是這些方法中的一種，但目前需要在血友病患者的極早期施用很大劑量(且昂貴)的FVIII製品。此方法只在部分病例中成功獲得了耐受性[Colowick，A.B.等(2000)Blood961698-1702]。在預先未接受治療的受試者中進行的兩種不同的重組產物的臨床試驗報告顯示，在20％左右的病例中有抑制物的產生[Lusher，J.M.等(1993)N.Engl.J.Med328453-459；Bray，G.L.等(1994)Blood832428-2435]。FVIII抑制物是在血漿中中和FVIII活性的免疫球蛋白抗體。在用FVIII濃縮品或重組FVIII治療的約25％嚴重血友病患者和5-15％輕度至中度患者中所說的抑制物作為同種抗體出現。
對於含有抑制物的病人還採用了因子IX複合物或「凝血酶原複合物」進行治療。通常這些藥劑是包括如因子II、VII、IX和X在內的多種不同因子的混合製品。EP0044343-B1提供這樣一種以已活化的成分(FVIIa)為特徵的凝血酶原複合物。類似地，US6358534描述了包含小部分FVIII蛋白和相對較高比例的其它凝血蛋白因子及載體蛋白的免疫耐受性凝血酶原複合物。
US5543145提供了組合物以抑制FVIII抑制物的產生，該組合物包括例如以與FVIII混合的F(ab』)2形式的多克隆抗體或單克隆抗體。US4769336提供了結合併由此封閉FVIII抗體抑制物的FVIII片段。
其它的策略是利用豬因子VIII替代人FVIII，不過這樣的治療是一種暫時的方法，因為豬VIII本身是會產生免疫性的。
其它可選擇的方法包括用免疫抑制性藥物進行治療並/或通過體外療法從循環中除去抑制物，可以理解的是這些方法代表了對目前所出現問題的極端和冒險的解決方案。遺傳工程技術的確為治療用途的FVIII分子的修飾和產生提供了相當大的機會。A型血友病的藥用組合物和療法由文件US4965199、US5618788和US5668108和外國同族專利提供，應被認為是本領域中可獲得的在此題目上進行大規模工作的典型例子。
用重組方法進行FVIII修飾的另外類型的例子參見文件US5859204、US6376463、US6485563和US6180371，它們共同提供了FVIII蛋白質及它們的編碼基因，其中的定位替代導致了對抑制性抗體反應性的降低。在這些具體的文件中替代被限制在FVIII A結構域的第484-509位胺基酸之間。這樣的修飾雖然改變了FVIII分子的表面布局從而使特定構象表位不再能被病人血清中的特定交叉反應抗體所識別，但是沒有涉及驅使B細胞產生抗體所需的潛在T細胞表位。
其它文獻已使用了重組DNA方法來提供通過定位胺基酸替代[WO87/07144]或相關分子間的結構域交換來修飾的FVIII分子。後一種方法的例子參見WO90/05530，其中提供了以人因子V的B結構域替代FVIII B結構域的FVIII分子。
還有其它文獻提供了包含重組FVIII分子的嵌合FVIII製品，通過遺傳工程化使其含有人和豬(或其它物種)來源的序列結構域。這樣的雜合分子參見US5744446、US5663060、US5583209、US5364771、US5888974及其它文獻中。
US5171844提供了遺傳工程化的FVIII分子，該分子可能具有增強的活性和/或降低的免疫原性。後一種特性涉及通過刪除缺失分子的某一部分。US4868112和國外同族專利中所述的較早工作提供了缺失B結構域的FVIII功能性刪除突變體。
對FVIII蛋白質的其它遺傳工程修飾致力於蛋白質生產過程的改進，US6,271,025提供了具體實例。提供此實例作為本領域可利用的且已知的許多更多相似工作的例示。
發明概述和描述本發明提供了修飾形式的人因子VIII，此處稱作「FVIII」，其中免疫特徵通過減少或去除潛在T-細胞表位的數目而被修飾。
本發明公開了在FVIII一級序列中鑑定到的序列，該序列由於其II型MHC結合潛力而是潛在的T細胞表位。本公開尤其同樣涉及2332個胺基酸殘基的同種型A完整人FVIII蛋白質以及該蛋白質中缺少B域的較小版本。
本發明還公開了在保持最大程度的蛋白質生物學活性的前提下可以通過特定的胺基酸替代、添加或缺失進行改變的本發明分子的一級序列中的特定位點。在只有同時喪失生物學活性才能去掉免疫原性的情況下，可通過在所述蛋白的胺基酸序列中做進一步的改造以恢復所述的活性。
本發明還公開了用於生成這些經修飾分子的方法，首先是用於鑑定為了降低或消除免疫原性位點而需要改變的T細胞表位的方法。
本發明提供了預期在體內展示增強特性的經修飾形式的FVIII蛋白質。本發明公開了在人體內具有免疫原性的FVIII一級序列的主要區域，並提供了為了消除或降低這些位點的免疫原性效力而對序列進行的修飾。在一個實施方案中，為了提升對完整分子的耐受原性應答(tolerogenic response)，可在藥學組合物中提供包含免疫原性區域的合成肽。
在另一個實施方案中，本發明的經修飾FVIII分子可用於製藥學組合物。
概括而言，本發明涉及下面的要點●一種經修飾的分子，其具有FVIII的生物學活性，且當其在體內應用時基本上無免疫原性或免疫原性低於任何具有相同生物學活性但未經修飾的分子；●如上所述的分子，其中，所述的免疫原性喪失是通過從原始的未經修飾的分子中去除一個或多個T-細胞表位而實現的；●如上所述的分子，其中，所述的免疫原性喪失是通過減少能與由所述分子衍生的肽相結合的MHC同種異型的數量來實現的；●如上所述的分子，其中，去除了一個T-細胞表位；●如上所述的分子，其中，原本存在的T-細胞表位是II型MHC的配體，或表現出經II型分子呈遞作用後有刺激或結合T-細胞的能力的肽序列；●如上所述的分子，其中，所述的肽序列選自如下肽a-ka)＝ILLFAVFDEGKSWHS，b)＝SYKSQYLNNGPQRIG，c)＝GPQRIGRKYKKVRFM，d)＝YKWTVTVEDGPTKSD，e)＝ASNIMHSINGYVFDS，f)＝VAYWYILSIGAQTDF，g)＝MSSSPHVLRNRAQSG，h)＝CNIQMEDPTFKENYR，i)＝STLFLVYSNKCQTPL，j)＝ISQFIIMYSLDGKKW，k)＝IARYIRLHPTHYSIRSTLRM；●如上所述的分子，其中所述肽序列選自表1和/或表2中的肽；●如上所述的分子，其中，所述的肽序列選自如

圖1所示的肽；●如上所述的分子，其中，任何原本存在的T-細胞表位中的1-9個胺基酸殘基，優選1個胺基酸殘基發生了改變；●如上所述的分子，其中，所述胺基酸殘基的改變是在特定的位置對原本存在的胺基酸殘基進行缺失或用其他的胺基酸殘基進行替代、添加；●如上所述的分子，其中，在需要時常通過替代，添加或缺失特定的胺基酸作進一步改變以恢復所述分子的生物學活性；●與上文肽序列a-k之任一共享超過90％胺基酸同一性的上文肽分子；●與上文肽序列a-k之任一共享超過80％胺基酸同一性的上文肽分子；●與表1或圖1之任一肽序列共享超過90％胺基酸同一性的上文肽分子；●與表1或圖1之任一肽序列共享超過80％胺基酸同一性的上文肽分子；●能夠結合II型MHC的上述肽序列；●如上所述的FVIII分子，其中在對應於上文肽a-k之任一中的任一所示胺基酸的位置進行了一個或多個胺基酸替代；●如上所述的FVIII分子，其中在對應於表1或圖1中任一所示胺基酸的位置進行了一個或多個胺基酸替代；●包含具有結合II型MHC的活性的上文任一個肽或修飾的肽的藥物組合物；●編碼任何上述和下述經修飾分子的DNA序列或分子；●包含具有FVIII生物學活性的經修飾分子的藥物組合物；●上述和/或權利要求中定義的藥物組合物，其任選地包含藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑；●製造如上引用的任何權利要求中所定義的具有FVIII生物學活性的經修飾分子的方法，該方法包括下述步驟(i)確定所述多肽或其中一部分的胺基酸序列；(ii)通過任意方法，包括利用體外或矽片(in silico)技術或生物學試驗確定所述肽與MHC分子的結合，由此鑑定所述蛋白的胺基酸序列中潛在的一個或多個T-細胞表位；(iii)設計新的序列變體，其中，經鑑定的潛在T-細胞表位內有一個或多個胺基酸經過修飾，由此基本上減弱或去除了所述T-細胞表位的活性，這一效果可由體外或計算機技術或生物學試驗通過所述肽與MHC分子的結合來確定；(iv)通過重組DNA技術構建所述序列變體，並檢測所述的變體以便鑑定一個或多個具有所需性質的變體；和(v)任選地重複步驟(ii)-(iv)；●如上所述的方法，其中步驟(iii)是通過在任何原本存在的T-細胞表位中替代、添加或缺失1-9個胺基酸殘基來進行的；●選自圖1的具有潛在的II型MHC結合活性且由未經修飾的FVIII產生的13肽T-細胞表位肽，及其在製造在體內使用時基本上沒有免疫原性或免疫原性低於具有相同生物學活性的任何未經修飾的分子的FVIII中的用途；●由上述的13肽T-細胞表位肽中的至少9個連續的胺基酸殘基組成的肽序列，及其在製造在體內使用時基本上沒有免疫原性或免疫原性低於任何未經修飾的分子並具有人因子VIII的生物學活性的FVIII中的用途。
●選自表1或圖1中序列的具有潛在的II型MHC結合活性且由未經修飾的FVIII產生的13肽T-細胞表位肽，及其在製造在體內使用時基本上沒有免疫原性或免疫原性低於任何未經修飾的分子並具有人因子VIII的生物學活性的FVIII中的用途；●由來自表1或圖1中任一序列的13肽T-細胞表位肽中的至少9個連續胺基酸殘基組成的肽序列，及其在製造在體內使用時基本上沒有免疫原性或免疫原性低於任何未經修飾的分子並具有人因子VIII的生物學活性的FVIII中的用途。
根據對本發明的理解，術語「T-細胞表位」是指具有下述能力的胺基酸序列，即能結合MCH II、能刺激T-細胞和/或也能以與MHC II形成複合物的形式結合(但不一定可測量地激活)T-細胞。
此處及後附權利要求中所用的術語「肽」是指包含兩個或多個胺基酸的化合物。胺基酸之間通過肽鍵相連(定義見下)。肽的生物生產中涉及20種不同的天然胺基酸，任意數量的所述胺基酸可按任意的順序連接形成肽鏈或環。用於生物生產肽的天然胺基酸全部具有L-構型。可應用常規的合成方法利用L-胺基酸、D-胺基酸或兩種不同構型的胺基酸的各種組合製備合成肽。一些肽僅包含少量的胺基酸單元。例如含有不到10個胺基酸單元的短肽有時被稱作「寡肽」。其他的包含大量胺基酸殘基，例如達100個或更多個胺基酸殘基的肽稱作「多肽」。習慣上將含有3個或3個以上胺基酸的任何肽鏈多看作「多肽」，而將「寡肽」視為特定類型的短「多肽」。因而本文所提到的「多肽」也包括「寡肽」。而且，所用到的「肽」包括多肽、寡肽和蛋白。不同的胺基酸排列形式形成不同的多肽或蛋白。因此，可形成的多肽的數量以及不同蛋白的數量實際上是無限的。「α碳(Cα)」是肽鏈中碳-氫(CH)組分中的碳原子。「側鏈」是Cα的側基，其可包含簡單的或複雜的基團或部分，且具有與所述肽的大小相比可顯著變化的外形大小。
本發明可應用於與此處公開的FVIII具有基本上相同的一級胺基酸序列的任何FVIII分子，因此包括利用基因工程手段或其他方法獲得的、可以包含多於或少於2332個胺基酸殘基的FVIII分子。
對於特別優選的FVIII分子，分子中缺乏B結構域，而且任何剩餘結構域中還包含一個或多個胺基酸替代，導致序列中一個或多個T細胞表位的消除。缺失了B結構域的1438個胺基酸殘基的治療性FVIII分子已經進行了成功的臨床試驗，正如Lusher等人及其中參考文獻所述[Lusher，J.M.等(2003)Haemophilia 938-49]。本文圖9描述了這種蛋白質的胺基酸序列。
FVIII蛋白，如從其他哺乳動物來源中鑑定出的相關蛋白與本發明中公開的肽序列之間存在大量共有序列，且與列表中公開的肽序列間存在大量基本上相同的共有序列。因此這樣的蛋白序列也落入本發明的保護範圍。
本發明設計用於克服實際應用中存在的下述問題，即將可溶性蛋白引入自體生物中可引發免疫應答，產生可與所述可溶性蛋白相結合的宿主抗體。對於許多A型血友病患者，針對現有治療性FVIII製劑的抗體應答是處理他們疾病的重大問題。在任何個體中，少數T細胞表位能夠驅動T輔助細胞信號傳導而導致針對天然FVIII蛋白質中許許多多由B細胞所識別的表面暴露決定簇的持續抗體應答。對來自A型血友病患者的編碼抑制劑抗體的基因的分析顯示許多這樣的抗體經歷了親和力成熟[Jacquemin，M.G.等(1998)Blood 92496-506；van den Brink，E.N.等(2000)Blood 95558-563]。親和力成熟下面的超變現象只發生於應答T細胞輔助的B細胞中，同樣早就認識到高比例的FVIII抑制劑抗體屬於IgG4亞型[Andersen，B.R.和Terry，W.D.(1968)Nature 217174-175]，而且類似地此必需的類型轉變反應是T輔助細胞依賴性事件。應答FVIII的抗體是由T細胞驅動的其它證據來自具有FVIII抑制劑的HIV陽性患者中的觀察結果，即FVIII抗體應答由於T細胞數目下降而喪失[Bray，G.L.等(1993)Am.J.Hematol.42375-379]。因此，本發明試圖通過提供在施用於人體時引發免疫應答的傾向發生改變的FVIII蛋白來解決這一問題。存在這樣一種理解，當多數B細胞表位在經修飾的FVIII表面保持完整時，在缺乏持續T細胞輔助時抑制劑滴度將最終降低，而且對於接受這種療法的新患者而言將開始就不能獲得建立。
根據本文所述方法，本發明人發現了FVIII分子中包含關鍵T細胞表位的區域，這些表位驅動針對該蛋白質的免疫應答。
本發明中形成經修飾的FVIII的一般方法包括下述步驟(a)確定多肽或其中一部分的胺基酸序列；(b)通過任意方法，包括利用體外或計算機技術或生物學試驗確定所述肽與MHC分子的結合，由此鑑定所述蛋白的胺基酸序列中潛在的一個或多個T-細胞表位；(c)設計新的序列變體，其中，經鑑定的潛在T-細胞表位內有一個或多個胺基酸經過修飾，由此基本上減弱或去除了所述T-細胞表位的活性，這一效果可由體外或計算機技術或生物學試驗通過所述肽與MHC分子的結合來確定。構建此序列變體以避免由所述的序列變體產生新的潛在T-細胞表位，否則所述的新的潛在T細胞表位又通過此種方式進行修飾以基本上減弱或消除T-細胞表位活性；和(d)根據已知的重組技術通過重組DNA技術構建所述序列變體，並檢測所述的變體以便鑑定一個或多個具有所需性質的變體。
對於步驟(b)中對潛在T-細胞表位的鑑定可依照本領域已公知的方法進行。在WO 98/59244；WO 98/52976；WO 00/34317；WO02/069232中公開了適當的方法，可以用於鑑定FVIII-衍生的肽對II型MHC分子的結合傾向。在實踐中，已經通過聯合應用生物學離體人T細胞增殖測定法和採用WO02/06922中所略述方案的軟體工具衍生了本發明的組合物，而且其中所述軟體工具是本發明的一個實施方案。
軟體在肽-II型MHC結合相互作用的水平模擬抗原呈遞過程，為任何指定肽序列提供了結合評分。這種評分針對群體中現存的許多主要II型MHC同種異型而確定。由於此方案能夠測試任何肽序列，因此能夠預測胺基酸替代、添加或缺失在肽與II型MHC結合溝相互作用的能力方面的後果。因此，可以設計包含減少數目的能夠與II型MHC相互作用從而發揮免疫原性T細胞表位功能的肽的新序列組合物。當生物學測定法能夠評估任一指定供體樣品與最多4種DR同種異型的結合時，矽片(in silico)方法可以同時用超過40種同種異型測試相同肽序列。在實踐中，這種方法能夠指導與多種MHC同種異型相互作用的能力受到損害的新序列變體的設計。
作為這種矽片方法的實例，圖1提供了在完整人FVIII序列上進行的分析的結果。圖中列出了衍生自FVIII且經檢測具有以顯著結合評分結合一種或多種II型MHC同種異型能力的13mer肽序列。從總體上看，針對人FVIII蛋白質，這組13mer肽數據集被認為以高度確定性提供了全部容許的MHC型配體。出於諸如對體內完整FVIII多肽的蛋白水解加工和導致FVIII肽呈遞的其它生理學步驟的需要等原因，顯然整個肽庫中相對少數的肽將具有最終的生物學適用性。為了進一步鑑定這些生物學相關肽，發明人開發了採用離體人T細胞增殖測定法的方法。
這種方法已經被證明是一種特別有效的方法，而且在本文中公開作為本發明的實施方案。該方法可用於測試部分序列，例如缺乏所有或部分B結構域的FVIII蛋白質；該方法可用於序列中的選定區域，例如FVIII肽子集諸如圖1中所列的所有或一些肽；或者該方法可用於測試完整FVIII序列。在本研究中，該方法包括在方案中測試重疊的FVIII衍生肽序列以掃描並測試缺乏B結構域的FVIII序列。對合成的肽測試它們在體外人T細胞培養物中引發增殖應答的能力。在使用來自健康供體的幼稚人T細胞進行這類方法時，本發明人確定了在這種測定法的操作中等於或大於2.0的刺激指數是所誘導增殖的有用測量值。刺激指數常規地通過用在有檢驗的肽時測量到的增殖分數(例如如果應用3H-胸苷摻入則為每分鐘的放射性計數)除以在不與檢驗的肽接觸的細胞中測量到的增殖分數而獲得。
在這種方法的另一個實施方案中，本發明人提供了使用離體生物學T細胞測定法對FVIII序列掃描以確定T細胞表位的存在和定位的方法，其中T細胞來源於血友病患者。對於這些患者的一部分而言，FVIII蛋白質在體內構成外來蛋白質和有力抗原。本發明人確定了有可能在體外由這些個體的PBMC衍生多克隆和原則上單克隆T細胞系，而且這些細胞系可以在FVIII蛋白質的T細胞表位作圖中用作有效試劑。
這是按如下實現的將血友病PBMC T細胞在體外進行幾輪抗原(FVIII)刺激，隨後立即在存在IL-2時進行擴增。對於建立多克隆T細胞系而言，2-3輪抗原刺激通常足以生成大量的抗原特異細胞，而且這些細胞可以冷凍保存繼而在需要時使用。細胞被用於篩選大量的合成肽。
在本情況中，使用每個庫包含8種不同肽序列的一系統庫分析了合成肽。圖2圖示了肽庫方案。在包括將FVIII與PBMC一起孵育7天的最初一輪抗原(FVIII)刺激之後，隨後在存在自體經照射PBMC作為抗原呈遞細胞時用抗原再次刺激。這些輪次的抗原選擇進行3-4天，並以包括用IL-2進行刺激的擴增階段間隔，IL-2可以每3天添加一次，總計大約9天。使用「靜息」的T細胞，即大約4天未經IL-2刺激的T細胞進行最後一次的再刺激。
如先前所述，使用最優選的自體抗原呈遞細胞用抗原(如合成肽或完整蛋白質)刺激這些細胞大約4天，然後測量後繼增殖應答(如果有的話)。組織這些肽庫使得每個庫包含與後繼庫重疊的肽。通過這種方式任何一個T細胞表位都出現在2個不同庫中，而且將由使用這兩個庫的處理中檢測到誘導的增殖。在對任何指定肽庫檢測增殖應答後，對肽庫解碼，使用分離的各個庫成員重複此測定法。
在本方案中，特別希望採用來自稱為「抑制劑患者」的患者類型的PBMC樣品，因為可以預期由來自這些個體的T細胞集合所定義的FVIII蛋白質表位圖譜將代表能夠在體內環境中呈遞的最普遍肽表位。在這方面，來自先前已被證明有免疫應答的患者的PBMC是體內致敏步驟的產物，而且可以預期這具有實踐優勢，即能夠針對任何指定的刺激肽引起強得多的增殖應答。這降低了進行增殖測量的技術難度。
本研究揭示了能夠引發顯著增殖應答(即SI＞2.0)的38種肽序列。這些肽在表1中列出，而且是本發明的一個實施方案。在這組肽中，又鑑定了一個肽子集，經鑑定子集中的肽在2個或更多個供體樣品中引發顯著增殖應答，而且對於這些應答中的某些而言，應答水平事實上顯著高於SI＝2.0。這些肽在表2中列出，而且是本發明的另一個實施方案。
表1
*依照B結構域缺失的序列進行序列編號(圖9)
表2能離體刺激來自2個或2個以上供體樣本的人T細胞的FVIII肽序列
*依照B結構域缺失的序列進行序列編號(圖9)本文所公開的肽序列是構建其中這些表位的一個或多個遭到破壞的經修飾FVIII分子所需要的關鍵信息。在本發明的方案中，通過突變破壞表位從而導致序列不再能夠發揮T細胞表位的作用。可以用重組DNA方法來完成這些靶序列的定向誘變，許多這樣的技術在本領域是可以獲得的且眾所周知的。
當本發明的目的是修飾上文表1所列舉的至少一個或多個肽的胺基酸序列時，最優選修飾表2所示的肽P1-P11中的一個或多個序列。此處公布了能夠達到雙重目的的適宜修飾，所述目的即在作為一種或多種II型MHC同種型分子的配體的水平上，或者更特別地在能夠誘導T細胞增殖(尤其是在T細胞是體外培養的人T細胞的情況)的水平上，降低或消除受試肽序列作為T細胞表位的能力。
這樣一套優選修飾中的一個例子是破壞肽P10所包含的T細胞表位，P10的序列為ISQFIIMYSLDGKKW。此表位定位於FVIII的C1結構域，而且是能夠引發來自血友病患者血液和健康非血友病個體的離體T細胞增殖的表位的一個典型例子。
以該肽序列在II型MHC配體活性方面的矽片分析結果為指導，將定點誘變方法用於在殘基F1207、I1208、I1209和M1210處產生替代。殘基依照缺失了B結構域的成熟FVIII序列進行編號(圖9)。在F1207處的誘變導致了FVIII表達的喪失，而且在所採用的檢測法中沒有可檢測的活性。相反，生成了包含I1208A或I1208T或I1208N和/或I1209C和/或M1210K或M1210N替代的活性FVIII分子。因此，具有一個或多個上述替代的活性FVIII蛋白是本發明方案下的優選組合物。尤其優選的替代是I1208A、I1209C、M1210K或M1210N，這些經過替代修飾的FVIII蛋白是本發明另外的實施方案。
同樣優選的實施方案還包括在肽P8所具有的T細胞表位中包含替代的FVIII分子，P8序列為CNIQMEDPTFKENYR。此表位定位於FVIII蛋白質的A3結構域。定點誘變方法已應用於此序列，而且為了提供在Coatest分析法及矽片(in silico)免疫學參數和體外免疫學檢測多方面看都保持了功能活性的分子，已生成了M1013K、I1011A或C或D或E或G或H或K或P或Q或R或S或T的替代。因此包含M1013K、I1011A或C或D或E或G或H或K或P或Q或R或S或T替代的FVIII分子是本發明的其它實施方案。
同樣優選的實施方案還包括在肽P7所具有的T細胞表位中包含替代的FVIII分子，P7序列為MSSSPHVLRNRAQSG。此表位也定位於FVIII蛋白質的A3結構域。在V823位的替代被認為是特別期望的修飾而且也是本發明的一個實施方案。定點誘變方法已應用於此序列，且為了提供在Coatest分析法和矽片免疫學參數及體外免疫學檢測多方面看都保持了功能活性的分子，已生成了V823A或D或E或G或H或N或P或S或T的替代。因此包含V823A或D或E或G或H或N或P或S或T替代的FVIII分子是本發明的其它實施方案。
在血友病患者血樣中顯示有活性的另一T細胞表位肽序列例子是肽P11，其序列為IARYIRLHPTHYSIRSTLRM。此表位定位於FVIII蛋白的C1結構域，而且原來已被鑑定為FVIII抑制劑產生的重要驅動劑[Jacquemin，M.等(2003)Blood1011351-1358]。在位點Y1254、I1255、L1257、Y1262、I1264、L1268處的替代被認為是尤其合乎需要的修飾，而且都是本發明的實施方案。
其它類似的優選實施方案有於肽P9(STLFLVYSNKCQTPL)所含表位的L1119、F1120、L1121、V1122和Y1123位點含有替代，以及於肽P6(VAYWYILSIGAQTDF)所含表位的Y636、Y638、I637、L638和I639位點含有替代；於肽P5(ASNIMHSINGYVFDS)所含表位的I613和I617位點含有替代；於肽P4(YKWTVTVRDGPTKSD)所含表位的V515和V517位點含有替代；於肽P3(GPQRIGRKYKKVRFM)所含表位的I419位點含有替代；於肽P2(SYKSQYLNNGPQRIG)所含表位的Y407、Y411和L412位點含有替代；於肽P1(ILLFAVFDEGKSWSH)所含表位的L197、L198、F199、V201和F202位點含有替代的FVIII分子。
從上文可見，依照本發明可生成許多FVIII蛋白質變體並檢測其期望的免疫和功能特性。用於製備和檢測這些FVIII變體蛋白質的示例方法參見實施例。所有這些功能性蛋白質都是本發明的實施方案。而且，所進行的修飾均已被證明生成了不能以與親本或「野生型」(wt)肽序列相同的親合力結合II型MHC分子的肽序列，所用的證實方法是WO02/069232的預測性矽片II型MHC結合工具。此外，使用離體人T細胞生物學增殖測定法進行了這些例示性變體肽表位的實際測試，證實這些肽支持T細胞增殖的能力並由此起到T細胞表位的功能如所期望的喪失了。在本案例中這包括用生物學測定法鑑定並由此證實能支持T細胞激活的肽序列。有意義的是許多這樣的肽能夠促進來自血友病患者血液的T細胞體外增殖，因而是經過加工的表位的代表而不能被認為是隱蔽的或免疫學無關的決定簇。
儘管有其它的方法，包括可考慮化學合成FVIII片段，但變體蛋白質最優選用重組DNA技術產生。很容易利用本文所提供的蛋白質序列信息來推斷任何優選變體FVIII分子或片段的多核苷酸(DNA)。最容易的是利用諸如DNAstar軟體包(DNAstar Inc.Madison WI，美國)或類似的計算機軟體為工具來完成此推斷。任何編碼本發明多肽或其重要同源物的這些DNA序列都應被認為是本發明的實施方案。
本發明涉及其中至少一個胺基酸已被替代的FVIII類似物，其中在所選位置的替代導致蛋白質的一個或多個潛在T細胞表位的消除或活性明顯降低。在圖1所示任一潛在II型MHC配體中或更優選的是表1和2的肽表位序列中，特殊位點處的一個或多個胺基酸替代可能導致產生在作為治療劑施用於人宿主時其免疫原性潛能有所降低的FVIII分子。
最優選的是提供在親代分子最具免疫原性的區域進行胺基酸修飾(如替代)而產生的FVIII分子。為了消除T-細胞表位，胺基酸替代優選在肽序列中預期可實現T-細胞表位活性的基本減少或消除的適當位點上進行。在實踐中，適當的位點優選等同於可以在II型MHC結合溝所提供的其中一個口袋中結合的胺基酸殘基。最優選地是改變肽在所謂的肽P1或P1錨定位置處與裂縫的第一個口袋的結合。在肽的P1錨定殘基和II型MHC結合溝的第一個口袋之間的結合相互作用質量被公認為是完整肽的總結合親和力的主要決定因素。在肽的該位置中的適當替代可為替代為較不易於容納於口袋中的殘基，如替代為更親水的殘基。肽中對應於與MHC結合裂縫其他口袋區域結合的位置的胺基酸殘基也可以加以考慮並且屬於本發明的範圍內。
正如本發明技術人員所清楚的，進行多重複合替代可達到去除不想要的表位的目的。然而，所產生的序列被認為與本文所公布的具體組合物極為同源並因而屬於本發明的範圍之內。
可以理解的是在給定的潛在T細胞表位中單個胺基酸替代是最優選的消除表位的途徑。在單個表位中也可以考慮進行組合替代，例如當單獨限定的表位相互重疊時組合替代可能是特別適當的。此外，可以在就II型MHC結合溝而言非「口袋殘基」的位置，在肽序列中任何位點處進行胺基酸替代，該胺基酸替代可以是於給定的表位中的單個替代或於單個表位中的組合替代。替代可參照同源結構或由本領域已知的計算機技術產生的結構方法進行，也可以根據本發明分子的已知結構特徵進行。所有此類替代均落入本發明的範圍內。
尤其可考慮與所列舉肽中的替代相聯合在以上限定的肽之外進行胺基酸替代。例如，可考慮進行某種改變來恢復變體分子的結構或生物學活性。這樣的補償性改變和包括從FVIII多肽中缺失或添加特殊胺基酸殘基從而產生具有期望活性的變體的改變與任何已公布肽中的改變相聯合均落入本發明的範圍內。
就本發明來說，它還涉及已修飾的FVIII和含此已修飾FVIII蛋白質或其片段的組合物，且所涉及的組合物應認為是在本發明的範圍之內。這方面的相關例子可以是開發肽介導的耐受性誘導策略，其中一個或多個已公布的肽以免疫治療的目的施用於病人。因此，合成的肽分子，例如一個或多個表1中所列舉的肽分子，是本發明已考慮過的實施方案。在另一方面，本發明涉及編碼已修飾的FVIII的核酸。在又一方面，本發明涉及用已修飾的FVIII蛋白質對人進行治療的方法。在還有一方面，本發明涉及利用含有序列與本文公布序列相同或部分相同的肽或衍生分子的藥物製品進行治療的方法。
現在將用以下實施例對本發明進行描述，但本發明並不局限於這些實施例。前文所述以及下面的實施例涉及以下附圖圖1提供了在人因子VIII中具有人II型MHC分子結合活性的一系列肽序列。肽長為13聚體，胺基酸以單字母密碼表示。
圖2描述了篩選肽庫的方案。在本研究中肽為15聚體，且每個與後續的肽重疊12個殘基。
圖3提供的柱形圖描述用FVIII衍生的合成肽處理後體外T細胞增殖測定法的結果。在此實施例中，用分離自血友病患者供體的FVIII T細胞系來篩選跨FVIII序列的重疊肽庫。箭頭指示誘發T細胞增殖並隨後被解碼的肽庫。
圖4提供的柱形圖描述用FVIII衍生的合成肽處理後體外T細胞增殖測定法的結果。在此實施例中，使用分離自血友病患者供體的FVIII特異性T細胞系解碼誘發T細胞增殖的兩個肽庫。含T細胞表位的肽用箭頭指示。
圖5提供的柱形圖描述用FVIII衍生的合成肽處理後得到的體外T細胞增殖測定法結果。在此實施例中，用分離自兩個供體的細胞來篩選跨越FVIII序列的肽。1#供體(A)和2#供體(B)具有相同的HLA-DR同種異型(DRB1*03、DRB1*04、DR3和DR4*01)。箭頭指示含T細胞表位的肽。
圖6提供了顯示肽8(P8)突變體的活性數據和蛋白質表達水平的圖陽性對照是野生型因子VIII。M1013K描述了含M1013K替代的FVIII分子的表達和活性數據。其它柱子代表了同時含有M1013K替代以及I1011位變換成所顯示胺基酸的改變的FVIII分子。
圖7提供了顯示肽7(P7)突變體的活性數據和蛋白質表達水平的圖陽性對照是野生型因子VIII，陰性對照是轉染中未加入DNA。其它的樣品是具有所指示胺基酸改變的V823突變體。
圖8提供了示例性T細胞測定數據，數據給出在野生型序列肽顯示刺激指數＞2.0的條件下具有刺激指數＜2.0的肽突變體。肽序列及PBMC供體同種異型數據已製成表格。
圖9顯示了用軟體模擬肽與II型MHC分子結合所獲的代表性結果。所示結果針對18種不同的HLA-DR同種異型，每個直立柱表示對單一同種異型的結合。A圖顯示在肽7周圍針對野生型FVIII序列檢測所得的結合圖。肽7序列被加深標出。B圖顯示對含替代V823A的已修飾肽7序列進行檢測得到的結合圖，證實其丟失了針對多種同種異型的高親和力配體。在每一圖中通過標明每個13肽II型MHC配體的第一個殘基來描述預期的MHC結合。以所示的各配體對各同種異型分子的計算結合分值為基礎，用H、M或L表示結合強度。先前的物理結合研究已顯示數值小於500000為可忽略的結合相互作用。
圖10顯示了野生型(WT)B結構域缺失的人FVIII序列的胺基酸序列及其編號。用單字母密碼表示胺基酸。
實施例1建立T細胞系和克隆的方法從血友病患者血液中分離外周血單核細胞(PBMC)並低溫保存於液氮中。血樣的提供得到完全的知情同意並在當地Addenbrooke’s HealthCare Trust的批准下進行加工。通過用FVIII刺激大量培養中的抗原特異性T細胞，隨後進行幾個循環的IL-2誘導的擴增來建立T細胞系。最初在24孔板中將PBMC以2×106的密度保溫(37℃、含5％CO2的潮溼空氣中)於2ml含4μg/ml FVVIII(RefactoTM)的AIM V培養基中。保溫7天後加入100U/ml的IL-2，繼續培養3天。10天的抗原/IL-2刺激完成後收集T母細胞(T blast)並計數。為了保持抗原特異性，用經γ輻射的自體PBMC作為抗原呈遞細胞對T母細胞進行第二輪抗原刺激。這一步的完成方法為在用4000拉德γ射線進行輻射前將24孔板中的1×106個/孔的自體PBMC與4μg/ml FVIII在0.75ml AIMV(含5％的熱失活人AB血清)中孵育1小時。將0.25ml AIM V中的自體T母細胞以4×105個細胞/ml的濃度加入經γ輻射的抗原呈遞細胞(預負載FVIII)中並孵育3天。通過用100U/ml IL-2刺激細胞3天擴增T母細胞，然後每隔3天向培養物提供新鮮的IL-2(終濃度100U/ml)共9天。為了保證所有的擴增T母細胞都是抗原特異的，進行第三輪抗原刺激，其中T母細胞被收集並以4×105個細胞/ml的濃度重懸於AIMV培養基中。如前文所述通過將24孔板中的1×106個γ輻射的自體PBMC與4μg/ml FVIII在0.75ml AIMV(含5％的熱失活人AB血清)中孵育1小時來產生抗原呈遞細胞。將0.25ml AIM V中的自體T母細胞以4×105個細胞/ml的濃度加入經γ輻射的抗原呈遞細胞中並孵育3天。最終在10U/ml的IL-2中擴增3天，然後收集T母細胞並用於篩選肽庫。
從大量培養物克隆在用FVIII抗原進行第三輪刺激後，收集T母細胞並通過系列稀釋將其重懸至密度4×102-1×104個細胞/ml(2x培養物終密度)。融化自體PBMC並以2×106個細胞/ml(2x培養物終密度)的密度重懸於聚丙烯管中。然後將PBMC暴露於4000拉德γ射線輻射並用作抗原呈遞細胞，通過限制稀釋選擇呈抗原反應性的T細胞克隆。將經γ射線輻射的抗原呈遞細胞(1×106終濃度)與T母細胞(2×102-5×103終濃度)、1-10μg/ml FVIII抗原和100U/ml IL-2混合。通過在Terasaki平板中每孔加入20μl APC、T母細胞、FVIII和IL-2混合物而建立T細胞克隆。用一個Terasaki平板上2-50個T母細胞/孔的稀釋度進行有限稀釋克隆。
T細胞克隆的篩選和維持T母細胞與FVIII抗原、IL-2和經γ射線輻射的自體抗原呈遞細胞一起孵育約14天。鑑定所含細胞呈現明確生長的孔後，將T母細胞轉移至含1×105經γ輻射的同種異體PBMC、100U/ml IL-2和1μg/ml植物凝集素(PHA)的圓底96孔板的單個孔中，終體積為200μl AIMV(含1％的熱失活人AB血清)。在細胞匯合後將T細胞克隆傳代，最後轉移至含1×106經γ輻射的同種異體PBMC(飼養細胞)、100U/ml IL-2和1μg/ml植物凝集素(PHA)的24孔板的單個孔中，終體積為2ml AIMV(含1％的熱失活人AB血清)。T細胞克隆的常規維持包括每隔2-3周(取決於細胞生長狀態)用新鮮的PHA和同種異體飼養細胞刺激一次，以及用100U/mlIL-2每周刺激2次。只有被證實為FVIII特異性的T細胞克隆才被擴增並用於篩選FVIII肽。
自體B細胞的EBV轉化通過在4×106個PBMC中加入3ml已過濾(0.45μ)的B95.8上清並在37℃保溫1小時，將來自PBMC製品的B細胞無限增殖化以產生B類淋巴母細胞系(BLCL)。沉澱PBMC並重懸於含5％熱失活胎牛血清(FCS)和1μg/ml環孢菌素A的2ml RPMI中。保溫7天後，用含5％FCS和2μg/ml環孢菌素A(達到終濃度為1μg/ml環孢菌素A)的新鮮RPMI置換1ml培養基。在第14和21天重複此飼餵方案，此後如需要用含5％FCS的RPMI進行細胞傳代並擴大至組織培養瓶。
用T細胞系/克隆篩選FVIII肽合成長度為15個殘基且通過增加12個胺基酸而與先前的肽重疊的肽(Pepscan，荷蘭)。為了保存，最初將肽以10mM的濃度溶於100％的二甲亞碸(DMSO)。建立肽庫以便同時針對FVIII特異性T細胞系篩選大量肽。組織肽庫以便每個庫都與隨後的庫包含重疊肽，通過使用此方法，與兩種肽重疊的T細胞表位將誘導兩個不同庫的增殖。通常每個庫由8種肽組成，以1或5μM的濃度測試每種肽。肽庫策略如圖2所述。
自體PBMC(對於T細胞系來說)或EBV轉化的BLCL(對於T細胞克隆來說)被用作抗原呈遞細胞，將1×105個PBMC或BLCL懸浮於50μL AIMV培養基中並隨後加入96孔圓底板的各個孔中。對於每個庫來說分別以兩個濃度(1或5μM)將肽庫加入三個平行孔中。在暴露於4000拉德γ射線輻射之前將抗原呈遞細胞和肽庫於37℃孵育1小時。當用作T細胞克隆的抗原呈遞細胞(代替已γ輻射的自體PBMC)時，BLCL在37℃用1μg/ml絲裂黴素C預處理1小時，隨後在AIMV中洗4次。然後將抗原特異性T細胞系或T細胞克隆以5×104個細胞/孔的濃度加入並培養3天。第三天在每個孔中加入1μCi[3H]-胸腺嘧啶核苷至少脈衝8小時。在濾墊上收穫平板後用Wallac小平板β計數器測定cpm/孔。圖3顯示了用T細胞系產生的表位圖譜，其中T母細胞被用於鑑定含T細胞表位的肽庫，隨後將這些庫解碼以鑑別含T細胞表位的單個肽。
用來自健康供體的PBMC繪製幼稚T細胞表位圖譜用來自40名健康HLA-DR類型供體的血液分離PBMC，將此PBMC用於在兩個濃度(1和5μM)篩選各FVIII肽。由於來自每個供體的PBMC數目不足以篩選所有的FVIII肽，供體被分成兩組，其中前20個供體用於篩選跨越前半段分子的肽，第二組供體用於篩選剩餘的肽。為了覆蓋呈現於世界人群中的多種同種異型，按所表達的II型MHC同種異型來選擇供體。檢測MHC同種異型。
用購買到的試劑體系(Dynal，Wirral，英國)來檢測所有PBMC樣品的組織類型。按供應商推薦的方案用標準的輔助試劑及瓊脂糖電泳體系來進行檢測。
PBMC包含生理性數量的幼稚T細胞和抗原呈遞細胞。這些細胞以2×105個細胞/孔(96孔平底板)的密度用於篩選三份平行200μL培養物中1μM和5μM的肽。將細胞與肽在37℃保溫6天，然後在每個孔中加入1μCi[3H]-胸腺嘧啶核苷至少脈衝8小時。收穫培養物於濾墊上後用Wallac小平板β計數器測定cpm/孔。圖5顯示了用兩組供體分別篩選分子兩半部分所產生的FVIII表位圖譜。
實施例2克隆和表達因子VIII的方法mRNA提取和cDNA合成從醫院病理學系獲取人的肝組織。將樣品切成方塊並分成50mg的等分試樣，保存於液氮中。將一份50mg試樣勻漿並直接用PolyA TractSystem1000試劑盒(Promega)按製造商說明書提取mRNA，得到約10μg mRNA。用ImProm-II逆轉錄系統(Promega)以寡(dT)15為引物按製造商的說明書將1μg等分試樣的mRNA在20μL反應體系中進行逆轉錄。然後在70℃加熱15分鐘滅活逆轉錄酶。
因子VIII序列的聚合酶鏈式反應擴增由於待克隆的是B結構域缺失的因子VIII變體，所以此cDNA以兩半段的方式擴增。用以下引物擴增5』端的mRNASEQ ID NO.1GCATCGCGCGCTAGCAATAAGTCATGCAAATAGAGSEQ ID NO.2GAAGCTCCTAGGTTCAATGGCATTGTTTTTACTCASEQ ID NO.1包含為方便克隆的兩個限制性酶切位點加上因子VIIImRNA序列ATG起始密碼子(粗體)周圍的24個核苷酸。SEQ ID NO.2與因子VIII mRNA的第2420-2454位核苷酸互補並在第2445和2448位(粗體)包含兩個改變的核苷酸，這樣就引入了一個新的限制性酶切位點同時使蛋白質序列未受影響。
用以下引物對擴增因子VIII基因的3』端SEQ ID NO.3TGAGTCTTAAGCTAGCTAGATACCTAGGAGCTTCTCCCAAAACCCACCAGTCTTGAAACGCCSEQ ID NO.4TACGTCTCGAGTCAGTAGAGGTCCTGTGCCTCGCASEQ ID NO.3包含限制性酶切位點NheI以便克隆，並包含與第5140-5164位核苷酸融合的因子VIII mRNA的第2442-2457位核苷酸。此引物因此建立了重鏈和輕鏈之間的聯結，在此幾乎整個B結構域缺失。此引物還含有在第2445和2448位點(粗體顯示)處的核苷酸改變，這樣就建立了也能在SEQ ID NO.2中找到的新限制性酶切位點。SEQ ID NO.4包含因子VIII編碼序列的最後24個核苷酸加上一個方便克隆的限制性酶切位點。
用Expand HiFi聚合酶(Roche)及供應的含MgCl2的緩衝液進行PCR反應，終體積50μL。反應體系是1x緩衝液中含dNTP各200μM、引物各50pmol(或者是seq ID No.1加No.2，或者是seq ID No.3加No.4)、2.5個單位的RNaseH和5μL逆轉錄酶的反應混合物。為了提高PCR反應的效率將反應在37℃保溫30分鐘使RNA/cDNA雜交體中的RNA被RNaseH所降解。然後將反應在94℃加熱2分鐘預變性，隨後的循環使用以下的溫度和時間94℃30秒，55℃30秒，72℃2.5分鐘。在第一個退火步驟期間加入推薦量的聚合酶，反應進行20個循環。在第20個延伸步驟後的退火步驟中加入第二等份聚合酶並再進行20個循環的反應。然後將反應在72℃保溫10分鐘以保證所有的鏈完全聚合。
因子VIII基因的克隆和組裝用1％的瓊脂糖凝膠分離PCR反應產物的一半，切下相應於因子VIIIcDNA 5』端的2286bp帶和相應於3』端的2015bp帶並通過Qiagen凝膠提取試劑盒將這兩條帶從瓊脂糖中純化出來。然後按製造商的說明將PCR產物連入PCR產物克隆載體(pGEM-T Easy Vector System，Promega)。按供應商所推薦的用0.1cm間距的電擊杯將連接反應液各1μL電穿孔轉化入20μL電感受態大腸桿菌菌株XL1-Blue(Stratagene)中。還按供應商所推薦的方法重懸細胞並使其復甦。將10μL和100μL等份的電穿孔細胞鋪於含100μg/ml氨苄青黴素、80μg/ml Xgal和0.5mM IPTG的LB瓊脂板上並在37℃培養過夜。
挑選白色菌落並分散於20μL水中。用供應的緩衝液和Taq聚合酶(Roche)以20μL的反應體積通過PCR分析來自各重懸菌落的樣品。反應體系為在1x緩衝液中包含dNTP各200μM、標準M13正向和反向引物(本文的SEQ ID Nos5和6)各50pmol和1μL的重懸菌落。然後將反應在94℃加熱2分鐘預變性，隨後的20個循環使用以下的溫度和時間94℃30秒，60℃30秒，72℃2分鐘。然後將反應在72℃保溫10分鐘以保證所有的鏈完全聚合。
取各反應樣品5μL於1％的瓊脂糖凝膠上分離。含有約2300bp大小條帶的樣品被認為對於因子VIII 5』半側的插入片段來說是陽性的，而含有約2150bp條帶的樣品被認為對於因子VIII 3』半側的插入片段來說是陽性的。對於各插入片段，將8個菌落分別接種於含100μg/ml氨苄青黴素的5ml2YT肉湯液體培養基中並在37℃振蕩培養過夜。用Qiagen小量提取試劑盒從1.5ml各培養物中製備質粒並將質粒送到合同測序機構進行序列測定，所用引物如下5』半側的克隆SEQ ID No.5 CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC (M13正向)SEQ ID No.6 AGCGGATAACAATTTCACACAGGA (M13反向)SEQ ID No.7 ATGATCAGACCAGTCAAAGG(因子VIII mRNA nt573-592)SEQ ID No.8 CAGGAAATCAGTCTATTGGC(因子VIII mRNA nt975-994)SEQ ID No.9 TGGGTACATTACATTGCTGC(因子VIII mRNA nt1372-1391)SEQ ID No.10 ACAGTGACTGTAGAAGATGG(因子VIII mRNA nt1768-1787)SEQ ID No.11 GTCTTCTTCTCTGGATATACC (因子VIII mRNA nt2179-2199)3』半側的克隆SEQ ID No.5 CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC (M13正向)SEQ ID No.6 AGCGGATAACAATTTCACACAGGA (M13反向)SEQ ID No.12 GAGTAGCTCCCCACATGTTC(因子VIII mRNA nt5370-5361)SEQ ID No.13 GTGCACTCAGGCCTGATTGG(因子VIII mRNA nt5786-5767)SEQ ID No.14 AGGTGTTTTTGAGACAGTGG(因子VIII mRNA nt6187-6168)SEQ ID No.15 GAGGAAATTCCACTGGAACC(因子VIII mRNA nt6594-6575)SEQ ID No.16 AATCTCTGCTTACCAGCATG(因子VIII mRNA nt6993-6974)已發現質粒pCF85編碼因子VIII基因5』半側的正確胺基酸序列。質粒pCF83則被發現編碼因子VIII基因3』半側的正確胺基酸序列。
用Bst98I和XhoI消化pCF83並通過瓊脂糖凝膠電泳純化所得到的含因子VIII基因3』半側的2.0Kbp片段，用標準技術將其克隆入同樣酶切和純化的pLitmus(NEB)中。如上所述通過PCR鑑別陽性菌落並選擇一個克隆-pCLF83進行培養和DNA製備。
用BssHII消化pCF85並在dNTP各100μM存在的條件下用T4 DNA聚合酶將末端補平。然後將反應在70℃加熱10分鐘並隨之以AvrII消化。通過瓊脂糖凝膠電泳純化酶切釋放的2.3kbp片段，將其克隆入已用Bst98I消化並如上補平及用AvrII消化並進行凝膠純化的pCLF83中。如上所述用引物Seq ID No.11和Seq ID No.17(ATCAGTAAATTCCTGGAAAAC[因子VIII mRNA第5448-5428位核苷酸])通過PCR篩選鑑別陽性菌落。這對引物擴增了跨越因子VIII基因兩半間連接區的片段，因此只有在克隆成功的情況下才能得到約570bp的產物。選擇陽性菌落並命名為pCLF8。培養此菌落，然後進行DNA製備和測序。用引物Seq ID No.6和Seq ID No.5證實了連接序列的正確。此5』和3』兩半之間的連接也用引物Seq ID No.17得到了證實。
因子VIII的表達和活性分析用已修飾的載體pCI變體(Promega，Southampton，英國)表達此FVIII蛋白。未修飾的pCI載體長4.0kbp，含用於哺乳動物表達的CMV增強子/啟動子和SV40晚期聚腺苷酸化信號，還包含細菌繁殖所必需的序列。該載體還含有噬菌體F1的起點，用限制性酶BamHI和EcoO109I消化此質粒去除該起點。如上所述用T4 DNA聚合酶將消化產物補平，然後通過1％的瓊脂糖凝膠分離。從凝膠中純化3.2kbp的載體片段，自連接並如上所述轉化入細菌菌株XL1-blue中。如上所述挑選菌落、培養過夜並小量製備質粒。用酶切位點出現於F1起點序列內的限制性酶NgoMIV消化已純化的質粒樣品並通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析。挑選抗性質粒並稱之為pCIΔ。
用限制性酶NheI和XhoI消化pCIΔ並通過瓊脂糖凝膠電泳純化載體片段。用同樣的酶消化pCLF8並通過瓊脂糖凝膠電泳純化含有因子VIII基因的4.4kbp片段，用標準技術將其克隆入酶切的pCIΔ中。用如上所述引物Seq ID No.11和Seq ID No.17通過PCR分析鑑別陽性菌落。
選擇一陽性菌落，命名為pCIF8，將其接種入含100μg/ml氨苄青黴素的50ml 2YT肉湯培養基中37℃劇烈振蕩培養過夜。用Qiagen小量製備試劑盒製備高純度的質粒DNA。質粒DNA用分光光度法定量，稀釋至0.2μg/μL並通過0.2μm孔徑、1.5cm直徑的濾器(Nalgene)進行無菌過濾。
HEK293細胞(ATCC CRL-1573)連續培養維持於75cm2組織培養瓶的DMEM中，此DMEM中含有Glutamax-I、丙酮酸鈉和4500mg/ml葡萄糖(Invitrogen目錄號31966-021)，補充有10％的熱滅活胎牛血清(Perbio目錄號CH30160.03)。細胞生長於37℃/5％CO2中並每48小時1/5稀釋進行傳代培養。HEK293細胞只微弱粘附於組織培養塑料製品上，通過洗滌培養瓶表面就使其脫離。
用Lipofectamine2000(Invitrogen)按製造商所述在聚L-賴氨酸包被的24孔組織培養皿(Beckton Dickinson)中轉染HEK293細胞。用磷酸緩衝鹽水(PBS)洗滌75cm組織培養瓶中幾乎匯合的細胞，並用胰蛋白酶/EDTA溶液使其從組織培養瓶上分離下來。加入等體積的生長培養基滅活胰蛋白酶。用血球計數器進行細胞計數並將細胞懸浮液以1200rpm離心5分鐘。去除上清，以4×105個細胞/ml的密度將細胞沉澱重懸於生長培養基中。在24孔組織培養皿的每孔中分配0.5ml細胞懸浮液並在37℃/5％CO2中培養過夜。轉染前去除各孔中的培養基並置換成新鮮的0.5ml培養基。將0.8μg質粒pCIF8和陰性對照質粒pCIΔ分別在Optimem(Invitrogen目錄號51985-026)中稀釋至50μL。對於每次轉染，將2μL Lipofectamine2000稀釋至50μL，室溫放置5分鐘後與已稀釋的質粒混合，隨後再室溫放置20分鐘。進行三份平行的轉染，然後在24孔板的每個孔中分別滴加100μL質粒/脂質混合物。然後將平板在37℃/5％CO2中保溫。在24小時、48小時和72小時三個時間點從各轉染樣品中取出10μL的等分試樣。將來自三個平行樣品的等分試樣合併得到每個樣品的總體積為30μL，在進行活性分析前凍存於-80℃。
按製造商的說明書用Coatest F8C/4試劑盒(Chromogenix)以微量滴定的形式檢測上清液中的因子VIII活性。在冰上融化上清液樣品，1/20和1/100稀釋於檢測緩衝液中並以雙份平行樣品進行檢測。標準品是已對照因子VIII活性的國際標準(Chromogenix)定量的凍乾血漿樣品。按製造商說明書將一小瓶血漿重溶於1ml水中。對於血漿中因子VIII活性水平參考所附數據表，然後將血漿通過添加檢測緩衝液進行100％稀釋(1IU/ml)。然後按製造商提供的微量滴定檢測方案中所述的步驟稀釋標準品。24小時後發現來自pCIF8所轉染細胞的上清中含0.16IU/ml活性，在48小時時增加到了0.74IU/ml，然後在72小時時又回落到0.5IU/ml。在用對照質粒轉染的細胞上清中未觀察到活性。因此因子VIII以足夠測定突變體活性的量成功表達。
肽P10中胺基酸的誘變(表2)肽10包含的4個疏水殘基具有作為與II型MHC分子相互作用的主要錨定位點的潛能F1207、I1208、I1209及M1210(按B結構域缺失的成熟序列編號)。因此這四個殘基被選為突變的目標殘基，以突變成不可能作為主要錨定位點的那些殘基。F1207改變成A、H、K、N、Q和R；I1208改變成A、T、D、N；I1209改變成A、C、D、N、P；M1210改變成A、K、N和Q。用本領域眾所周知的已建立的方法通過交迭PCR進行誘變。肽10位於因子VIII核苷酸序列中被PspOMI和SphI限制性位點所限定範圍的片段內。合成用於擴增這些片段的PCR引物(下文的Seq IDNo.18和Seq ID No.19)，它們相應於緊鄰此區域外側的序列。對於F1207的誘變，合成的內部引物如下所述SEQ ID No.18 GGACACATTAGAGATTTTCA (基因nt.3463-3482)SEQ ID No.19 CAGTAATCTGTGCATCTGAT (基因nt.3949-3930)SEQ ID No.20 CTGAGAGATGTAGAGGCT (基因nt.3675-3658)SEQ ID No.21 AGCCTCTACATCTCTCAGgccATCATCATGT (F1207A)SEQ ID No.22 AGCCTCTACATCTCTCAGcacATCATCATGT (F1207H)SEQ ID No.23 AGCCTCTACATCTCTCAGaagATCATCATGT (F1207K)SEQ ID No.24 AGCCTCTACATCTCTCAGaacATCATCATGT (F1207N)SEQ ID No.25 AGCCTCTACATCTCTCAGcagATCATCATGT (F1207Q)SEQ ID No.26 AGCCTCTACATCTCTCAGcgcATCATCATGT (F1207R)用Expand HiFi聚合酶(Roche)及供應的含MgCl2的緩衝液進行PCR反應，終體積50μL。5』片段的反應體系是1x緩衝液中含dNTP各200μM、引物各50pmol(Seq ID No.18加No.20)、100ng pCIF8和2.5個單位的Expand聚合酶。建立6個3』片段反應，體系為1x緩衝液中含dNTP各200μM、引物各50pmol(Seq ID No.19加Seq ID No.21、22、23、24、25或26)、100ng pCIF8和2.5個單位的Expand聚合酶。然後將反應在94℃加熱2分鐘預變性，隨後的循環使用以下的溫度和時間94℃30秒，50℃30秒，72℃30秒。反應進行20個循環，然後在72℃保溫10分鐘以保證所有的鏈完全聚合。
在1％瓊脂糖凝膠上分離各PCR的一半反應產物，將226bp的5』片段和292bp的6個不同的3』片段從凝膠上切下來並用Qiagen凝膠提取試劑盒進行純化。然後如下將5』片段與各個3』片段連接如上所述用ExpandHiFi聚合酶進一步進行6個PCR反應，以已洗脫的5』片段2μL和6個已洗脫的3』片段各2μL作為模板，引物是Seq ID No.18和Seq ID No.19。將這些反應液各一半在1％的瓊脂糖凝膠上進行分離並如上所述純化6個486bp大小的片段。用限制性酶PspOMI和SphI在37℃消化各PCR產物過夜，總反應體積為50μL。同樣在37℃消化4μg質粒pCIF8 2小時，並將質粒和PCR片段消化產物的一半進行1％瓊脂糖凝膠電泳。從凝膠中切下7.2kbp的載體帶和391bp的PCR片段並如上所述進行純化，純化產物分別溶於水中，終體積為30μL。在標準10μL連接反應體系中用T4DNA連接酶和所供應的緩衝液(Invitrogen)將1μL載體與6種片段各3μL連接。反應液在室溫放置4小時。按供應商所推薦的用0.1cm間距的電擊杯將連接反應液各1μL電穿孔轉化入20μL電感受態大腸桿菌菌株XL1-Blue(Stratagene)中。還按供應商所推薦的方法重懸細胞並使其復甦。將10μL和100μL等份的電穿孔細胞鋪於含100μg/ml氨苄青黴素的LB瓊脂板上並在37℃培養過夜。
從各連接產物所鋪的板上挑選4個菌落並在含100μg/ml氨苄青黴素的5ml 2YT液體培養基中37℃劇烈振蕩培養過夜。用Qiagen Mini-Prep試劑盒從各1.5ml培養物中製備質粒DNA。用引物Seq ID No.18對各質粒樣品進行DNA測序。從4個一組中挑選序列正確的一個質粒保存以備通過轉染進行活性和表達水平的分析。
在此相同的一般步驟後對I1208、I1209和M1210進行突變。用於各胺基酸的引物如下I1208SEQ ID No.18 GGACACATTAGAGATTITCA (基因nt.3463-3482)SEQ ID No.19 CAGTAATCTGTGCATCTGAT (基因nt.3949-3930)SEQ ID No.20 CTGAGAGATGTAGAGGCT (基因nt.3675-3658)SEQ ID No.27 AGCCTCTACATCTCTCAGTTTgccATCATGT (I1208A)SEQ ID No.28 AGCCTCTACATCTCTCAGTTTaccATCATGT (I1208T)SEQ ID No.29 AGCCTCTACATCTCTCAGTTTgacATCATGT (I1208D)SEQ ID No.30 AGCCTCTACATCTCTCAGTTTaacATCATGT (I1208N)I1209SEQ ID No.18 GGACACATTAGAGATTTTCA (基因nt.3463-3482)SEQ ID No.19 CAGTAATCTGTGCATCTGAT (基因nt.3949-3930)SEQ ID No.20 CTGAGAGATGTAGAGGCT (基因nt.3675-3658)SEQ ID No.31 AGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCgccATGTATA (I1209A)SEQ ID No.32 AGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCtgcATGTATA (I1209C)SEQ ID No.33 AGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCgacATGTATA (I1209D)SEQ ID No.34 AGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCaacATGTATA (I1209N)SEQ ID No.35 AGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCcccATGTATA (I1209P)M1210SEQ ID No.18 GGACACATTAGAGATTTTCA (基因nt.3463-3482)SEQ ID No.19 CAGTAATCTGTGCATCTGAT (基因nt.3949-3930)SEQ ID No.20 CTGAGAGATGTAGAGGCT (基因nt.3675-3658)SEQ ID No.36 AGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCATCgccTATAGTC(M1210A)SEQ ID No.37 AGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCATCaagTATAGTC(M1210K)SEQ ID No.38 AGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCATCaacTATAGTC(M1210N)SEQ ID No.39 AGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCATCcagTATAGTC(M1210Q)如上所述，在24孔聚-L-賴氨酸平板中將已通過序列分析證實的各突變克隆一式兩份轉染入HEK293細胞中。轉染在37℃/5％CO2中進行48小時。合併各轉染的平行試樣上清並如上所述檢測因子VIII的活性。還用配對的抗因子VIII抗體ELISA試劑盒(Affinity Biologicals)檢測上清中的因子VIII表達水平。修改此檢測法使其有效地對組織培養上清物質進行定量，步驟如下將捕捉抗體以1/100稀釋於pH9.6的碳酸鈉/碳酸氫鈉緩衝液中，按100μl/孔加入Dynex Immulon4 96孔ELISA平板中。此平板在4℃放置過夜。用洗滌緩衝液(含0.1％Tween20的Tris緩衝鹽水[TBS25mMTris，137mM NaCl，3mM KCl，在25℃pH7.4])將孔洗4次，100μl/次，將雙份100μl等分試樣的平行稀釋標準品和組織培養上清加入各個孔中。標準品是已對照因子VIII活性的國際標準(Chromogenix)定量的凍乾血漿樣品。按製造商說明書將一小瓶血漿重溶於1ml水中。參考所附數據表顯示的血漿中因子VIII活性水平，然後添加樣品稀釋緩衝液(含1％w/v的牛血清白蛋白)進行100％稀釋(1IU/ml)。然後用樣品稀釋緩衝液將其1/4稀釋得到100％的ELISA標準。然後再用樣品稀釋緩衝液對其進行進一步的稀釋得到代表75％、50％、25％和5％的標準。用樣品稀釋緩衝液1/4稀釋組織培養上清。平板在室溫放置2小時後用洗滌緩衝液漂洗4次，100μl/孔。在每個孔中加入100μl已綴合辣根過氧化物酶的抗體並室溫放置1小時。如前文所述漂洗平板，然後在每個孔中加入100μl底物(現配的TMB/過氧化物溶液Sigma目錄號T0440)。將平板室溫放置15分鐘後加入終止液(2M硫酸)。在Anthos HTII平板閱讀器上用450nm波長的濾片對平板進行讀數。
活性值及表達水平的比較顯示了所有對F1207的改變都導致了無表達從而無活性。I1208突變成A產生與未修飾的因子VIII相似的表達和活性，而突變成T和N則導致25％和50％的活性損失。對於I1209來說，只有突變成C才使突變體的表達和活性與未修飾的因子VIII相似。所有對於M1210的改變都導致了具明顯活性的蛋白質表達，其中具K和N的蛋白與未修飾的因子VIII無差別。因此，I1208A、I1209C、M1210K和M1210N是用於去除肽10內T細胞表位的有用突變。
肽8中胺基酸的誘變(表2)肽8包含兩個有可能作為結合II型MHC分子的主要錨定位點的胺基酸I1011和M1013(按B結構域缺失的成熟序列進行編號)。因此這兩個殘基也是突變的靶殘基，突變成除了可能是主要錨定位點的殘基之外的殘基。與其它物種(狗、小鼠和大鼠)的因子VIII序列比較的結果顯示，在狗的因子VIII中，M1013是K。K也被證實對於肽10的M1210誘變來說它是最好的置換殘基。因此只將M1013突變成K，並與在I1011處不可能形成主要錨定位點的所有胺基酸(即A、C、D、E、K、N、P、Q、R、S、T)相結合。
用本領域技術人員眾所周知的已建立的方法通過交迭PCR進行誘變。肽8位於因子VIII核苷酸序列中被PflM1和PspOMI限制性位點所限定範圍的片段內。合成用於擴增此片段的PCR引物(下文的Seq ID No.40和SeqID No.41)，它們相應於緊鄰此區域外側的序列。對於M1013K和I1011X的誘變，合成的內部引物如下所述SEQ ID No.40ATGAGACCAAAAGCTGGT (基因nt.3026-3043)SEQ ID No.41AGGCATTGATTGATCCG (基因nt.3559-3543)SEQ ID No.42ATTGCAGGGAGCCCTGCAGT(基因nt.3087-3068)SEQ ID No.43ACTGCAGGGCTCCCTGCAATATCCAGaagGAAGA(M1013K)SEQ ID No.44ACTGCAGGGCTCCCTGCAATgccCAGaagGAAGA(I1011A，M1013K)SEQ ID No.45ACTGCAGGGCTCCCTGCAATtgcCAGaagGAAGA(I1011C，M1013K)SEQ ID No.46ACTGCAGGGCTCCCTGCAATgacCAGaagGAAGA(I1011D，M1013K)SEQ ID No.47ACTGCAGGGCTCCCTGCAATgagCAGaagGAAGA(I1011E，M1013K)SEQ ID No.48ACTGCAGGGCTCCCTGCAATggcCAGaagGAAGA(I1011G，M1013K)SEQ ID No.49ACTGCAGGGCTCCCTGCAATcacCAGaagGAAGA(I1011H，M1013K)SEQ ID No.50ACTGCAGGGCTCCCTGCAATaagCAGaagGAAGA(11011K，M1013K)SEQ ID No.51ACTGCAGGGCTCCCTGCAATaacCAGaagGAAGA(I1011N，M1013K)SEQ ID No.52ACTGCAGGGCTCCCTGCAATcccCAGaagGAAGA(I1011P，M1013K)SEQ ID No.53ACTGCAGGGCTCCCTGCAATcagCAGaagGAAGA(I1011Q，M1013K)SEQ ID No.54ACTGCAGGGCTCCCTGCAATcgcCAGaagGAAGA(I1011R，M1013K)SEQ ID No.55ACTGCAGGGCTCCCTGCAATagcCAGaagGAAGA(I1011S，M1013K)SEQ ID No.56ACTGCAGGGCTCCCTGCAATaccCAGaagGAAGA(I1011T，M1013K)用與上述肽10誘變相同的常規步驟進行誘變，不同處在於5』片段長度為62bp及3』片段長為492bp。此連接片段長為534bp，用PspOMI和PflMI消化後克隆入同樣酶切消化的pCIF8。
對於各個突變來說選擇一個序列正確的克隆並如上所述分析它們的活性和表達水平，但不同之處在於轉染以三份平行形式進行，且各上清單獨分析以便評估表達/活性中的變化。
對以上突變體的表達水平和活性的比較結果顯示單獨的M1013K突變與未修飾的因子VIII非常相似。此外，含M1013K加上I1011A、E、P、S或T的聯合突變體也與未修飾的因子VIII無差別。因此這些突變可用於去除與肽8相關的T細胞表位。
肽P7中胺基酸的誘變(表2)肽7包含一個有可能作為結合II型MHC分子的主要錨定位點的胺基酸V823(按B結構域缺失的成熟序列進行編號)。因此這個殘基也是突變的靶殘基，突變為不可能是主要錨定位點的殘基(即A、C、D、E、K、N、P、Q、R、S、T)。
如前文所述用已建立的方法通過交迭PCR進行誘變。肽7位於因子VIII核苷酸序列中被AvrII和PflM1限制酶位點所限定範圍的766bp片段內。合成用於此片段擴增的PCR引物(下文的Seq ID No.57和Seq ID No.58)，它們相應於緊鄰此區域外側的序列。對於V823X的誘變，合成的內部引物如下所述SEQ ID No.57CGAGGACAGTTATGAAG (基因nt.2214-2230)SEQ ID No.58AGTGGGATCTTCCATCTG(基因nt.3108-3091)SEQ ID No.59ATGTGGGGAGCTACTCATCCC (基因nt.2523-2503)SEQ ID No.60GGGATGAGTAGCTCCCCACATgccCTAAGAAACAG (V823A)SEQ ID No.61GGGATGAGTAGCTCCCCACATtgcCTAAGAAACAG (V823C)SEQ ID No.62GGGATGAGTAGCTCCCCACATgacCTAAGAAACAG (V823D)SEQ ID No.63GGGATGAGTAGCTCCCCACATgagCTAAGAAACAG (V823E)SEQ ID No.64GGGATGAGTAGCTCCCCACATgggCTAAGAAACAG (V823G)SEQ ID No.65GGGATGAGTAGCTCCCCACATcacCTAAGAAACAG (V823H)SEQ ID No 66GGGATGAGTAGCTCCCCACATaagCTAAGAAACAG (V823K)SEQ ID No.67GGGATGAGTAGCTCCCCACATaacCTAAGAAACAG (V823N)SEQ ID No.68GGGATGAGTAGCTCCCCACATcccCTAAGAAACAG (V823P)SEQ ID No.69GGGATGAGTAGCTCCCCACATcagCTAAGAAACAG (V823Q)SEQ ID No 70GGGATGAGTAGCTCCCCACATcgcCTAAGAAACAG (V823R)SEQ ID No.71GGGATGAGTAGCTCCCCACATagcCTAAGAAACAG (V823S)SEQ ID No.72GGGATGAGTAGCTCCCCACATaccCTAAGAAACAG (V823T)用與肽10誘變相同的常規步驟(見上文)進行誘變，不同處在於5』片段長度為310bp及3』片段長為606bp。此連接片段長為894bp，用AvrII和PflMI消化後克隆入同樣酶切消化的pCIF8。
對於各個突變來說選擇一個序列正確的克隆並如上所述分析它們的活性和表達水平，轉染以雙份平行形式進行並在檢測前合併上清。
對以上突變體的表達水平和活性比較的結果顯示多種改變都基本上未影響表達水平和活性。這些數據見圖7。V823改變成A、D、E、G、H、N、P、S或T所產生的突變體具有至少與野生型因子VIII相同的表達和活性。因此這些突變可用於去除與肽7相關的T細胞表位。
實施例3合成含有突變的FVIII來源肽並用離體試驗檢測它們所保持的促進T細胞增殖的能力。所說的肽是15聚體的序列，且是為檢測I1011A或I1011T與M1013K聯合替代而設計的。用原先顯示對野生型肽序列有響應的4個PBMC供體樣品測試所說的肽。在所有的案例中所檢測的突變肽都不能以SI＞2.0刺激增殖。包括供體同種異型詳情和肽序列在內的此試驗結果如圖8所示。
在96孔平底板中以2×106個PBMC/孔的密度用蛋白質和肽抗原刺激PBMC。在加入3H-胸苷前將PBMC在37℃孵育7天。產生了具有所述替代的肽，並相對於分離自原先已顯示對FVIII P8肽序列有響應的4個健康供體的PBMC，對各個肽進行分別篩選。在各供體試驗中使用了來自流感血凝素的對照肽和有效的非回憶型抗原匙孔血藍蛋白(KLH)。
將肽溶於DMSO中至終濃度10mM，然後將這些貯液以1/500稀釋於AIMV培養基中(終濃度20μM)。將肽加入平底96孔板中，於100μl中達終濃度2μM和20μM。用臺盼藍染料排除法估計已融化的PBMC的存活力，然後以2×106個細胞/ml的密度重懸細胞，分別將100μl(2×105個PBMC/孔)轉移入含有肽的各個孔中。對於每一種肽濃度檢測三份平行孔培養物。平板在潮溼的5％CO2空氣中37℃孵育7天。在收穫至濾墊上之前用1μCi3H-Thy/孔脈衝細胞18-21個小時。用Wallac小平板β頂平板計數器(Perkin Elmer)測定CPM值。結果表示為刺激指數，通過用測試肽的CPM值除以未處理孔中的CPM值而計算得到。刺激指數大於2被認為是陽性增殖。
權利要求
1.與未修飾的人因子VIII相比包含特異改變的胺基酸殘基、在體內使用時基本上無免疫原性或免疫原性較未修飾親本分子低且具有基本上相同的生物學特異性和活性的經修飾人因子VIII分子，其中所述已改變的胺基酸殘基引起一個或多個在親本未修飾分子中擔當II型MHC結合配體並刺激T細胞的T細胞表位的減少或消除。
2.依照權利要求1的經修飾因子VIII分子，其中所述改變是在表1所描述的親本分子中存在的一個或多個連續胺基酸殘基序列內的一個或多個位置進行的。
3.依照權利要求2的經修飾因子VIII分子，其中所述改變是在表2所描述的親本分子中存在的一個或多個連續胺基酸殘基序列內的一個或多個位置進行的。
4.依照權利要求1-3之任一項的經修飾因子VIII分子，其中所述改變是1-9個胺基酸殘基的替代。
5.依照權利要求4的經修飾因子VIII分子，其中表1所描述的序列中的下列位置的一個、多個或所有胺基酸殘基已經被替代197、198、199、201、202、407、411、412、419、515、517、613、617、636、637、638、639、823、1011、1013、1208、1209、1210、1254、1255、1257、1262、1264、1268、1119、1120、1121、1122、1123。
6.依照權利要求3的經修飾因子VIII分子，其中在表2的肽P10中進行了下列胺基酸殘基替代的一個、多個或所有I1208A、I1208T、I1208N；I1209C；M1210K、M1210N。
7.依照權利要求3的經修飾因子VIII分子，其中在表2的肽P8中進行了下列胺基酸殘基替代的一個、多個或所有M1013K；I1011A、I1011C、I1011D、I1011E、I1011G、I1011H、I1011K、I1011P、I1011Q、I1011R、I1011S、I1011T。
8.依照權利要求3的經修飾因子VIII分子，其中在表2的肽P7中進行了下列胺基酸殘基替代的一個、多個或所有V823A、V823D、V823E、V823G、V823H、V823N、V823P、V823S、V823T。
9.依照權利要求1-8之任一項的經修飾因子VIII分子，其中當作為完整蛋白質在人T細胞的經誘導細胞增殖生物學測定中被測試時其展示的刺激指數(SI)小於使用來自相同供體的細胞平行測試的親本分子且小於2，其中所述指數為用蛋白質刺激後評價的細胞增殖值除以未接受蛋白質的對照細胞中評價的細胞增殖值，並且其中細胞增殖是通過任何適宜方法測量的。
10.編碼權利要求1-9之任一項所定義的因子VIII分子的DNA序列。
11.包含上述權利要求之任一項的經修飾因子VIII分子的藥物組合物，其任選還包含藥學可接受載體、稀釋劑或賦形劑。
12.由表1選擇的、由未修飾人因子VIII的一級序列生成且具有潛在II型MHC結合活性的肽分子，其中所述肽分子在細胞增殖生物學測定中具有大於1.8的刺激指數，其中所述指數為用肽刺激後評價的細胞增殖值除以未接受肽的對照細胞中評價的細胞增殖值，並且其中細胞增殖是通過任何適宜方法測量的。
13.通過胺基酸替代由權利要求12的肽分子衍生的經修飾肽分子，其缺少或具有降低的潛在II型MHC結合活性，表現為刺激指數低於2，其中所述指數為用肽刺激後評價的細胞增殖值除以未接受肽的對照細胞中評價的細胞增殖值，並且其中細胞增殖是通過任何適宜方法測量的。
14.編碼權利要求12或13的肽的DNA序列。
15.依照權利要求13的肽在製造權利要求1所定義的經修飾因子VIII分子中的用途。
16.依照權利要求12的肽在製造用於降低因子VIII在患者體內的免疫原性的疫苗中的用途。
全文摘要
本發明涉及對人因子VIII(FVIII)進行修飾，從而導致當用於體內時與任何未修飾的親代抗體相比基本無免疫原性或具低的免疫原性的FV VIII蛋白質。本發明也涉及來源於所述未經修飾的蛋白質的T－細胞表位肽，通過該肽可以構建具有降低的免疫原性的修飾的FVIII變體。
文檔編號A61K38/36GK1646564SQ03808701
公開日2005年7月27日 申請日期2003年4月17日 優先權日2002年4月18日
發明者T·瓊斯, M·貝克爾, F·J·卡爾 申請人:默克專利有限公司