前列腺癌雄激素依賴性細胞psa基因表達的特異克隆分子及其克隆方法和應用的製作方法

2023-10-10 01:20:09

專利名稱：前列腺癌雄激素依賴性細胞psa基因表達的特異克隆分子及其克隆方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學領域，尤其是一種前列腺癌雄激素依賴性細胞PSA基因表達的特異克隆分子及其克隆方法和應用。
背景技術：
在美國前列腺癌佔男性惡性腫瘤死亡率的第二位。雖然我國前列腺癌的發病率和死亡率比歐美國家低，但近年來有迅速上升的趨勢。而且隨著人口老齡化及飲食結構的改變其發病率將會進一步升高。
前列腺癌與前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)關係密切，多數前列腺癌患者無論早期或晚期均有PSA持續表達，高度表達者佔90％以上，因此PSA已作為前列腺癌臨床診斷和治療監測的敏感指標之一。1985年得到PSA的cDNA克隆和定序，其基因位於染色體9q13.2，全長約為6kb，由5個外顯子和六個內含子組成，可轉錄成1.6kb含五個外顯子mRNA。在基因啟動子的-640bp序列含有一個TATA盒(TATABox)TTTATA(-28--23)，一個GC盒(GC Box)GGGCGGAGT(-170--156)和一個雄激素應答元件(ARE)AGAACAgcaAGTGCT(-170--156)。啟動子有兩個轉錄起始點(+1-+7)，開放閱讀框架從+44開始。由於PSA幾乎只在前列腺組織中表達，該基因啟動子具有前列腺組織特異性，適用於構建前列腺組織特異性載體，在產生PSA的前列腺癌細胞中選擇性表達治療基因。
雄激素及其受體在前列腺癌的發生發展過程中發揮重要作用。PSA的表達受雄激素調節，雄激素進入前列腺上皮細胞後首先與細胞核內雄激素受體(androgen receptor，AR)結合，引起AR構象改變，隨後AR與熱休克蛋白解離，受體磷酸化形成二聚體，二聚體與PSA啟動子中雄激素應答元件(ARE)結合，誘導PSA基因的轉錄表達。有些物質可調節AR的表達，例如生長因子使AR增加五倍等。有研究發現雄激素非依賴的前列腺癌中AR同樣是非常重要的分子，其作用有待進一步研究。
與腫瘤發生發展相關的基因有很多，但是由於PSA在前列腺癌表達的特異性最強，因此，欲判斷外源性藥物對前列腺癌雄激素依賴性細胞是否具有抑制作用時，可以考慮到尋找特異的靶標基因PSA作為研究對象，並構建含PSA啟動子的雄激素受體表達系統和螢光素酶報告基因的重組質粒，在重組質粒中螢光素酶的表達受上遊PSA啟動子序列的調節，將該表達載體轉染體外培養的前列腺癌雄激素依賴性細胞後，螢光素酶活性的高低能夠直接反映啟動子作用的強度，依此來判斷外源性藥物對前列腺癌雄激素依賴性細胞是否有抑制作用、抑制程度如何以及是否主要通過對PSA的作用影響前列腺癌雄激素依賴性細胞。PSA啟動子基因序列的克隆可以通過聚合酶鏈式反應(PCR)，又稱體外酶促基因擴增，是一種在體外模擬DNA體內複製的基因擴增技術。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種檢測前列腺癌雄激素依賴性細胞PSA靶標基因表達的特異性克隆分子及其克隆方法。
本發明的另一個目的是提供利用所述特異克隆分子檢測外源性中藥藥物對前列腺癌雄激素依賴性細胞是否有抑制作用及其作用是否與PSA相關方面的應用。
本發明的一種檢測前列腺癌雄激素依賴性細胞PSA基因表達的特異克隆分子是以pGL3-Basic質粒作為載體，該質粒含有螢光素酶報告基因，PSA啟動子基因插入載體的Sac I和Kpn I酶切位點部位，並位於螢光素酶報告基因上遊。
所述的pGL3-Basic質粒也可以是pGL2-Basic質粒。
本發明的一種檢測前列腺癌雄激素依賴性細胞PSA基因表達特異克隆分子的克隆方法由以下步驟組成(1)PCR擴增PSA基因5』側啟動子中640bp的DNA片段；(2)擴增的DNA片段經電泳純化後用限制性內切酶Sac I和Kpn I消化，然後連接到用同樣限制性內切酶切割的pGL3-Basic質粒上，DNA片段連至質粒中螢光素酶基因上遊而構建重組質粒，並命名為pGL3-PSA。
本發明的前列腺癌雄激素依賴性細胞PSA基因表達的特異克隆分子在檢測外源性中藥藥物對前列腺癌雄激素依賴性細胞抑制作用的應用。
本發明的優點和有益效果是1.與腫瘤發生發展相關的基因有很多，但是由於PSA在前列腺癌表達的特異性最強，因此，欲判斷外源性藥物對前列腺癌雄激素依賴性細胞是否有抑制作用時，以特異的靶標基因PSA作為研究對象，構建含PSA啟動子的雄激素受體表達元件和螢光素酶報告基因的重組質粒，在重組質粒中螢光素酶的表達受上遊PSA啟動子序列的調節，將該表達載體轉染體外培養的前列腺癌雄激素依賴性細胞後，螢光素酶活性的高低直接反映了啟動子作用的強度，依此來判斷外源性藥物對前列腺癌雄激素依賴性細胞是否有抑制作用、抑制程度如何以及是否主要通過對PSA的作用影響前列腺癌雄激素依賴性細胞。
2.本方法提供的特異克隆分子及其應用為研究或檢測外源性中藥藥物對前列腺癌雄激素依賴性細胞的抑制作用及分子機制提供一個具有靈敏度高、速度快、特異性強的檢測平臺，能夠在外源性藥物抗腫瘤活性篩選方面推廣應用。


圖1 pGL3-PSA重組質粒圖譜示意圖。
圖1中1螢光素酶報告基因，2 SV40病毒多聚腺苷A標記位點，3氨苄青黴素抗性標記，4起始位點，5合成多聚腺苷A信號轉錄終止位點，6Kpn I酶切點，7 PSA啟動子，8雄激素應答元件，9 Sac I酶切點。
圖2 pGL3-PSA酶切鑑定電泳圖。
圖2中M表示DNA分子量標準，1表示pGL3-PSA質粒，2表示SacI和Kpn I對pGL3-PSA質粒酶切鑑定。
圖3不同劑量的薑黃素處理LNCap細胞後螢光素酶活性測定值。
圖4不同劑量的槲皮素處理LNCap細胞後螢光素酶活性測定值。
圖5不同劑量的兒茶素處理LNCap細胞後螢光素酶活性測定值。
具體實施例方式
下面結合具體實施例進一步闡述本發明。
應當理解，下列實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明要求保護的範圍。下列實施例中未註明具體實驗條件和方法的部分，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等主編，科學出版社，1992，分子克隆實驗指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科學出版社，2001，細胞實驗指南；呂鴻聲，科學出版社，1982，或按照製造廠商所建議的條件。
以下是本發明的前列腺癌細胞PSA基因表達的特異分子克隆方法及特異克隆分子實施例實施例1(1)PCR擴增PSA基因5』側啟動子中640bp的DNA片段PCR反應體系50.0μL，其中含10xbuffer5.0μL，pGL3-640bp-PSA噬菌粒模板10ng2.5mmol/L，dNTPs4.0μL，Taq PlusI酶1.25u，正反向引物各2μL。
反應參數預變性94℃4min 完全延伸72℃ 10min(2)將擴增的DNA片段經電泳純化後用限制性內切酶Sac I和Kpn I消化，然後連接到用同樣限制性內切酶切割的pGL3-Basic質粒上，所述連接體系為10.0μL，其中含10xbuffer1.0μL，pGL3-Basic載體25ng，T4連接酶1u，其餘為蒸餾水，在環境溫度4℃下反應得連接產物。DNA片段連至質粒中螢光素酶基因上遊，構建重組質粒並命名為pGL3-PSA，其圖譜如圖1所示。
(3)將重組質粒轉化到大腸桿菌，分離純化後，雙酶切和電泳鑑定後進行基因測序其具體操作為取重組質粒3.0μL轉化感受態大腸桿菌DH5a，經藍白斑篩選出陽性重組子，從陽性重組子中小量提取pGL3-PSA重組質粒，用於SacI和Kpn I雙酶切鑑定有無插入片段，其電泳圖見圖2，從圖2可以看出在pGL3-Basic載體中成功插入了PSA基因5』側啟動子中640bp的DNA片段。
隨後用Sac I和Kpn I雙酶切pGL3-Basic載體及pGL3-PSA特異克隆分子，玻璃奶回收純化PGL3-Basic載體，與純化後的目的基因克隆片段定向連接，轉化大腸桿菌DH5a，挑選重組質粒，進行基因測序，以便進一步證明本方法所獲得的特異克隆分子基因序列的準確性。
實施例2將實施例1中pGL3-Basic質粒用pGL2-Basic質粒替代，實施例2所有特異分子克隆方法與實施例1相同。
以下是本發明的前列腺癌細胞PSA基因表達的特異克隆分子在檢測外源性中藥藥物應用方面的實施例實施例1是前列腺癌細胞PSA基因表達的特異克隆分子檢測薑黃素對前列腺癌雄激素依賴性細胞抑制作用的實施例。
(1)脂質體法將pGL3-PSA質粒和pRL-TK質粒共轉染前列腺癌雄激素依賴性細胞，pRL-TK質粒作為內參照，內參照與各表達質粒的比值為1∶25；(2)轉染前1d，接種2×105個細胞於12孔板中，於環境溫度30C培養20h，待細胞匯合至93％，用無血清培養基洗滌細胞2次；(3)將步驟(1)所述比值的兩種質粒1.1μg和3μL脂質體LipofectaminTM2000在無血清培養基中混勻，室溫放置20min後加到前列腺癌雄激素依賴性細胞上，6h後換含血清培養基時在12孔板中分別加入濃度為0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L的薑黃素，其中0μmol/L的為4孔，其餘濃度各2孔。繼續培養24h收集細胞，測定螢光素酶活性，測定結果見圖3。
其中，對檢測結果有影響的主要是薑黃素濃度，劑量在0～50μmol/L範圍內選擇，50μmol/L為最大非毒性劑量。
所述的螢光素酶活性的測定方法為(1)吸去細胞培養液，PBS(Na2HPO41.15g/L，KH2PO40.2g/L，NaCl8g/L，KCl0.2g/L，PH7.4)洗滌細胞1次，每孔加入100μL lxPLB(裂解緩衝液Passive Lysis Buffer)，輕輕晃動5min，將細胞裂解液轉移到1.5mlEppendorf管內。
(2)化學發光儀設置如下測量前延擱時間2s，測量時間10s，手動操作。
(3)在測量管中加入100μL LAR(螢光素酶分析試劑Luciferase AssayReagent)，吸取20μL細胞裂解液與之混勻，並放入發光儀，讀取樣品中載體攜帶的螢火蟲螢光素酶激發底物所釋放螢光的數值(M1)然後在同一測量管中加入100μL反應終止劑StopGloReagent，混勻後讀取樣品中內參照質粒攜帶的水母螢光素酶激發底物所釋放螢光的數值(M2)。
(4)為消除轉染效率帶來的影響，以螢火蟲螢光素酶與水母螢光素酶活性的比值(M1/M2)表示螢光素酶重組質粒的相對表達活性。所有數據均以平均數±標準差表示。應用t檢驗進行兩均數間的差異性分析，p≤0.05認為有顯著性差異。採用復孔處理，每組實驗重複三次。
從圖3可以看出濃度為40μmol/L的薑黃素其螢火蟲螢光素酶與水母螢光素酶活性的比值(M1/M2)在0.1以下，對PSA基因5』側啟動子區640bp區域的抑制作用最強，即反映出薑黃素對前列腺癌雄激素依賴性細胞有抑制作用最強。
實施例2是前列腺癌細胞PSA基因表達的特異克隆分子檢測槲皮素對前列腺癌雄激素依賴性細胞抑制作用的實施例。
本實施例的檢測方法同於實施例1，檢測結果如圖4所示，從圖4可以看出濃度為40μmol/L的槲皮素其螢火蟲螢光素酶與水母螢光素酶活性的比值(M1/M2)在0.1以下，對PSA基因5』側啟動子區640bp區域的抑制作用最強，即反映出槲皮素對前列腺癌雄激素依賴性細胞有抑制作用最強。
實施例3是前列腺癌細胞PSA基因表達的特異克隆分子檢測兒茶素對前列腺癌雄激素依賴性細胞抑制作用的實施例。
本實施例的檢測方法同於實施例1，檢測結果如圖5所示，從圖5可以看出濃度為40μmol/L的兒茶素其螢火蟲螢光素酶與水母螢光素酶活性的比值(M1/M2)在0.1以下，對PSA基因5』側啟動子區640bp區域的抑制作用最強，即反映出兒茶素對前列腺癌雄激素依賴性細胞有抑制作用最強。
各種酶均購自Takara公司；(1640培養液)RPMI1640為Hyclone產品；雙螢光素酶報告系統Dual-luceferase Reporter Assay System購自Promega公司；薑黃素(Curcurmin)購自Sigma公司；前期構建並保存含PSA基因5』側啟動子區640bp序列(目的基因)的重組質粒pGL3-640，質粒pGL3-Basic、pRL-TK質粒、脂質體LipofectaminTM2000購自GIBCO公司；前列腺癌雄激素依賴性細胞LNCap由美國西部林業大學泌尿研究所Mayo Clinic/Foudation的Dr.Young實驗室惠贈。
權利要求
1.一種前列腺癌雄激素依賴性細胞PSA基因表達的特異克隆分子，是以pGL3-Basic質粒作為載體，該質粒含有螢光素酶報告基因，其特徵在於PSA啟動子基因插入載體的Sac I和Kpn I酶切位點部位，並位於螢光素酶報告基因上遊。
2.如權利要求1所述的特異克隆分子，其特徵在於所述的pGL3-Basic質粒也可以是pGL2-Basic質粒。
3.如權利要求1所述的前列腺癌雄激素依賴性細胞PSA基因表達特異克隆分子的克隆方法，其特徵在於由以下步驟組成(1)PCR擴增PSA基因5』側啟動子中640bp的DNA片段；(2)擴增的DNA片段經電泳純化後用限制性內切酶Sac I和Kpn I消化，然後連接到用同樣限制性內切酶切割的pGL3-Basic質粒上，DNA片段連至質粒中螢光素酶基因上遊而構建重組質粒。
4.如權利要求1所述的前列腺癌雄激素依賴性細胞PSA基因表達的特異克隆分子在檢測外源性中藥藥物對前列腺癌雄激素依賴性細胞抑制作用的應用。
全文摘要
本發明涉及一種前列腺癌細胞PSA基因表達的特異克隆分子及其方法和應用，屬於分子生物學領域。該前列腺癌細胞PSA基因表達的特異克隆分子是含有PSA啟動子的雄激素受體表達系統和螢光素酶報告基因的重組質粒。利用該技術可以準確地判斷外源性中藥藥物對前列腺癌雄激素依賴性細胞是否有抑制作用及其作用是否與PSA相關。本方法提供的特異克隆分子及其應用為研究或檢測外源性中藥藥物對前列腺癌雄激素依賴性細胞的抑制作用及分子機制提供一個具有靈敏度高、速度快、特異性強的檢測平臺，能夠在外源性藥物抗腫瘤活性篩選方面推廣應用。
文檔編號C12N15/64GK1995344SQ20061001618
公開日2007年7月11日 申請日期2006年10月20日 優先權日2006年10月20日
發明者楊磊, 呼文亮, 陳立軍, 王洪敏, 牟心紅, 靳秋月, 姚麗, 鎖江蕊, 謝紅, 王瑞岷, 王瑋, 程世翔, 樊嶸 申請人:中國人民武裝警察部隊醫學院