沉默DNMT基因的雙鏈siRNA分子及其應用的製作方法

2023-10-25 12:09:17 1

沉默DNMT基因的雙鏈siRNA分子及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及生物醫藥【技術領域】，具體涉及沉默DNMT基因的雙鏈siRNA分子及其應用，更具體地，本發明針對人腫瘤細胞DNMT基因的核苷酸序列設計合成siRNA，所述siRNA轉入肝癌細胞後能明顯促進免疫原性相關蛋白的表達。
【專利說明】沉默DNMT基因的雙鏈siRNA分子及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫藥【技術領域】，具體涉及雙鏈siRNA分子及其應用，更具體地，本發明針對人腫瘤細胞DNMT基因的核苷酸序列設計合成siRNA，所述siRNA轉入肝癌細胞後能明顯促進免疫原性相關蛋白的表達。
【背景技術】
[0002]DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)是催化DNA甲基化修飾的酶。具有催化甲基化功能的DNMTs有3種，分別為DNMTl、DNMT3a及DNMT3b [Plass, C.Cancerepigenomics.Human Molecular Genetics, 2002 ;11:2479-2488]。DNA 甲基化是調控免疫細胞的分化及功能表達。甲基化調節免疫分子和腫瘤抗原的表達與腫瘤的免疫原性和免疫反應性有明確的關係，因此，合理的去甲基化是克服免疫耐受和免疫逃逸的有效手段[Teitella, M., et al.DNA methylation in immune system.Clinical immunology, 2003 ；109:2-5]。
[0003]癌/睪丸抗原(cancer / testis antigen, CTA)是一種腫瘤相關抗原，目前已確定19個CTA家族的基因產物，均具有較強的免疫原性(如CT10(cancer / testislO)，有多個HLA-1 (human leukocyte antigen) I類抗原限制的免疫表位,體內外實驗證實能夠誘導功能性的淋巴細胞毒性反應，促進腫瘤的消退，在HCC患者的肝癌組織中，CTA表達非常高[Zhao L, et al.Progress and prospects in hepatocellular carcinoma surgery.Ann Chir, 1988 ；52:558-563]，因此針對CTA的抗腫瘤免疫治療符合肝癌及其其他腫瘤病人進行免疫的理想選擇[Chen YT., et al.A testicular antigen aberrant lye expressedin human cancers detected by autologous antibody screening.Proc Natl Acard SciUSA, 1997 ；94:1914-1918Korangy F., et al.Spontaneous tumor-specific humoral andcellular immune responses to `NY-ES0-1 in Hepatocellular carcinoma.Clin CancerRes, 2004；10:4332-43410h BK., et al.DNA me thyItransferase expression and DNAmethylation in human hepatocellular carcinoma and their clinicopathologicalcorrelation]。雖然已有報導稱，CTA和HLA基因的表達均受甲基化調控，通過抑制DNMT，可促進其表達[Guo ZS., et al.De novo induction of a Cancer / Testis Antigenby5_Aza-2』-Deoxycytidine Augments Adoptive Immunotherapy in a Murine TumorMode.Cancer Res.，2006 ；66:1105-1113]。但是在肝癌細胞中CTA,HLA是否受甲基化調控還不太清楚。
[0004]近來研究已經表明，在哺乳動物中小幹擾RNA RNA(SiRNA)能通過對生物學上保守結構的RNA進行幹擾，從而抑制靶基因表達。RNA幹擾作用(RNAi)技術被認為是一種最有效特異性下調祀基因表達的方法之一 [Noor1-Daloii MR., et al.Use of siRNA in knockingdown of dopamine receptors, a possible therapeutic option in neuropsychiatricdisorders.Molecular biology reports2012 ;39:2003-2010]。幹擾小 RNA (siRNA)是 RNA幹擾作用(RNAi)賴以發生的重要中間效應分子。siRNA是一類長約21~25個核苷酸(nt)的特殊雙鏈RNA (dsRNA)分子，具有特徵性結構，即siRNA的序列與所作用的靶mRNA序列具有同源性；siRNA兩條單鏈末端為5』端磷酸和3』端羥基。siRNA可作為一種特殊引物，RNA依賴RNA聚合酶(RdRp)作用下以靶mRNA為模板合成dsRNA，後者可被降解形成新的siRNA。新生的dsRNA反覆合成和降解，不斷產生新的siRNA，從而使靶mRNA漸進性減少，呈現基因沉默現象。
[0005]為了探究肝癌細胞中CTA和HLA基因表達是否受甲基化的調控，我們利用siRNA幹擾技術，沉默DNMT基因，檢測CTA和HLA在肝癌細胞中的表達情況，從而為恢復肝癌細胞的免疫原性提供新的治療手段。

【發明內容】

[0006]本發明的目的在於公開一種高效的針對DNMT基因的廣譜小分子幹擾RNA(siRNA),序列如下:
[0007]siRNAl:
[0008]正義鏈:5』-UCAGGAACGCGCACUGAAAtt-3』 (SEQ ID NO:1)，
[0009]反義鏈:5』-UUUCAGUGCGCGUUCCMGAtt-3』(SEQ ID NO:2)。
[0010]本發明的另一目的在於公開一種雙鏈siRNA分子組合物，該組合物包括上述siRNAl,還包括siRNA2和/或siRNA3 ;其中siRNA2包括正義鏈和反義鏈，siRNA2正義鏈的序列為:5』-CAGAUGUUCUUCGCUAAUAtt-3』 (SEQ ID NO:3)，siRNA2 反義鏈的序列為:5』-UAUUAGCGAAGAACAU CUGtt-3』(SEQ ID NO:4);其中 siRNA3 包括正義鏈和反義鏈，siRNA3正義鏈的序列為:5』-GAUCAGAGCCGAGAACAAAtt-3』 (SEQ ID NO:5)，siRNA3 反義鏈的序列為:5』-UUUGUUCUCGGCUCUGAUCtt-3』 (SEQ ID NO:6)。
[0011]本發明提供了雙鏈siRNA或雙鏈siRNA分子組合物在製備降低細胞DNMT基因表達試劑中的應用，優選地，DNMT是DNMT1、DNMT3a或DNMT3b。
[0012]本發明提供了雙鏈siRNA或雙鏈siRNA分子組合物在製備促進細胞CTA蛋白表達試劑中的應用，優選地，CTA蛋白是CT10。
[0013]本發明提供了雙鏈siRNA或雙鏈siRNA分子組合物在製備促進細胞HLA-1類蛋白表達試劑中的應用，優選地，HLA-1類蛋白是HLA-A、HLA-B或HLA-C。
[0014]優選地，本發明使用的細胞是腫瘤細胞。
[0015]體外實驗證明，本發明的siRNA分子的反義鏈可特異性地與DNMT基因的mRNA結合，降解mRNA，從而幹擾轉錄後的翻譯過程，進而促進DNMT蛋白調控的CTA和HLA蛋白的表達，增強免疫細胞的毒性反應，誘導腫瘤細胞的消退，達到治療腫瘤的目的。
[0016]本發明的有益效果是:本發明的siRNA分子可以應用於製備調節細胞中DNMT基因的藥物中發揮RNA幹擾的作用，增強免疫細胞的毒性反應，誘導腫瘤細胞消退，達到治療腫瘤的目的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1顯示了化學合成的siRNA對DNMT基因沉默效果的檢測結果，其中
[0018]圖1a顯示了利用QPCR檢測siRNA對DNMT基因的沉默效果，
[0019]圖1b顯示了利用免疫印跡檢測siRNA對DNMT基因的沉默效果，[0020]圖2顯示了利用免疫印跡檢測化學合成的siRNA對CTA基因表達的影響，
[0021]圖3顯示了化學合成的siRNA對HLA基因表達的影響，其中
[0022]圖3a顯示了利用QPCR檢測siRNA對HLA基因表達的影響，
[0023]圖3b顯示了利用免疫印跡檢測siRNA對HLA基因表達的影響，
【具體實施方式】
[0024]下面詳細描述本發明的實施例。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用於解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。
[0025]實施例1:化學合成的siRNA對DNMT基因沉默效果的檢測實驗
[0026]1.主要儀器、試劑和材料.[0027]1.1儀器:PCR儀(ABI公司)；實時定量PCR儀(Bio-Rad);細胞培養箱(Thermo)，凝膠成像儀(Alpha Innothech)等。
[0028]1.2材料和試劑:mRNA提取純化試劑盒(QIAGEN)，脂質體2000轉染試劑(Invitrogen), DMEM 培養基(Gibco), Oligo (dT) (Promega), M-MLV(Promega), Tap 酶(Takara)等。
[0029]2.合成 siRNA
[0030]在Genebank 中找到 DNMTl，DNMT3a, DNMT3b 的基因序列(NO:NM-001379, NO:NM-175629, NO:NM_006892)。由上海基凱生物公司設計及化學合成，每個基因設計一對siRNA序列，2.0OD (5nmol) *2隻，並有陽性對照β-actin的幹擾序列和陰性對照，如下:
[0031]siRNAl:
[0032]正義鏈:5，-UCAGGAACGCGCACUGAAAtt-3』(SEQ ID NO:1)，
[0033]反義鏈:5』-UUUCAGUGCGCGUUCCUGAtt-3』(SEQ ID NO:2)。
[0034]siRNA2:
[0035]正義鏈:5，-CAGAUGUUCUUCGCUAAUAtt-3』(SEQ ID NO:3)，
[0036]反義鏈:5，-UAUUAGCGAAGAACAUCUGtt-3』(SEQ ID NO:4)。
[0037]siRNA3:
[0038]正義鏈:5，-GAUCAGAGCCGAGAACAAAtt-3』(SEQ ID NO:5)，
[0039]反義鏈:5』-UUUGUUCUCGGCUCUGAUCtt-3』(SEQ ID NO:6)。
[0040]β -actin siRNA:
[0041 ]正義鏈:5』 -ACCAGGUGCUACGCUCAGAAAtt-3 』，
[0042]反義鏈:5』-UCUGACUACUGUGAG⑶CUtt-3，。
[0043]陰性對照(NC-siRNA)
[0044]正義鏈:5』-UUAAGUAGCUUGGCCUUGAtt-3，，
[0045]反義鏈:5』-UCAAGGCCAAGCUACUUAAtt-3 』。
[0046]3.沉默效率驗證
[0047]3.1細胞培養:肝癌細胞H印G2在含10% FBS的DMEM培養基中，37°C、5 % CO2培
養箱培養。
[0048]3.2細胞鋪板並轉染:將細胞按IXlO4 /孔接種到24孔細胞培養板中，在37°C、5% CO2培養箱細胞培養24小時，在無雙抗含10% FBS的DMEM培養基中，轉染按照脂質體轉染試劑2000(購自於Invitrogen公司)的說明書轉染，實驗分為未轉染組、陰性對照組和實驗組(80nM)，其中陰性對照組siRNA為通用對照siRNA，即NC-siRNA，與DNMT基因的序列無同源性，濃度為SOnM /孔。同時分別轉染。
[0049]3.3RT-PCR檢測DNMT基因mRNA水平:用mRNA提取純化試劑盒(TurboCapturemRNA kit)提取純化細胞RNA，操作按試劑盒說明書進行，用80 μ L無RNA酶水/孔溶解RNA，取 2 μ gRNA加入 0.6 μ LOligo (dT)，無菌DEPC水補充體積至 20 μ L, 70°C變性 IOmin。迅速插入冰冷至少5min ;冰上操作，加入以下試劑:6.Ομ L5*buffer,5.Ομ L2.5μΜ dNTPs,l.0yL RNasin (40U / μ L)和 1.0 μ L M-MLV，混勻後，短暫離心，37°C 孵育 lh，70°C 15min 中止反應，用基因特異性引物檢測樣本中DNMT mRNA表達水平，同時擴增看家基因β-actin作為內參對照(引物序列如表1所示)。每個反應做3個平行。建立如下25yL反應體系:1「14莫板。0嫩，0.54 1^ Tap E，各I μ L5』正反向引物(0.5 μ M)，2.5 μ L10*反應緩衝液，
2.5μ L dNTP(0.2mM)，用無RNA酶水補足體系至25yL。反應條件:95°C預變性lOmin，94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸45s，循環36次，充分延伸72°C IOmin0同等體積的各PCR樣品進行瓊脂糖膠電泳(膠濃度:1% )。其中DNMT基因的
[0050]結果分析--從RT-PCR電泳結果來看:經過RNA幹擾的H印G2細胞，在相應的組內，均有所降低，未處理組和模擬對照組的DNMT變化無明顯差異，數據未顯示。
[0051]3.4螢光實時定量PCR(QPCR)檢測DNMT基因mRNA水平:用基因特異性引物檢測樣本中DNMT mRNA表達水平(引物序列如表1所示)，同時擴增看家基因β -actin作為內參對照。每個反應做3個平行。建立如下25 μ L反應體系:1.0 μ L模板eDNA，各I μ L5』正反向引物(0.5yM)，1.0yL20XEver Green 1,0.5μ L Hotstar TapE(5U / μ L)，用無RNA酶水補足體系至25 μ L。反應條件:40°C反轉錄30min，95°C預變性5min，94°C變性20s，60°C退火45s，72。。延伸45s，循環40次，充分延伸72°C IOmin0
[0052]結果分析:以β-actin內參，用實時定量PCR2_""et法確定DNMT mRNA表達量，並作出柱狀圖，結果見圖la。如圖所示，縱坐標表示DNMT相對於β-actin的mRNA表達水平；橫坐標表示3個處理實驗組，其中「模擬轉染組」表示轉染濃度80nM NC-siRNA的陰性對照，其他兩組為siRNAl轉染實驗組，「siRNAl」表示單獨轉染一種DNMT幹擾RNA實驗組，「siRNAl+2+3」表示共轉染三種DNMT幹擾RNA實驗組，結果顯示本發明的siRNA對DNMT基因的沉默效果明顯。
[0053]3.5免疫印跡(western blot)檢測DNMT基因蛋白表達水平:按照3.2的方法轉染細胞後72小時，用細胞裂解液(150mM氯化鈉+1 % NP-40 (去垢劑)+0.1 % SDS (去垢劑)+2yg/ ml Aprotinin(蛋白酶抑制劑)(使用前加入)+2μ g / ml Leupeptin(蛋白酶抑制劑)(使用前加入)或ImM PMSF(蛋白酶抑制劑)+1.5mM EDTA(蛋白酶抑制劑 )+ImMNaVanadate (磷酸脂酶抑制劑))收集細胞，用BCA蛋白檢測試劑盒進行蛋白濃度的測定，各實驗組取50 μ g蛋白進行SDS-PAGE，轉膜，5%脫脂奶粉封閉，分別加入DNMTl抗體、DNMT3a抗體、DNMT3b抗體進行檢測，以管家蛋白Tubulin為內參，觀察DNMT蛋白的表達情況。
[0054]結果分析:使用western blot的方法檢測各實驗組DNMT的表達水平，DNMTl為一 190kDa的雙帶，與抗體說明書的描述一致，在有DNMTl幹擾的組中均有明顯降低，尤其在DNMTl+3a+3b組中降低的幅度更明顯；在模擬轉染組中則無降低。DNMT3a和DNMT3b的表達情況與DNMTl類似，在有DNMT幹擾的組中，無相應的條帶，說明本發明設計的DNMT幹擾RNA能明顯的降低DNMT蛋白的表達水平，三種DNMT幹擾RNA混合效果更明顯(圖1b)。
[0055]實施例2 =DNMT基因沉默對CTA基因表達的影響
[0056]1.RT-PCR檢測CTA基因轉錄水平的變化
[0057]1.1主要儀器、試劑和耗材同實施例1
[0058]1.2RT-PCR實驗步驟同實施例1 (相應的引物序列見表1)
[0059]結果分析:在H印G2細胞中，使用脂質體SiNRA幹擾DNMT基因後，可見CTlO和SSXl兩個基因在SiRNAl組和混合幹擾組(siRNAl+2+3)中有不同程度的再表達，在為未處理組和模擬轉染組則無相應條帶(數據未顯示)。MAGE-1和MAGE-3在各組中均無明顯變化。NY-ES0-1也無明顯變化，其餘三種CTA、CTpll、SCPl和SSX4未檢測到表達(數據未顯示)O
[0060]1.3螢光實時定量PCR(QPCR)實驗步驟同實施例1 (相應的引物序列見表1)
[0061]結果分析:QPCR檢測顯示，MAGEl無明顯變化。CTlO和SSXl的再表達趨勢明顯(數據未顯示)。
[0062]2.Western blot檢測CTA基因蛋白表達水平的變化
[0063]Westernblot的步驟同實施例1，利用抗體為CTA蛋白中的CTlO蛋白抗體。
[0064]結果分析:CT10蛋白的表達和RT-PCR的結果一致，在siRNAl組有明顯的再表達，在混合幹擾組(siRNAl+2+3)表達的效果更明顯(圖2)。
[0065]上述結果表明，siRNAl組`促進了 CTA分子中的CTlO蛋白和SSXl的表達，混合幹擾組(siRNAl+2+3)效果更明顯。
[0066]實施例3 =DNMT基因沉默對HLA基因表達的影響
[0067]1.RT-PCR檢測HLA基因轉錄水平的變化
[0068]1.1主要儀器、試劑和耗材同實施例1
[0069]1.2RT-PCR實驗步驟同實施例1 (相應的引物序列見表1)
[0070]結果分析:在H印G2細胞中，使用脂質體siNRA幹擾DNMT基因後，可見HLA-1類分子中的HLA-A、HLA-B、HLA-C基因在siRNAl組和混合幹擾組(siRNAl+2+3)中有不同程度的再表達，HLA-1I類分子和CIITA基因均無條帶，數據未顯示。
[0071]1.3螢光實時定量PCR(QPCR)實驗步驟同實施例1 (相應的引物序列見表1)
[0072]結果分析:以模擬轉染組三種HLA-1類分子的相對表達為I。在siRNAl組和混合幹擾組(siRNAl+2+3)中，HLA-A的相對表達度分別為5和8 ；HLA-B的相對表達度分別為
2.5和6 ；HLA-C的相對表達度分別為30和45 (圖3a)。
[0073]2.Western blot檢測HLA基因蛋白表達水平的變化
[0074]Western blot的步驟同實施例1，利用抗體為HLA-1類蛋白抗體。
[0075]結果分析=HLA-1類蛋白的表達和RT-PCR的結果一致，在siRNAl組有明顯的再表達，在混合幹擾組(siRNAl+2+3)再表達的效果更明顯(圖3b)。
[0076]上述結果表明，siRNAl組促進了 HLA-1類分子表達，混合幹擾組(siRNAl+2+3)效果更明顯。
[0077]實施例4 =CTA和HLA的啟動子甲基化狀態的檢測
[0078]1.儀器:PCR 儀(ABI 公司)，凝膠成像儀(Alpha Innothech)[0079]2.材料和試劑:DNA提取試劑盒(QIAGEN)，純化柱(Promega)，Tap酶(Takara)等。
[0080]3.實驗步驟
[0081]3.1DNA提取:利用DNA提取試劑盒(QIAGEN)按照說明書上的步驟提取細胞總DNA。
[0082]3.2DNA修飾:取1-10 μ gDNA,溶解於18 μ L無菌水中，95°C水浴變性20min，冰浴；加入3M氫氧化鈉2 μ L (混勻，脈衝離心)，42°C水浴變性20min，配製5M亞硫酸氫鈉處理液(每份樣品0.5ml,以配製4mI為例):取1.9g亞硫酸氫鈉加入2.5ml無菌水中，加入2M氫氧化鈉0.7ml，加入IM對苯二酚(IlOmg / ml) 0.5ml，50°C水浴，反覆倒置直至完全溶解；向上述20 μ L DNA變性液加入新鮮配製的5Μ亞硫酸氫鈉處理液380 μ L (混勻，脈衝離心)；加入200 μ L石蠟油以防蒸發，50°C水浴12-16h ；
[0083]3.3DNA純化除鹽:安裝DNA純化柱，標記；將上述處理的樣本加入純化柱(Promega)內，真空抽吸；加入80%異丙醇洗漆二次；12000rpm離心,去除殘留液體；將0嫩洗脫到50 μ L無菌水中(801:7欠，801:溫浴51^11，離心)；加入3Μ氫氧化鈉lyL，37°C水浴15min ;加入5M醋酸銨166 μ L ;加入2.5倍體積的無水乙醇，_70°C沉澱0.5_lh ； 1000Orpm離心20min，棄上清；70%乙醇200 μ L洗沉澱，離心20min，棄上清；將DNA溶解於30-50 μ LTE緩衝液中，-20°C保存。
[0084]3.4甲基化PCR反應
[0085]3.4.1引物設計=HLA-1類分子的甲基化引物序列參照Nie等[Nie Y.，et al.DNAhypermethylation is a mechanism for loss of expression of HLA CTAss I genes inhuman esophageal squamous cell carcinomas.Carcinogenesis,2001 ;22:1615-1623]的文獻的引物和反應體系。MAGE引物序列參考Honda等[HondaT.，et al.Demethylationof MAGE promotors during gastric cancer progression.British Journal ofcancer, 2004 ；90:838-843]文獻。CTlO 的甲基化引物自行設計，從 www.genecards.0rg 網站下載CTlO基因的第一外顯子前1000bp序列以及第一外顯子本身共計1190bp ;進入www.methprimer.com,,複製這段序列,選擇MSP引物，即在線輸出5對甲基化和非甲基化引物。選擇第一對甲基化和非甲基化引物進行實驗(引物序列見表2所示)。
[0086]3.4.2配製反應體系
[0087]向200yL PCR管中加 入以下成分，並混勻。
[0088]
【權利要求】
1.一種雙鏈SiRNA分子，其特徵在於，具有下述核苷酸序列的正義鏈和反義鏈組成:
正義鏈:5』-UCAGGAACGCGCACUGAAAtt-3』 (SEQ ID NO:1),
反義鏈:5』 -UUUCAGUGCGCGUUCCUGAtt-3』 (SEQ ID NO:2)。
2.一種雙鏈SiRNA分子組合物，其特徵在於，所述的組合物包含權利要求1所述的SiRNA0
3.權利要求2所述的siRNA分子組合物，其特徵在於，所述的siRNA分子組合物還包括siRNA2和/或siRNA3 ;其中所述的siRNA2包括正義鏈和反義鏈，siRNA2正義鏈的序列為:5』 -CAGAUGUUCUUCGCUAAUAtt-3』 (SEQ ID NO:3)，siRNA2 反義鏈的序列為:5』 -UAUUAGCGAAGAACAUCUGtt-3』 (SEQ ID NO:4);其中所述的 siRNA3 包括正義鏈和反義鏈，siRNA3 正義鏈的序列為:5』 -GAUCAGAGCCGAGAACAAAtt-3』 (SEQ ID NO:5)，siRNA3 反義鏈的序列為:5』-UUUGUUCUCGGCUCUGAUCtt-3』 (SEQ ID NO:6)。
4.權利要求1-3中任意一項所述的雙鏈siRNA或雙鏈siRNA分子組合物在製備降低細胞DNMT基因表達試劑中的應用。
5.權利要求1-3中任意一項所述的雙鏈siRNA或雙鏈siRNA分子組合物在製備促進細胞CTA蛋白表達試劑中的應用。
6.權利要求1-3中任意一項所述的雙鏈siRNA或雙鏈siRNA分子組合物在製備促進細胞HLA-1類蛋白表達試劑中的應用。
7.權利要求4中所 述的應用，其特徵在於，所述DNMT是DNMTl、DNMT3a或DNMT3b。
8.權利要求5中所述的應用，其特徵在於，所述CTA蛋白是CT10。
9.權利要求6中所述的應用，其特徵在於，所述HLA-1類蛋白是HLA-A、HLA-B或HLA-C。
10.權利要求2至5中任一項所述的細胞，其特徵在於，所述細胞是腫瘤細胞。
【文檔編號】A61K48/00GK103757021SQ201410021188
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月17日 優先權日:2014年1月17日
【發明者】肖文華, 董偉偉 申請人:肖文華