利用膨脹床色素親和色譜純化重組人幹擾素α-2b的方法

2023-10-09 21:16:49 3

專利名稱：利用膨脹床色素親和色譜純化重組人幹擾素α-2b的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用膨脹床色素親和色譜直接從細胞裂解液中純化重組人幹擾素α-2b的方法，屬於膨脹床吸附色譜純化基因工程蛋白質藥物的色譜分離技術。
背景技術：
幹擾素(IFN)是病毒等誘導劑作用於寄生細胞而產生的一類具有生物活性的糖蛋白，具有很高的抗病毒活性並能夠抑制病毒、腫瘤細胞的增殖，是一類廣譜的抗病毒藥物。幹擾素被廣泛地用於治療肝炎、流行性感冒等常見病毒性疾病，同時在乳腺癌、骨髓癌等多種癌症的治療中也得到廣泛的應用。幹擾素根據其結構和來源可分為三種，即幹擾素α、幹擾素β、幹擾素γ。作為一種多基因產物，幹擾素α分為許多亞型，其中重組人幹擾素α-2b(Human Recombinant Interferon α-2b，簡稱rHuIFN α-2b)以其對重症急性呼吸系統症候群(SARS)的顯著防治作用，更是引起了眾多企業界和學術界的關注。
由於人幹擾素α-2b為胞內活性產物，利用傳統的血漿製備得到的產物產量很低。因此，現階段在工業上多採用基因工程技術進行生產，主要是通過對重組基因工程菌的構建，培養和下遊的分離純化等一系列步驟而得到的。一般來說，在實際生產中，從細胞裂解到獲得符合藥品規範的純品幹擾素一般需要8步以上的分離純化過程，即細胞破碎、離心沉降、鹽析沉澱、沉澱物復溶、疏水性相互作用層析、陰離子交換層析、陽離子交換層析和凝膠過濾層析等。繁多的分離步驟引起的產品收率低(一般產品收率約10％)和生產周期長，成為了整個生產過程的瓶頸問題。因此，選擇快速而有效的分離手段是解決上述問題的關鍵。目前，國內對相關方面的技術改造多集中在對生產過程後期的改進，如採用單抗親和層析技術(宋禮華等，一種可純化多種IFN-α的單抗親和層析柱，申請號93114639.9)或多步非親和層析方法(梁國棟等，關於酵母重組株及IFN α-2b幹擾素的純化方法，申請號02108974.4)來達到分離純化幹擾素的目的。雖然上述的專利對於整個生產過程有所改進，但是並未省略離心、鹽析沉澱等步驟，所以對於生產中的瓶頸問題並沒有實質性的解決。
近年來，集成化分離技術概念的提出為生物分離技術開闢了新的領域，並逐漸成為生物分離技術研究中的新熱點，膨脹床吸附技術就是其中之一。膨脹床是固體粒子流化狀態穩定、返混程度很小的液固流化床。膨脹床吸附技術可從含有細胞和細胞碎片的粗料液中直接分離回收目標產物，且細胞或細胞碎片的殘留量僅相當於離心分離法的1-10％。而色素親和技術是利用生物分子間具有的特異性結合作用的原理而進行的分離純化技術，色素配基具有價格便宜，吸附容量大，化學穩定性好，與載體偶聯方法簡便，不容易生物降解等特點。
目前尚未見到有關膨脹床和色素親和配基相結合的技術用於純化重組人幹擾素α-2b的方法，倘要將此項技術應用於重組人幹擾素α-2b的純化過程，將可代替現有的包括以細胞破碎、離心沉降、鹽析沉澱、疏水性相互作用層析、陰離子交換層析、陽離子交換層析和凝膠過濾層析為主體的純化過程，從而大大縮短純化時間，提高產品活性收率，降低能耗。

發明內容
本發明的目的在於提供一種採用膨脹床色素親和色譜純化幹擾素α-2b的方法。該方法過程簡單，產品活性收率高，能耗低。
本發明是通過下述技術方案加以實現的。採用柱內裝填辛巴藍修飾的石英核瓊脂糖介質(Streamline Quartz Base Matrix)的膨脹床色素親和色譜，純化幹擾素α-2b的方法。其過程包括介質的修飾、吸附和脫附，其特徵在於介質的修飾是以1-3mol/L的氯化鈉溶液配製成含辛巴藍濃度0.35-9g/L和含氫氧化鈉的濃度為3.5-36g/L的溶液。在該溶液中加入等體積的粒徑為80-500μm密度為1.15-1.3g/mL的石英核瓊脂糖介質，並在40-70℃水浴搖床中反應10h以上，得到辛巴藍修飾的石英核瓊脂糖介質；吸附工藝是採用pH為6.0-8.0的0.002mol/L的磷酸鈉鹽緩衝液稀釋細胞破碎液，配製成活性值為2.5×105-2.5×107IU/mL的原料液；將辛巴藍修飾石英核瓊脂糖介質裝柱後用pH為6.0-8.0的0.001-0.02mol/L的磷酸鈉鹽緩衝液平衡，以流速為80-260cm/h從膨脹床底部通入原料液，上樣量為每升柱體積1-5L原料液，並控制床層膨脹比為1.5-3.0，於室溫操作。脫附條件是以pH為6.0-8.0的0.001-0.02mol/L的磷酸鈉鹽緩衝液，以80-260cm/h的流速在膨脹床狀態下清洗1-4個柱體積，包括去除雜蛋白和細胞碎片固形物；在固定床操作狀態用pH為9-13的0.002-0.03mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液洗脫目標蛋白。在洗脫過程中，觀察色譜峰值，當色譜峰響應值達到基線位置時洗脫完畢。
上述的優化條件介質的修飾是以1.5-2.5mol/L的氯化鈉溶液配製成含辛巴藍濃度0.5-8g/L和含氫氧化鈉的濃度為4-30g/L的溶液。膨脹床的膨脹比控制在1.5-2.5的範圍內；將活性值為5×105-1.0×107IU/mL以下的細胞破碎液作為原料液，上樣量為每升柱體積1.6-4L原料液，上樣結束後用緩衝液在膨脹床狀態下清洗雜蛋白；最終，在固定床操作狀態用pH為10-11的0.01-0.03mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液洗脫目標蛋白。
本發明純化人幹擾素α-2b的過程同現有的分離方法相比，其明顯的優點是，菌體細胞破碎後，無需在低溫下的離心、鹽析沉澱、pH沉澱、沉澱溶解以及溶解後的離心過程，可適當稀釋後直接用於膨脹床吸附色譜分離，使整個分離過程的步驟減少4步，大大縮短了分離過程的時間，大幅度地提高了重組人幹擾素α-2b的收率，並且降低了能耗。該技術在重組人幹擾素α-2b的純化過程中具有廣闊的應用前景。
下面對本發明進行詳細說明。
本發明的關鍵技術有五點一是膨脹床介質的選擇。膨脹床的介質粒徑和密度對於膨脹性能有著明顯的影響，本發明選擇粒徑範圍為80-500μm，密度為1.15-1.3g/mL的石英核瓊脂糖介質作為膨脹床吸附介質。關鍵技術之二是色素親和膨脹介質——StreamlineCB的修飾密度的選擇。合適色素親和配基的修飾密度的選擇是保證目標產物的收率的關鍵之一，其值應控制在為20μmol/mL以下。關鍵技術之三是對原料液中幹擾素活性的控制。由於幹擾素的活性收率和幹擾素在介質上的吸附量成正比例關係，因此，將活性值為5×105-1.0×107IU/mL以下的細胞破碎液作為原料液。關鍵技術之四對上樣量的控制。適合的上樣量的選擇保證了目標產物的收率，控制處理量在每升柱體積1.6-4L原料液。關鍵技術之五是採用的適宜的洗脫條件，選擇pH為10-11的0.01-0.03mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液洗脫目標蛋白，有利於最大程度的回收吸附在介質上的人幹擾素α-2b，同時保持其活性及單體結構。
具體實施例方式
下面的實例將對本發明提供的方法予以進一步的說明。
實施例1
取沉降體積為50mL的石英核瓊脂糖介質與2.0mol/L的NaCl溶液等體積混合，加入1.0g辛巴藍，10g NaOH，定容在200mL；在60℃，200rpm的水浴搖床中反應15h。反應完畢，將抽濾過的辛巴藍介質裝入層析洗柱中，用含有0.5mol/LNaCl的10％乙醇溶液進行洗滌，直到清洗液澄清，即可認為沒有游離的辛巴藍。清洗完畢，即得到膨脹床色素親和介質Streamline CB。將修飾得到的Streamline CB填充到XK 26色譜柱中，填充高度為10.0cm。將色譜柱上流體分布器調節到20.5cm處，固定。從色譜柱下部以132cm/h的流速通入緩衝液A，使床層膨脹2倍，平衡30min。將活性為2.1×106IU/mL的原料液從色譜柱下部通入，調節料液的流速，以70cm/h維持膨脹床的膨脹比不變，同時收集從色譜柱流出的溶液。重組人幹擾素α-2b上樣量為202.3mL。上樣後以132cm/h的流速通入緩衝液A，清洗2-3個柱體積，收集清洗階段色譜柱流出的溶液。將上流體分布器降至10.5cm處，採用固定床操作方式，以60cm/h的流速從色譜柱上部通入pH值為11的0.01mol/L的甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液進行一步洗脫，收集洗脫峰處的流出液的體積。洗脫完畢，使用濃磷酸迅速將洗脫液的pH值調節至7.0。採用ELISA夾心方法，測定料液、上樣、清洗和洗脫階段的樣品的幹擾素的活性值(U)；使用Bradford法測定收集樣品中的蛋白含量；測定收集樣品的體積。幹擾素的活性收率及純化因子分別為60％和0.68，處理量為每升柱體積4L原料液。
實施例2取沉降體積為100mL的石英核瓊脂糖介質與2.0mol/L的NaCl溶液等體積混合，加入2.0g辛巴藍，18g NaOH，定容在400mL；在60℃，200rpm的水浴搖床中反應24h。反應完畢，將抽濾過的辛巴藍介質裝入層析洗柱中，用含有0.5mol/LNaCl的10％乙醇溶液進行洗滌，直到清洗液澄清，即可認為沒有游離的辛巴藍。清洗完畢，即得到膨脹床色素親和介質Streamline CB。將修飾得到的Streamline CB填充到XK 26色譜柱中，填充高度為18.0cm。將色譜柱上流體分布器調節到32.5cm處，固定。從色譜柱下部以132cm/h的流速通入緩衝液A，使床層膨脹1.8倍，平衡30min。將活性為2.1×106IU/mL的原料液從色譜柱下部通入，調節料液的流速，以70cm/h維持膨脹床的膨脹比不變，同時收集從色譜柱流出的溶液。重組人幹擾素α-2b上樣量為210mL。上樣後以132cm/h的流速通入緩衝液A，清洗2-3個柱體積，收集清洗階段色譜柱流出的溶液。將上流體分布器降至18.5cm處，採用固定床操作方式，以60cm/h的流速從色譜柱上部通入pH值為11的0.01mol/L的甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液進行一步洗脫，收集洗脫峰處的流出液的體積。洗脫完畢，使用濃磷酸迅速將洗脫液的pH值調節至7.0。採用ELISA夾心方法，測定料液、上樣、清洗和洗脫階段的樣品的幹擾素的活性值(U)；使用Bradford法測定收集樣品中的蛋白含量；測定收集樣品的體積。幹擾素的活性收率及純化因子分別為159％和4.8，處理量為每升柱體積1.6L原料液。
實施例3取30mL的石英核瓊脂糖介質2.5mol/L氯化鈉溶液等體積混合後，加入1.6g辛巴藍及4g氫氧化鈉，定容到160mL，在50℃，200rpm的水浴搖床中反應15h。反應完畢，將抽濾過的辛巴藍介質裝入層析洗柱中，用含有1mol/L NaCl的30％乙醇溶液進行洗滌到清洗液澄清，即可認為沒有游離的辛巴藍。清洗完畢，得到色素親和膨脹床介質Streamline CB。將修飾得到的Streamline CB填充到XK 16色譜柱中，填充高度為6.0cm。將色譜柱上流體分布器調節到12.5cm處，固定。從色譜柱下部以180cm/h的流速通入pH為6.5的0.02mol/L緩衝液(緩衝液A)，使床層膨脹2倍，平衡30min。將活性為1.6×106IU/mL的原料液從色譜柱下部通入，調節料液的流速，以165cm/h維持膨脹床的膨脹比不變，同時收集從色譜柱流出的溶液。上樣量為120mL。上樣後，重新以180cm/h的流速通入緩衝液A，清洗2-3個柱體積，收集清洗階段色譜柱流出的溶液。將上流體分布器降至6.5cm處，採用固定床操作方式，以30cm/h的流速從色譜柱上部通入pH值為10的0.03mol/L的甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液進行一步洗脫，收集洗脫峰處的流出液的體積。洗脫完畢，使用濃磷酸將洗脫液的pH值調節至7.0。採用ELISA夾心方法，測定料液、上樣、清洗和洗脫階段的樣品的幹擾素的活性值(U)；使用Bradfort法測定收集樣品中的蛋白含量；測定收集樣品的體積。幹擾素的活性收率及純化因子分別為117％和4.6，處理量為每升柱體積4L原料液。
權利要求
1.一種利用膨脹床色素親和色譜純化重組人幹擾素α-2b的方法，該方法是採用柱內裝填辛巴藍修飾的石英核瓊脂糖介質的膨脹床色素親和色譜，其過程包括介質的修飾、吸附和脫附，其特徵在於介質的修飾是以1-3mol/L的氯化鈉溶液配製成含辛巴藍濃度0.35-9g/L和含氫氧化鈉的濃度為3.5-36g/L的溶液，在該溶液中加入等體積的粒徑為80-500μm密度為1.15-1.3g/mL的石英核瓊脂糖介質，並在40-70℃水浴搖床中反應10h以上，得到辛巴藍修飾的石英核瓊脂糖介質；吸附工藝是採用pH為6.0-8.0的0.002mol/L的磷酸鈉鹽緩衝液稀釋細胞破碎液，配製成活性值為2.5×105-2.5×107IU/mL的原料液；將辛巴藍修飾石英核瓊脂糖介質裝柱後用pH為6.0-8.0的0.001-0.02mol/L的磷酸鈉鹽緩衝液平衡，於20-30℃，以流速為80-260cm/h從膨脹床底部通入原料液，上樣量為每升柱體積1-5L原料液，並控制床層膨脹比為1.5-3.0進行吸附操作；以pH為6.0-8.0的0.001-0.02mol/L的磷酸鈉鹽緩衝液，以80-260cm/h的流速在膨脹床狀態下清洗1-4個柱體積，包括去除雜蛋白和細胞碎片固形物；在固定床操作狀態用pH為9-13的0.002-0.03mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液洗脫目標蛋白，在洗脫過程中，觀察色譜峰值，當色譜峰響應值達到基線位置時洗脫完畢。
2.根據權利要求1所述的利用膨脹床色素親和色譜純化重組人幹擾素α-2b的方法，其特徵在於以1.5-2.5mol/L的氯化鈉溶液配製成含辛巴藍濃度0.5-8g/L和含氫氧化鈉的濃度為4-30g/L的溶液，膨脹床的膨脹比控制在1.5-2.5的範圍內；將活性值為5×105-1.0×107IU/mL以下的細胞破碎液作為原料液，上樣量為每升柱體積1.6-4L原料液，上樣結束後用緩衝液在膨脹床狀態下清洗雜蛋白；最終，在固定床操作狀態用pH為10-11的0.01-0.03mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液洗脫目標蛋白。
全文摘要
本發明公開了一種利用膨脹床色素親和色譜純化重組人幹擾素α－2b的方法。該方法包括介質的製備、吸附和脫附，其特徵在於，以粒徑為80－500μm密度為1.15－1.3g/mL的石英核瓊脂糖介質，在鹼性條件下修飾辛巴藍配基，合成介質；採用磷酸鈉鹽緩衝液稀釋細胞破碎液，配製成活性值為2.5×10
文檔編號C07K1/00GK1539848SQ20031010672
公開日2004年10月27日 申請日期2003年10月29日 優先權日2003年10月29日
發明者孫彥, 趙雪雁, 張磊, 史清洪, 董曉燕, 白姝, 孫 彥 申請人:天津大學