荷葉黃酮的製備方法及其藥物應用的製作方法

2023-10-28 22:52:27 2

專利名稱：荷葉黃酮的製備方法及其藥物應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於植物藥用成份的提取和應用領域，特別涉及從荷葉中提取分離黃酮類 化合物及其藥物利用。
背景技術：
葡萄糖激酶(GK)是己糖激酶(///O家族中的一員(7Wny)，有465個胺基酸， 分子量為50^DG,特異性存在於成熟的肝細胞和胰島細胞中。GAT是這兩種細胞中葡 萄糖代謝的限速酶，在^7P存在下，催化葡萄糖轉變成6-磷酸葡萄糖，此反應是葡萄 糖代謝的第一步反應，也是糖代謝過程的關鍵因素。G《的Km值較高，與葡萄糖親和 力低，不受產物6-磷酸葡萄糖的反饋抑制，因而與其它己糖激酶有所不同，能夠保證 生理範圍內波動的血糖被充分磷酸化而進入代謝過程。胰島^-細胞中的葡萄糖激酶與 肝臟中的葡萄糖激酶不全相同。胰島/ -細胞中的葡萄糖激酶受葡萄糖濃度調節，當血 糖升高時，該酶活性升高，葡萄糖代謝加速。而肝臟中的葡萄糖激酶受胰島素的調節， 當血糖升高時，血漿胰島素水平相應升高，葡萄糖激酶活性增強，糖原合成增加。由 於胰島^-細胞分泌胰島素主要受細胞內葡萄糖代謝的調節，故葡萄糖激酶活性改變所 導致的細胞內葡萄糖代謝改變，可間接調節胰島素分泌，因而該酶也有葡萄糖感受器 之稱。
近年來，人們發現GK基因突變與某些特殊類型糖尿病的發病有著密切聯繫。青 年發病的成年型糖尿病(^TODiO是一種特殊類型的糖尿病(美國糖尿病協會(^04) 糖尿病分型)，主要是由G/C基因突變引起的。大約60。/。的MODr患者中有GK基因 突變，現已證實GK基因突變是兒童、青少年發病的MODr中最常見的原因。除此之 外，G《基因變異還易於導致妊娠糖尿病，進而造成嬰兒糖尿病。並且對於一般的糖 尿病患者而言，也普遍存在G《活性下降的現象。
糖尿病是繼腫瘤、心血管病之後第三大嚴重威脅人類健康的慢性疾病。據世界衛 生組織預計，到2025年，全球成人糖尿病患者人數將增至3億。在糖尿病患者中90 %以上為11型糖尿病，其患者體內缺乏胰島素或已有的胰島素不能正常發揮作用，所 以無法及時降解葡萄糖，使血液中葡萄糖含量異常升高，並導致併發症。隨著對II型 糖尿病的發病機制進一步研究發現，G《活性降低可能參與胰島素抵抗機制，導致血 糖升高，胰島功能受損和胰島素抵抗加重。尋找能增加G尺活性的藥物或措施，以阻
止或延緩疾病的發展，有可能為早期預防和治療n型糖尿病開闢一條新途徑。由此引
發的以GK作為靶點來開發新的藥物將成為研究的熱點，其中以該靶點的小分子活化 劑研究較為活躍。自2001年羅氏公司篩選出第一個合成的小分子活化及0"28-1675 [3-環戊基-2- ( 4-甲黃醯基-苯基)-N-噻唑-2-基丙醯胺]以來，目前報導的以葡萄糖激酶 為靶點的小分子活性化合物有200餘個，其中大部分是化學合成的化合物，而從天然 植物中提取分離得到的具有G尺激活作用的物質報導很少。由於化學合成的激活劑有明顯的藥用局限性，且可能引起低血糖和肝脂肪蓄積等問題，所以不可避免地存在一 些安全問題。而天然產物普遍具有多種生理活性，且毒性低，應用安全，是作為藥物 研發最具潛力的資源之一。近年來，許多中外學者研究發現黃酮類化合物具有抗氧化、
抑制a-葡萄糖苷酶、抗病毒、抗血小板凝集和抑制醛糖還原酶等作用，對糖尿病及其
併發症均有一定的防治作用。
荷葉(AWwm6o m/c^ra)為我國民間常用的中藥材，分布於我國大部分地區，主 產於湖南、湖北、浙江、江蘇、江西等地。荷葉味苦，性平，歸肝、脾、胃，具有清 暑利溼、升發清陽、清心去熱、止血利水、降脂減肥等功效。荷葉中的黃酮類化合物 是一類重要的高藥理活性的天然多酚類化合物，近年來研究表明，荷葉黃酮類化合物 具有降低甘油三酯、降低膽固醇、抗氧化、消除自由基、抑菌、抗病毒和止痙攣等作 用。但是還沒有關於荷葉黃酮防治糖尿病的報導。

發明內容
本發明目的是提供荷葉黃酮作為製備預防和治療與葡萄糖激酶活性介導的疾病藥 物的應用，並且提供了一種荷葉黃酮的製備方法。 本發明所述的黃酮的製備方法具體步驟如下
1、 荷葉黃酮粗提。在反應溫度控制在5(TC以下的情況下，按常規方法粗提荷葉 黃酮並濃縮；
2、 層析。將上述濃縮濾液經聚醯胺層析柱層析，用水-乙醇梯度洗脫，收集50% 90%乙醇洗脫部分，溫度控制在50匸以下，在減壓條件下濃縮至幹，然後用蒸餾水 溶解，即得具有激活葡萄糖激酶活性的黃酮類化合物。
本發明所述的聚醯胺以60 - 90目為宜。
本發明所述的荷葉黃酮的粗提，在粗提溫度控制在50 'C以下的情況下，可以採 用浸提法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法、酶解法、超濾法或超臨界萃取法中的 任一種。
本發明所述的荷葉黃酮的粗提，可以採用以下工藝將乾燥的荷葉粉碎後，以溶 劑/原料的重量比為10 50:1，加入30% 90%的含水乙醇超聲提取，溫度控制在 50 'C以下，重複提取1 3次，去渣，濾液在減壓條件下濃縮。本工藝所用的提取溶 液是30% 95%的含水乙醇，溶劑/原料的重量比以40: l為最佳；也可以是水、甲醇、 30%~95%含水甲醇、乙醇、丙酮、30% ~95%含水丙酮或乙酸乙酯等。
本發明所述的預防和治療葡萄糖激酶介導的病症的黃酮的應用為將得到的黃酮 與藥用載體和/或藥學上可接受的輔劑組合製成用於治療葡萄糖激酶介導的的病症的 藥物。該藥物組合物可以口服給藥，例如注射劑、片劑、丸劑、膠囊、糖錠劑、懸浮 劑或者乳劑的形式。給藥也可以通過直腸進行，例如使用栓劑；或者胃腸外給藥，例 如使用可注射溶液的靜脈內、肌肉內、皮下或者經皮給藥；或者是舌下給藥或作為氣 溶膠如噴霧劑的形式給藥。
本發明所述荷葉黃酮的製備方法環境汙染小，所述的黃酮具有激活葡萄糖激酶活性的作用，可用於防治葡萄糖激酶介導的病症，為荷葉黃酮的藥用提供了一條新途徑，
可使荷葉資源得到更廣泛地利用。


附圖1為本發明所述製備方法製備的黃酮不同濃度對葡萄糖激酶(GiO的激活率 的實驗曲線圖。
附圖2為葡萄糖激酶(GiO的活性測定反應路線。
具體實施例方式
本發明將通過以下實施例將進一步說明。
實施例1
取荷葉粉末IO g,加入70%乙醇水溶液400 m丄，超聲提取40 mf",真空抽濾， 濾渣重複提取2次，合併濾液，在減壓條件下濃縮至幹，用25附丄的70%乙醇溶解。 將該濃縮的粗提物過已處理好的聚醯胺層析柱，釆用水-乙醇梯度洗脫，收集50%~ 90%的乙醇洗脫部分，在減壓條件下將其濃縮至幹(低於5(TC),然後用蒸餾水溶解, 即得具有激活葡萄糖激酶活性的黃酮類化合物。
實施例2
取荷葉粉末5g，加入50%乙醇水溶液200 mL,浸提法提取1 A,真空抽濾，濾 渣重複提取2次，合併濾液，在減壓條件下濃縮，用10m丄的70%乙醇溶解。將該濃 縮的粗提物過已處理好的聚醯胺層析柱，釆用水-乙醇梯度洗脫，收集50%~90%的 乙醇洗脫部分，在減壓條件下濃縮至幹(低於50 °C),然後用蒸餾水溶解，即得具有 激活葡萄糖激酶活性的黃酮類化合物。
實施例3
取荷葉粉末10g,加入90y。乙醇水溶液500 m丄，超聲提取30脂'n，真空抽濾， 濾渣重複提取2次，合併濾液，在減壓條件下濃縮至幹，用20 m丄的90。/。乙醇溶解。 將該濃縮的粗提物過已處理好的聚醯胺層析柱，採用水-乙醇梯度洗脫，收集50%~ 70%的乙醇洗脫部分，在減壓條件下將其濃縮至幹(低於5(TC),然後用蒸餾水溶解, 即得具有激活葡萄糖激酶活性的黃酮類化合物。
生物活性實施例體外葡萄糖激酶活性
葡萄糖激酶(G《)的活性通過在340 nm下iV^C^的光密度增加來測定。GK催 化葡萄糖和Mg-J7P生成葡萄糖-6-磷酸和^DP。葡萄糖-6-磷酸和煙醯胺腺嘌呤二核 苷酸(A^4D)在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6屍Di7)的作用下生成A^4D/f。測定反應路 線如附圖2所示。
G《分析在37 'C下，反應的最終培養體積為150/^。培養混合物含有60mM7h's 緩衝液(pH = 7. 0 )， 6. 0 wM》葡萄糖，4. 0 mM爿7P, 0. 9 mM々-A^D屍，2. 0 wMMgC/2， 100 GdPDi/和0. 26 tZ/丄G^7P, / -A^Z)P, G6屍D/f和葡萄糖購自美國 公司，其它試劑為分析純。取IO ,丄溶於蒸餾水的受試化合物稀釋成不同的濃度，並 分別加入到不含G尺的不同的培養混合物中，將混合物亶於紫外可見分光光度計中，然後加入5 ^Z的GK開始反應。
反應開始後，歷經10脂'"的培養期，監測3"鵬處的光密度(OD)的增加並以 此作為G《活性的度量。以含有蒸餾水而不含受試化合物的培養混合物作為空白對照， 在空白對照中加入足夠的G尺，以產生歷經10 /m'"培養期的ODw的增加。預實驗已 確定GK反應在這段時間內呈線性，甚至在產生G《活性增加IO倍的激活劑存在下亦 如此。比較空白對照和含受試化合物的G《活性，並計算產生GX活性增加到50。/。的 激活劑的濃度。
實驗結果見說明書附圖。釆用*' 7.5軟體處理數據，使G《活性增加到50y。 的激活劑的濃度，表示為FA.s,即激活GK酶50y。所需的激活劑刺激濃度，其半數有 效激活濃度i^.5為0.0803 wgw丄—、即屍J"為0. 002 ^M。
權利要求
1、一種荷葉黃酮的製備方法，其特徵是反應溫度控制在50℃以下，對荷葉黃酮粗提並濃縮，然後聚醯胺層析柱層析，用水-乙醇梯度洗脫，收集50％～90％乙醇洗脫部分，在減壓條件下濃縮至幹，之後用蒸餾水溶解。
2、 權利要求1所述的黃酮作為製備治療葡萄糖激酶介導的病症的藥物的應用。
3、 一種用於治療葡萄糖激酶介導的病症的藥物，其特徵是含有權利要求l所述的 黃酮以及藥學上可接受的輔助劑。
4、 根據權利要求3所述的藥物，其特徵是該藥物作為注射劑、片劑、丸劑、膠囊、 糖錠劑、懸浮劑、乳劑、栓劑或者氣溶膠。
全文摘要
荷葉黃酮的製備方法及其藥物應用，反應溫度控制在50℃以下，對荷葉黃酮粗提並濃縮，聚醯胺層析柱層析，用水-乙醇梯度洗脫，收集50％～90％乙醇洗脫部分，減壓條件下濃縮至幹，再用蒸餾水溶解，將本發明製備所得黃酮加入藥用載體和/或藥學上可接受的輔助劑，作為注射劑、片劑、丸劑、膠囊、糖錠劑、懸浮劑、乳劑、栓劑或者氣溶膠，本發明所述的黃酮具有激活葡萄糖激酶活性的作用，可用於防治葡萄糖激酶介導的病症。
文檔編號C07H17/00GK101423508SQ20081013630
公開日2009年5月6日 申請日期2008年11月26日 優先權日2008年11月26日
發明者何慶華, 吳酬飛, 李燕萍, 楊冀豔, 磊 胡, 楊 許, 勇 陶, 黃志兵 申請人:南昌大學