透明質酸一步法化學發光定量檢測試劑盒的製作方法

2023-09-20 17:15:25

專利名稱：透明質酸一步法化學發光定量檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及ー種ー步法進行人血清、體液或組織勻眾中透明質酸(HyaluronicAcid，簡稱HA)含量檢測的化學發光試劑盒。屬於免疫分析醫學範疇。
背景技術：
近年來的臨床醫學陸續發現透明質酸含量變化與腫瘤的生長、浸潤和擴散密切相關，尤其發現檢測血清HA對診斷腫瘤有一定價值，可作為區分良、惡性腫 瘤的ー個重要指標。它還有助於肝病的診斷和鑑別診斷、病情判斷和預後評估，還是抗纖維化藥物治療的ー個非常重要的動態觀察手段。目前，HA的檢測方法主要以放射免疫方法為主，文獻CN1047391A公開了ー种放射免疫方法檢測透明質酸(H A)含量的方法。它將碘標記的HA(125I-HA)與未知量標本中的H A共同競爭加入的透明質酸結合蛋白(HABP)，再用第一抗體、第二抗體將結合複合物沉澱下來，測其放射性計數，通過標準品的濃度-計數關係計算出擬合方程，根據樣本放射性計數反推出其中的HA含量來。這是ー種比較靈敏、準確的透明質酸檢測方法。但是上述方法也存在一定的缺陷一、加樣步驟繁瑣。整個實驗包括三步加樣和離心等過程，反應的總計時間達到2個多小時；ニ、試劑盒操作自動化程度低，試劑盒的有效期也很短。只有30-45天；三、使用125I作為標記物，對環境產生放射性汙染，對操作人員健康有潛在危害。同樣，在市場上也有一部分的HA化學放光和酶聯檢測試劑，據了解，它們大多數都是採用三步法反應模式，免疫反應的時間一般都要I. 5-2個小時左右，可以說操作起來都比較繁瑣。究其原因在於這些試劑盒都藉助了 HA與HABP之間的結合反應，而HABP是ー個成分和結構比較複雜的蛋白，提純エ藝複雜，純度也不會太高，且其與HA的結合力沒有像抗原和抗體的結合力那麼強，所以，一、不能用它直接包被，幹擾因素比較多，造成試劑的重複性差。ニ、不能用它直接標記，HABP某些活性基團極易失活，造成試劑的穩定性差。本發明從根本上解決了透明質酸試劑盒不能一歩法檢測的難題，可以讓操作更方便，讓檢測更準確。其反應原理為預先在固相載體(例如96孔微孔板)上包被HA，再依次加入校準品或樣品和HA酶結合物，反應過程中固相包被HA與樣本中的HA共同與限量的HABP-anti-HABP-HRP進行競爭性結合反應，經過一定的反應溫度和反應時間，經洗滌除去某些游離成分，最終在固相板上形成HABP-anti-HABP-HRP的複合物。校準品或樣本中的HA含量越高，在包被板上形成的複合物就越少。測定時，先洗去包被板中的液體，再加入發光底物液A和B，發光底物液中的化學發光物質經催化劑的催化和氧化劑的氧化，形成ー個激發態的中間體，當這種激發態中間體回到穩定的基態時，會釋放等能級的光子，對光子進行測定從而實現定量分析。本試劑盒的突出技術優勢具體在於(I)採用化學發光定量測定方法，充實了透明質酸的免疫檢測手段，進ー步突出了方法學具有的靈敏度高，特異性強，精密度好，線性範圍寬，試劑穩定性好等優點。本發明試劑盒所有組分從緩衝液到原材料再到製備條件均經過了最優化篩選與配比，大大提高了試劑盒的的靈敏度，特異性，檢測範圍和準確性。試劑盒的底物系統使用魯米諾(Luminol)/過氧化氫/辣根過氧化物酶(HRP)/對碘苯酹(p-iodophenol)底物發光系統,其在精心配比的Tris-HCL緩衝液中延長了底物系統發光持續時間，I小時內對樣品的測定值變化在10%以內，大大提高了測定結果的穩定性。同時，本試劑盒適用於開放式化學發光檢測儀器，更有利於其進一歩推廣和應用。(2)液體試劑可直接使用，無需提前配製；可拆卸板條最大滿足實驗設計要求。(3) 一歩法反應，操作極為簡單，只需向微孔中連續加入校準品或樣本及HA酶結合物，反應I小時即可。(4)間接法形成酶結合物，從根本上解決辣根過氧化物酶直接標記HABP存在的不穩定、易失活的問題，試劑盒的穩定性大大改善，有效期可以達到6個月，而且測定結果的重複性也明顯提高。 (5)採用LogX-(I-BZiBci)擬合方法進行數據處理，避免個別低值血樣發光值偏出標準曲線範圍，無法計算的弊病。本試劑盒在具備了靈敏度高，測值準確，重複性好，試劑穩定，有效期長，等技術優勢的基礎上，科學性、創新性地解決了 HA酶促法(化學發光和酶聯法)試劑普遍存在的技術難題，大大筒化了操作步驟，令其獨特品質在國內的HA非放試劑中名列前茅。

發明內容
ー種ー步法進行人血清、體液或組織勻眾中透明質酸(Hyaluronic Acid,簡稱HA)含量檢測的化學發光試劑盒。本發明所提供的檢測透明質酸的化學發光試劑盒包括1)HA校準品2)HA包被板3) HA酶結合物4)化學發光底物液A和化學發光底物液B。上述本發明的試劑盒中，所述的HA校準品內含有經準確定值的HA抗原。上述本發明的試劑盒中，所述的HA包被板上包被有與牛血清白蛋白(BSA)偶聯的HA(HA-BSA)。上述本發明的試劑盒中，所述的用於HA包被板的HA-BSA其製備方法如下準確稱取5mg HA抗原,溶解於2ml 0. lmol/L pH 5. 6磷酸鹽緩衝液(PB)加IOmg牛血清白蛋白，溶解後加5mg I-こ基-3-(3-ニ甲基氨基丙基)-碳ニ亞胺(EDC) 4°C反應17-20小時，裝入透析袋於1000ml 0. 01mol/L pH7. 4PB中透析，換液4次，取出凍存於-15°C以下備用。上述本發明的試劑盒中，所述的HA酶結合物是由透明質酸結合蛋白(HABP)和辣根過氧化物酶(HRP)標記的HABP抗體分別按體積比I : 2000和I : 6500稀釋到酶稀釋液中(含50mmol/L ΡΒ,Ο. 25% BSA，10%丙三醇)，經過4°C 20小時二者充分反應後配製而成。上述本發明的試劑盒中，所述的HA酶結合物中HABP的製備方法如下取新鮮牛鼻軟骨，洗淨後切成小塊，加入4mol/L鹽酸胍，製成均漿，4°C提取30小時，抽提液13000g離心I小時，上清液對水透析，冷凍乾燥後即得HABP粗品，HABP粗品I. 6g，溶於25ml 0. ImoI/L Tris-HCKpH 7. 3)中，加入5mg胰蛋白酶，於37°C溫育2小時，加入Img大豆胰蛋白酶擬制因子，在上述HABP粗品酶解液中，加入38g鹽酸胍，用0. 5mol/L醋酸-醋酸鈉緩衝液補足體積至50ml，與親和層析凝膠混合，置於透析袋中，對蒸餾水透析，4°C過夜，透析後將凝膠裝柱，依次用lmol/L和3mol/L的氯化鈉(NaCl)梯度洗脫未吸附物及雜蛋白，然後用4mol/L鹽酸胍洗脫，分步收集洗脫液，各組份分別取少量與碘標記HA (125I-HA)反應，合併與125I-HA有結合的組份，對水透析後，用PEG20000進行濃縮成3mg/ml，凍存於-15°C以下保存。上述本發明的試劑盒中，所述的HA酶結合物中HABP抗體的製備方法如下採用常規免疫法將HABP按照O. 5mg/kg的免疫劑量融合完全佐劑多點注射到大耳白實驗用兔子的背部皮下，間隔15天後相同方法、相同免疫劑量注射HABP融合的不完全佐劑，共免疫5次，頸動脈取血，分離出血清，測定血清滴度，硫酸銨2次分級沉澱得到兔IgG，透析於2000ml50mmol/L pH7. 4PB緩衝液中過夜，透析4次後取出，凍存於_15°C以下備用。上述本發明的試劑盒中，所述的HA酶結合物中酶標記HABP抗體的製備方法如下採用改良高碘酸鈉氧化法將HABP抗體與辣根過氧化物酶(HRP)聯結稱取5mg HRP溶解於Iml蒸餾水中，加入O. 2ml新配的O. lmol/L高碘酸鈉(NaI04)溶液，室溫下避光攪拌20分鐘，將上述溶液裝入透析袋中，對lmmol/L pH4. 4的醋酸鈉緩衝液透析，4°C過夜，加20 μ I
0.2mol/L pH9. 5碳酸鹽緩衝液，使以上醛化HRP的pH升高到9· O 9· 5，然後立即加入IOmgHABP抗體在ImlO. OlM碳酸鹽緩衝液中，室溫避光輕輕攪拌2小時，加O. Iml新配的4mg/ml硼氫化鈉(NaBH4)液，混勻，再置4°C 2小時，將上述液裝入透析袋中，對O. 15mol/L pH7. 4PB透析，4°C過夜。上述本發明的試劑盒中，所述的化學發光底物液A的製備方法為6mmol/L過氧化氫，50mmol/L pH7. ITris-HCL緩衝液；化學發光底物液B的製備方法為4mmol/L Luminol,
1.2mmol/L p-iodophenol, 50mmoI /T, pH8. 6Tris_HCl 緩衝液。上述本發明的試劑盒中，所述的數據擬合方法為以校準品的標示濃度的Log值為橫坐標，以(1-B/BJ值為縱坐標的數學擬合方程。上述本發明的試劑盒中，所述的HA校準品和HA酶結合物的加樣量均為50μ 1，一步法，反應時間為I小時。上述本發明的試劑盒中，所述的與HA偶聯的BSA可以被其它蛋白或多肽替代；微孔板可以被其它適宜包被的材料，如塑料試管、塑料珠等替代；用於標記的辣根過氧化物酶可以被鹼性磷酸酶或其它螢光物質、化學發光標記物替代，並用相應的儀器進行檢測。


附圖I為本發明檢測方法的流程圖附圖2 :本發明與北方所放射免疫試劑盒測值相關性比較圖
具體實施例方式實施例I :製備本發明的透明質酸一歩法化學發光定量檢測試劑盒一、HA校準品的製備。l、50mmol/L ρΗ7· 4 磷酸鹽緩衝液(PB)Na2HPO4 · 12Η20 14. 5 克NaH2PO4 · 2H20 I. 48 克溶解於1000ml去離子水中，測其pH值為7. 4。
標準品稀釋液中加5%小牛血清。2、將HA濃抗原準確稀釋成25，50，100，200,400,800ng/ml幾個濃度，SO為校準品稀釋液，共7瓶。ニ、HA包被板的製備緩衝液I :包被液SOmmo I /T, pH7. 4PB 緩衝液2:封閉液SOmmoI /T, pH7. 4PB10% 蔗糖O. 5% BSA0.1% 防腐剤。包被板的製備將HA-BSA按比例稀釋到50mmol/L pH7. 4PB包被液，100 μ I/孔加到微孔板中，2 8°C放置過夜，扣幹。加入封閉液150 μ I/孔，2 8°C放置過夜，棄去封閉液，扣幹，待其自然乾燥後，用鋁箔袋真空密封后備用。三、濃縮洗滌液的製備。配方為15% NaClI % 吐溫(Tween 20)50mmol/L pH7. 4 磷酸鹽緩衝液混合均勻，分別按20ml/瓶分裝，2_8°C儲存。實施例2 :本發明的透明質酸一歩法化學發光定量檢測試劑盒的操作方法。以上實施例I製備的透明質酸一歩法化學發光定量檢測試劑盒的具體操作方法為a.向微孔板各孔中加入50 μ I HA校準品或待測樣本。b.向微孔板各孔中加入50 μ I HA酶結合物。c.將微孔板放置振蕩器上，室溫振蕩反應60分鐘。d.棄去微孔板內液體，每孔加入洗滌液，靜置30秒鐘後吸乾或甩幹。如此反覆洗滌5次。結束後在紙上將微孔板扣幹。e.每孔各加入50 μ I (I滴)底物液A和底物液B，加樣完畢後將微孔板震蕩混合。f.在室溫(14 28°C )環境下避光反應10分鐘後在微孔發光儀上測量各孔發光值。實施例3本發明透明質酸一歩法化學發光定量檢測試劑盒的方法學鑑定按照本領域常規製造及檢定規程對實施例I中製備的試劑盒進行檢定，結果見表I。表I試劑盒的方法學鑑定結果
權利要求
1.一種ー步法檢測透明質酸(HA)的化學發光試劑盒，其特徵在於試劑盒包括1)HA校準品2) HA包被板3) HA酶結合物4)化學發光底物液A和化學發光底物液B。
2.如權利要求I所述的試劑盒，其特徵在於所述的HA包被板上包被有與牛血清白蛋白(BSA)偶聯的 HA(HA-BSA)。
3.如權利要求I或2所述的試劑盒，其特徵在於所述的HA-BSA按照如下方法製備準確稱取5mg HA抗原，溶解於2ml O. lmol/L pH 5. 6磷酸鹽緩衝液(PB)加IOmg牛血清白蛋白，溶解後加5mg I-こ基-3-(3-ニ甲基氨基丙基)-碳ニ亞胺(EDC) 4 °C反應17-20小吋，裝入透析袋於IOOOml O. 01mol/L pH7. 4PB中透析，換液4次，取出凍存於-15°C以下備用。
4.如權利要求I所述的試劑盒，其特徵在於所述的HA酶結合物是由透明質酸結合蛋白(HABP)和辣根過氧化物酶(HRP)標記的HABP抗體分別按體積比I : 2000和I : 6500稀釋到酶稀釋液中(含50mmol/L PB, O. 25% BSA，10%丙三醇)，經過4°C 20小時二者充分反應後配製而成。
5.如權利要求4所述的試劑盒，其特徵在於其中HABP的製備方法如下取新鮮牛鼻軟骨，洗淨後切成小塊，加入4mol/L鹽酸胍，製成均漿，4°C提取30小時，抽提液13000g離心I小時，上清液對水透析，冷凍乾燥後即得HABP粗品，HABP粗品I. 6g，溶於25ml O. lmol/LTris-HCKpH 7. 3)中，加入5mg胰蛋白酶，於37°C溫育2小時，加入Img大豆胰蛋白酶擬制因子，在上述HABP粗品酶解液中，加入38g鹽酸胍，用O. 5mol/L醋酸-醋酸鈉緩衝液補足體積至50ml，與親和層析凝膠混合，置於透析袋中，對蒸餾水透析，4°C過夜，透析後將凝膠裝柱，依次用lmol/L和3mol/L的氯化鈉(NaCl)梯度洗脫未吸附物及雜蛋白，然後用4mol/L鹽酸胍洗脫，分步收集洗脫液，各組份分別取少量與碘標記HA (125I-HA)反應，合併與125I-HA有結合的組份，對水透析後，用PEG 20000進行濃縮成3mg/ml，凍存於-15°C以下保存。
6.如權利要求4或5所述的試劑盒，其特徵在於其中HABP抗體的製備方法如下採用常規免疫法將HABP按照0. 5mg/kg的免疫劑量融合完全佐劑多點注射到大耳白實驗用兔子的背部皮下，間隔15天後相同方法、相同免疫劑量注射HABP融合的不完全佐劑，共免疫5次，頸動脈取血，分離出血清，測定血清滴度，硫酸銨2次分級沉澱得到兔IgG，透析於2000ml 50mmol/L pH7. 4PB緩衝液中過夜，透析4次後取出，凍存於-15°C以下備用。
7.如權利要求4，5或6所述的試劑盒，其特徵在於其中酶標記HABP抗體的製備方法如下採用改良高碘酸鈉氧化法將HABP抗體與辣根過氧化物酶(HRP)聯結稱取5mg HRP溶解於Iml蒸餾水中，加入0. 2ml新配的0. lmol/L高碘酸鈉(NaIO4)溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。將上述溶液裝入透析袋中，對lmmol/L pH4. 4的醋酸鈉緩衝液透析，4°C過夜。加20 μ I 0. 2mol/L pH9. 5碳酸鹽緩衝液，使以上醛化HRP的pH升高到9. O 9. 5，然後立即加AlOmg HABP抗體在Iml 0. OlM碳酸鹽緩衝液中，室溫避光輕輕攪拌2小時，加0. Iml新配的4mg/ml硼氫化鈉(NaBH4)液，混勻，再置4°C 2小時，將上述液裝入透析袋中，對0. 15mol/L pH7. 4PB 透析，4°C過夜。
8.如權利要求I所述的試劑盒，其特徵在於所述的化學發光底物液A的製備方法為6mmol/L過氧化氫，50mmol/L pH7. ITri s-HCL緩衝液；化學發光底物液B的製備方法為4mmol/L Luminol, I. 2mmol/L p-iodophenol, 50mmoI /T, pH8. 6Tris-HCl 緩衝液。
全文摘要
本發明涉及一種一步法進行人血清、體液或組織勻漿中透明質酸含量檢測的化學發光法試劑盒，屬免疫分析醫學範疇。其採用固相包被及間接標記酶技術，從根本上解決了透明質酸試劑盒不能一步法檢測的難題，可以讓操作更方便，讓檢測更準確，讓試劑更穩定。本發明試劑盒包括有校準品；包被板；酶結合物和化學發光底物液A和B。試劑盒中HA校準品和酶結合物的加樣量均為50μl，一步法，反應時間1小時。通過嚴謹的方法學鑑定，確定了科學合理的正常值範圍，並對臨床測值結果與放免法試劑盒進行統計學比較，表明試劑盒具備靈敏度高，測值準確，重複性好，試劑穩定等諸多技術優點，值得市場的大力推廣和應用。
文檔編號G01N33/532GK102692408SQ201210125220
公開日2012年9月26日 申請日期2012年4月26日 優先權日2012年4月26日
發明者白雲鵬 申請人:北京北方生物技術研究所