用於卵巢癌早中期快速診斷試劑盒的製備方法
2023-10-26 06:48:17 3
用於卵巢癌早中期快速診斷試劑盒的製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種用於卵巢癌早中期快速診斷試劑盒的製備方法，包括的步驟如下：(1)抗原的製備：將半乳糖凝集素-3、轉甲狀腺素蛋白、癌抗原-125和人附睪蛋白4基因製得所需的抗原；(2)捕獲抗體的製備：將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的單克隆抗體；(3)檢測抗體的製備：將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的多克隆抗體；(4)捕獲抗體包被；(5)封閉和加樣。本發明的有益效果如下：最全面的檢測卵巢癌，能夠更好的判斷絕經前或絕經後盆腔腫塊的良惡性，更好地對婦科良性卵巢腫塊和囊腫與卵巢癌進行鑑別診斷，具有靈敏度高準確性強的特點，其靈敏度及準確性均達到96％以上。
【專利說明】用於卵巢癌早中期快速診斷試劑盒的製備方法
【技術領域】:
[0001]本發明涉及癌症診斷檢測用的試劑盒領域，具體為一種用於卵巢癌早中期快速診斷試劑盒的製備方法。
【背景技術】:
[0002]卵巢惡性腫瘤是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，是指生長在卵巢上的惡性腫瘤，其中90%~95%為卵巢原發性的癌。就診時60%~70%已為晚期，而晚期病例又療效不佳。因此，雖然卵巢癌的發病率低於宮頸癌和子宮內膜癌居婦科惡性腫瘤的第三位，但死亡率卻超過宮頸癌及子宮內膜癌之和，高居婦科癌症首位，是嚴重威脅婦女健康的最大疾
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[0003]由於卵 巢的胚胎發育、組織解剖及內分泌功能較複雜，早期症狀不典型，術前鑑別卵巢腫瘤的組織類型及良惡性相當困難，所以卵巢癌無論在診斷和治療上確是一大難題。到目前為止，就國內外臨床資料統計，其五年生存率僅25%左右。但是如果發現得早，90%的病人都能活下來；卵巢癌5年內的復發率可高達80%，且復發時間主要集中在治療期的3年內。在女性的一生中，每五位女性就會有一位出現盆腔腫塊,需要接受檢查來排除惡性腫瘤的可能性。目前，卵巢癌的診斷主要依據兩種檢測手段。一種是經陰道超聲檢查(TUV)。這種成像方法可用於檢查女性的生殖器官，包括子宮、卵巢、宮頸及陰道。儘管其應用較為普遍，但是這種方法並不能準確檢測出該腫塊是良性還是惡性。此外，該方法還需要經驗豐富的臨床技師對檢測結果進行解讀。另一種常規檢測方法是檢測腫瘤標誌物CA125，這種方法被視為卵巢癌診斷的「金標準」。但是，CA125的特異性及敏感度較低，容易出現假陰性或假陽性。大約50%的卵巢癌I期患者並沒有CA125水平升高的現象，也就是說有一半的卵巢癌患者可能被漏診。某些良性卵巢疾病也會導致CA125水平升高，造成假陽性。因此，在臨床診斷上亟需一種更好的診斷工具以儘早診斷卵巢癌。
[0004]腫瘤標誌物(tumor markers,TM)是指在腫瘤發生和增殖過程中，由腫瘤細胞本身合成、釋放，或由機體對腫瘤細胞反應而產生的標誌腫瘤存在和生長的一類物質。這些物質在正常成人中不存在或者是在癌症患者中出現的水平顯著高於正常人。目前腫瘤標誌物檢測技術被認為是早期發現無症狀微灶腫瘤的唯一途徑，這一檢測技術可先於X光片、超聲、CT、MRI或PET-CT等物理檢查發現腫瘤。可用於高危人群惡性腫瘤的篩查，腫瘤診斷與鑑別診斷，評估治療的效果，預測或監視腫瘤復發或轉移。目前，醫院出現的卵巢癌診斷試劑盒是檢測常見的腫瘤標記物，靈敏性及準確性都偏低，即使聯檢也只70%左右，難以滿足早期快速診斷的要求。
[0005]由於市場上還沒有針對卵巢癌的快速高效診斷試劑盒問世，嚴重影響到卵巢癌早期發現及治療，卵巢癌患者確診時往往已處於癌症晚期，錯過了最佳治療時機，大大降低了患者的生存率。如果卵巢癌能被早期診斷，可以極大地提高患者的生存率。
【發明內容】
:[0006]本發明的目的是針對以上述卵巢癌診斷存在的不足，提供一種靈敏度高，準確性強的用於卵巢癌早中期快速診斷試劑盒的製備方法。
[0007]為了實現本發明目的，本發明採取的技術方案是:用於卵巢癌早中期快速診斷試劑盒，包括捕獲抗體，所述捕獲抗體包括半乳糖凝集素-3、轉甲狀腺素蛋白(TTR)和癌抗原-125(CA-125)分別製得的單克隆抗體。
[0008]所述捕獲抗體還包括人附睪蛋白4(HE4)製得的單克隆抗體。
[0009]所述試劑盒還包括檢測抗體，所述檢測抗體包括半乳糖凝集素-3、轉甲狀腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125 (CA-125)和人附睪蛋白4(HE4)分別製得的多克隆抗體。
[0010]所述捕獲抗體為將半乳糖凝集素-3、轉甲狀腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125(CA-125)和人附睪蛋白4(HE4)克隆到真核表達載體，並在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化後得到相應的抗原，將所述抗原免疫哺乳動物得到的相應單克隆抗體。
[0011]所述捕獲抗體的製備方法包括的步驟如下:
[0012](I)抗原的製備:把半乳糖凝集素_3、轉甲狀腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125(CA-125)和人附睪蛋白4(HE4)基因克隆到真核表達載體，並在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化後得到抗原，此抗原也可作為標準品用；
[0013](2)捕獲抗體的製備:將上述抗原免疫哺乳動物，得到相應的單克隆抗體為捕獲抗體。
[0014]所述檢測抗體為將半乳糖凝集素-3、轉甲狀腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125(CA-125)和人附睪蛋白4(HE4)克隆到真核表達載體，並在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化後得到相應的抗原，將所述抗原免疫哺乳動物得到的相應多克隆抗體。
[0015]所述檢測抗體的製備方法包括的步驟如下:
[0016](I)抗原的製備:把半乳糖凝集素-3、轉甲狀腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125(CA-125)和人附睪蛋白4(HE4)基因克隆到真核表達載體，並在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化後得到抗原，此抗原也可作為標準品用；
[0017](2)檢測抗體的製備:將上述抗原免疫哺乳動物，得到相應的多克隆抗體為檢測抗體。
[0018]所述捕獲抗體預先包被於微量滴定板的孔內，可以簡化步驟，提高檢測效率。
[0019]用於卵巢癌早中期快速診斷試劑盒的製備方法，其包括以下步驟:
[0020](I)抗原的製備:將半乳糖凝集素_3、轉甲狀腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125(CA-125)和人附睪蛋白4(HE4)基因克隆到真核表達載體，並在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化後得到所需的抗原，其中，所述抗原也可作為標準品用；
[0021](2)捕獲抗體的製備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的單克隆抗體，所述單克隆抗體作為本試劑盒的捕獲抗體；
[0022](3)檢測抗體的製備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的多克隆抗體，所述多克隆抗體作為本試劑盒的檢測抗體；
[0023](4)捕獲抗體包被:
[0024]①.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液(pH9.6)將濃度為I μ g/ml的捕獲抗體包被微量滴定板的孔.封蓋微量滴定板並在4°C下孵育過夜.棄去包被液(碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液稀釋的捕獲抗體)，並用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入200 μ IPBST (磷酸鹽吐溫緩衝液)，在水槽上方輕輕甩動微量滴定板，除去洗滌液，在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩餘的液滴，晾乾放於4°C環境中備用。
[0025](5)封閉和加樣:每孔添加200 μ I封閉緩衝液(1.2% BSA/PBS)，封閉包被孔中剩餘的蛋白質結合位點。
[0026]本發明方法可以提高用於卵巢癌早中期快速診斷試劑盒的敏度高準確性強的特點，其靈敏度及準確性均達到96%以上。
[0027]用於卵巢癌早中期快速診斷試劑盒的檢測方法，其包括以下步驟:
[0028](I)抗原的製備:將半乳糖凝集素-3、轉甲狀腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125(CA-125)和人附睪蛋白4(HE4)基因克隆到真核表達載體，並在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化後得到所需的抗原；
[0029](2)捕獲抗體的製備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的單克隆抗體，所述單克隆抗體作為本試劑盒的捕獲抗體；
[0030](3)檢測抗體的製備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的多克隆抗體，所述多克隆抗體作為本試劑盒的檢測抗體；
[0031](4)捕獲抗體包被:
[0032]①.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液(pH9.6)將濃度為I μ g/ml的捕獲抗體包被微量滴定板的孔；
[0033]②.封蓋微量滴定板並在4°C下孵育過夜；
[0034]③.棄去包被液(碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液稀釋的捕獲抗體)，並用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入200 μ I PBST (磷酸鹽吐溫緩衝液)，在水槽上方輕輕甩動微量滴定板，除去洗滌液，在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩餘的液滴，晾乾放於4°C環境中備用。
[0035](5)封閉
[0036]①.在微量滴定板的每個孔添加200 μ I封閉緩衝液(1.2% BSA/PBS)，封閉包被孔中剩餘的蛋白質結合位點；
[0037]②.封蓋微量滴定板並在37°C下孵育至少I小時，優選的，孵育過夜；
[0038](6)加樣
[0039]①.將100 μ I的樣品添加到每個孔，在37°C下孵育60分鐘；要得到準確的定量結果，通常做法是比較未知樣品與標準曲線的信號。每個酶標板都必須測定標準品(兩重測定或三重測定)和空白樣，以確保準確性；
[0040]②.棄去樣品，並洗滌微量滴定板三次，每次在微孔中加入200 μ I PBST (磷酸鹽吐溫緩衝液)；
[0041]③.將100 μ I濃度為0.5 μ g/ml的檢測抗體添加到微量滴定板的每個孔；
[0042]④.封蓋微量滴定板並在37°C下孵育I小時；
[0043]⑤.用PBST洗滌微量滴定板四次；
[0044]⑥.添加100 μ I標記二抗；
[0045]⑦.封蓋微量滴定板並在37°C下孵育I小時。
[0046]⑧.用PBST洗滌微量滴定板四次。
[0047](7)檢測[0048]①.將TMB (3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺)溶液添加到每個孔，孵育15-30分鐘，添加等體積的終止液，然後在450nm處讀取光密度。
[0049]②.由系列稀釋液得到的數據繪製標準曲線，濃度標在X軸(對數標度)上，而吸光度標在Y軸(線性標度)上。通過內插法在此標準曲線上得出樣品濃度。
[0050]本發明從眾多的腫瘤標記物中，篩選出4個腫瘤標記物一半乳糖凝集素-3(Galectin-3)，轉甲狀腺素蛋白(TTR)，人附睪蛋白4 (HE4)及癌抗原-125 (CA-125)組成卵巢癌快速診斷試劑盒。其中，轉甲狀腺素蛋白(TTR)又被稱為前白蛋白(PA)，是一種由肝臟、脈絡叢和眼產生的蛋白，它與轉運甲狀腺素和維生系A代謝有關。在肝臟受到損傷的病人的血清中TTR的含量明顯降低。肝癌中TTR基因轉錄受阻，並在基因結構上存在缺陷。而且TTR對腫癌細胞的生長有明顯的抑制作用，因此TTR基因是一種抑癌基因。由於血漿中提取TTR產量低、步驟繁瑣，所以我們用基因工程分子克隆的方法可大量生產TTR研發本試劑盒。半乳糖凝集素-3(Galectin-3)是一種半乳糖結合蛋白，是Galectin家族中唯一具有嵌合結構的成員。半乳糖凝集素-3(Galectin-3)廣泛分布於腫瘤組織中，半乳凝素-3的表達同其腫瘤的侵襲和轉移密切相關。Galectin-3可與細胞表面糖基化的⑶98結合促使整合素在細胞表面聚集成簇，間接增強整合素與其配體的親和力；也能直接結合整合素α I β I和⑶I lb/18，正性或負性調節整合素的活性，影響整合素與細胞外配體的結合。Galectin-3還可以增加整合素在細胞表面的表達，並促進膠原在細胞間隔的分泌。由於半乳糖凝集素-3對多聚糖有親和力，它也可以直接結合糖基化的細胞外基質成分，介導細胞與基質的黏附。我們的研究顯示卵巢癌患者血清中Galectin-3水平明顯超過健康人群。人附睪蛋白4(HE4)是一種新的腫瘤標誌物。正常生理情況下，HE4在呼吸道、生殖系統和卵巢組織中有非常低水平的表達，但在很多卵巢癌組織和患者血清中高度表達。癌抗原-125 (CA-125或糖鏈抗原-125)，也被稱為粘蛋白_16，是被MUC16基因所編碼的蛋白質，是從上皮性卵巢癌抗原檢測出可被單克隆抗體0C125結合的一種糖蛋白。CA-125對卵巢癌的早期檢測的潛在作用是有爭議的，尚未廣泛用於在無症狀婦女篩選。使用CA-125這一生物標誌物的主要問題是它缺乏敏感性，特別是在檢測卵巢癌時其缺乏特異性，尤其是在絕經前婦女的早期階段。這些限制意味著，CA-125測試卵巢癌往往給人誤報，讓病人焦慮，從而做進一步不必要的篩選(有時包括手術)。此外，這些限制意味著，許多早期卵巢癌的婦女將收到來自CA-125檢測假陰性，並沒有得到自己的病情進一步治療。美國食品藥品監督管理局(FDA)批准的可用於臨床的卵巢癌血清標誌物包括CA125和HE4，兩者的聯合使用對卵巢癌的總體敏感性和特異性分別為76%和95%，但用於卵巢癌的早期診斷缺乏足夠的敏感性和特異性。
[0051]與現有技術相比，本發明的有益效果如下:最全面的檢測卵巢癌，能夠更好的判斷絕經前或絕經後盆腔腫塊的良惡性，更好地對婦科良性卵巢腫塊和囊腫與卵巢癌進行鑑別診斷，具有靈敏度高準確性強的特點，其靈敏度及準確性均達到96%以上。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0052]圖1是本發明用於卵巢癌早中期快速診斷試劑盒的原理圖；
[0053]圖2是本發明用於卵巢癌早中期快速診斷試劑盒在卵巢癌治療前後血中檢測到Galectin-3的變化對比圖；[0054]圖3是本發明用於卵巢癌早中期快速診斷試劑盒在卵巢癌治療前後血中檢測到TTR的變化對比圖；
[0055]圖4是本發明用於卵巢癌早中期快速診斷試劑盒在卵巢癌治療前後血中檢測到HE4的變化對比圖；
[0056]圖5是本發明用於卵巢癌早中期快速診斷試劑盒在卵巢癌治療前後血中檢測到CA125的變化對比圖。
【具體實施方式】
[0057]以下結合附圖和具體實施例對本發明用於卵巢癌早中期快速診斷試劑盒進行詳細的描述說明。
[0058]用於卵巢癌早中期快速診斷試劑盒，包括捕獲抗體，捕獲抗體封閉緩衝液，標準品，標記抗體，洗漆液及顯色液等。所述標記抗體選用HRP標記二抗。所述捕獲抗體包括半乳糖凝集素-3、轉甲狀腺素蛋白(TTR)和癌抗原-125(CA-125)分別製得的單克隆抗體；通過對半乳糖凝集素-3、轉甲狀腺素蛋白(TTR)和癌抗原-125(CA-125)的共同快速檢測，可以有效的提高檢測準確率和靈敏度，有效的克服單憑檢測癌抗原_125(CA-125)導致的不足。
[0059]所述捕獲抗體還包括和人附睪蛋白4(HE4)製得的單克隆抗體，通過檢測半乳糖凝集素-3、轉甲狀腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125 (CA-125)和人附睪蛋白4 (HE4)，使其靈敏度及準確性均達到96%以上，這個是現有試劑盒不可比擬的，可以快速準確的診斷卵巢癌，極大地提高患者的生存率。
[0060]所述捕獲抗體為將半乳糖凝集素-3、轉甲狀腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125(CA-125)和人附睪蛋白4(HE4)克隆到真核表達載體，並在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化後得到相應的抗原，將所述抗原免疫哺乳動物得到的相應單克隆抗體。
[0061]所述捕獲抗體的製備方法包括的步驟如下:
[0062](I)抗原的製備:通過分子克隆的方法把半乳糖凝集素_3、轉甲狀腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125 (CA-125)和人附睪蛋白4(HE4)基因克隆到真核表達載體，並在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化後得到抗原，此抗原也可作為標準品用；所述抗原的製備也可以使用現有常規方法製備，在此不再累贅。
[0063](2)捕獲抗體的製備:將上述抗原免疫哺乳動物，得到相應的單克隆抗體為捕獲抗體。所述哺乳動物是小鼠及兔子，優選小鼠。所述捕獲抗體的製備也可以使用現有常規方法製備，在此不再累贅。
[0064]所述檢測抗體包括半乳糖凝集素-3、轉甲狀腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125(CA-125)和人附睪蛋白4(HE4)分別製得的多克隆抗體。
[0065]所述檢測抗體為將半乳糖凝集素-3、轉甲狀腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125(CA-125)和人附睪蛋白4(HE4)克隆到真核表達載體，並在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化後得到相應的抗原，將所述抗原免疫哺乳動物得到的相應多克隆抗體。所述檢測抗體的製備方法包括的步驟如下:
[0066](I)抗原的製備:通過分子克隆的方法把半乳糖凝集素_3、轉甲狀腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125 (CA-125)和人附睪蛋白4(HE4)基因克隆到真核表達載體，並在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化後得到抗原，此抗原也可作為標準品用；
[0067](2)檢測抗體的製備:將上述抗原免疫哺乳動物，得到相應的多克隆抗體為檢測抗體。所述哺乳動物是小鼠及兔子，優選兔子。
[0068]其中，所述捕獲抗體可以預先包被於PVC材質的微量滴定板的孔內，可以簡化步驟，提高檢測效率。
[0069]用於卵巢癌早中期快速診斷試劑盒的製備方法，其包括以下步驟:
[0070](I)抗原的製備:通過分子克隆的方法將半乳糖凝集素_3、轉甲狀腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125 (CA-125)和人附睪蛋白4(HE4)基因克隆到真核表達載體，並在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化後得到所需的抗原，其中，所述抗原也可作為標準品用；
[0071](2)捕獲抗體的製備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的單克隆抗體，所述單克隆抗體作為本試劑盒的捕獲抗體；
[0072](3)檢測抗體的製備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的多克隆抗體，所述多克隆抗體作為本試劑盒的檢測抗體；
[0073](4)捕獲抗體包被:
[0074]①.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液(pH9.6)將濃度為I μ g/ml的捕獲抗體包被於微量滴定板的孔內；
[0075]②.用粘合塑料製品封蓋微量滴定板並在4°C下孵育過夜；
[0076]③.棄去包被液(碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液稀釋的捕獲抗體)，並用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入200 μ I PBST (磷酸鹽吐溫緩衝液)，在水槽上方輕輕甩動微量滴定板，除去洗滌液，在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩餘的液滴，晾乾放於4°C環境中備用；所述洗滌液為PBS(磷酸鹽緩衝液)中加入一定量的TWeen20，所述Tween20的質量百分比濃度為0.05% ;
[0077](5)封閉
[0078]①.在微量滴定板的每孔添加200 μ I封閉緩衝液(為含1.2% BSA (牛血清白蛋白)的PBS(磷酸鹽緩衝液))，用於封閉包被孔中剩餘的蛋白質結合位點；
[0079]②.用粘合塑料製品封蓋微量滴定板並在37°C下孵育至少I小時，優選的，孵育過夜。
[0080]用於卵巢癌早中期快速診斷試劑盒的檢測方法，其包括以下步驟:
[0081](I)抗原的製備:通過分子克隆的方法將半乳糖凝集素_3、轉甲狀腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125 (CA-125)和人附睪蛋白4(HE4)基因克隆到真核表達載體，並在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化後得到所需的抗原，其中，所述抗原也可作為標準品用；
[0082](2)捕獲抗體的製備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的單克隆抗體，所述單克隆抗體作為本試劑盒的捕獲抗體；
[0083](3)檢測抗體的製備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的多克隆抗體，所述多克隆抗體作為本試劑盒的檢測抗體；
[0084](4)捕獲抗體包被:
[0085]①.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液(pH9.6)將濃度為I μ g/ml的捕獲抗體包被微量滴定板的孔；
[0086]②.用粘合塑料製品封蓋微量滴定板並在4°C下孵育過夜；[0087]③.棄去包被液(碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液稀釋的捕獲抗體)，並用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入200 μ I PBST (磷酸鹽吐溫緩衝液，可以是含0.05%吐溫-20的pH值為7.4的磷酸鹽緩衝液)，在水槽上方輕輕甩動微量滴定板，除去洗滌液，在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩餘的液滴，晾乾放於4°C環境中備用；所述洗滌液為PBS (磷酸鹽緩衝液)中加入一定量的TWeen20，所述TWeen20的質量百分比濃度為0.05% ;
[0088](5)封閉
[0089]①.在微量滴定板的每個孔添加200 μ I封閉緩衝液(1.2% BSA/PBS)，封閉包被孔中剩餘的蛋白質結合位點；
[0090]②.用粘合塑料製品封蓋微量滴定板並在37°C下孵育至少I小時，優選的，在4°C下孵育過夜；
[0091](6)加樣
[0092]①.將100 μ I適當稀釋(稀釋20倍)的樣品添加到每個孔，在37°C下孵育60分鐘；要得到準確的定量結果，通常做法是比較未知樣品與標準曲線的信號。每個酶標板都必須測定標準品(兩重測定或三重測定)和空白樣，以確保準確性；
[0093]②.棄去樣品，並洗滌微量滴定板三次，每次在微孔中加入200 μ I PBST (磷酸鹽吐溫緩衝液)；
[0094]③.將100 μ I濃度為0.5 μ g/ml的檢測抗體添加到微量滴定板的每個孔；
[0095]④.用粘合塑料製品封蓋微量滴定板並在37°C下孵育I小時；
[0096]⑤.用PBST洗滌微量滴定板四次；
[0097]⑥.添加100 μ I標記二抗，其在使用前便已在PBS中稀釋10000倍(1:10000)。所述標記二抗可以為HRP標記羊抗兔。
[0098]⑦.用粘合塑料製品封蓋微量滴定板並在37°C下孵育I小時。
[0099]⑧.用PBST洗滌微量滴定板四次。
[0100](7)檢測
[0101]①.將TMB(3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺)溶液添加到每個孔，孵育15_30分鐘，添加等體積的終止液(2M H2SO4),然後在450nm處讀取光密度。
[0102]②.由系列稀釋液得到的數據繪製標準曲線，濃度標在X軸(對數標度)上，而吸光度標在Y軸(線性標度)上。通過內插法在此標準曲線上得出樣品濃度。
[0103]本發明用於卵巢癌早中期快速診斷試劑盒包括半乳糖凝集素_3、轉甲狀腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125 (CA-125)和人附睪蛋白4(HE4)四項指標中兩項同時升高作為診斷早中期卵巢癌的標準，檢測原理如圖1所示；半乳糖凝集素_3、轉甲狀腺素蛋白(TTR)、癌抗原-125(CA-125)和人附睪蛋白4(HE4)四項指標中兩項同時下降作為卵巢癌治療效果評估的標準。可以用於臨床上通過檢測血中3個腫瘤標記物水平的高低對卵巢癌的治療效果進行動態評估。另外還可以用於臨床上對卵巢癌的復發轉移及預後判斷的應用；也可用於肺癌早中期快速診斷。
[0104]近幾年本發明人一直從事半乳糖凝集素及其抑制劑與腫瘤相關的研究，取得了許多具有世界先進水平科研成果。半乳糖凝集素-3 (Galectin-3)正在成為新的研究熱點，世界很多實驗室都開始著手這方面的研究。很顯然，本發明人在這個領域的研究走在世界的前列。同時，發明人還對TTR與卵巢癌的相關性進行了研究，我們的研究表明Galectin-3對卵巢癌的敏感性和特異性分別為78.2%和82.6% ;TTR對卵巢癌的敏感性和特異性分別為65.5%和85.2%，見下表:
[0105]
【權利要求】
1.用於卵巢癌早中期快速診斷試劑盒的製備方法，其特徵在於.包括的步驟如下: (1)抗原的製備:將半乳糖凝集素-3、轉甲狀腺素蛋白、癌抗原-125和人附睪蛋白4基因克隆到真核表達載體，並在哺乳動物細胞中實現蛋白的表達，純化後得到所需的抗原； (2)捕獲抗體的製備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的單克隆抗體； (3)檢測抗體的製備:將上述抗原免疫哺乳動物得到相應的多克隆抗體； (4)捕獲抗體包被: ①.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液將濃度為I μ g/ml的捕獲抗體包被微量滴定板的孔；②.封蓋微量滴定板並在4°C下孵育過夜；③.棄去包被液，並用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入200 μ I PBST,除去洗滌液，除去剩餘的液滴，晾乾放於4°C環境中備用； (5)封閉和加樣:每孔添加200μ I封閉緩衝液，封閉包被孔中剩餘的蛋白質結合位點。
2.根據權利要求1所述的用於卵巢癌早中期快速診斷試劑盒的製備方法，其特徵在於:所述捕獲抗體預先包被於微量滴定板的孔內。
【文檔編號】G01N33/574GK103969437SQ201410164258
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年4月22日 優先權日:2014年4月22日
【發明者】餘躍飛, 羅喜平, 王曉娟 申請人:廣州恆泰生物科技有限公司