保持、改善和恢復軟骨細胞的軟骨表型的方法

2023-10-09 13:01:49 7

專利名稱：：保持、改善和恢復軟骨細胞的軟骨表型的方法
技術領域：
：本發明涉及軟骨細胞擴充和軟骨修復領域。本發明還涉及軟骨的可控性細胞群可用於保持、改善或恢復諸如軟骨細胞或軟骨母細胞的成軟骨細胞的軟骨表型。
背景技術：
：關節軟骨和半月軟骨均在正常關節運動機制中起重要作用。關節軟骨覆蓋膝關節諸骨的末端。它由稀疏分布的包圍在細胞外基質中的細胞(軟骨細胞)組成，軟骨基質由膠原、多種蛋白質/糖蛋白和攜帶稱為粘多糖的負L電荷多聚糖的高保水性的蛋白聚糖組成。半月軟骨是以細胞出現在基質中成行和成束的膠原纖維中排列的陷窩中為特徵的纖維軟骨。關節軟骨和/或半月軟骨的損傷是影像數百萬人的常見病患。該損傷由於成人關節軟骨的弱的再生性和損傷帶來的運動障礙和疼痛而變得複雜。近年來已提出幾種軟骨修復的模式。其中一種模式，"自體軟骨細胞遷移"技術(ACT)，從健康逛街軟骨收集細胞，進行培養擴增以得到足夠的細胞數，並再植入關節或半月軟骨缺損[Brittberg等(1994)NEngl.JMed.331，889-895]。細胞擴充必須從小的活檢軟骨獲取以修復軟骨缺損。ACT技術有例如軟骨細胞在單細胞層培養中擴增具有與增加的傳代數量去分化傾向的限制。這種去分化將導致基質的合成物與原始組織中的合成物具有不同的生物化學和生物機械特性。需要優化細胞培養條件和限制傳代數量以保持軟骨細胞的表型性質，包括在體內形成穩定的玻璃樣軟骨的能力，抵抗血管侵蝕和軟骨內成骨。所有目前採用的ACT技術使用由取自原始活檢通過細胞培養方法的擴充的軟骨細胞群組成的細胞療法。不可否認，這些細胞群包含不同數量的保持其表型穩定性的和不能穩定地朝形成關節軟骨細胞分化的去分化細胞。這種情況在組織修復質量的臨床研究中表現為從纖維軟骨上玻璃樣軟骨到未顯示修復的高度變異性中得到驗證[Peterson等(2000)ClinOrthopRes.374,22-234]。這提示軟骨細胞擴增的數量不足以達到實現成功移植的程度。已採用多種努力以改進軟骨細胞的質量或使用軟骨細胞的替代來源。(WO0124833)描述了使用分子標記物作為軟骨細胞擴增或傳代的質量控制。這些標記物的使用能夠確定一個軟骨細胞群的傳代數量是否能在移植後不明顯損失軟骨形成能力。已使用不同方法通過對軟骨細胞增加不同基質組分(例如基底膜蛋白聚糖)以增加ACT的結果[French等(1999)J.Cell.Biol.145，1103-1115]。也有報導環境基質對軟骨細胞再生能力的影像。Graff等[2003，Biotechnol.Bioeing.82,457-464]描述了取自軟骨的以存在原生細胞外基質("軟骨質")為特徵的一種細胞群，並記載了這些細胞相對於已在體外重建其細胞外膜的軟骨細胞具有增強的軟骨形成特性。己描述軟骨活檢包括除了典型的軟骨細胞，還有具有不同形態和行為的小部分細胞。Kamil等[2004，TissueEng.10，139-144]描述了—在擴增方案中為了獲得更高的產量從軟骨活檢去除通常稱為"泡沫細胞"的細胞群，並描述了這些細胞如何能夠仍然被擴增。該報導建議除了經典的粘附軟骨細胞部分軟骨活檢的其它部分也可用作成軟骨細胞的來源。儘管有多種方法擴增軟骨細胞並驗證其質量，仍不能在限定的傳代數量中獲得足夠數量的表型穩定的軟骨細胞，以改進低質量軟骨細胞的特性或恢復不當處理後(例如，過度孵化或擴增)細胞特性的恢復。對於在ACT中對產生穩定數量高質量細胞的方法的需求，需要能夠保證在活檢中軟骨細胞質量和數量的一致性、獨立性的方法。發明概述本發明涉及可獲自軟骨的細胞群，當與有成軟骨能力的細胞群組合時其具有調節效應，從而增加、誘導或恢復軟骨細胞表型穩定性。該調節細胞群自然狀態下表現為新鮮分離的軟骨活檢的一部分，但可基於其物理和/或生理屬性富集和/或分離。己證實該細胞群冷凍時保持其調節能力，使存儲調節細胞群(以富集形式或非富集形式)成為可能，例如在此期間須將成熟軟骨細胞擴增至移植所需的足夠大的數量。一旦獲得足夠數量的軟骨細胞，該軟骨細胞群與調節細胞群組合，組合後的細胞群準備供移植。並且已發現該調節細胞群可在一定時間內通過採集從軟骨活檢的軟骨細胞分離，如在接種後約2到5天和/或當粘附細胞達到培養容器的細胞非粘附部分的至少30%匯合時。一方面，本發明提供富集本發明調節細胞群的方法。更具體地，本發明提供從分離的軟骨樣本富集調節細胞群的方法，所述方法包括以下步驟(a)機械和/或酶處理分離的軟骨樣本以獲取獨立的細胞；(b)將所得獨立細胞轉移至細胞培養容器使軟骨細胞以單層擴增；(C)將細胞培養容器置於合適的細胞培養條件中，從而獲得粘附細胞群和包含非粘附細胞群的上清液；(d)至少2天後和/或當粘附細胞達到至少約30%匯合時從細胞培養容器收集包含非粘附細胞群的上清液；(e)從上清液收集相當於本發明調節細胞群的非粘附細胞群。根據一實施方式，用於本發明富集方法的軟骨樣本是關節軟骨或半月軟骨的樣本。本發明富集方法通常始於用膠原酶A酶處理的軟骨樣本。在另一方面，本發明提供富集的調節細胞群，該細胞群是用本文所述富集方法獲得的非粘附性、非傳代調節細胞群。在又一方面，本發明提供本發明富集調節細胞群的不同應用。根據第一實施方式，用本發明方法獲得的富集調節細胞群被作為藥物使用。更具體地，本發明提供治療軟骨病患的方法包括給軟骨疾患患者輸注本發明的富集調節細胞群。因此，本發明提供包含本發明富集調節細胞群的藥物組合物。更具體地，本發明提供涉及在關節軟骨缺陷處形成微小裂口的治療方法。病患處形成的微裂口使下方骨幹細胞能進入關節軟骨缺陷。然後，通過施加細胞性治療形成體內軟骨重建，根據本發明該治療包括具調節功能的細胞群。在此重建過程中本發明調節細胞群引導間葉幹細胞進入成軟骨細胞系。根據又一實施方式，富集的調節細胞群用於在體外改善、保持或恢復擴增或傳代軟骨細胞群的軟骨細胞表型穩定性。根據再一本發明實施方式，使用富集調節細胞群使間葉幹細胞體外分化成成軟骨細胞系。在另一方面，本發明提供包含一種或多種不同細胞群的調節細胞群(富集形式或如本文的新鮮分離的軟骨細胞)的組合物。更具體地，本發明提供包含兩種或多種不同細胞群的組合的組合物，所述細胞群包含一包含調節細胞的細胞群，其為(i)獲自軟骨活檢的新鮮分離的軟骨細胞群，或(ii)通過收集取自軟骨活檢新鮮分離的軟骨細胞PO培養上清液的非粘附細胞的富集調節細胞群；和一選自下組的一種或多種細胞群傳代的軟骨細胞細胞群，間葉幹細胞群，和軟骨母細胞群。更具體地，本發明提供包含兩種或多種不同細胞群的組合的組合物，所述細胞群包括富集的調節細胞群，富集的調節細胞的相對量範圍通常是組合的組合物細胞總數的1到75%。根據具體實施方式，出現在本發明的組合的組合物中的包含調節細胞的細胞群取自關節軟骨或半月軟骨。本發明還提供調節細胞群(富集形式或如本文的新鮮分離的軟骨細胞)與不同細胞群的聯和的不同應用。更具體地包含本發明調節細胞的細胞群的組合細胞群被作為一種藥物。因此本發明提供包含本文所述組合細胞群的藥物組合物。該組合細胞群也可用於支撐物供治療用。本發明提供了本發明調節細胞群(任選富集的)和第二細胞群的組合在製備治療軟骨病患的細胞治療劑中的應用。因此提供治療軟骨病患的方法，包括給予軟骨病患患者包含本發明調節細胞群和一種或多種其它細胞群的組合物調節細胞群與其它細胞群組合可使用如較高傳代數的軟骨細胞供移植。並且，本發明方法使通過反覆傳代生成大量軟骨細胞成為可能。過度傳代後軟骨細胞表型的最終減低可通過加入本發明調節細胞群得到恢復。因此由於可獲得具有穩定表型的大量軟骨細胞，本發明細胞群的使用能夠進行較大缺陷的細胞性治療。或者，不依賴可用軟骨細胞的數量，可使用本發明調節細胞群改進其質量。本發明調節細胞群的使用改進了通常使用的ACT方法。更具體地，本發明提供製備用於ACT移植的細胞群的方法，該方法包括以下步驟a)機械和/或酶處理分離的軟骨樣本以獲取個體細胞，b)將所獲個體細胞轉入細胞培養容器以使軟骨細胞單層擴增，c)保持培養容器在合適的細胞培養條件，獲得粘附細胞群和包含非粘附細胞群的上清液，d)在至少2天後或一旦至少培養容器中約30%粘附細胞匯合，從培養容器收集包含非粘附細胞群的上清液，e)從所述上清液收集所述非粘附細胞，f)將所獲非粘附細胞群與成軟骨細胞群(其並非富集的調節細胞群)組合。根據製備用於ACT移植的細胞群的方法的實施方式，成軟骨細胞群是取自相同或不同的分離的軟骨樣本的成熟軟骨細胞群。更具體地，該方法還包括以下步驟-g)擴增或傳代步驟(c)中所得粘附細胞群，h)收集擴增和傳代的粘附細胞群，i)步驟(f)中，將步驟(e)所得非粘附細胞群與步驟(h)所得粘附細胞群擴增和傳代後的群組合。通常，在本發明方法中，步驟(a)中的酶處理使用膠原酶A。在本發明方法的具體實施方式中分離的軟骨樣本是半月軟骨樣本。任選地，成軟骨源細胞群來自半月軟骨活檢。或者，成軟骨細胞群是間葉幹細胞群。本發明用於製備ACT移植細胞群方法的其它實施方式還包括將步驟(f)或(i)所得組合細胞群接種到支撐物上的步驟。因此本發明涉及通過施加包含本發明自體或異體調節軟骨細胞群和具有成纖維細胞形態的擴增的自體甚或異體軟骨細胞的混合物或組9合物的細胞治療劑改善體內軟骨重建的方法。本發明還涉及通過施加包含本發明調節細胞群和間葉幹細胞的混合物的細胞治療劑改善體內軟骨重建的方法。包含本發明細胞群和軟骨細胞組合的組合物能夠在體外加快軟骨形成。因此，構想本發明軟骨細胞和調節細胞群的組合植入導致軟骨重建增強，當注入體內時引導更快的再生過程和高質量的軟骨形成。並且觀察到，在顆粒培養中本發明細胞群生成的軟骨即使與較高傳代的去分化軟骨細胞組合時仍顯示快速地形成機械穩定的顆粒。這不僅使涉及可供移植的軟骨細胞群更具靈活，而且預示對局部成軟骨細胞發揮作用。誘導部分去分化細胞穩定的軟骨細胞表型的能力顯示本發明調節細胞可應用於誘導軟骨形成，例如在骨關節炎情況下，關節內局部軟骨細胞已受到分解過程影響時。發明詳述定義術語"成軟骨"在用於細胞或細胞群時指該細胞或細胞群在適當情況下固有的產生軟骨或刺激軟骨生長的能力。成軟骨細胞包括軟骨細胞和本身分化成軟骨細胞的細胞，例如屬於骨軟骨系的前體細胞。本文中"成軟骨因子"指促進軟骨分化的化合物，例如某些生長因子如TGF-(3。術語"軟骨細胞表型穩定性"在用於細胞群時，指該細胞群在體內產生軟骨的能力。此能力可通過在諸如免疫缺陷小鼠的哺乳動物(體內)注射部分細胞群(至少約1-20"06個細胞)進行測試，確定(時間跨度約3星期)軟骨植入物的進展而無血管侵蝕或軟骨內成骨徵象。表型穩定的軟骨細胞群，及其以表型穩定性標誌物的出現為特徵，如W0124833所述。經傳代後在成熟軟骨細胞逐漸失去軟骨細胞表型穩定性。術語"新鮮分離細胞"(FI)指取自組織消化後活檢的細胞群。術語"新鮮分離軟骨細胞"在本文則是指直接從含軟骨細胞組織，例如軟骨經消化未傳代獲得的細胞群。在本發明範圍裡新鮮分離細胞群或直接使用(即分離後48-120小時內)或冷凍供以後使用。或者，新鮮分離細胞群的特徵可在某種培養條件下長期保持，如以高密度在培養箱的超低接觸板中未傳代培養較長時間段。術語"調節"當用於細胞或細胞群時指該細胞或細胞群當接觸另一細胞群時影響該細胞群的成軟骨性，和/或啟動軟骨細胞擴增，和/或影響其它細胞群的軟骨細胞表型穩定性的能力。術語"富集"用於本發明調節細胞群時涉及以下情況從獲自軟骨活檢的新鮮分離細胞，去除發展為成熟軟骨細胞的細胞，從而得到相對於新鮮分離細胞總體中調節細胞百分比較高的調節細胞。根據本發明一種富集調節細胞群的具體方法是基於其非粘附特性。術語"非粘附"，"漂浮"，或"非接觸"當用於指示軟骨衍生細胞或細胞群時指以下情況當細胞或細胞群引入培養容器(例如培養瓶)時，保持懸浮不粘附於容器表面。更具體地，本發明非粘附細胞群(NAC)是在至少兩天或當粘附細胞已獲至少30%匯合後，出現在新鮮分離軟骨細胞的軟骨細胞單層的上清液中(即在標準培養條件下第一次擴增期間)。在本發明中用到的"成熟軟骨細胞"，是指軟骨組織的成熟細胞，其源於成軟骨細胞且能夠生成軟骨。成熟軟骨細胞從軟骨的新鮮分離細胞群經培養獲得。當可接觸基質或支撐物(例如在單層培養)時，新鮮分離細胞變平並獲得多角型或成纖維細胞形態，失去其細胞外基質而成為成熟軟骨細胞。因此"成熟軟骨細胞群"用在本文是指通過軟骨細胞單層培養得到的細胞群，例如在培養瓶中，成熟軟骨細胞粘附於培養瓶表面並經傳代一次或多次。術語"擴增"，當用於得自諸如軟骨組織的細胞群時，指示該細胞群己置於一定條件下，其細胞數已通過增殖得以增加。簡單地看，擴增是通過使細胞群在具有適當培養基的培養容器中實現，任選地直到匯合。分離自組織的細胞群的"第一次擴增"是指該細胞群在第一次傳代前的培養。在此第一次擴增中，一部分新鮮分離細胞將粘附於瓶表面並成為成熟軟骨細胞(PO成熟軟骨細胞)，而一部分新鮮分離細胞仍保持為上清液中的非粘附細胞(非粘附細胞群)。通常第一次擴增約為15天，取決於接種細胞的密度。一旦傳代，去除經培養細胞的上清液，並使粘附細胞從培養容器脫離，分份並再次轉至含新鮮培養基(此階段相對於PI)的培養容器。Pl細胞再次粘附於培養瓶可進一步傳代。Pl細胞或更高傳代數的細胞在本文中一般稱為"傳代細胞"。術語"軟骨缺陷"在本文中指任何由於軟骨缺失或損傷導致的情況。最常見的發生於關節，例如但不限於膝關節，肘關節，踝關節，因此通常被稱為關節軟骨缺陷。軟骨缺陷也常以附近的骨命名，例如股骨髁缺陷，肱骨缺陷等。半月板的纖維軟骨缺失/撕裂也稱為半月板缺陷。本發明基於以下觀察取自軟骨活檢的新鮮分離細胞，除了包含將分化為成熟軟骨細胞的細胞群，當引入培養瓶時粘附於瓶表面並可擴增的細胞群；以及非粘附細胞群，其不僅表型穩定，還可作為調節細胞群。該細胞群的調節活性由以下情況顯示其能夠保持軟骨細胞群的軟骨細胞表型穩定性並恢復去分化細胞群的軟骨細胞表型穩定性。因此，出現在取自軟骨的新鮮分離細胞中的該細胞群對軟骨產生和修復具有特殊意義。因此，本申請提供新鮮分離軟骨細胞的新型應用，利用了其中調節細胞亞群的特徵。並且，該調節細胞群的非粘附特徵提供了本發明調節細胞群富集的方法。因此，儘管傳統上取自軟骨細胞培養的第一次擴增的非粘附細胞被棄用，本發明提供了該非粘附細胞的使用，不僅作為成軟骨細胞群還作為能夠顯著影響其它細胞群軟骨細胞表型穩定性的調節細胞群。已觀察到本發明調節細胞群包含具有細胞外基質的細胞。軟骨細胞出現在軟骨組織中時具有園型或半園型表現。軟骨組織的消化破壞了出現在細胞周圍的天然細胞外基質。在最初48小時培養中，細胞再次得到(儘管不同的)細胞外基質。當接觸基質或支撐物，例如單層培養時，大多數新鮮分離細胞變平並形成多角型或成纖維細胞形態，再次失去其細胞外基質。本發明調節細胞群以具有園型的細胞形狀為特徵，其周圍保留著這種重獲得的細胞外基質。根據本發明，本發明調節細胞群出現在得自各種軟骨活檢的新鮮分離細胞中。因此本發明提供涉及使用該調節細胞群的方法，既可出現在新鮮分離細胞中，也可是富集細胞群，在體外或體內的軟骨生成中。本發明還提供富集具有調節功能的細胞群的方法。本發明調節細胞群或是新鮮分離細胞群的一部分，或是富集的調節細胞群，通常得自分離的軟骨樣本。根據本發明，該分離的軟骨是得自人體或動物體任何部位的纖維軟骨和/或關節軟骨。更具體地是選擇體內易於到達以獲取軟骨活檢的部位。如調節細胞群的分離是用於實現本文供ACT的細胞，理想的軟骨活檢來自與其它骨接觸少的非承重部位，例如股骨髁間切跡。或者，用於本發明方法的軟骨樣本是脫出的椎間盤軟骨或半月軟骨(纖維軟骨)。在本發明中用於生成細胞的軟骨活檢可得自幼年或老年個體、健康或病患軟骨(如骨關節炎軟骨)。本發明第一方面涉及富集本發明調節細胞群的方法。以最通常的形式，該方法包括以下步驟一機械和/或酶處理分離的軟骨樣本以獲取單個細胞群，_將所獲單個細胞群轉至細胞培養容器使軟骨細胞以單層擴增，一保持培養容器在合適細胞培養條件下，以及一從細胞培養容器收集包含非粘附細胞群的上清液，非粘附細胞群相當於本發明調節細胞群。根據本發明，來自軟骨組織新鮮分離細胞的培養為物理分離細胞為包括必須的軟骨細胞的"粘附"細胞群，以及具有調節特徵的非粘附細胞群提供了方法。根據本發明富集過程的第一步驟中，處理分離的軟骨以獲取個體細胞群("新鮮分離軟骨細胞")。根據具體實施方式，該處理包括酶處理。適於消化軟骨活檢的酶包括但不限於膠原酶NB4，膠原酶A或分散酶/膠原酶11。在本發明具體實施方式中用膠原酶A處理軟骨活檢。其它適於分解軟骨的蛋白酶包括選自下組的酶(單獨使用或與胰島素組合)天冬氨酸酶例如組織蛋白酶D，半胱氨酸酶例如組織蛋白酶B、L、S、K和鈣激活中性蛋白酶I和II，絲氨酸蛋白酶例如嗜中性粒細胞彈性蛋白酶，組織蛋白酶G和蛋白酶3和金屬蛋白酶例如MMPl-20。本發明的"處理"包括分離的組織與一定量的酶接觸足夠的時間段使組織消化為單個細胞。示例性的酶濃度和消化時間段在本文實施例部分描述，本領域熟練技術人員可簡單地決定其它處理方法。在本發明具體實施方式中使用0.1到0.3%的膠原酶A持續8到16小時，更具體是12小時。或者，可使用機械方法處理軟骨活檢以獲得單個細胞群，例如使用低速機械均質化，如Poole等(1998)J.Orthop.Res6,408-419所述。在本發明富集過程中，從軟骨活檢("新鮮分離軟骨細胞")得到的單個細胞被引入"培養容器"，以使"粘附"和"非粘附"細胞群在其中出現分離。用於本發明的合適培養容器是用於基質依賴細胞培養的標準培養瓶(例如，但不限於，得自BD公司(BectonDickinson)的Falcon瓶，得自特科諾塑料製品公司(TechnoPlasticProducts)的TPP瓶，經Greiner組織培養處理的瓶等)。通常，這些培養瓶包含已施加表面處理的內表面或瓶底。可使用不同形狀或尺寸的培養瓶，且這些方面在本發明文本中未嚴格要求。唯一的限制是瓶子是關閉的，即可以使粘附細胞群上方的培養基保留成熟軟骨細胞群粘附於底面所需的時間段，從而使粘附和非粘附細胞物理分離和從培養基中回收非粘附細胞。根據具體實施方式，用於本發明富集方法的該步驟的培養基和條件是標準的軟骨細胞培養基。用於軟骨細胞擴增工藝中的培養基通常包含DMEM，HAMS/F12或其它任選的細胞培養基添加5到15%血清。或者可使用適於軟骨細胞培養的無血清培養基。這些培養基可包含混合維生素，生長因子，激素，糖，等。根據具體實施方式，使用含血清和抗生素的DMEM培養基。該細胞培養標準化地置於37'C含5^C02，但希望這些條件地輕微變化不會顯著影響細胞群粘附到本發明培養容器的表面。根據本發明地具體實施方式，包含非粘附細胞群的培養瓶的上清液將保留在培養瓶中-段時間，如接種後2到5天或直到粘附細胞得到至少約20%，更具體地約30%匯合後進行收集。這將視瓶的尺寸和初始引入其中的細胞數而定。在第一次擴增中為使粘附細胞在培養瓶中的培養在約兩周內達到匯合，通常在175cn^的瓶中引入5，000-20，000新鮮分離軟骨細胞。對於熟練技術人員軟骨細胞的培養技術是眾所周知的。本發明調節細胞群的特徵是它是非粘附性的，即在用得自軟骨活檢的細胞接種培養瓶2到5天後或當來自軟骨細胞的粘附細胞達到約30%匯合時，它不粘附於培養瓶表面。根據本發明，可通過在新鮮分離軟骨細胞群的第一次擴增中分離粘附和非粘附細胞而獲取調節細胞群。典型的出現在來自軟骨活檢的細胞群的成熟軟骨細胞無天然的細胞外膜，在1星期時間段內粘附於(預處理的)培養容器表面。這種細胞接觸過程是富集調節細胞群的方法的基礎，該細胞群的特徵是其在較長時間內耐受去分化和接觸過程。應理解本發明富集過程中調節細胞群的收集時間可以是接種後少於2天或多於5天，但由於上清液將包含較高比例的或仍未粘附或不再粘附於培養容器表面的成熟軟骨細胞，這會影響富集過程的效果。在本發明富集過程中，非粘附細胞群以物理方法從粘附細胞群去除。根據本發明實施方式，非粘附細胞群隨上清液從培養容器一起收集。更具體地，從非粘附細胞群從培養容器的收集包含施加輕柔機械力的步驟(如輕微拍打瓶子)使粘附較弱的細胞脫離並收集培養上清液。從上清液回收細胞使用標準技術，例如，但不限於離心(如1500rpm持續10分鐘)。其它方法包括包括其它分離法例如過濾。通常，本發明富集過程導致出現在細胞群中調節細胞的百分比相對於新鮮分離活檢中的調節細胞出現百分比增加至少10%，更特殊地至少20%，最特殊地至少30%。通常發現軟骨細胞活檢包含5-20%的調節細胞。因為在剛從活檢回收後細胞的性質難於確定，也可在成熟軟骨細胞已開始粘附於培養瓶表面後確定。根據具體實施方式，本發明富集的調節細胞群包含至少30%，更特殊的至少40%，最特殊的介於50%到95%的調節非粘附細胞。根據另一實施方式，粘附和非粘附細胞群基於形態學和/或生理學特徵進行分離。因此，本發明調節細胞群以園型細胞形態和細胞外基質為特徵，與Graff等(2003，如上)所述"軟骨質"的細胞外基質不同，不是天然的細胞外基質，而是細胞在培養中再次獲得的。本發明調節細胞群還以II型膠原和軟骨聚集蛋白聚糖的表達為特徵。因此本發明其它隔離調節細胞的方法包括以下方法如上所述為得到單個細胞對軟骨活檢的處理，然後使用分離技術分離普通軟骨細胞和調節細胞群，如使用FACS分析或其它細胞分離技術。由於本發明提供從上述活檢獲取富集調節細胞群的方法，也應注意從這些活檢獲得的新鮮分離細胞包含本發明調節細胞群並可如此使用。因此，本發明構想新鮮分離細胞的使用既作為供富集的調節細胞的來源，也可如下文所述直接用於本發明調節細胞的不同應用。因此，根據本發明一個實施方式，新鮮分離細胞群中的調節細胞群用於本文所述的不同應用。新鮮分離細胞群可直接使用，即在標準培養條件下從軟骨組織分離24小時內。已進一步明確出現在新鮮分離細胞群中的調節細胞群的調節特性在某種培養條件下可在體外保持較長時間，例如以高密度將細胞保存在培養箱超低接觸板中(得自如康寧公司(Corning))。或者新鮮分離細胞群在分離24小時內冷凍供以後使用。在本領域中細胞群冷凍和解凍的方法是眾所周知的。根據一個實施方式，得自軟骨活檢的新鮮分離細胞分為兩部分，其中之一進一步擴增以增加細胞數(使用經典軟骨細胞擴增技術)，另一部分被冷凍直到第一部分的擴增完成，之後新鮮分離細胞的解凍部分與軟骨細胞的擴增和傳代後的部分組合，建立組合細胞群，可用作具有本發明增加表型穩定性作用的細胞治療劑。根據本發明另一實施方式，調節細胞群以通過本文所述方法獲得的富集的調節細胞群的形式，用於本文所述不同應用中。再次，該富集調節細胞群可或直接使用或冷凍供以後使用。本發明的其它方面提供了本發明調節細胞群的不同應用。本發明的一方面提供了a)本發明的調節細胞群("富集"或非富集的，即出現在新鮮分離軟骨細胞群的形式)和b)成熟，祖代和/或去分化軟骨細胞群的組合用於細胞性治療策略。根據本發明具體實施方式，用於本發明的組合細胞群的調節細胞群和成軟骨細胞群從同一軟骨樣本獲得。根據第一實施方式，從該活檢樣本獲得的一部分新鮮分離細胞是冷凍的，或直接或第一次擴增的24小時內，而第二部分是擴增後的以獲得擴增的軟骨細胞群(成熟軟骨細胞群)。或者，調節細胞群和軟骨細胞群均來源於新鮮分離軟骨細胞樣本的同一第一次擴增，其中調節細胞相當於取自軟骨細胞第一次擴增期間的非粘附細胞部分的細胞群，成熟軟骨細胞相當於同一軟骨細胞第一次擴增的粘附細胞群的一個或多個軟骨細胞傳代。或者，構想調節細胞群和軟骨細胞群或成軟骨細胞群的組合源自不同軟骨活檢或來自已被分為第一和第二部分的軟骨樣本，則調節細胞群優選從第一部分分離而軟骨細胞群優選從第二部分分離。根據本發明，在新鮮分離細胞群中出現的或在新鮮分離軟骨細胞第一階段擴增期間獲得的非粘附細胞群具有調節屬性，其在體外和體內均對軟骨生成均有特殊影響。因此本發明的其它方面涉及經識別的調節細胞群在軟骨生成和軟骨修復各方面的使用。本發明的調節細胞群的不同應用基於當與第二細胞群混合時其調整該第二細胞群軟骨細胞表型穩定性的能力。細胞群的軟骨細胞表型穩定性可通過將細胞群植入如WO0124833所述的裸鼠模型來測定。通常約5"06個早期傳代成軟骨細胞的細胞群能夠在2-3周內產生成熟軟骨株。如WO0124833所述，可使用分子標誌物預測該移植的結果，因此這些分子標誌物可指示細胞群的軟骨細胞表型穩定性。通常，一種或多種陽性標誌物(例如BMP-2禾n/或FGFR-3)的出現可一種或多種陰性標誌物(例如ALK-1)的空缺可用於識別軟骨細胞表型穩定的群。根據一方面，本發明提供保持、改善和/或恢復成軟骨細胞群的軟骨細胞表型穩定性的方法。在本發明的方法中，調節細胞群與成軟骨細胞群組合或混合。本發明文本中構想的成軟骨細胞群可以是選自下組的細胞群的一種或混合物新鮮分離軟骨細胞，經擴增傳代的軟骨細胞，間葉幹細胞(MSC)，或屬於骨軟骨系的前體細胞。在本發明方法中，調節細胞群中的細胞與成軟骨細胞群組合，其中調節細胞的相對數量通常介於1到75%，更特殊的在混合物細胞總數的10到50%。根據本發明，調節細胞群可與成軟骨細胞群組合，或以混合物的形式(輕柔混合細胞懸液以保證兩細胞群的完全混合)或以所謂軟骨球的形式，軟骨球代表成簇的軟骨形成細胞。因此，本發明提供了改善、恢復和保持新鮮分離軟骨細胞，經擴增傳代的軟骨細胞，間葉幹細胞或屬於骨軟骨系的前體細胞的軟骨細胞表型穩定性的方法。更具體地，本發明提供改善、恢復和保持經培養的軟骨細胞的軟骨細胞表型穩定性的方法，其中的培養可包括6到10次或更多次隨後的傳代。因此本發明的方法使調節細胞群(新鮮分離細胞群或是富集細胞群)和成軟骨細胞群任選地組合在一個組合物中。通常，當所得組合細胞群將用於移植時，兩細胞群都是自體的。或者，例如使用異種軟骨細胞或異種MSC與自體甚或同種異體調節細胞群組合也是可以考慮的。本發明一個具體方面涉及從軟骨活檢獲得具有改善的軟骨細胞表型穩定性的細胞群的方法。本發明的方法設想的改善可以是不同的途徑，但在體外或體內對軟骨生成和/或軟骨缺陷的重建有效。已證實接觸從具有本發明調節細胞群的標準單層培養獲得的軟骨細胞群，導致所得細胞群的軟骨細胞表型穩定性顯著改善，效果超過兩細胞群的加法效應。這種對軟骨細胞表型穩定性的正效應不僅己在第一或第二次傳代的軟骨細胞群觀察到，並且對已進行高次數傳代的顯示去分化徵象的細胞也有效。因此，根據本發明的這方面，提供了獲取改良的成軟骨細胞群的方法，例如用於ACT。這些方法基於兩個細胞群的組合，第一細胞群是用標準培養方法從軟骨活檢獲得的成熟軟骨細胞群，第二細胞群是調節細胞群，可如上文所述獲得。兩個細胞群可獨立地處理並在任何階段組合。調節細胞群對軟骨細胞群的調節效應使成熟軟骨細胞群的顯著增殖而不影響最終細胞治療劑的軟骨細胞表型穩定性成為可能。本發明另一具體實施方式涉及使用調節細胞群(如本發明的新鮮分離的軟骨細胞群或是富集的調節細胞群)恢復具有較低或減少的軟骨細胞表型穩定性的細胞群的軟骨細胞表型穩定性。雖然直接從外植組織(如軟骨活檢)衍生的初始細胞保持產生和分泌天然軟骨特徵性的細胞外組分，具體是II型膠原和硫酸蛋白聚糖，已知在體外單層擴增期間，成熟軟骨細胞去分化並失去其在體內形成透明軟骨的能力。本發明調節細胞群能夠改善或恢復那些已失去其穩定表型向前進一步傳代的細胞的軟骨細胞表型穩定性。此外或或者本發明調節細胞群能夠改善或恢復，由於疾病(如骨關節炎軟骨)或其它狀況所致不具有或軟骨細胞表型穩定性減低的軟骨細胞的軟骨細胞表型穩定性。一旦這樣的細胞群與本發明調節細胞群組合，所得細胞群的軟骨細胞表型穩定性得到恢復。例如用於移植目的時，由於對可用作細胞源供自體修復策略如ACT，或同種異體修復策略的組織設置較少限制，這是有益的。本發明的又一具體實施方式涉及使用調節細胞群引導軟骨細胞的18前體細胞朝形成軟骨的軟骨細胞發展更具體地，在本發明文本中，考慮諸如間葉幹細胞(MSC)的前體細胞或諸如WO0125402所述的CDMP-1正性前體細胞的軟骨細胞前體細胞。事實上，本發明證實，與本發明調節細胞群組合的千細胞，更具體是MSCs或骨軟骨系前體細胞被朝向產生軟骨的表型引導。間葉幹細胞(MSCs)能夠分化成不同的間葉系，包括脂肪和結締組織，骨，和軟骨。MSCs已在人出生後骨髓(BM)，外周血，骨膜，肌肉，脂肪組織和成人結締組織中檢出。也已證實許多胎兒組織包含MSCs，例如人妊娠首三月胎兒BM(骨髓)，肝臟，血液，以及第二三月期的BM，肝，肺，脾，胰，和腎。目前對於臨床，成人BM是最常用的MSC來源。本發明調節細胞群使多能性MSC分化成軟骨細胞系的能力，更具體是誘導軟骨樣表達模式的能力使MSC可用於軟骨的有效產生和/或再生成。並且，間葉幹細胞具有重要優點，即它們是調節免疫系統並減輕人類異體排斥程度的自更新細胞群。因此，由於間葉幹細胞使利用HLA-非匹配(同種異體)細胞修復或替換受損組織成為可能，其在再生性醫療領域具有重要潛力。因此本發明提供了修復細胞群的方法，該方法包括使本發明調節細胞群與自體或同種異體MSC組合。應理解上述改善、誘導或恢復軟骨細胞群或軟骨細胞前體細胞群的軟骨細胞表型穩定性的方法可以不同途徑實現。在具體實施方式中本發明調節細胞群與其它細胞群在對患者給藥前接觸。在一個實施方式中，給藥前l-30分鐘內多個細胞群接觸，但也需考慮接觸時間是達到1小時還是更多。任選地，細胞群可以是細胞懸液的形式接觸。或者被一起置於供移植的基質上。本發明的另一方面涉及使用本發明調節細胞群任選地與一個或多個成軟骨細胞群組合的軟骨的體外生產。事實上，在軟骨修復中在體外形成軟骨材料，隨後植入軟骨缺損，可能是有益的。這樣合成軟骨材料的優點是軟骨的生產可通過形態學、生物化學和分子特徵，在植入前進行監控。本發明調節細胞群既可單獨使用，或與成軟骨細胞群(選自新鮮分離軟骨細胞，經擴增的和任選的經傳代的軟骨細胞，MSC)組合用於在錨基依賴或非錨基依賴的培養系統中成軟骨細胞的擴增。對於後者，任選地與諸如軟骨細胞組合的調節細胞群的細胞可在瓊脂凝膠中克隆培養。或者，在另一錨基非依賴型方法中，任選地與諸如軟骨細胞組合的調節細胞群可在懸浮液培養基中克隆培養。在錨基依賴方法中，本發明調節細胞群與例如分離自原始組織並單層生長的成軟骨細胞群在二維或三維基質中組合以產生形成軟骨的結節。在其它方面，本發明提供了用作藥物的調節細胞群，以及包括該調節細胞群給予需要的患者的治療方法。更具體地說，認為通過調節細胞直接給藥至需要軟骨生成的缺陷處，該調節細胞群對骨軟骨缺陷的治療具有治療價值。通常本發明調節細胞將給藥到包含軟骨細胞的區域，最常見的是作為疾病或機械性缺損結果的不再能夠產生足夠量的透明軟骨的軟骨細胞。根據本發明的這方面，在植入軟骨缺損後，本發明調節細胞群對細胞群的軟骨細胞表型穩定性的改善或恢復發生在原位。再次，本發明的細胞可作為細胞懸液給藥或施於諸如基質的固體支撐物上。根據另一方面，本發明提供了組合物，即一個或多個調節細胞群(新鮮分離細胞群或是"富集後的形式")和一個或多個選自下組的成軟骨細胞群的混合物或組合新鮮分離軟骨細胞，經傳代的成熟軟骨細胞，間葉幹細胞或屬於骨軟骨細胞系的祖代細胞。如上文所示，與本發明調節細胞組合使用的成軟骨細胞或以穩定的軟骨細胞表表型或以不穩定的表型為特徵。這些混合物或組合物可用作藥物。本發明還提供包含本發明混合物和組合物的藥物組合物。因此，本發明通過給予本發明組合物或混合物為軟骨缺陷的治療提供了方法，以及本發明組合物或混合物在生產治療軟骨缺陷藥物中的對應的用途。涉及本發明調節細胞或單獨或與其它細胞群組合或混合給藥的治療方法包括但不限於關節(例如膝關節)的關節軟骨和半月軟骨的治療方法，體內其它部位的彈性軟骨、纖維軟骨或關節軟骨的其它治療(如椎間盤的修復，骨關節炎或風溼性關節炎的治療)。通常，在用於治療關節缺陷時，本發明的細胞群或組合物是注射在骨膜瓣下方，骨膜瓣被縫合以覆蓋軟骨缺陷。或者，本發明的細胞群或組合物用於浸透合成的載體基質，或接種到天然生物聚合物上然後植入軟骨缺陷。至今己使用多種生物聚合物，包括三維膠原凝膠(如美國專利號4,846,835)，重建的纖維蛋白-凝血酶凝膠(如美國專利號4,642，120;5,053,050和4,904,259)，合成聚合物基質包括聚酐，聚原酸酯，聚羥基乙酸和它們的共聚物(美國專利號5，041，138)，和透明質酸基聚合物。除了一個或多個細胞群，本發明文本所述藥物組合物常包括至少一種製藥學可接受的載體，該載體對本領域技術人員是眾所周知的，例如選自蛋白質如膠原和凝膠，碳水化合物如澱粉、多聚糖、糖(右旋糖，葡萄糖和蔗糖)，纖維素衍生物如羥甲基纖維素鈉鹽或鈣鹽、羥丙基纖維素或羥丙甲基纖維素，預糊化澱粉，果膠瓊脂，角藻膠，黏土，親水樹膠(阿拉伯樹膠、瓜爾膠、阿拉伯膠和黃原膠)，褐藻酸，褐藻鹽，聚羥基乙酸和聚乳酸，右旋糖苷，果膠，合成聚合物例如水溶性丙烯酸聚合物或聚乙烯吡咯垸酮，蛋白聚糖，硫酸鈣等。此外或或者，藥物組合物包括調節細胞群或還包括例如趨藥性因子或分化因子等因子的本發明組合細胞群。附圖簡述以下實施例並非試圖使本發明限制於所述具體實施方式，可組合所附示圖進行理解，其內容包括於此作參考，其中圖1顯示不同個體活檢的新鮮分離軟骨細胞(FI)、經擴增的單層軟骨細胞(P0)和本發明調節細胞群(NAC)的標誌物圖表(QS評分)。QS評分通過RT-PCR檢測的特有基因的表達水平的量化評估定義。高的評分與軟骨細胞表型穩定性增加相關。圖2顯示與新鮮分離軟骨細胞比較，不同個體活檢的單層擴增的軟骨細胞(PO)和本發明非粘附調節細胞群(NAC)中的一些標誌物表達的變化。所述標誌物是II型膠原(圖A)，聚集蛋白聚糖(圖B)和BMP-2(圖C)。圖3顯示體外調節細胞群的軟骨形成。圖4顯示軟骨細胞與不同數量本發明調節細胞群混合的混合細胞團培養物的體外軟骨形成(圖A)。圖A顯示包含IO，20或30%(富集)非粘附細胞群(NAC)的去分化軟骨細胞樣本的細胞團形成，證實隨著本發明調節細胞數量的增加細胞團形成的尺寸和機械穩定性顯著增加。圖B通過番紅O染色陽性證實，包含P4軟骨細胞的TGFP-剌激的細胞團與50%本發明的調節軟骨細胞混合能有效形成細胞外基質。圖5顯示II型膠原(圖A)和聚集蛋白聚糖(圖B)的表達特徵，分別為與30X調節細胞群(NAC)混合的P6軟骨細胞的TGFP-刺激的細胞團培養物(左)以及與30%P0軟骨細胞混合的P6軟骨細胞的TGF(3-刺激的細胞團培養物(右)，對照為相同組合物未經刺激的細胞團培養物。圖6顯示P4軟骨細胞(左)、P4軟骨細胞與30%(中)或50%調節細胞群(NAC)(右)的經TGFp-剌激的細胞團培養物的II/I型膠原比例。圖7顯示一60歲供體的去分化P6軟骨細胞與10%調節細胞群混合的異位軟骨形成。圖8顯示包含人滑膜(HSM)衍生的間葉幹細胞(MSC)以及間葉幹細胞與不同濃度調節細胞的細胞團培養物在TGFI3-剌激和非刺激條件下的II/I型膠原比例(每個樣本的數字指示MSC在MSC和調節細胞群混合物中的百分比)。圖9顯示根據本發明實施方式的從半月軟骨獲得的新鮮分離細胞群、PO的粘附性成熟軟骨細胞和調節細胞群(NAC)的I型膠原和II型膠原表達的比較圖。圖10顯示從半月軟骨獲得的調節細胞(NAC)經TGF(3-處理後的細胞團培養物中的纖維形成，與根據本發明實施方式的滑膜衍生幹細胞(HSM)的比較。A:包含100%滑膜衍生千細胞的細胞團；B:包含100X半月軟骨調節細胞群(NAC)的細胞團；C:包含70%半月軟骨調節細胞群(NAC)和30%滑膜衍生幹細胞的細胞團；D:包含50%半月軟骨調節細胞群(NAC)和50%間葉幹細胞(HSM)的細胞團。實施例實施例l:調節細胞的分離和特徵描述關節/半月活檢在無血清DMEM培養基和抗生素中切碎。隨後在組織中加入含0.1%膠原酶A的無血清DMEM培養基和抗生素溶液。酶反應在37'C培養箱轉動體中的試管中進行約12小時，以釋放來自活檢的單個細胞或細胞簇。通過離心收集細胞，隨後移至含血清和抗生素的DMEM培養基中。細胞培養在37'C含5%(302下進行。開始細胞培養4天後，如下更換培養基收穫培養上清液，在粘附性軟骨細胞部分加入新鮮培養基。通過在1500rpm離心10分鐘從細胞上清液收集鬆散粘附的和非粘附的細胞。然後將這些表型穩定的細胞冷凍或保存在培養瓶或經特殊處理的平板中，或直接在各種實驗程序/臨床應用(如下所述)中使用。在人體中發現這種圓型調節細胞群在不同組織來源的經消化的軟骨活檢中出現，包括關節軟骨和半月軟骨，不論年齡或疾病。在關節軟骨消化物中發現具有調節細胞的軟骨細胞亞群的存在濃度為接種細胞量的8-20%(表1)。在半月軟骨活檢中，發現非粘附細胞群約佔細胞總數的約5-20%。表1:從軟骨消化物獲得的非粘附細胞佔總細胞群的百分比。tableseeoriginaldocumentpage23經免疫組化分析非粘附細胞群證實，至少一部分非粘附細胞具有包含VI的細胞外基質。流式細胞計分析顯示了CD29、CD49e、CD51、CD54和CD56的表達。調節細胞群證實與軟骨表型穩定性相關的標誌物的異常表達曲線。通常，當關節軟骨細胞單層培養時它們失去其特徵性的表型。伴隨著朝多邊形甚至成纖維細胞形態轉變的是軟骨特異性細胞外基質基因表達的戲劇性降低。在第一次擴增期間非粘附調節細胞群不僅保持其圓形形態，並且與粘附的PO成熟軟骨細胞比較，這些細胞表型穩定軟骨的標誌物的表達曲線改善(在第一次擴增末期分析)(圖1)。由於新鮮分離軟骨細胞(FI)中調節細胞的出現保證表型穩定軟骨細胞標誌物的表達曲線得到改善優於粘附性PO成熟軟骨細胞，這些標誌物的表達低於經富集的調節細胞群(圖1)。所有分析證實，不論用來獲取軟骨的患者的年齡，本發明所述調節細胞群與PO軟骨細胞甚或新鮮分離(FI)軟骨細胞比較，顯示更高的QC評分。除了一個樣本(供體81歲，患嚴重OA)外的所有樣本，n型膠原表達率高於新鮮分離細胞(數據未示出)且明顯超過P0粘附性成熟軟骨細胞(圖2A)。聚集蛋白聚糖的表達率顯著超過P0粘附性成熟軟骨細胞(圖2B)和新鮮分離的軟骨細胞(數據未示出)。BMP-2表達率較P0粘附性成熟軟骨細胞高(圖2C)但低於新鮮分離的軟骨細胞(數據未示出)。實施例2:本發明調節細胞的軟骨形成能力約200,000個細胞的非粘附性調節細胞群(活檢CS225)在15ml圓錐型試管中以1500rpm離心並在軟骨生成誘導條件下成團培養。該培養基的配方如下含l:IOO抗生素的DMEM，1:IOO丙酮酸鈉，h100ITS+[BD生物科技公司(BDBiosciences)],1-7m的塞米松和1:100037.5mg/ml抗壞血酸。然後將試管蓋輕輕旋鬆，細胞培養在含5%C02的37'C條件下進行。細胞培養周期為2周，每2-3天更換培養基。在一些細胞團中還加入TGF-P。2周後，將細胞團用於組織學分析或提取RNA進行實時定量PCR。TGF(3刺激導致機械穩定的異常質地的成軟骨組織，通過石蠟包埋軟骨切片的細胞外基質的甲苯胺藍和番紅O異染性染色可得以證實(圖3)。這些數據證實本發明調節細胞群是本身表型穩定的軟骨細胞群，能夠產生高質量的軟骨。實施例3:調節細胞群能夠改善成熟軟骨細胞的軟骨細胞表型穩定混合細胞團的培養類似於上文實施例2所述的過程，但使用調節細胞和成熟軟骨細胞的組合。反覆傳代的軟骨細胞和不同數量(10%，20%，30%)的本發明調節細胞群(NAC)的TGF(3刺激的混合細胞團培養物兩周後進行觀察，顯示較單一去分化軟骨細胞更強的軟骨形成能力，細胞團尺寸的增加(圖4A)和番紅O異染性染色(圖4B)可以證實。本發明調節細胞群和70%P6軟骨細胞的組合誘導高質量的細胞外基質。包含調節軟骨細胞的混合細胞團培養物與使用P0軟骨細胞和P6軟骨細胞組合體的混合細胞團培養物比較可觀察到II型膠原和聚集蛋白聚糖表達顯著增加(圖5)。II型膠原I型膠原比率的顯著增加也反映了軟骨形成能力改善(圖6)。在II型膠原表達率增加之後觀察到I型膠原表達減少(圖6，中、右欄)。相反，純粹去分化的P4軟骨細胞的細胞團培養物不形成機械穩定的軟骨，在3D培養中只顯示受限的II型膠原重新表達率(圖6，左)。實施例4:裸鼠肌肉組織中表型穩定軟骨的生成本發明調節細胞群的重分化能力通過在裸鼠肌肉內注射後的異位軟骨形成證實。在該方法中將約3到4百萬細胞與HBSS培養基混合併以50微升容積注射入裸鼠股部。2-3周後處死動物，其股部肌肉用福馬林固定，包埋在蠟中並切片供組織學研究。當注射4百萬個由90%P6軟骨細胞和10%P0成熟粘附性軟骨細胞的組合構成的細胞後，未檢測到軟骨植入。然而，當注射相同數量的P6軟骨細胞與10X調節非粘附細胞(CS225-調節細胞/CS216P6)的組合後形成巨大軟骨植入物。甲苯胺藍及番紅O異染性染色證實該透明軟骨樣植入物質量優良(圖7)。實施例5:間葉千細胞朝成軟骨系的分化間葉千細胞與數量不等的調節細胞組合，置於如上文所述TGF卩刺激的混合細胞團培養物，或用於如上文所述裸鼠體內檢驗。通過培養70%間葉幹細胞和30%調節軟骨細胞的混合物，戲劇性地促進了分化為成軟骨系。通過測量II型膠原與I型膠原的表達評估軟骨細胞團的數量(圖8B)。結果顯示調節細胞通過增強II型膠原表達至相當高的水平，在促進分化成軟骨上優於最常使用的單一TGFP分化劑。實施例6:用自體或同種異體非造血幹細胞和自體或同種異體表型穩定軟骨細胞組成的組合細胞產品治療OA關節按實施例1收穫的自體或同種異體非粘附性細胞與經擴增的成熟軟骨細胞、人滑膜衍生的幹細胞、或其它來源的非造血幹細胞組合。非粘附性調節細胞與軟骨細胞前體細胞的組合形成具有組合治療活性的細胞產品，其中調節細胞引導幹細胞形成成軟骨系，而幹細胞可調節炎症反應。此組合細胞產品，能夠生成軟骨和調節炎症，在治療風溼性關節炎軟骨缺陷中具有特殊意義。實施例7:半月軟骨調節細胞群的分離和表徵通過如實施例1所述收集非粘附部分從半月軟骨樣本富集調節細胞群。測定調節細胞群的表達曲線。得自半月軟骨的調節細胞群以II型膠原表達率顯著高於對應的得自半月軟骨樣本的粘附性P0軟骨細胞群為特徵(圖9)。發現新鮮分離半月軟骨細胞的II型膠原低表達。相反，得自半月軟骨的經富集調節細胞群中I型膠原表達率降低。實施例8:得自半月軟骨的調節細胞群的纖維形成能力如實施例2所述使用得自半月軟骨的富集調節細胞群獲得細胞團培養物。發現半月軟骨調節細胞群的TGFP刺激細胞團培養物形成膠原纖維，提示該細胞群能夠整合入周圍組織(圖10，右上欄)。製備半月軟骨衍生的調節細胞群和滑膜衍生的幹細胞的混合細胞團培養物並用TGF卩刺激。觀察到半月軟骨調節細胞具有相對數量不等的膠原纖維出現(圖10，下欄)，而單一滑膜衍生幹細胞的細胞團培養物不形成膠原纖維(圖10，左上欄)。半月軟骨調節細胞的該特性在修復半月軟骨內部撕裂中尤其有益，對該疾病目前無治療方法(見下文)。實施例9:使用半月軟骨衍生的調節細胞群治療半月軟骨缺陷使用實施例1所述過程從半月軟骨樣本富集調節細胞群，並計細胞26數。然後將半月軟骨衍生調節細胞群與經擴增的人滑膜衍生幹細胞混合，任選地置於支撐物中，用於治療半月軟骨缺陷，甚至用於半月板的無血管區域。權利要求1.從分離的軟骨樣本富集調節細胞群的方法，所述方法包括以下步驟a)機械和/或酶處理分離的軟骨樣本以獲取獨立的細胞，b)將所述按步驟a)所獲獨立的細胞轉移至細胞培養容器使軟骨細胞以單層擴增，c)將所述容器置於合適的細胞培養條件中，從而獲得粘附細胞群和包含非粘附細胞群的上清液，d)至少2天後和/或當至少約30％匯合時從所述容器收集包含所述非粘附細胞群的所述上清液，e)從所述上清液收集相當於所述調節細胞群的所述非粘附細胞群。2.如權利要求l所述方法，其特徵在於，所述軟骨樣本是關節軟骨樣本。3.如權利要求l所述方法，其特徵在於，所述軟骨樣本是半月軟骨樣本。4.如權利要求1-3中任一項所述方法，其特徵在於，步驟(a)包括用膠原酶A處理分離的軟骨樣本。5.—種包含兩種或多種不同細胞群組合的組合物，該組合物包含a)—種包含調節細胞的細胞群，其為(i)得自軟骨活檢的新鮮分離的軟骨細胞群，或(ii)通過從得自軟骨活檢的新鮮分離的軟骨細胞的P0培養上清液收集非粘附細胞獲得的富集的調節細胞群b)選自下組的一種或多種細胞群經傳代軟骨細胞群，間葉幹細胞群，軟骨細胞前體細胞群。6.如權利要求5所述組合物，其包含富集的調節細胞群，其中所述富集的調節細胞佔組合物細胞總數中的相對量介於1-75。％。7.如權利要求5或6所述組合物，其特徵在於，所述細胞群包含從關節軟骨獲得的調節細胞。8.如權利要求5或6所述組合物，其特徵在於，所述細胞群包含從半月軟骨獲得的調節細胞。9.一種藥物組合物，其包含權利要求5到8中任一的組合。10.—種包含權利要求5到8中任一細胞組合的支撐物。11.權利要求5到8中任一組合在製備用於治療軟骨缺陷的細胞治療劑中的應用。12.—種治療軟骨缺陷的方法，所述方法包括給予具有所述軟骨缺陷的患者權利要求5到8中的任一組合。13.—種可通過權利要求1到4中任一方法獲得的非粘附性、非傳代調節細胞群，其作為藥物使用。14.一種治療軟骨缺陷的方法，所述方法包括給予具有所述軟骨缺陷的患者通過權利要求1到4中任一方法獲得的調節細胞群。15.—種藥物組合物，其包含通過權利要求1到4中任一方法得到的非粘附性、非傳代調節細胞群。16.—種非粘附性、非傳代調節細胞群在體外改善、保持或恢復經擴增或傳代的軟骨細胞群的軟骨細胞表型穩定性中的應用。17.—種非粘附調節細胞群在使間葉幹細胞體外分化為成軟骨系細胞中的應用。18.—種製備供ACT移植的細胞群的方法，所述方法包括以下步驟a)機械和/或酶處理分離的軟骨樣本以獲取獨立的細胞，b)將所述按步驟a)所獲獨立的細胞轉移至細胞培養容器使軟骨細胞以單層擴增，c)將所述容器置於合適的細胞培養條件中，從而獲得粘附細胞群和包含非粘附細胞群的上清液，d)至少2天後和/或當所述容器中達到至少約30%匯合時從所述容器收集包含所述非粘附細胞群的所述上清液，e)從所述上清液收集所述非粘附細胞。f)將步驟(e)所獲所述非粘附細胞群與成軟骨細胞群組合，所述成軟骨細胞群不是富集的調節細胞群。19.如權利要求18所述方法，其特徵在於，所述成軟骨細胞群是從所述分離的軟骨樣本得到的成熟軟骨細胞群，其中所述方法還包括以下步驟g)將所述步驟(c)所得粘附細胞群擴增和傳代，h)收集所述經擴增和傳代的粘附性細胞群，i)在步驟(f)中，將步驟(e)所獲所述非粘附細胞群與步驟(h)所獲所述經擴增和傳代的粘附性細胞群組合。20.如權利要求18或19所述方法，其特徵在於，步驟(a)中所述酶處理用膠原酶A實現。21.如權利要求18到20中任一所述方法，其特徵在於，所述分離的軟骨樣本是半月軟骨樣本。22.如權利要求18到21中任一所述方法，其特徵在於，所述成軟骨細胞群源於半月軟骨活檢。23.如權利要求18到21中任一所述方法，其特徵在於，所述成軟骨細胞群是間葉幹細胞群。24.如權利要求18或19所述方法，還包括以下步驟j)將步驟(f)或(i)所得所述組合的細胞群接種到支撐物上。全文摘要本發明涉及能夠恢復、保持或改善經擴增和傳代的軟骨細胞的穩定軟骨表型的調節細胞。該調節細胞還能引導前體細胞和幹細胞進入成軟骨系。富集的調節細胞群可通過在PO軟骨細胞單層培養的培養基中收穫非粘附性細胞得到。文檔編號A61L27/38GK101432419SQ200780015243公開日2009年5月13日申請日期2007年3月20日優先權日2006年3月20日發明者A·尼普爾,P·繆爾-麥克利奧德申請人:泰根尼克斯股份有限公司