人胚胎神經幹細胞的培養擴增方法

2023-10-25 23:39:42 1

專利名稱：人胚胎神經幹細胞的培養擴增方法
技術領域：
本發明專利涉及一種人胚胎神經幹細胞的體外培養方法，尤其是獲得足夠數量的神經幹 細胞和神經前體細胞，用於中樞神經系統損傷和退行性疾病細胞移植臨床治療。
背景技術：
目前，尚未發現有相關方面的報導，中樞神經系統損傷和退行性疾病細胞移植臨床治療 還存在很大的風險，甚至無法治療。

發明內容
為了克服中樞神經系統損傷和退行性疾病細胞移植等臨床治療上的難題，本發明專利提 供了一種人胚胎神經幹細胞的體外培養方法。它能夠有效的解決中樞神經系統損傷和退行性 疾病等神經疾病細胞移植臨床治療中存在的風險，使其安全、高效的進行治療成為可能。
本發明專利解決其技術問題所採用的技術方案是取8~12周齡流產胎兒全腦，用含DNA (0.01%)的胰籌消化製成單細胞懸液，接種於25毫升無菌培養瓶中，用含EGF， b-PGF， B27 等一系列神經營養因子培養並傳代至20^,動態觀察神經幹細跑克隆球的形成及生長過程。 用nestin (巢蛋白)、tubulin (微管蛋白)、MSE《神經元特異性烯醇酶)、GFAP (神經膠 質酸性蛋白)多種抗體作免疫細胞化學染色，對陽性細胞進行形態學鑑定，結果神經幹細胞 呈球形，不直接貼附於培養皿，僅粘著在首先貼壁的扁平基底細鹿上，逐漸分裂聚集形成克 隆球，隨著細胞傳代次數的增加，克隆球逐漸分裂出新細胞又分裂形成新的克隆球，並以此 循環，球內細跑nestin、 tubulin免疫細胞化學染色陽性。
本發明專利的有益效果是，培養中的成熟細胞隨著傳代的增加逐漸凋亡，此時所有的細 胞都可以作為治療中樞神經系統疾病的種子細胞，從而使中樞神經系統疾病細胞移植的臨床 治療成為可能。
具體實施例方式
(1) 收集婦產科流產和引產的無明顯發育障礙的胚胎。
(2) 試劑MEM/F12 (Gibco) ， B27 (Gibco) ， EGF (PEH OTEni) PGF (PEPR0TmO L-穀氨醯胺(Sigma)膠原蛋白酶(Sigma)。
(3) 沿死亡胚胎眉弓上開顱，獲取腦組織放入1UEM/F12中清洗數遍以洗去腦組織上的血 液，剪碎後加入少量的基礎培養基，用彎頭吸管將剪碎的組織移入15毫升離心管中，加5毫 升基礎培養基，用粗彎頭吸管上下吹打使之成為組織懸液，離心5fflin 1000轉棄上清；如此 重複2次，加入含DNA (0.01*)的胰醣，用吸管吹勻，放入371C水浴鍋中，消化15min後用 吸管輕輕吹打靜置吸出上清，加入(含10%胎牛血清)D/F12的離心管中，如此重複3 次可以將組織消化為單細胞懸液，將消化終止後的懸液收集一起離心，D/F12清洗3次，用 內含表皮生長因子的條件培養基傳代培養。
(4) 第一代細胞貼壁生長，發出突出，進而連接成片長滿整個培養瓶。此時傳代第二代:
第一代產生的細胞球粘著在首先貼壁的扁平基底細胞上，逐漸分裂聚集形成克隆球，細胞鋪
滿瓶時傳代，如此反覆進行細胞傳代，傳至20代細胞基本處於穩定的分裂狀態。
(5) 培養中的成熟細胞隨著傳代的增加逐漸凋亡，此吋所有的細胞都可以作為治療中樞神 經系統疾病的種子細胞。
權利要求
1. 一種人胚胎神經幹細胞的體外培養方法，其特徵是獲得足夠數量的神經幹細胞和神經前體細胞，用於中樞神經系統損傷和退行性疾病細胞移植臨床治療。
2. 根據權利要求1所述的人胚胎神經幹細胞的體外培養方法，其特徵是取8 12周齡流產 胎兒全腦，用含WA (0. 01%)的胰嗨消化製成單細胞懸液，接種於25毫升無菌培養瓶中， 用含EGF， b-FGF, B27等一系列神經營養因子培養並傳代至20代，動態觀察神經幹細胞 克隆球的形成及生長過程。用nestin (巢蛋白)、tubulin (微管蛋白)、NSE (神經元 特異性烯醇酶)、GFAP (神經膠質酸性蛋白)多種抗體作免疫細瓶化學染色，對陽性細 胞進行形態學鑑定。
3. 根據權利要求l所述的人胚胎神經幹細胞的體外培養方法，其特徵是它的應用範圍很廣 泛，包括臨床治療應用和基礎研究應用領域。
全文摘要
一種人胚胎神經幹細胞的體外培養方法，通過收集婦產科流產和引產的無明顯發育障礙的胚胎的全腦利用含DNA(0.01％)的胰酶消化製成單細胞懸液，接種於25毫升無菌培養瓶中，用含EGF，b-FGF，B27等一系列神經營養因子培養並傳代至20代來進行人胚胎神經幹細胞的體外培養，使其大量擴增，獲得足夠數量的神經幹細胞和神經前體細胞，用於中樞神經系統損傷和退行性疾病細胞移植臨床治療。
文檔編號A61P25/00GK101531995SQ20081008494
公開日2009年9月16日 申請日期2008年3月10日 優先權日2008年3月10日
發明者黃紅雲 申請人:北京市虹天濟神經科學研究院