膜轉位肽的製作方法

2023-10-28 06:15:12 3

專利名稱：膜轉位肽的製作方法
膜轉位肽發明領域本發明涉及分離被稱為膜轉位肽(MTPs)的新型化合物的方法。該MTPs 的特徵在於，具有將其自身及與MTP結合的非轉位部分轉運穿過膜的能力。
背景技術：
將核酸、蛋白質、肽、胺基酸、小分子、病毒等(下文將被共同稱為"非 轉位部分")遞送至細胞內或遞送至特定類型的細胞內的能力可用於腫瘤學、發 育生物學和基因治療的多種應用，以及對模型系統中特定蛋白質、核酸和小分 子的操作模式的一般性理解也有用。大多數重要的治療性蛋白質和肽不易於轉 位穿過生物膜。然而，已發現一些反式激活因子和同源異型蛋白能夠促進膜轉 位，其中包括Tat衍生肽(Fawell & 1994 Prac. M^/. 5W. t/SJ91:664-668)、觸角足同源結構域蛋白的第三螺旋(Derossi"a/.， 1994， J!5/o/.C/^附. 269:10444-10450; U.S. Pat. Nos. 5,888,762 and 6,015,787)和VP22 (Schwarze "/.， 2000, 7>e"(is T^(^maco/. 5W. 21:45-48)。這些天然衍生的肽一般被隔離於細胞 質中的膜囊中，這常常阻止結合的非轉位部分接近其預期的靶(Potocky w d 2003, J6oz7 278:50188-94)。目前，通過兩種不同的途徑來工程化新型肽。第一種途徑通過化學合成6-10 個胺基酸肽的隨機文庫來生成候選肽(J.Eichler W a/., 1995， i 飢化v.15:481-496; K丄am, 1996,爿油c朋cw Dn/gDm. 12:145-167; M. Lebl W 1997, e"巧/wo/. 289:336-392)。第二種途徑中，通過將隨機的寡核苷酸文庫克 隆至Ff絲狀噬菌體基因中而合成候選肽，這樣使得更大的肽在噬菌體的表面表 達(H. Lowman， 1997,^4"". i ev. fifop/2ys. 5wmo/. Sfn^cf, 26:401-424; G. Smith ef o/.， 1993, Me仇￡/iz. 217:228-257)。也已經製備出長度高達38個胺基酸的隨機肽文 庫，而且使用該系統，有可能製備出更長的肽。使用上述兩種策略任意一種制 備的肽文庫隨後通常與預選的結合基質的蛋白靶相混合。洗脫結合的肽，並確 定其序列。根據這一信息，合成新的肽，並確定其生物學特性。噬菌體展示以 往被用來鑑定轉位蛋白，但是通過這種方法分離出的肽相對很少，並且那些已經分離到的肽通常為細胞類型特異性的肽，並需要通過內吞作用進入細胞(Gao e^/. 2002，MW C/ ew.， 10:4057-65)。肽依賴內吞作用進入細胞的現有技 術的缺點之一是，這種機制導致轉位肽及結合的非轉位部分進入包含體，在包 含體中他們均將遭到破壞，從而不能引起所需的細胞作用。現有技術的又一缺點在於，通過噬菌體展示和化學合成而產生的文庫的容 量限制在106-109範圍內。如果不繼而使用費時的突變過程，這一限制導致較低 親和力肽的分離。上述文庫容量方面的限制導致了體外生成肽文庫技術的發展， 其中包括mRNA展示(Roberts, & Szostak, 1997, /Voc. A^/. 5W. C7&4， 94， 12297-12302)、核糖體展示(Mattheakis e "/., 1994,iVw/.C7&4， 91, 9022-9026)、和順式(CIS)展示(Odegrip ef a/.， 2004,屍rac. iVa" jcad [/&4, 101 2806-2810)等等。這些文庫優於噬菌體展示文庫的方面在於通過該方法產 生的文庫容量比通過噬菌體展示而可能產生的文庫容量要大2至3個數量級。 其原因是，不同於諸如噬菌體展示等技術，其中不存在中間的體內步驟。然而，目前還沒有記載使用體外展示系統而特異性和選擇性地鑑定膜轉位 肽(MTPs)的方法。而且，這種方法能鑑定可穿過細胞層(例如內皮)的MTPs。因此，仍需能在MTP發現和肽藥物開發領域提供具有需要的較大進步的方法。發明概述本發明提供了選擇被稱為膜轉位蛋白或MTP的新化合物的方法，該新的化 合物可將其自身和非轉位部分轉位穿過如細胞膜的脂膜。根據其有效地將結合 的部分納入膜包裹的隔室內的能力來選擇本發明的MTP，所述隔室包括體內和 體外的很多細胞類型。所鑑定的本發明MTP也可包括用於診斷和治療目的的分子。因此，本發明的第一方面提供了從肽展示文庫中分離顯示膜轉位活性的化 合物的方法，其中所述文庫包括多種編碼展示肽的核酸序列，且該方法包括如 下歩驟a)表達多種核酸構建體，其中，每個核酸構建體包括可操作地連接至核酸序列的啟動子序列，如此 以來，多種核酸構建體的表達導致了多種核酸-肽偶聯體的形成，且每一偶聯體包括至少一種展示肽，其中所述的展示肽與編碼展示肽的相應核酸構建體相結 合.b) 將多個核酸-肽偶聯體暴露於膜包裹的隔室群，從而使轉位反應發生；c) 移除與膜包裹的隔室未結合的核酸-肽偶聯體；以及d) 從膜包裹的隔室中回收被納入的核酸-肽偶聯體，並且當包括膜轉位蛋白 (MTP)時，表徵核酸序列編碼的肽。在本發明的優選實施方式中，膜包裹的隔室為細胞。因此，本發明提供了 從肽展示文庫中分離顯示細胞膜轉位活性的化合物的方法，其中所述文庫包括 多種編碼展示肽的核酸序列，且該方法包括如下步驟a) 表達多種核酸構建體，其中，每個核酸構建體包括可操作地連接至核酸序列的啟動子序列，如此 以來，多種核酸構建體的表達導致多種核酸-肽偶聯體的形成，且每一偶聯體包 括至少一種肽，其中所述的肽與編碼展示肽的相應核酸構建體相結合；b) 將多個核酸-肽偶聯體暴露於一種或一種以上的細胞類型，從而使轉位反 應發生；C)移除與一種或多種細胞類型未結合的核酸-肽偶聯體；以及d)從細胞中回收被納入的核酸-肽偶聯體，並且當包括膜轉位蛋白(MTP)時，表徵核酸序列編碼的肽。在另一個實施方式中，膜包裹的隔室優選為脂質囊。例如，人工構建的脂質包裹的隔室，如微團或脂質體。優選地，脂質囊是脂質體。優選地，膜包括脂雙層。在上述發明的另一個特定實施方式中，所述方法在(c)後進一步包括移除 核酸-肽偶聯體的步驟，其中所述的核酸-肽偶聯體連結至膜包裹隔室(例如，脂 質體或一種或一種以上的細胞類型)表面，但沒有被納入隔室。因此，本發明 的方法優選地進一步包括步驟(C')移除與細胞表面結合的核酸-肽偶聯體。該 實施方式相對噬菌體展示而言顯示了本技術領域的顯著進步，因為其區分了表 面結合的MTPs和被納入的MTPs。令人驚喜的是，這顯著提高了經過一輪、兩 輪或多輪的選擇之後被鑑定出的MTPs的數目。確實，在對順式(CIS)展示文 庫進行5輪選擇後，9/23的肽被鑑定為MTPs (實施例1)。相反，通常在用於6鑑定MTPs的噬菌體展示選擇中，只發現了很少數量的MTPs (Gao 2002, 所owg.C/ze附.10:4057-4065)。在另一實施方式中，所選擇的MTP的膜轉位活性不涉及或不需要內吞作用。 優選地，MTP能在無內吞機制的情況下穿過靶膜。因而，在優選的方法中，所 述的一種或一種以上的細胞類型是沒有內吞能力的，例如紅血細胞。本發明的另一方面提供了通過本發明的方法所鑑定的MTP。優選地，MTP 為被分離的肽。本發明進一步包括本發明的MTP的衍生物。在另一優選的實施 方式中，本發明的MTP或衍生物連接、結合或者附著/偶聯至非轉位部分。如以 下詳述，非轉位部分可為肽、核酸或另一化合物。優點在於，上述連接、結合、 附著或偶聯的方式易於通過酶促反應或其它的化學方法/降解而被斷裂。如果轉位是單向的，至少對於轉位穿過膜的化合物的部分是單向的，則是 優選的。這樣是有好處的，因為MTP可能能夠轉位進入膜包裹的隔室或從膜包 裹的隔室轉位出來。因而， 一旦MTP轉位至膜包裹的隔室內，至少肽的一部分 保留在隔室中。保留在隔室中的肽的一部分可為MTP本身、結合的非轉位部分、 或者MTP和非轉位部分兩者。優選地，至少非轉位部分保留在膜包裹的隔室例 如靶細胞中。因此，更優選地，MTP連接、結合或者附著/偶聯至(例如通過可 斷裂的鍵的方式)非轉位部分，且在轉位至膜包裹的隔室中之後，非轉位部分 從MTP釋放至隔室或細胞。方便的是，非轉位部分的釋放是通過酶切或化學方 法，例如化學降解，這些將在下文中有進一步的描述。本發明進一步提供包括MTP的治療性分子，其中所述的MTP偶聯至或功 能性地連接至治療性分子，例如治療性肽或核酸。方便的是，治療性分子為如 上所述的非轉位部分，其包括用作診斷劑或治療劑的任何化合物。非轉位部分和潛在性治療性分子的非限制性實例包括核酸(例如siRNA分 子)、酶、激素、細胞因子、抗體或抗體片段、肽片段(例如抗體識別的肽)、 止痛劑、退熱劑、抗炎劑、抗生素、抗病毒劑、抗真菌藥物、心血管藥物、影 響腎功能和電解質新陳代謝的藥物、作用於中樞神經系統的藥物和化療藥物等 等。本發明的又一方面提供了包括編碼本發明MTP的核酸序列的核酸分子，該 核酸序列任選地進一步編碼非轉位肽或非轉位部分，並任選地進一步包括調節 性核酸序列。同時也提供了包含本發明核酸分子的表達載體。本發明的又一方面提供了一種組合物(例如治療性組合物)，其包括膜包裹的隔室(例如脂質體)和本發明的MTP。優選地，該組合物進一步包括偶聯至 MTP的非轉位部分。最優選地，非轉位部分是治療性分子。進一步優選地，治 療性組合物是通過將一種或一種以上的治療性分子或/和本發明的MTP，或者兩 者一起添加至一種或一種以上脂質體的製劑中並使轉位發生而製備的。本發明的MTP文庫由例如肽或肽的衍生物(如由天然的或非天然的胺基酸 組成的肽模擬物和肽類似物)組成。根據本發明，通過本發明分離的膜轉位肽 (MTP)優選為非天然的胺基酸序列，其能越過或橫跨脂質膜，優選地，越過 或橫跨脂雙層。通常，本發明的MTP能越過靶膜，從而肽被釋放至膜內空間，即細胞的胞 質溶膠或脂質體的內空間。然而，在某些情況下，MTP可僅僅嵌入至靶膜中， 進而其能橫跨膜。在這種情況下，至少MTP的一部分處於膜中，優選地，至少 MTP的一部分和/或結合的非轉位部分中的一種處於內膜空間中。優選地，本發 明的MTP能越過靶膜並進入細胞質，例如紅血細胞的細胞質。優選地，MTP 為大約2-25個或大約8-20個胺基酸殘基的非天然胺基酸序列。優選地，通過本發明的方法來選擇這些化合物，以進入膜包裹的隔室(例 如目標細胞)，同時保持與編碼性核酸連接，從而也將核酸轉運至細胞內。這些化合物的特異性實例包括線性肽或環肽(優選的長度為2-25個胺基酸 或大約8-20個胺基酸殘基)、上述線性肽和環肽的組合(任選地，肽在N端或C 端、或兩端有修飾)、及其鹽和衍生物、其功能性類似物、和在序列的末端帶有 胺基酸或多肽的延長的肽鏈。根據本發明，體外肽展示文庫通過本領域技術人員已知的合適方法而製得。 例如，體外產生的核酸-肽偶聯體的文庫可通過下述合適的方法而適宜地產生， 例如Robert, & Szostak (1997,Ato/. ^cad 94, 12297-12302)、Mattheakis ef a/"(1994, iVa".爿cad Sci, 91,9022國9026)和Odegrip ""/.，(2004,戶rac. 7V"f/. ^cad t/&4, 101 2806-2810)以及WO2004/022746所描述 的方法。諸如在文庫的最大庫容在噬菌體展示技術或化學合成的限度內的某些 情況下，這些方法可擇一使用。然後根據轉位越過(或至少為橫跨)靶膜例如 目標類型細胞的膜的能力，對體外產生的核酸-肽偶聯體的文庫進行選擇。在本發明所述方法的另一步驟中，編碼MTP的文庫成員通過使用合適的核 酸酶或蛋白酶或其兩者的結合，從靶膜或細胞的表面移除編碼非膜轉位肽的核 酸-肽偶聯體而被進一步選擇。然後回收和表徵能越過膜，進而進入細胞或囊(例 如脂質體)，並將結合的核酸部分轉運至細胞的MTP。本發明還提供了編碼MTP的核酸-肽偶聯體的選擇，其中的MTP連接至兩 種或更多種MTP或本領域技術人員可想到的其它任何組合上。例如，核酸序列 文庫的一個或一個以上(優選"每個")成員可編碼2、 3、 4或更多MTP或潛 在的MTP序列。本發明進一步提供了編碼連接至兩種或更多種非轉位部分的 MTP的核酸-肽偶聯體的選擇。本文引用的所有文獻以整體引用的方式納入本文。如果沒有特別限定，本 文所有的技術術語和科學術語具有本發明所述領域的普通技術人員通常理解的 含義。本發明通過附圖進一步說明，其中

圖1顯示非固定的Jurkat細胞的FACS分析和螢光顯微觀察。肽7、 13和 19為通過本發明的方法分離的膜轉位肽。肽24為陰性對照FLAG表位肽。圖2顯示了通過本發明的方法所選擇出的膜轉位肽與已知的HIV-TAT的膜 轉位肽之間的肽序列比較。詳細描述為了有助於理解本發明，本文對幾個術語進行了定義。本文所用的"肽"、"膜轉位肽"或"MTP"是指以線性鏈的形式連接在一 起的多個胺基酸，包括二肽、三肽、寡肽和多肽。二肽包括兩個胺基酸；三肽 包括3個胺基酸；寡肽通常是指具有2至大約50個或更多個胺基酸的肽。大於 50個胺基酸的肽通常被稱為多肽或蛋白質。本發明的"肽"和"膜轉位肽"或 "MTP"不被限制於任何特定的胺基酸數目。優選地，它們包含約2-約50或約 2-約40個胺基酸，更優選地，它們包括約2-約30個胺基酸或約2-約25個氨基 酸。最優選地，肽或MTP包括約2-約20個胺基酸或約8-約20個胺基酸。例如， 本發明所鑑定的MTP的長度可為18、 19、 20、 21、 22、 23、 24或25個胺基酸， 通常，蛋白質的膜橫跨結構域的長度是22-25個胺基酸，因此，特別在MTP橫 跨而非越過靶膜的情況下，MTP的長度可為22、 23、 24或25個胺基酸。本文所用的"膜轉位肽"(MTP)是指胺基酸序列(如上所述)，其可包含 天然胺基酸和非天然的胺基酸。所以，所謂的"肽模擬物"和"肽類似物"在 本發明的上下文中也可為"膜轉位肽"，其中所述的"肽模擬物"和"肽類似物" 可包括模擬特定胺基酸或肽的非胺基酸性的化學結構。該模擬物或類似物的特 性通常表現為相似的物理性質，諸如大小、帶電性或疏水性，以及在他們的天 然肽對等物中所發現的合適的空間定位。肽模擬化合物的特定實例是其中的一 個或多個胺基酸之間的醯胺鍵被例如為碳-碳鍵或其它非醯胺鍵的鍵所替代的化 合物，這是本領域所熟知的(例如，見屍e/ "fifeBasWDn/gr^/g/z, pp. 378-422， ACS, Washington D.C. 1995中的Sawyer)。本發明針對從肽群(或肽庫)中鑑定和表徵MTP， g卩，在核酸序列文庫中 表達的潛在的或假定的MTP。儘管本文用到術語"肽"，應當理解的是，本發明 並不排除那些可能按照傳統的命名法而被恰當地稱為多肽或蛋白質的MTP或更 大的肽結構域和基序的鑑定。進一步地，術語"膜轉位肽"(MTP)可包括越過膜的肽，從而MTP以及 任何結合的非轉位部分從膜的一邊穿過到膜的另一邊，並且，該術語也可包括 僅僅"橫跨"靶膜的肽。"橫跨"是指，MTP可插入(或貫穿)靶膜，從而至少 MTP的一部分留在膜中。因此，例如，通過本發明的方法選擇的MTP可橫跨靶 膜，從而導致了 MTP的一部分留在膜(或脂雙層)中以及MTP的一部分或結 合的非轉位部分被納入(即被發現位於各自囊或細胞的內部)。然而優選地，本 發明的MTP越過靶膜，從膜的一側穿過到另一側。有一種形式是，本發明的 MTP能越過多個膜，例如多層Caco-2細胞或內皮細胞，這樣，MTP能從組織 的一側移動到組織的另一側或到組織的層中。MTP的"衍生物"是指能將自身和任選的結合的順聯的非轉位部分穿過靶 膜的肽序列，其包含對通過本發明的方法鑑定的MTP的初級肽序列的一個或一 個以上的突變或修飾。因此，MTP的衍生物可具有引入至本發明的MTP的一個 或一個以上，例如1、 2、 3、 4、 5和更多個化學修飾的側鏈。另外，或可選擇 地，MTP的衍生物可含有對本發明的MTP的初級肽序列的一個或一個以上，例 如1、 2、 3、 4、 5和更多胺基酸突變、替換或缺失。因此，本發明包括為改善 MTP的一個或一個以上的性質而對MTP進行的突變試驗的結果。例如，使用本 領域已知的方法(例如通過修飾編碼性DNA或RNA序列)而隨機突變或特異性突變MTP的1、 2、 3、 4、 5和更多個胺基酸殘基，並通過本領域已知的任何 方法，根據預定的要求(例如對轉位至特定細胞類型的改善，或對特定細胞類 型選擇性的改善)而選擇所獲得的衍生肽的文庫或群。所選擇出的顯示出膜轉 位能力的肽為MTP的衍生物，並落入到本發明的範圍之內。"膜轉位蛋白"短語中的術語"膜"包括任何人工的或天然的膜，其包括 單層或雙層的脂肪族分子，例如脂肪酸或脂質分子。因此，該術語包括微團的 膜、脂質體膜或本領域技術人員己知的其它囊的膜、和任何類型天然細胞的膜， 其中包括細菌、真菌、植物、動物或人，例如血細胞(如紅細胞)或上皮細胞(包括皮膚細胞和腸壁細胞)。優選地，膜是脂雙層並包裹人工脂質體，或是胞 內機能不全的細胞。本文所述的"非轉位部分"是指不能使其自身穿過膜(例如為脂單層、脂 雙層或細胞膜)的實體；或指不能使其自身充分有效地越過膜從而產生預期胞 內效果的部分。這種非轉位部分包括核酸和其它聚合物、肽、蛋白質、肽核酸(PNAs)、抗體、抗體片段和膜不透性小分子等。優選地，非轉位部分是治療性 分子，這些在本文的其它部分有進一步的描述。本發明範圍內的術語"胺基酸"以其最廣泛的含義使用，其旨在包括天然 的L型a胺基酸或胺基酸殘基。本文使用通常所使用的天然胺基酸的單字母或 三字母簡稱(Lehninger， A丄.，(1975)歷0c/^附W7, 2d ed.， pp. 71-92， Worth Publishers, New York)。標準的單字母代碼和標準的三字母代碼的對應關係是本 領域技術人員所熟知的，複述如下A=Ala; C=Cys; D=Asp; E=Glu; F=Phe; G=Gly; H=His; I=Ile; K=Lys; L=Leu; M=Met; N=Asn; P=Pro; Q=Gln; R=Arg; S=Ser;T=Thr;V=Val; W=Trp;Y=Tyr。 一般性術語"胺基酸"進一步包括D氨基 酸以及化學修飾的胺基酸(例如胺基酸類似物)、通常不包含在蛋白質中的天然 胺基酸(如正亮氨酸)和具有本領域已知的胺基酸特性的化學合成化合物。例 如苯丙氨酸或脯氨酸的類似物或模擬物同天然的Phe或Pro—樣對肽化合物起到 相同的構象限制作用，所以他們屬於胺基酸定義的範疇。這種類似物或模擬物 在本文被稱為各自胺基酸的"功能性類似物"。胺基酸的其它實例見通過引用被 納入本文的下述文獻Robert and Vellaccio， 7T e屍e/ ^/asv ^wa/ys/s, Gross and Meiehofer， eds., Vol. 5p. 341, Academic Press, Inc., N.Y. 1983.本發明針對從肽群(或庫)中鑑定和表徵MTP，即潛在的或假定MTPs。 具體地說，本發明的MTPs的選擇是通過使用體外產生的肽庫的體外展示而進 行的。本文所用的術語"體外展示"、"體外肽展示"和"體外產生的文庫"是指 這樣的系統，其中肽庫以被表達的肽與編碼它們的核酸相結合的方式被表達， 而且這種結合不隨細胞或細菌與所述核酸而轉化。該系統與噬菌體展示和其它 "體內展示"系統形成鮮明的對比，在後者的系統中，肽與編碼它們的核酸的 結合隨細胞或細菌與所述核酸而轉化。本文的上下文中所用的膜轉位肽可"偶聯"至非轉位部分。本文所用的術 語"偶聯"以其最廣泛的含義使用，從而包括本領域技術人員已知的所有聯結或 連接的方法。例如，非轉位部分可以是MTP的C端或N端的胺基酸延伸。另 外，在MTP和非轉位部分之間可存在短的胺基酸連接子序列。本發明進一步提 供了MTP連接的分子，例如任選地通過連接子序列化學偶聯至非轉位部分。一 般情況下，MTP將通過非轉位部分中不影響非轉位部分活性的位點而被連接至 非轉位部分。再一次地，認為MTP被偶聯至非轉位部分。任選地，在被納入後 這種連接可被細胞質中的還原性環境所破壞。如本文所用的，術語"偶聯"可與術語"連接"、"結合"或"附著"互換 使用。廣泛的共價和非共價形式的偶聯是本領域的技術人員已知的，並落入至 本發明的範圍之中。例如雙硫鍵、化學性連接和肽鏈都是共價連接的形式。在 優選非共價方式的偶聯時，聯結的方式可為，例如生物素-抗生蛋白(鏈菌素) 連接或與其類似的連接。抗體(或抗體片段)-抗原間的相互反應也適用於將本 發明的MTP偶聯至非轉位部分。合適的抗體-抗原的配對是螢光素-抗螢光素間 的相互反應。用這種方式製備單向和靶向的轉運系統，藉此，MTP及其結合的非轉位部 分之間的偶聯方式優選地在一旦MTP及其結合的非轉位部分(至少是非轉位部 分本身)越過靶膜時被斷裂/剪切。可使用偶聯方式與剪切系統的任一合適的組 合，例如酶切、配體競爭、輻射等等。優選地，當靶膜為細胞膜時(這時非轉 位部分將被遞送至細胞)，偶聯方式為在細胞內(例如在細胞質內)能被酶(優 選為內切酶)剪切的肽鍵。或者，偶聯優選為易於在細胞的胞內還原性環境剪 切的二硫橋。當膜包裹的隔室不是細胞，例如為脂質囊、脂質體或其類似物時，優選使用偶聯方式與剪切方式的替代組合。同樣，只要非轉位部分可被單向性 地遞送至隔室內部(如需要)，可使用任何合適的方式。偶聯形式的非轉位部分可以是活性的，也可以不是活性的，但在任何情況下優選地是，其從MTP上解離後(也就是一旦偶聯被斷裂)是活性的。本發明通過在體外產生的文庫中篩選膜轉位性質，從而表現出在肽藥物開 發領域的顯著進步。合成編碼多種肽的體外產生的文庫並首先對結合、貫穿(例 如橫跨膜)或納入至靶細胞或脂質體群進行選擇。不能以上述一種或兩種方式 與靶細胞或脂質體相結合文庫成員通過洗滌或本領域技術人員已知的其它的合 適方法被移除。例如，密度足夠大的細胞和脂質體(或其它靶膜包裹的隔室) 可以通過旋轉穿過非水相的油層，從未結合的文庫成員中分離結合膜的文庫成 員。優選地，所述油為礦物油。其它合適的油包括比重比水小的油。在這一方 面，礦物油在25'C下具有的比重為0.84g/ml。優選地，諸如血紅細胞的細胞通 過離心穿過礦物油而從未結合文庫成員中分離出來。如上面所提到的，MTP可 貫穿或越過靶膜，編碼MTP或表面結合肽的文庫成員在這一過程中保持與靶的 結合或被納入至細胞。隨後通過非特異性蛋白酶(例如胰蛋白酶)或核酸酶(例如DNaseI)、或上 述兩者的組合，或本領域技術人員已知的任何其它的方法將表面結合文庫成員 從細胞表面移除。只有編碼MTP的文庫成員保留在細胞群中。然後回收被納入的MTPs，並通過對結合的核酸進行測序以及通過例如表達 或合成編碼的MTP以確認所需的膜轉位特性，從而對其逐一進行表徵。也可確 定MTP的最終亞細胞定位。如前所述，該步驟(即，從MTPs中移除與膜結合 的文庫成員)不能用於噬菌體展示文庫，這是因為這些噬菌體展示文庫對蛋白 酶(例如胰蛋白酶)有天然抗性(見例如WO-A-9卯58655)，並且由於病毒衣 對噬菌體核酸的保護而導致不能使用核酸酶。噬菌體展示文庫的又一限制在於， 噬菌體顆粒對細胞膜的固有的非特異性結合，該非特異性結合對本領域的技術 人員而言是熟知的。優點是，本發明的MTPs被分離並被分別表徵。然而，可通過本發明的方 法來獲得MTPs的混合群，例如在本發明的方法中當一種以上核酸-肽偶聯體越 過膜並被納入至例如脂質體或細胞中時。這時，本發明也包括所述的MTPs的 混合群。優選地，本發明提供了不是通過內吞作用而令人驚訝地越過細胞膜的MTPs。這些MTPs可通過在選擇中使用沒有已知的內吞轉運機制的細胞(例如 血紅細胞)，或通過使用膜包裹的隔室(例如脂質體)進行進一步的選擇。任選地，本發明可用於細胞類型特異性MTPs的分離。合成體外產生的編 碼多種肽的核酸文庫，並在與不同的非靶細胞群一起進行較早時的溫育以移除 可交叉反應的MTP (即那些與非耙細胞類型相結合的MTP)後，根據結合或納 入至所感興趣的靶細胞群(例如癌細胞群)而進行選擇。實施該方法的手段將 為本領域技術人員所周知。通常，通過洗滌或本領域技術人員已知的其它方法 移除不能結合至所感興趣靶細胞群的文庫成員。然後通過非特異性蛋白酶(例 如胰蛋白酶)、或核酸酶(例如DNaseI)、或上述兩者的結合、或本領域技術人 員已知的其它方法將表面結合的文庫成員從細胞表面移除。在本發明上述方法 中，只有編碼MTP的文庫成員保留在細胞群中。然後回收被納入的MTPs，並 通過對結合的核酸進行測序、表達或合成編碼的MTP進行測序以確認所需的膜 轉位特性，而對其進行逐一表徵，而且，如果有可能，也可通過確定MTP的亞 細胞定位進行表徵。本發明也可用於對能越過諸如Caco-2細胞或人上皮細胞的細胞層的MTPs 的分離。合成編碼多種靶肽的體外產生的核酸文庫，然後根據結合、貫穿或納 入至感興趣的細胞群進行選擇，其中所述的靶細胞群，例如為生長於層中的 Caco-2細胞。通過洗滌或本領域技術人員已知的其他方法移除不能結合至靶細 胞群的文庫成員。優選地，然後通過非特異性蛋白酶(例如胰蛋白酶)、或核酸 酶(例如DNaseI)、或上述兩者的結合、或本領域技術人員已知的其它方法將表 面結合的文庫成員從細胞表面移除。再一次地，只有編碼MTP的文庫成員保留 在細胞群中，並免遭蛋白酶和核酸酶的裂解。然後回收被納入的MTPs，並通過 對結合的核酸進行測序、以及任選的表達或合成編碼的MTP以確認所需的上皮 細胞層的轉位特性，而對其進行逐一表徵。或者，細胞可在聚碳酸酯濾器上排 列成單層，並如Stevenson等(1999， 7/ t. /屍力ar瓜177, pp 103-115)所述進行選擇。如果其轉位通過細胞的話，可將放置在細胞頂面的體外肽文庫回 收在基底外測面。使用這種方法，有可能選擇能越過生物膜(例如腸細胞壁或 皮膚)的MTPs。用這種方式分離的MTPs具有作為非轉位部分的口服遞送劑的用途。舉例 來說，本發明的MTP可偶聯至諸如胰島素的蛋白質藥物並配製成合適的藥物組 合物，從而在進入腸時MTP將胰島素轉位至血液循環系統。再舉一例，本發明 的MTP可偶聯至小分子並配製成合適的藥物組合物，從而在進入腸時MTP將 小分子轉位至血液循環系統。在又一實例中，可將MTP以適當的藥物組合物包 被在包含蛋白質、肽或小分子藥物的納米顆粒表面，從而在進入腸時MTP將納 米顆粒轉位至血液循環系統。在本發明的另一組合物中，MTP及其結合的非轉位部分(即治療性分子) 與脂質偉群(即脂質囊或其它人工膜包裹的隔室)相混合，以產生包含MTP和 治療性分子的脂質體治療性群。可通過例如靜脈注射的方式將脂質體治療性群 施用至患者。當治療性脂質體有必要特異性地靶向特定細胞類型時，脂質體組 合物可與識別耙細胞類型的抗體結構域或其類似物進行進一步地配製。該方法 對本領域技術人員而言是公知的。本發明的MTPs以及結合至非轉位肽的MTPs可通過重組DNA技術和標準 的蛋白表達和純化步驟進行製備。因此，本發明進一步提供了編碼本發明的 MTPs、及其衍生物或治療性分子的核酸分子。例如，根據常規技術(Sambrook J. et al, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY)將編碼相關肽的DNA插入至合適的表達載體(例如 pGEM ， PromegaCorp.，USA)中，並轉化至合適的宿主細胞中進行蛋白表達。 合適的宿主細胞是那些能在培養物中生長並順從外源DNA轉化的細胞，包括細 菌、真菌細胞以及較高等的真核來源細胞(優選哺乳動物細胞)。或者，可使用 合適的體外(轉錄和)翻譯系統(例如大腸桿菌S30提取系統，Promega corp.,USA)來體外合成MTPs。應用於DNA序列(例如在表達載體中或構建體中)的術語"可操作地連接" 是指排列序列，以使序列能協調作用，從而達到所期望的目的，即，啟動子序 列起始轉錄，並使之繼續進行通過所連接的編碼性序列，直至終止序列。選擇和分離MTP後，通過合適的手段將諸如治療性分子的功能性群體聯結 至MTP。如之前所述，MTP可偶聯至治療性分子的任一合適形式，例如抗體、 酶和小分子化學性化合物。治療性分子的優選形式是能在靶細胞內誘導RNAi 的siRNA分子。通常，使用化學連接子將siRNA連接至諸如MTP的肽。例如，通過馬來醯亞胺-巰基鍵(馬來醯亞胺基在肽上，而巰基在核酸上)或二硫鍵(游離的半胱氨酸基在肽上，而巰基在核酸上)將核酸或PNA連接至肽。按照常規標準配製本發明的藥物製劑和組合物，並以口服、靜脈、局部或 其它標準途徑的形式施用。藥物組合物的形式可為片劑、丸劑、洗劑、凝膠劑、 液體、粉劑、栓劑、混懸劑、脂質體、微顆粒或本領域已知的其它合適劑型。因此，本發明也包括根據本發明方法分離的MTP在治療性或診斷性處理中 的用途。具體地說，本發明提供了MTP將非轉位部分(如前文所述)遞送至一 種或一種以上膜包裹的隔室群中的用途。優選地，所述的膜包裹的隔室是脂質 體或一種或一種以上的細胞類型的群。尤其優選的本發明的MTP的用途是將 非轉位部分(尤其是諸如siRNA分子的治療性分子)遞送至靶細胞類型或群體。 靶細胞或細胞群可為體內的，即在動物或人受試者中；或為間接體內的，即從 動物或人受試者中移除後並將其重新導入；或者另外，細胞、細胞群或脂質體 是體外的。可使用本領域技術人員已知的任一施用途徑。具體而言，優選使用 對靶細胞類型或靶細胞群優選的施用途徑。例如，施用至受試者或患者的優選 途徑包括皮下注射、攝食或栓劑。示例性地，為了治療受試者的病毒感染，本發明的MTP可偶聯至合適的抗 病毒劑，然後將MTP和抗病毒分子以裸露的形式或以包含在如人工脂質體中的 形式施用至受試者。相似地，如果受試者患有諸如癌症的細胞性疾病，本發明 的MTP可偶聯至合適的抗癌分子/藥物(例如siRNA分子或其它治療性實體)， 並通過合適的施用途徑將其施用至受試者。MTPs可用於將其自身或非轉位部分 遞送至細菌細胞。因此，通過將本發明的MTP偶聯至抗細菌劑能治療受試者的 細菌感染。進一步，在這方面有時需要治療性組合物，諸如偶聯至治療性分子的MTP， 被遞送至受試者中特異性的細胞類型或細胞群。這可通過下述方式以間接體外 的方式完成，例如，將治療性組合物添加至已從受試者或患者中移除的細胞群 中。另外，可根據需要如前所述地選擇MTP以轉位至特異性的細胞類型。另外， MTP可直接偶聯至抗體分子、抗體片段(例如Fab、 F(ab)2、 scFv等)或其它 合適的靶向性試劑，從而MTP和任何其它的被偶聯部分靶向需要治療和診斷的 特異性細胞群。在另一個實施方式中，MTP和其結合的非轉位部分可包含在脂16質體群中，其中脂質體(例如脂質體膜)又包括合適的靶向性部分，例如抗體 和抗體片段。然後可將所得的脂質體施用至受試者和患者。在上述用途中，優選地，MTP通過在靶細胞類型中可剪切的相互作用偶聯 至非轉位部分或治療性分子，例如通過酶切，或源於細胞內還原性環境的方式。 本發明將通過下述非限制性的實施例得到進一步的闡釋。實施例除非另外指出，實施例中使用市售的反應試劑和分子生物學和生物化學中 的標準技術。材料和方法本申請所使用的下述方法在上述的Sambrook， J. et al.， 1989:analysis of restriction enzyme digestion products on agarose gels and preparation of phosphate buffered saline中有描述。通常用途的反應試劑從SIGMA-AldrichLtd (Poole， Dorset, U.K.)處購買。 寡核苷酸得自Eurogenetec Ltd (Southampton, U.K.)。胺基酸和S30提取物得自Promega Ltd( Southampton, Hampshire, U.K. )。 Vent 和Taq DNA聚合酶得自New England Biolabs(Cambridgeshire, U.K.)。 FITC標記 的肽得自Pepscan Systems (Lelystad, Netherlands )。實施例l(i) 用於選擇MTPs的順式展示文庫的構建 文庫構建及體外轉錄和翻譯的實施在文獻Odrgrip et al., 2004, Proc. Natl.Acad. SciUSA， 101 2806-2810中有描述。通過PCR將18-mer NNB文庫(其中N為任一核苷酸，B為C、 T或G) 附著至tac啟動子，然後通過PCR擴增將其連接至-RepA-CIS-ori區域，從而制 得tac-NNB-RepA-CIS-ori構建體。(ii) 具有細胞膜轉位能力的肽的選擇3(TC下在大腸桿菌S-30溶菌產物系統中用2pg文庫DNA進行體外轉錄和 翻譯30分鐘，然後用封閉緩衝液進行稀釋(含1%BSA的PBS)。通常，每50^1S-30溶菌產物中添加2嗎線性DNA。向表達的文庫中添加5^1 PBS洗滌的紅血 細胞(RBC)中，並在冰上孵育30分鐘。在2000 rpm下離心RBC達5分鐘，然後移除上清液。RBC沉澱物在200^1添加有2mM CaC12、2mM MgCl和l嗎DNasel的PBS中重新懸浮，並在室溫下溫育15分鐘。用PBS洗滌細胞一次，通過離心形成松 散的沉澱物，然後將該沉澱物再次重新懸浮於20(^1 PBS中。將RBC混懸液置 於200ial鄰苯二甲酸二丁酯上，並在11000rpm下離心4分鐘。移除水相，並將 RBC沉澱物從油中慢慢吸出，再重新懸浮在100plPBS中。在500(il PB緩衝液(Qiagen)中溶解細胞，使用Qiagen柱純化DNA，然 後將純化的DNA重新懸浮於50^1無菌水中。在平行選擇中，用lkig/ml胰蛋白酶代替DNaseI在37"C下處理RBC達30 分鐘，此時，旋轉細胞，移除上清液，然後將沉澱物重新懸浮於200^1 PBS中。 旋轉細胞通過鄰苯二甲酸二丁酯，並且將如上所述回收的DNA用於DNase處理 的細胞。如Odegrip等的文獻(2004， Proc.Natl. Acad. Sci USA, 101 2806-2810)所 述，分別從兩種選擇中擴增N末端文庫區域，並用Rep-CIS-ori進行重新組裝, 從而產生用於下輪選擇的輸入用DNA。5輪選擇後，使用PCR擴增回收的DNA， 純化後用和iVcoI消化。然後將上述DNA連接至被相似消化的M13 gpVIII 噬菌粒載體，並轉化至大腸桿菌XL-1藍細胞中，然後平鋪在2%葡萄糖、2xTY、 100 pg/ml氨卡青黴素平板上。使單克隆生長過夜，分離噬菌體DNA並對其測 序以確定其肽序列。(m)膜轉位能力分析合成所選擇的肽，同時在N端用FITC標記，並使用Jurkat細胞通過FACS 分析細胞結合。在PBS中洗滌Jurkat細胞(100 000)，室溫下在100 pl添加有1% 胎牛血清的PBS中與1嗎標記肽溫育15分鐘，在PBS中洗滌兩次，然後在Becton Dickinson FACS分析儀中分析。在沒有固定的情況下用螢光顯微鏡下觀察結合 細胞的肽以監測細胞的納入。23種肽中，有9種與細胞相結合。實例如圖l所示。圖1顯示了非固定的Jurkat細胞的螢光顯微鏡檢測以及FACS分析。肽7、 13和19為通過所述方法分離的示例性膜轉位肽。通過顯微鏡所觀察到的細胞內的螢光(左邊和中間的圖片)和FACS得到細胞內的螢光強度(右邊的曲線圖) 可觀察標記。FACS分析的曲線圖表明了FITC-螢光(X軸)對細胞數目(Y軸) 的計數。肽24是作為陰性對照的FLAG表位肽，其通過顯微鏡下或FACS分析 時不使細胞產生螢光。如上所述，用DNaseI或胰蛋白酶進行平行選擇，以移除膜結合的或非轉位 的肽-repA-DNAl體，從而避免對細胞溶解後對MTP回收的汙染。被納入的肽 -repA-DNAl體對這些酶中的任何一個的處理具有抗性。在另一個方法中，或者 使用DNaseI消化repA DNA，從而其不能被擴增，或者使用胰蛋白酶消化肽-repA 蛋白以及任何潛在的蛋白-蛋白間的相互反應。己發現，這兩種方法在選擇所需 MTPs方面是成功的。(iv) MTP的序列分析選擇膜轉位活性肽(MTP)進行序列分析，以確定膜轉位活性肽序列是否 與己知的膜轉位基序具有序列相似性。結果如圖2所示。如所顯示的那樣，所選擇的肽(表示為D4，最上面的一行，SEQIDNO: 1) 顯示出與已知的mV-TAT蛋白的膜轉位基序(最下面的一行)具有某種程度的 序列同源性(如中間的一行所示)。結果進一步說明了所述選擇方法的功效，其中所述的選擇方法用於分離顯 示出細胞膜轉位活性的化合物。然而需要指出的是，根據所述及的方法分離到的其它MTPs並沒有顯示出 與已知轉位結構域的序列同源性。這提供了對新型MTPs的鑑定。實施例2(i) 用於選擇MTPs的順式展示文庫的構建 下述實施例描述了能夠越過或貫穿合成脂質膜的MTPs的選擇。文庫構建以及體外轉錄和翻譯根據上述實施例1所述進行。(ii) 合成的具有膜轉位能力的肽的選擇 體外轉錄和翻譯根據上述實施例1所述進行。人造油性隔室的乳劑通過如下步驟製備將50plPBS (以10pl等分)緩緩 加至0.5 ml冰冷的含0.5% Triton X-100和4.5% Span80 (山梨糖醇酐三油酸酯 (sorbitane trioleate))的輕礦物油，並於冰上以1600rpm攪拌5分鐘。乳劑混合物在3000g下旋轉5分鐘，移除油相，使乳劑保留在管底部。然後將體外轉錄 和翻譯混合物加至lml PBS中的乳劑混合物中，並緩緩翻轉5次進行混合，然 後在冰上孵育30分鐘。然後加入2.5pg DNaseI以及2mM CaCl2和2mM MgCl (最終濃度)，並在室 溫下溫育15分鐘。作為DNaseI的替代，可加入lpg/ml胰蛋白酶，並在37"C下 溫育30分鐘。通過每次加入lml PBS並在3000g下離心5分鐘，再去除洗液來洗滌乳劑5 次。通過加入lml己垸、漩渦、簡短離心和移除己烷層來破壞和洗滌乳劑。洗 滌步驟可重複1次或兩次以上，殘留的己垸通過在Speedvac (Farmingdale， NY) 中室溫下乾燥5分鐘來移除。通過加入100plPB緩衝液(Qiagen)來回收DNA，且如實施例1所示製備 用於下一輪的選擇的DNA。在如實施例1所示將DNA克隆至噬菌體之前，選擇步驟可重複多次，例如 5次。通過測序可鑑定肽序列，並且如實施例1所示檢測肽。
權利要求
1. 從肽展示文庫中分離顯示膜轉位活性的化合物的方法，其中所述文庫包括多種編碼展示肽的核酸序列，該方法包括如下步驟a)表達多種核酸構建體其中，每個核酸構建體包括可操作地連接至核酸序列的啟動子序列，以使多種核酸構建體的表達導致多種核酸-肽偶聯體的形成，且每一偶聯體包括至少一種展示肽，所述展示肽與編碼展示肽的相應核酸構建體相結合；b)將多個核酸-肽偶聯體暴露於膜包裹的隔室群，從而使轉位反應發生；c)移除與膜包裹的隔室未結合的核酸-肽偶聯體；以及d)從膜包裹的隔室中回收被納入的核酸-肽偶聯體，並且當包含膜轉位肽(MTP)時，表徵核酸序列編碼的肽。
2. 根據權利要求1所述的方法，其中所述的膜包裹的隔室群是一種或一種以上類型的細胞群。
3. 根據權利要求2所述的方法，其中一種或一種以上類型的細胞群包括細 胞層。
4. 根據權利要求3所述的方法，其中步驟(d)被修改為回收轉位通過細胞 層的核酸-肽偶聯體。
5. 根據權利要求3或4所述的方法，其中所述的細胞為Caco-2細胞。
6. 根據權利要求1所述的方法，其中所述的膜包裹的隔室群為脂質體群。
7. 根據以上任一項權利要求所述的方法，其在(c)部分後進一步包括移除 核酸-肽偶聯體的步驟，其中所述的核酸-肽偶聯體結合至膜包裹的隔室表面，但 並沒有被納入隔室內。
8. 根據權利要求7所述的方法，其中所述的移除包括將膜包裹的隔室暴露 於蛋白酶、核酸酶或蛋白酶和核酸酶的組合。
9. 根據以上任一項權利要求所述的方法，其中通過離心隔室通過非水層將 未結合膜的肽-核酸偶聯體與膜包裹的隔室分離。
10. 根據權利要求9所述的方法，其中所述非水層為礦物油。
11. 根據以上任一項權利要求所述的方法，其中所述的肽展示文庫為體外肽 展示文庫。
12. 根據權利要求11所述的方法，其中體外肽展示文庫為順式體外肽展示 文庫。
13. 根據以上任一項權利要求所述的方法，其進一步包括將步驟(d)中的 一種或一種以上表達的膜轉位肽與相應的核酸構建體相關聯的步驟，從而鑑定 膜轉位肽化合物的核酸序列。
14. 根據以上任一項權利要求所述的方法，其中所述MTP包括長度為2-50 個殘基的胺基酸序列。
15. 根據以上任一項權利要求所述的方法，其中所述MTP包括長度為2-25 個殘基的胺基酸序列。
16. 根據以上任一項權利要求所述的方法，其中所述MTP包括長度為2-20 個殘基的胺基酸序列。
17. 通過以上任一項權利要求所述的方法獲得的膜轉位肽(MTP)或其衍生物。
18. 根據權利要求17所述的MTP或其衍生物，其偶聯至非轉位部分。
19. 根據權利要求18所述的MTP,其中偶聯的非轉位部分是治療性分子。
20. 根據權利要求18或19所述的MTP，其中所述的偶聯可在細胞內被剪 切，從而非轉位部分或治療性分子被胞內遞送。
21. 根據權利要求20所述的MTP，其中所述的偶聯藉助二硫鍵或可酶切肽鍵。
22. 根據權利要求19-21任一項所述的MTP，其中所述的治療性分子是 siRNA分子、肽核酸、或者抗體或抗體片段。
23. 通過權利要求1-16任一項所述的方法獲得的編碼MTP的核酸。
24. 包含權利要求23所述核酸的表達載體或構建體。
25. —種脂質體組合物，其包括一種或一種以上的脂質體以及一種或一種以 上的權利要求14-19任一項所述的肽。
26. 根據權利要求25所述的脂質體組合物，其進一步包括諸如抗體或抗體 片段的靶向部分。
27. 權利要求17所述的MTP在將非轉位部分遞送至耙細胞中的應用。
全文摘要
本申請提供了從肽展示文庫中選擇膜轉位肽(MTPs)的方法，其中所述的轉位肽越過或貫穿脂質膜。表達編碼展示肽的多種核酸構建體，從而形成多種核酸-肽偶聯體，且每一偶聯體包含至少一種展示肽，其中所述展示肽結合有編碼該展示肽的相應核酸構建體；將偶聯體暴露於膜包裹的隔室群中，從而使轉位反應發生；移除與膜未結合的偶聯體；任選地，移除與膜結合的偶聯體；並回收被納入的核酸-肽偶聯體。所述的膜包裹的隔室可為人造小囊，例如脂質體，或為一種或一種以上細胞類型的群。
文檔編號C12Q1/68GK101258242SQ200680026758
公開日2008年9月3日 申請日期2006年7月24日 優先權日2005年7月22日
發明者克裡斯·厄爾曼, 凱文·菲茨傑拉德, 戴維·孔伯, 託馬斯·利安德森, 鄧肯·麥格雷戈 申請人:伊索傑尼卡有限公司