HIV-gag基因遺傳密碼子優化及愛滋病疫苗的製備方法與應用的製作方法

2023-10-05 19:04:19

專利名稱：HIV-gag基因遺傳密碼子優化及愛滋病疫苗的製備方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及Hiv-gag基因遺傳密碼子優化及愛滋病疫苗的製備方法與應用。
背景技術：
自1981年發現首例愛滋病病例以來，全世界現已有3340萬人患病，並且正以每天7400人的速度增長，去年因愛滋病及相關疾病死亡的人數就有200萬。由此可見愛滋病的傳播和流行已經對人類健康構成了巨大的威脅，對經濟和社會的發展造成了嚴重的危害。雖然國際社會為防治愛滋病付出了積極的努力，防治工作也有所進展，但愛滋病在全球範圍內的傳播仍未得到有效的控制。在90年代後亞洲取代非洲成為愛滋病增長最快的區域，我國愛滋病的流行也自1994年後進入快速增長期，存在多種愛滋病亞型流行。截至 2009年10月底，我國累計報告愛滋病毒感染者和愛滋病人的人數達到319877名，其中病人 102233名，死亡人數49845人，如果不加快控制，估計到2010年愛滋病的人數會達到1000 萬人。這場「超級瘟疫」給人類帶來了可怕的災難，消耗了巨大的衛生資源，造成了沉重的經濟負擔，同時引發了救治關懷患者，照顧孤兒寡老，消除社會危害和維護群眾健康等一系列社會問題。我國過去採取的宣教和行為幹預政策雖然對愛滋病的傳播控制起到了一定的作用，但僅憑這些措施並不能有效地控制愛滋病的傳播。縱觀人類控制傳染病的歷史，可以得到一個重要的啟示，即疫苗仍是控制傳染病最有力、最經濟的武器。所以研製開發系列具有自主智慧財產權的愛滋病疫苗刻不容緩。近20年以來很多國家都進行了愛滋病疫苗的開發研究並進行了大量的臨床試驗。由於研究資源、資金、免疫原性等因素多數疫苗僅進入了 I期臨床試驗，已進入II期臨床試驗的疫苗包括重組蛋白亞單位疫苗、非複製型痘病毒疫苗、DNA疫苗、腺病毒載體疫苗等，僅有蛋白亞單位疫苗單獨免疫和與重組金絲雀痘病毒愛滋病疫苗聯合免疫方案進入了 III期臨床試驗。2003年2月VaxGen公司宣布其研製的蛋白質亞單位愛滋病疫苗在經歷了 3年的III期臨床試驗宣告失敗。由Sanofi-Pasteur公司研製的ALVAC愛滋病疫苗已經進行了多項臨床試驗，以表達HIV-I膜蛋白的ALVAC疫苗臨床實驗，由於70%的接種者不能產生足夠強的細胞免疫反應，NIH終止了美國進行的III期臨床試驗計劃。Merck公司及美國NIH疫苗研究中心聯合開發的以非複製型腺病毒作為載體的愛滋病疫苗在進行II 期臨床試驗時也宣告了失敗。美國軍隊在泰國進行的III期臨床試驗與2009年10宣布令世界振奮的消息免疫組和對照組相比有31%的保護效果，雖然相關的數據還待進一步的分析，但依然讓人們看到了愛滋病疫苗研究的曙光。目前我國愛滋病疫苗研究雖讓取得了一些成績，但從整體上來說在國際上影響力有限。愛滋病疫苗的研究策略大體經過了三個階段開始的時候主要利用外殼相關蛋白或者肽誘導機體的體液免疫；後來越來越重視核心蛋白誘導的細胞免疫；現在則重視體液免疫和細胞免疫相結合的策略。=疫苗本身也從最初的蛋白疫苗、多肽疫苗，變成現在各種病毒載體，DNA載體以及蛋白疫苗相結合的免疫策略。但是病毒載體存在安全性的問題，DNA載體又存在免疫效果差的缺點。愛滋病疫苗研究的當務之急是開發安全有效的疫苗載體， 研製具有誘導持久細胞免疫應答及高效特異抗體產生兩種作用疊加的疫苗。小環DNA載體是一種新型的非病毒基因載體，與質粒載體相比，小環DNA載體僅含有外源基因的表達盒，不包括來自細菌質粒的骨架結構。最新的研究表明，外源基因表達盒與細菌質粒骨架之間的共價連接會導致外源基因的沉默，這是造成質粒載體所攜帶的外源基因在體內只能瞬時表達的主要原因，也是質粒載體臨床應用的主要限制因素。由於不含有來自細菌質粒的骨架結構，小環DNA所攜帶的外源基因可在體內高效表達，其表達效率較質粒載體高10-100倍，且持續表達的時間可長達數月。去除了細菌骨架的小環DNA不含有原核DNA的CpG序列，因此不會引起機體針對基因載體的免疫反應，提高了載體的安全性。此外，小環DNA明顯小於質粒載體，這提高了它在胞外和胞內的生物利用度，從而提高了轉染效率。愛滋病病毒基因組是兩條相同的正義RNA，每條RNA長約9. 2-9. 81Λ。兩端是長末端重複序列(long terminal r印eats，LTR)，含順式調控序列，控制前病毒的表達。已證明在LTR有啟動子和增強子並含負調控區。LTR之間的序列編碼了至少9個蛋白，可分為叄類結構蛋白、調控蛋白、輔助蛋白。gag基因能編碼約500個胺基酸組成的聚合前體蛋白， 經蛋白酶水解形成P17，P24核蛋白，使RNA不受外界核酸酶破壞。

發明內容
本發明的目的是提供HIV-gag基因遺傳密碼子優化及愛滋病疫苗的製備方法與應用。本發明提供的優化後的gag基因為序列表中序列2自13至1515位核苷酸所示的 DNA分子。含有所述DNA分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌均屬於本發明的保護範圍。所述重組載體可為在pShuttle的多克隆位點插入所述DNA分子得到的重組質粒。所述重組載體具體可為重組質粒pShuttle-gag ；所述重組質粒pShuttle-gag為在質粒pShuttle的)(ba I和Not I酶切位點之間插入所述DNA分子得到的重組質粒。所述重組載體具體可為按如下方法構建得到的重組質粒p2c5C31-gag (1)用限制性內切酶Spe I和EcoR I雙酶所述重組質粒pshuttle-gag，回收2. 5kb 的片段；(2)用限制性內切酶Spe I和EcoR I雙酶切質粒pBS_T，回收3. Okb的片段；(3)將步驟⑴回收的片段和步驟(2)回收的片段連接，得到重組質粒 pBS-T-gag ；(4)用限制性內切酶Spe I和XhoI雙酶切重組質粒pBS-T-gag，回收2. 5kb的片段；(5)用限制性內切酶Spe I和Xho I雙酶切質粒ρ2Φ(:31，回收Ilkb的片段；(6)將步驟(4)回收的片段和步驟(5)回收的片段連接，得到重組質粒 p2C>c31-gag0所述重組載體優選序列表的序列4所示的質粒。
所述重組載體還可為重組質粒minicircle-gag ；所述重組質粒minicircle-gag 為將重組菌用阿拉伯糖進行誘導得到的；所述重組菌是將所述重組質粒p2c5C31-gag導入宿主菌得到的。所述宿主菌優選為大腸桿菌T0P10。用於進行所述誘導的阿拉伯糖的終濃度優選為1.5% (質量百分含量，w/w)。所述重組質粒minicircle-gag優選為序列表的序列4自5，末端第4319至6915位核苷酸所示的質粒。所述DNA分子、任一所述重組載體(pShuttle-gag、p20c31_gag或 minicircle-gag)、所述表達盒、所述轉基因細胞系或所述重組菌均可應用於製備愛滋病疫
田ο所述DNA分子、任一所述重組載體(pShuttle-gag、p20c31_gag或 minicircle-gag)、所述表達盒、所述轉基因細胞系或所述重組菌均可應用於製備體液免疫增強劑和/或和細胞免疫增強劑。本發明還保護一種體液免疫增強劑和/或細胞免疫增強劑和/或愛滋病疫苗，包括所述 DNA 分子、任一所述重組載體(pShuttle-gag、p2Φ c31-gag 或 minicircle-gag)、所述表達盒、所述轉基因細胞系或所述重組菌。本發明通過對現有的gag基因進行優化，得到了優化後的gag基因，將優化後的 gag基因與的小環(Hiinicircle)DNA載體結合，可以得到一種新的愛滋病疫苗。與現有的基於gag基因的愛滋病疫苗相比，本發明提供的疫苗具有安全性高和療效顯著提高的優點， 可以誘導機體產生抗原特異的細胞免疫和體液免疫，為我國的自主的愛滋病疫苗研究提供候選疫苗。


圖1為HIV-Igag的密碼子優化步驟示意圖。圖2為實施例1過程中的電泳圖。圖3為優化前的gag基因和優化後的gag基因的表達能力比較的電泳圖；1為空白對/照，2 為 pShuttle-gag-wt, 3 為 pShuttle-gago圖4為重組質粒p2(DC31-gag的構建流程圖。圖5為重組質粒p20c31_gag (母環)和重組質粒minicircle-gag (小環)的酶切鑑定圖；上樣量均為:P2cDC31-gag(未酶切)；2 :p2OC31-gag(Xh0 I酶切)； 3 :minicircle_gag (未酶切)；4 :minicircle_gag (Xho I 酶切)。圖6為用重組質粒p20c31_gag (母環)誘導重組質粒minicircle-gag (小環) 的流程示意圖。圖7為不同劑量minicircle-gag免疫小鼠後的免疫效果檢測結果；A為ELISA檢測結果；B為Elispot檢測，C為ICS檢測結果。。圖8為p20c31_gag(母環)和minicircle-gag (小環)的免疫效果比較；A為 ELISA檢測結果；B為Elispot檢測，C為ICS檢測結果。圖9為minicircle-gag和pVAX-gag的免疫效果比較；A為ELISA檢測結果；B為 Eli spot檢測，C為ICS檢測結果。。
具體實施方式
以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質量百分含量。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重複實驗，結果取平均值。質粒ρ2Φ(:31 由史丹福大學陳志英教授惠贈；公眾可以從中國科學院微生物研究所獲得；構建請參見以下文獻Chen ZY, He CY，Ehrhardt A, Kay MA. Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo. Mol Ther 2003Sep ；8 (3) :495_500o實施例1、HIV-Igag的密碼子優化1、引物設計與合成根據人密碼子的偏好性優化HIV-IB亞型89. 6病毒株的gag基因 (GENBANKACCESSION NO. U39362)，得到的序列分成38段小片段，每段59個核苷酸，相鄰兩段有18個互補的核苷酸。序列由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，其中上遊和下遊的序列如下(其它序列略)gagF :5』-GCTCTAGAGCCACCATGGGCGCCAGA-3』 (XbaI) ；gagR 5』 -ATGCGGCCGCTTACTGGCTGCTGGGGTCG-3』 (Not I)。2、密碼子優化過程HIV-Igag的密碼子優化步驟示意圖見圖1。(l)oligo 引物均加 ddH20 10(^1^，稀釋至 200-360 11101/^1^。然後，19對基因序列每兩對一起退火，見圖 1。反應體系oligo DNA :3/2/2/3 μ L，10 X Buffer :2 μ L，dNTP 2μ L, Taq 酶0. 5 μ L ；ddH20 :5. 5 μ L。反應條件:95°C，4min ；95°C,40s ；72°C，3min ；72°C, 7min ；5個循環。退火後進行2. 5%瓊脂糖凝膠電泳，見圖2_1。(2)將上述10個退火產物為模板(均稀釋20倍)，分1-5，5-10兩組進行退火，反應條件同上。退火後進行2. 5%瓊脂糖凝膠電泳，見圖2-11。反應體系oligo DNA :2μ L， 引物1/1 μ L, IOXBuffer :3 μ L，dNTP :2 μ L，Taq 酶0. 5μ L ； ddH20 :20. 5 μ L。(3)用引物gagF/gagR PCR擴增密碼子優化的gag全序列。進行2. 5 %瓊脂糖凝膠電泳，見圖 2-111。PCR 體系oligo 模板1 μ L/1 μ L ；gag-f/r :1/1 μ L ；dNTP :2μ L ； IOXBuffer :3 μ L ；Pyrobest DNA polymerase 0. 3μ L ； ddH20 :21. 7μ L ；Total :30 μ L0PCR 條件:95°C,4min ；95°C，30s ；62°C，30s ；72°C,90s ；72°C，7min ；30 個循環。得到的優化後的 gag基因連接至PMD18-T，送北京奧科生物技術有限責任公司測序。優化後的gag基因如序列表的序列2所示，編碼序列表的序列1所示的蛋白質(序列1所示蛋白質即為GENBANK ACCESSION NO. U39362所示的蛋白質)。序列表的序列2所示DNA自5』末端第13至1515位核苷酸為開放閱讀框，開放閱讀框兩端的序列分別為)(ba I酶切識別位點和Not I酶切識別位點。實施例2、優化前的gag基因和優化後的gag基因的表達能力比較一、重組質粒pShuttle-gag的構建及鑑定1、合成序列表的序列2所示的DNA(優化後的gag基因)，然後用限制性內切酶 XbaI和Not I雙酶切，回收酶切產物(約1. 5kb)。2、用限制性內切酶 Xba I 和 NotI 雙酶切質粒 pShuttle (GenBank AccessionNO. AF334399, VERSION AF334399. 1，GI :12698892)，回收載體骨架。
3、將步驟1回收的酶切產物和步驟2回收的載體骨架連接，連接產物(質粒)進行PCR鑑定(鑑定所用的引物對gagR/gagF)。gagF :5，-GCTCTAGAGCCACCATGGGCGCCAGA-3，(XbaI)；gagR :5，-ATGCGGCCGCTTACTGGCTGCTGGGGTCG-3，(Not I)。4、將PCR鑑定陽性的質粒進行測序；結果表明，得到了重組質粒pShuttle-gag(骨架載體為質粒pShuttle，在^CbaI和NotI位點之間插入了序列表的序列2所示的DNA)。二、對照質粒 Shuttle-gag-wt 的構建1、合成序列表的序列3所示的DNA (優化前的gag基因)，然後用限制性內切酶^Cba I和NotI雙酶切，回收酶切產物(約1. 5kb)。2、用限制性內切酶 XbaI 和 Not I 雙酶切質粒 pShuttle (GenBank Accession NO. AF334399, VERSION AF334399. 1，GI :12698892)，回收載體骨架。3、將步驟1回收的酶切產物和步驟2回收的載體骨架連接，得到對照質粒 pShuttle-gag-wt (骨架載體為質粒pShuttle，在)(ba I和Not I位點之間插入了序列表的序列3所示的DNA)。三、優化前gag基因和優化後gag基因的表達量比較U93T 細胞(人胚腎細胞，ATCC Number =CRL-11268 )置於 DMEM(Gibco)培液 (含lOOunits/mL青黴素、lOOunits/mL鏈黴素和體積百分含量為10%的胎牛血清)中， 37°C、飽和溼度，含5% CO2的細胞培養箱中培養。取對數生長期細胞，胰酶消化、計數，接種到細胞培養板(每孔0. 9X 105-4X IO5個細胞)。2、16_24h細胞貼壁，60 % -80 %融合後，採用Effectene轉染試劑盒(購自 Qiagen，貨號 301427)分別轉染等量的 pShuttle-gag 或 pShutt le-gag-wt。轉染後4 用NP-40細胞裂解液裂解細胞，離心取上清，進行SDS-PAGE，western 檢測蛋白表達情況(一抗為HIV-IpM抗體，購自Santa Cruz Biotechnology,貨號 sc-697^;內參為β-actin)。western檢測結果見圖3。圖3中，1為空白對照，2為 pShutt le-gag-wt, 3為pShuttle-gag。實驗結果顯示，優化前的gag基因(野生型)基本看不到雜交信號，即基本不表達，經過密碼子優化後的gag基因能在哺乳動物細胞中有效的表達。實施例3、重組質粒minicircle-gag(小環)的製備一、重組質粒minicircle-gag(小環)的製備1、重組質粒？20 031飛&8(母環)的構建重組質粒p2(DC31-gag的構建流程如圖4所示。①用限制性內切酶SpeI和EcoRI雙酶切實施例2構建的重組質粒pShuttle-gag， 回收約2.51Λ的片段(該片段自上遊至下遊依次含有如下元件Spe I位點、cmv啟動子、優化後的gag基因、EcoR I位點)。②用限制性內切酶Spe I和EcoRI雙酶切質粒pBS-T(購自天根公司，貨號 VT201-01)，回收約3. Okb的片段。③將步驟①回收的片段和步驟②回收的片段連接，得到重組質粒pBS-T-gag。④用限制性內切酶SpeI和BioI雙酶切重組質粒pBS-T-gag，回收約2. 5kb的片段(該片段自上遊至下遊依次含有如下元件Spe I位點、cmv啟動子、優化後的gag基因、BGHpo lyA、XhoI 位點)。⑤用限制性內切酶SpeI和Bio I雙酶切質粒ρ2Φ(:31，回收約111Λ的片段。⑥將步驟④回收的片段和步驟⑤回收的片段連接，得到重組質粒p2c5C31-gag。重組質粒p20C31-gag的酶切鑑定圖見圖5的泳道1和泳道2 ；泳道1為未酶切後的p20c31_gag，泳道2為Xho I酶切的p20c31_gag。重組質粒p20c31_gag大小約為 12. 31Λ。將重組質粒p2c5C31-gag進行全質粒測序，其核苷酸序列如序列表的序列4所示。2、重組質粒minicircle_gag(小環)的製備(1)製備重組菌用重組質粒p2(DC31-gag轉化大腸桿菌TOPlO(購自hvitrogen公司，貨號 C404006)感受態，得到重組菌。p2cDC31-gag誘導後，其中的部分DNA片段可以形成 minicircle-gag (小環)。(2)重組質粒 minicircle-gag 的製備①挑取重組菌的單克隆菌落，接種於3mL含氨苄青黴素(100微克/毫升)的LB 培養基(胰蛋白腖10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉5g/L ；pH = 7.0)中，37°C、250rpm、振蕩 10小時，得到菌懸液。②取2mL菌懸液接種於200mL TB培養基中，37°C、250rpm振搖12_1乩，振蕩培養至OD26tl = 2. 1左右，得到菌液。每升培養基TB培養基的製備方法在900ml去離子水中加入12g胰化蛋白腖、 24g酵母提取物、甘油，使溶質完全溶解；然後在15psi (1. 05kg/cm2)高壓下蒸汽滅菌 20min ；當溶液冷至60°C時加入IOOml無菌溶液甲。無菌溶液甲的製備方法用90ml去離子水溶解2. 31g KH2PO4和12. 54g K2HPO4,完全溶解後，用去離子水定容至100ml，15pSi(1.05kg/cm2)高壓下蒸汽滅菌20min。③收集菌液於無菌預冷的50mL離心管中，室溫4000rpm離心收菌。④用50mL含1. 5% (質量百分含量)阿拉伯糖和氨苄青黴素(50微克/毫升)的 LB培養基(pH = 7. 0)重懸細菌，32°C、250rpm振蕩4小時。⑤加入25mL含1. 5% (質量百分含量)阿拉伯糖和氨苄青黴素(50微克/毫升) 的LB培養基(pH = 8. 0)，37°〇、250卬111、振蕩4小時。⑥4°C、4000rpm離心10分鐘收菌，用質粒抽提試劑盒(購自Qiagen公司，目錄號是12981)提取質粒，即為重組質粒minicircle-gag。重組質粒minicircle-gag的酶切鑑定圖見圖5的泳道3和泳道4 ；泳道3為未酶切的minicircle-gag，泳道4為Β ο I酶切後的minicircle-gag。泳道3中，最前面三條帶為小環，分別為超螺旋，線性的以及有切口的小環質粒。重組質粒minicircle-gag純度達 80%以上，小環所佔的摩爾比達95%以上，大小約為2. 6kb。將重組質粒minicircle-gag進行全質粒測序，其核苷酸序列如序列表的序列4自5』末端第4319至6915位核苷酸所示。重組質粒p20c31_gag (母環)誘導產生重組質粒minicircle-gag質粒(小環) 的過程示意圖見圖6。二、對照質粒minicircle-gag-wt (小環)的製備1、對照質粒p20c31_gag(母環)的構建用實施例2構建的對照質粒pShuttle-gag-wt代替重組質粒pShuttle-gag，其它同步驟一的1，得到對照質粒p2(DC31-gag-Wt。2、對照質粒minicircle-gag-wt (小環)的製備用對照質粒p2(DC31-gag-Wt代替重組質粒p2(DC31-gag，其它同步驟一的2，得到對照質粒minicircle-gag-wt質粒(對照小環)。實施例4、minicircle-gag作為DNA疫苗免疫小鼠的效果BALB/c小鼠雌性，5_6周，購自北京維通利華實驗動物有限公司。 minicircle-gag和ρ2 Φ c31_gag均為實施例3製備的。本實施例中的PBS溶液均為 ρΗ7· 20. 2Μ (KH2PO4O. 2g, Na2HPO4 · 12H20 2. 9g, NaCl 8. Og, KCl 0. 2g，加水定容至 1L)的 PBS 溶液。一、不同劑量的minicircle-gag在小鼠體內的免疫效果1、分組免疫將小鼠分成4組，每組10隻，分別免疫如下第一組用PBS溶液免疫；第二組用minicircle-gag 溶液免疫，minicircle-gag 單次免疫劑量為 0. 4ug ；第三組用minicircle-gag溶液免疫，minicircle-gag單次免疫劑量為4. Oug ；第四組用minicircle-gag溶液免疫，minicircle-gag單次免疫劑量為40ug。minicircle-gag溶液即為將minicircle-gag溶於PBS溶液得到的溶液；實驗中， 第1天初次免疫，第21天和第42天各將強免疫一次；每次的免疫方式均為雙側腿部肌肉注射，每側50ul，注射後在注射點兩次插入電極60V瞬間電擊6次；第35天進行免疫效果檢測。2、免疫效果檢測(1) ELISA檢測抗HIV-Igag特異性的抗體小鼠(每組5隻)眼眶靜脈叢採血，4°C靜置過夜，低速離心取血清，以第一組小鼠的血清為陰性對照，通過ELISA法檢測第二組、第三組和第四組小鼠血清的滴度；包被抗原為抗原P24 (購自上海領潮生物科技有限公司，目錄號L2H002)，包被濃度為0. 5 μ g/mL, 二抗為1 10000倍稀釋的山羊抗小鼠IgG-HRP抗體(購自北京中杉金橋生物技術有限公司， 貨號觀-2305)；酶標儀檢測時，採用450nm的檢測波長；判斷標準陽性孔OD值> 2. 1倍的陰性孔OD值；最低稀釋倍數即為滴度。O)Elispot檢測免疫小鼠中HIV-Igag特異的細胞免疫反應頸椎脫臼法處死小鼠(每組5隻)，取脾細胞；利用鼠的Elispot檢測試劑盒(試劑盒購自BD，貨號為551083)按試劑盒的操作說明進行Elispot，檢測每IO6個脾細胞中 IFN-Y陽性細胞的個數。刺激物為P1、P2和P3三條肽，終濃度均為10ug/ml ；Pl的胺基酸序列為「TTSTLQEQI」，P2的胺基酸序列為「AMQMLKETI 」，P3的胺基酸序列為「EPFRDYVDRF」。(3)細胞內細胞因子染色法檢測免疫小鼠中HIV-Igag特異性細胞免疫反應頸椎脫臼法處死小鼠(每組5隻)，取脾細胞，用細胞內細胞因子染色法檢測免疫小鼠中HIV-Igag特異性細胞免疫反應。細胞內細胞因子染色法(ICS)步驟如下①取2 X IO6脾細胞離心後重懸於200ul 1640完全培養基中，鋪於96孔板中。每孔加入刺激物(P1、P2和P3三條肽，終濃度均為10ug/ml =Pl的胺基酸序列為「TTSTLQEQI 」， P2的胺基酸序列為「AMQMLKETI 」，P3的胺基酸序列為「EPFRDYVDRF」)，37°C、5% CO2培養箱孵育2小時。②2 小時後加入 BrefeldinA (購自 BD，貨號；347688)，終濃度為 2ug/ml，37°C、5% CO2培養箱孵育4小時。③4小時後，收穫細胞，用含(質量百分含量)的FCS的PBS洗一次，IOOOrmp/ min收集細胞，用IOOul含(質量百分含量)FCS的PBS重懸細胞，並加入1 40倍稀釋的 Percy5. 5-CD3+ (Percy5. 5 標記的抗小鼠 CD3 抗體，購自 biolegend，貨號 100218)，1 80 倍稀釋的PE_CD4+(PE標記的抗小鼠CD4抗體，購自biolegend，貨號100408), 1 200倍稀釋的FITC-CD8+(FITC標記的抗小鼠CD8抗體，購自biolegend，貨號100804)。4°C避光孵育20分鐘。④lOOOrmp/min收集細胞，PBS洗一次，4%多聚甲醛4°C避光固定30分鐘。⑤1000rmp/min 收集細胞，300ul 穿膜劑(購自 ebioscience，貨號 00-8333)洗一次。⑥lOOOrmp/min收集細胞，300ul穿膜劑4°C避光穿膜30分鐘。⑦1000rmp/min收集細胞，IOOul含有1 200稀釋的APC-INF- y (APC標記的抗小鼠INF-Y抗體，購自ebioscience，貨號17-7311)的穿膜劑，4°C避光孵育20分鐘。⑧lOOOrmp/min收集細胞，300ul穿膜劑洗一次，收集細胞，300ulPBS重懸，上流式細胞儀檢測。第35天免疫效果檢測結果見圖7，A為ELISA檢測結果；B為Elispot檢測，C為 ICS檢測結果。結果表明0. 4ug的mincircle-gag就能在Balb/c小鼠體內誘導很好的針對 gag的體液免疫和細胞免疫反應，並且免疫反應隨著劑量的增加而加強，以4. Oug的劑量誘導的特異性的細胞免疫反應和抗體反應水平已經達到很高的水平，增加到40ug雖然抗體水平和特異細胞免疫反應水平都有所增加，但增加的幅度不是很大。證明mincircle-gag 為一種無需免疫高劑量的DNA疫苗。二、p20c31_gag與minicircle-gag在小鼠體內免疫效果的比較1、分組免疫40隻小鼠隨機分為四組，每組10隻，分別免疫如下第一組用PBS溶液免疫；第二組用minicircle-gag溶液免疫，minicircle-gag單次免疫劑量為20ug ；第三組用minicircle-gag溶液免疫，minicircle-gag單次免疫劑量為4. 3ug ；第四組用p2(DC31-gag溶液免疫，p2(DC31-gag單次免疫劑量為20ug。minicircle-gag溶液即為將minicircle-gag溶於PBS溶液得到的溶液， ρ2Φ c31-gag溶液即為將ρ2Φ c31-gag溶於PBS溶液得到的溶液；實驗中，第1天初次免疫， 第21天和第42天各將強免疫一次；每次的免疫方式均為雙側腿部肌肉注射，每側50ul，注射後在注射點兩次插入電極60V瞬間電擊6次；第35天進行免疫效果檢測。2、免疫效果檢測(I)ELISA檢測抗HIV-Igag特異性的抗體方法同步驟一的2的(1)。0)Elispot檢測免疫小鼠中HIV-Igag特異的細胞免疫反應方法同步驟一的2的O)。
(3)細胞內細胞因子染色法檢測免疫小鼠中HIV-Igag特異性細胞免疫反應方法同步驟一的2的(3)。第35天免疫效果檢測結果見圖8，A為ELISA檢測結果；B為Elispot檢測，C為 ICS檢測結果。結果表明p2(DC31-gag與小環minicircle-gag都能誘導出明顯的特異性細胞免疫反應和抗體反應，但minicircle-gag誘導的特異性細胞免疫反應和抗體反應水平都明顯比p20c31_gag高，證明與p20c31_gag相比minicircle-gag作為疫苗在小鼠體內免疫效果更好。三、pVAX-gag與minicircle-gag在小鼠體內免疫效果的比較1、對照質粒pVAX-gag的構建①以pShuttle-gag為模板，以gagPX_F/gagPX_R為引物進行PCR擴增，回收1. 5kb 的PCR擴增產物。gagPX_F 5' -ATGCGGCCGCGCCACCATGGGTGCGAGA-3' (Not I)；gagPX_R 5' -GCTCTAGATTACTGGCTGCTGGGGTCG-3『 (Xba I)。PCR 體系模板 2 μ L ；gagPX_F 2 μ L ；gagPX_R 2 μ L ； dNTP 4 μ L ； 10 X Buffer 6μ L ；Pyrobest DNA polymerase 0. 25 μ L ； ddH20 33. 75 μ L0PCR 條件:95°C,4min ；95°C，30s ；58°C, 30s ；72°C, 1. 5min ；72°C，7min ；30 個循環。②用限制性內切酶Not I和^CbaI雙酶切PCR擴增產物，回收酶切產物。③用限制性內切酶Not I和Xba I雙酶切pVAXl (購自hvitrogen公司，產品目錄號V26020)，回收載體骨架。④將步驟②的酶切產物和步驟③的載體骨架連接，得到重組質粒pVAX-gag。2、分組免疫40隻小鼠隨機分為四組，每組10隻，分別免疫如下第一組用PBS溶液免疫；第二組用minicircle-gag溶液免疫，minicircle-gag單次免疫劑量為2ug ；第三組用minicircle-gag溶液免疫，minicircle-gag單次免疫劑量為1. Hug ；第四組用pVAX-gag溶液免疫，pVAX-gag單次免疫劑量為2ug。minicircle-gag 溶液艮口 為 minicircle-gag 溶於 PBS 溶液得至 Ij 的溶液，pVAX-gag 溶液即為將pVAX-gag溶於PBS溶液得到的溶液；實驗中，第1天初次免疫，第21天和第42 天各將強免疫一次；每次的免疫方式均為雙側腿部肌肉注射，每側50ul，注射後在注射點兩次插入電極60V瞬間電擊6次；第35天進行免疫效果檢測。3、免疫效果檢測(I)ELISA檢測抗HIV-Igag特異性的抗體方法同步驟一的2的(1)。0)Elispot檢測免疫小鼠中HIV-Igag特異的細胞免疫反應方法同步驟一的2的O)。(3)細胞內細胞因子染色法檢測免疫小鼠中HIV-Igag特異性細胞免疫反應方法同步驟一的2的(3)。第35天免疫效果檢測結果見圖9，A為ELISA檢測結果；B為Elispot檢測，C為 ICS檢測結果。實驗結果表明，pVAX-gag與小環minicircle-gag都能誘導出明顯的特異性細胞免疫反應和抗體反應，但minicircle-gag誘導的特異性細胞免疫反應和抗體反應水平都明顯比pVAX-gag高，證明與pVAX-gag相比minicircle-gag作為疫苗在小鼠體內免疫效果更好。PVAX載體是被美國藥品及食物鑑定委員會承認的用於疫苗臨床使用的真核表達載體。
權利要求
1.序列表中序列2自13至1515位核苷酸所示的DNA分子。
2.含有權利要求1所述DNA分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
3.如權利要求2所述的重組載體，其特徵在於所述重組載體為在pShuttle的多克隆位點插入權利要求1所述DNA分子得到的重組質粒；所述重組載體優選為在質粒 pShuttle的)(ba I和Not I酶切位點之間插入權利要求1所述DNA分子得到的重組質粒 pShuttle-gag。
4.如權利要求2所述的重組載體，其特徵在於所述重組載體為重組質粒 p20c31_gag ；所述p20c31_gag的構建方法如下(1)用限制性內切酶SpeI和EcoR I雙酶切權利要求3所述的重組質粒 pshuttle-gag，回收 2. 5kb 的片段；(2)用限制性內切酶SpeI和EcoRI雙酶切質粒pBS_T，回收3. Okb的片段；(3)將步驟(1)回收的片段和步驟回收的片段連接，得到重組質粒pBS-T-gag;(4)用限制性內切酶SpeI和B10I雙酶切重組質粒pBS-T-gag，回收2. 5kb的片段；(5)用限制性內切酶SpeI和B10I雙酶切質粒ρ2Φ(:31，回收111Λ的片段；(6)將步驟回收的片段和步驟(5)回收的片段連接，得到重組質粒p2c5C31-gag。
5.如權利要求4所述的重組載體，其特徵在於所述重組質粒p2c5C31-gag的核苷酸序列如序列表的序列4所示。
6.如權利要求2所述的重組載體，其特徵在於所述重組載體為將重組菌用阿拉伯糖進行誘導得到的重組質粒minicircle-gag ；所述重組菌是將權利要求4或5所述重組質粒 p2c5C31-gag導入宿主菌得到的；所述宿主菌優選為大腸桿菌TOPlO ；用於進行所述誘導的阿拉伯糖的終濃度優選為1. 5% (質量百分含量)。
7.如權利要求6所述的重組載體，其特徵在於所述重組質粒minicircle-gag的核苷酸序列如序列表的序列4自5』末端第4319至6915位核苷酸所示。
8.如下物質中的至少一種在製備愛滋病疫苗中的應用權利要求1所述DNA分子，權利要求2至7中任一所述重組載體，權利要求2所述表達盒，權利要求2所述轉基因細胞系和權利要求2所述重組菌。
9.如下物質中的至少一種在製備體液免疫增強劑和/或細胞免疫增強劑中的應用權利要求1所述DNA分子，權利要求2至7中任一所述重組載體，權利要求2所述表達盒，權利要求2所述轉基因細胞系和權利要求2所述重組菌。
10.體液免疫增強劑和/或細胞免疫增強劑和/或愛滋病疫苗，包括如下物質中的至少一種權利要求1所述DNA分子，權利要求2至7中任一所述重組載體，權利要求2所述表達盒，權利要求2所述轉基因細胞系和權利要求2所述重組菌。
全文摘要
本發明公開了HIV-gag基因遺傳密碼子優化及愛滋病疫苗的製備方法與應用。本發明提供的基因為序列表中序列2自第13至1515位核苷酸所示的DNA分子。本發明還保護幾種重組質粒在pShuttle的Xba I和Not I酶切位點之間插入所述DNA分子得到的重組質粒pshuttle-gag；以pshuttle-gag為出發載體，得到的重組質粒p2Φc31-gag；將重組質粒p2Φc31-gag誘導得到的重組質粒minicircle-gag。minicircle-gag質粒可以促進生物體內的體液免疫和細胞免疫，從而可以用於製備愛滋病疫苗。本發明提供的疫苗具有安全性高和療效顯著提高的優點，可以誘導機體產生抗原特異的細胞免疫和體液免疫，為我國的自主的愛滋病疫苗研究提供候選疫苗。
文檔編號C12N1/19GK102453722SQ201010521568
公開日2012年5月16日 申請日期2010年10月27日 優先權日2010年10月27日
發明者張輝, 王清濤, 陳玉海, 高詩娟, 黃文林 申請人:中國科學院微生物研究所