一種超聲輔助-催化合成灰樹花多糖硫酸酯的方法

2023-10-05 21:21:14

一種超聲輔助-催化合成灰樹花多糖硫酸酯的方法
【專利摘要】本發明公開了一種超聲輔助-催化合成灰樹花多糖硫酸酯的方法，該方法以灰樹花多糖為原料，以三氧化硫-吡啶作為磺化劑，在4-二甲氨基吡啶的催化作用下製備灰樹花多糖硫酸酯。進一步地，該方法還包括將灰樹花多糖在N，N-二甲基甲醯胺中的超聲溶脹的步驟。本發明採用超聲輔助-催化的方法合成灰樹花多糖硫酸酯，降低了酯化溫度，縮短了酯化時間，提高了硫酸基團取代度，取代度為1.07～2.13。採用本發明的方法反應條件安全可控，反應速度較快。
【專利說明】一種超聲輔助-催化合成灰樹花多糖硫酸酯的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種超聲輔助-催化合成灰樹花多糖硫酸酯的方法，屬於中藥多糖結構修飾【技術領域】。
【背景技術】
[0002]人體細胞的各種活動與糖類密切相關，多糖是生物體內除蛋白質和核酸以外的又一類重要的生物大分子，具有非特異性免疫增強功能，能提高機體免疫力，具有抗感染、抗腫瘤、抗氧化和防治病毒性肝炎、愛滋病等功能。多糖的生物活性與其結構、分子量、溶解度等因素密切相關，特別是引入某些化學基團使糖鏈的柔韌性和空間結構發生變化，從而引起多糖溶解度及生物活性發生改變或產生新的活性。
[0003]多糖的化學修飾主要有硫酸化、磷酸化等，而天然多糖硫酸酯，如硫酸軟骨素、肝素等，較易溶於水，具有抗凝血、抗病毒等生理功能。研究發現有的自身無抗病毒活性的多糖經硫酸酯化之後表現出抗病毒特性，而對於具有抗病毒活性的某些多糖硫酸酯，在脫去其硫酸基團之後，其抗病毒活性大大降低。這使得硫酸化多糖的研究受到重視。[0004]灰樹花(Grifola frondosa)為擔子菌亞門、多孔菌科植物，也叫慄子蘑、蓮花菌、千佛菌等，日本則稱之為「舞茸」，其主要活性成份是灰樹花多糖，因其有β-α — 6)分支，具有顯著的生理活性，具有抑制腫瘤生長、防止腫瘤細胞轉移、防止正常細胞癌變等作用。但前期研究結果表明，灰樹花多糖的生物活性與其分子量正相關，而分子量較大的灰樹花多糖片段難溶於水，而研究發現對灰樹花多糖進行硫酸化改性之後，不僅其溶解度大大提聞，同時其抗癌活性也有很大提聞提聞。
[0005]專利文獻CN1563102A公開了一種灰樹花多糖硫酸酯及其製備方法與應用，其中灰樹花多糖硫酸酯的製備是通過將灰樹花水不溶性多糖加入到磺化劑中，在50-75°C下酯化反應2-8小時，經乙醇沉澱，中和，洗滌，乾燥得到。該方法中所使用的磺化劑為氯磺酸與甲醯胺或吡啶反應生成的。採用該方法得到的產品的分子量為10-20萬道爾頓，有機硫含量為8-18%。在該專利文獻中多糖硫酸酯的合成採用氯磺酸作為磺化試劑，但是氯磺酸是一種強氧化劑，遇水會發生劇烈分解，放出大量的熱，有濃煙，有爆炸性危險，屬於限制性化學品。氯磺酸與吡啶或甲醯胺反應製備磺化劑需要在冰浴中進行，氯磺酸需緩慢滴加，而且要嚴格控制反應體系不能含水，操作要求較高，控制失當容易發生爆炸危險。

【發明內容】

[0006]本發明的目的在於提供一種新的安全可控的超聲輔助-催化合成灰樹花多糖硫酸酯的方法，降低酯化溫度，縮短酯化時間，提高硫酸基團取代度。
[0007]為實現上述目的，本發明採用以下技術方案:
[0008]一種超聲輔助-催化合成灰樹花多糖硫酸酯的方法，以灰樹花多糖為原料，以三氧化硫-吡啶作為磺化劑，在4- 二甲氨基吡啶的催化作用下製備灰樹花多糖硫酸酯。
[0009]優選地，該方法還包括將灰樹花多糖在N，N- 二甲基甲醯胺中超聲溶脹的步驟。[0010]具體來講，本發明的方法包括以下步驟:
[0011](I)將三氧化硫-吡啶複合物溶解在有機溶劑吡啶中，得到酯化劑均相液A ;
[0012](2)將灰樹花多糖置於N，N-二甲基甲醯胺中，在頻率為40~IOOHz條件下超聲溶脹5~120min，得到灰樹花多糖的分散液B ;然後將催化劑4- 二甲氨基吡啶溶解在分散液B中，得到含4- 二甲氨基吡啶的灰樹花多糖的分散液C ；
[0013](3)將分散液C緩慢加入酯化劑均相液A中，在30~75°C油浴中反應I~6h，反應結束後冷卻至室溫,將酯化反應後的溶液中和至pH值為6~8,靜置,抽濾；
[0014](4)濾液濃縮後用乙醇進行沉澱，沉澱經乙醇洗滌後溶解在水中，溶液進行透析純化，純化後的溶液經濃縮後用乙醇進行沉澱，沉澱經洗滌、冷凍乾燥得到灰樹花多糖硫酸酯。
[0015]優選地，所述步驟(1)中有機溶劑吡啶的用量相對於三氧化硫-吡啶複合物的用量為3~10mL/g。
[0016]優選地，所述步驟⑵中N，N-二甲基甲醯胺的用量相對於灰樹花多糖的用量為10~50mL/g;4-二甲氨基吡啶與灰樹花多糖的質量比為1: 2~1: 20。
[0017]優選地，所述步驟(3)中灰樹花多糖與三氧化硫-吡啶複合物的質量比為1: 2~I: 10。
[0018]優選地 ，所述步驟(3)中酯化反應後的溶液用質量百分比濃度為2%~10%的NaOH溶液進行中和。
[0019]優選地，所述步驟(4)中濾液或溶液濃縮時均濃縮至原體積的1/8~1/30，濃縮液用乙醇沉澱時，加入相對於濃縮液2~6倍體積的乙醇。
[0020]優選地，所述步驟(4)中的透析純化過程為:將溶液裝入截留量為5kD~IOkD的透析袋中，流水透析12~36h ;然後用超純水透析48~96h,超純水透析過程中每3~6h
換一次水。
[0021 ] 優選地，所述冷凍乾燥的條件為:在-50~_20°C、I~5Pa條件下冷凍乾燥24~36h。
[0022]本發明的優點在於:
[0023]本發明採用超聲輔助-催化的方法合成灰樹花多糖硫酸酯，降低了酯化溫度，縮短了酯化時間，提高了硫酸基團取代度，取代度為1.07~2.13。
[0024]本發明採用三氧化硫-吡啶複合物作為磺化劑合成灰樹花多糖硫酸酯，只需將三氧化硫-吡啶複合物室溫溶解於吡啶試劑中即可得到磺化劑，水的存在對安全性不會有影響，因而反應條件相對溫和可控，反應速度較快。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為灰樹花多糖和灰樹花多糖硫酸酯的紅外譜圖，其中曲線I為灰樹花多糖原糖的紅外譜圖，曲線2為灰樹花多糖硫酸酯的紅外譜圖，橫坐標為波數，cm~，縱坐標為透
光度％。
【具體實施方式】
[0026]以下通過實施例對本發明作進一步說明，但本發明並不限於以下實施例。[0027]如無特殊說明，以下實施例中所用原料和試劑均可從商業途徑獲得，所涉及的儀器和設備均為本領域常規設備。以下實施例中所使用的灰樹花多糖的相對分子量為20kD~30kD，純度在90%以上，可以從市場購買，也可以採用以下方法進行製備:
[0028](I)將灰樹花子實體粉碎，過5~20目篩，稱取顆粒度為5~20目的灰樹花子實體粉，加10倍超純水浸泡30min，置於微波萃取釜中，1400W微波輻射30min，收集微波萃取液和萃餘物；
[0029](2)稱取適量木瓜蛋白酶、纖維素酶和果膠酶，按質量比為2: 2: I的比例混合，超純水溶解，得酶解液，備用；
[0030](3)將微波萃取液和萃餘物在一容器中混合，置於50°C水浴，按複合酶與灰樹花粉質量比為0.4%的比例加入酶解液，調pH為6.0,酶解90分鐘；酶提取液100°C滅酶IOmin ;滅酶結束，冷卻至室溫，過濾，取濾液，得酶提多糖溶液；
[0031](4)每升酶解液加40g溼S-8樹脂，在40°C條件下吸附脫色；脫色多糖溶液，經截留分子量分別為30kD和20kD的微濾組件和超濾組件，得純化灰樹花多糖；純化灰樹花多糖用95%乙醇沉澱，靜置24h，4000r/min離心15min，傾去上清，得沉澱，沉澱乙醇洗滌，離心，傾去上清，得沉澱，反覆3次，真空乾燥，得灰樹花多糖。
[0032]實施例1
[0033](I)稱取6.0g三氧化硫-吡啶複合物於配有冷凝、攪拌、加熱裝置的反應器中，向其中加入60mL吡啶，室溫攪拌，使三氧化硫-吡啶複合物充分溶解，得酯化劑均相液A。
`[0034](2)稱取經脫色、分級純化處理的灰樹花多糖3.0g,向其中加入45mL N，N-二甲基甲醯胺(DMF)，於超聲反應器中，在頻率為40Hz條件下超聲溶脹60min，得到灰樹花多糖分散液B。
[0035](3)室溫下將1.0g4_ 二甲氨基吡啶(DMAP)溶解於灰樹花多糖分散液B中，得到含DMAP的灰樹花多糖分散液C。
[0036](4)酯化反應:將步驟(3)得到的灰樹花多糖分散液C緩慢加入A中，在50°C油浴中反應3h，反應結束，冰水冷卻至室溫，5% NaOH調pH值為6，靜置，抽濾，濾液旋蒸濃縮至原體積的1/15，再加入6倍體積的乙醇，充分混合，室溫靜置12小時，離心，棄去上清液，沉澱物用乙醇洗滌，抽濾，沉澱蒸餾水溶解，得溶液D。
[0037](5)將溶液D裝入截留量為5kD的透析袋中，流水透析24h，超純水透析72h，每6h換一次水。透析結束，透析袋內的液體旋蒸濃縮至原體積的1/10，濃縮液中加入5倍體積的乙醇進行沉澱，室溫靜置過夜，離心，抽濾，濾餅乙醇洗滌，在_40°C、5Pa條件下冷凍乾燥36h，得到灰樹花多糖硫酸酯，其中硫酸根的取代度為1.07。
[0038]如圖1所示為灰樹花多糖和灰樹花多糖硫酸酯的紅外譜圖，其中曲線I為灰樹花多糖原糖的紅外譜圖，曲線2為灰樹花多糖硫酸酯的紅外譜圖。橫坐標為波數，cnT1，縱坐標為透光度％。可以看出灰樹花多糖硫酸酯在1231CHT1和1050CHT1處的吸收分別為S = O的彎曲振動和伸縮振動，在813CHT1處的吸收峰為C-O-S的拉伸振動，在2930CHT1處的羥基吸收峰明顯降低，表明部分羥基己被硫酸基團取代。
[0039]實施例2
[0040](I)稱取9.0g三氧化硫-吡啶複合物於配有冷凝、攪拌、加熱裝置的反應器中，向其中加入60mL吡啶，室溫攪拌，使三氧化硫-吡啶複合物充分溶解，得酯化劑均相液A。[0041](2)稱取經脫色、分級純化處理的灰樹花多糖3.0g,向其中加入45mL N，N_ 二甲基甲醯胺(DMF)，於超聲反應器中，在頻率為80Hz條件下超聲溶脹40min，得到灰樹花多糖分散液B。
[0042](3)室溫下將1.0g DMAP溶解於灰樹花多糖分散液B中，得到含DMAP的灰樹花多糖分散液C。
[0043](4)酯化反應:將步驟(3)得到的灰樹花多糖分散液C緩慢加入A中，在60°C油浴中反應3h，反應結束，冰水冷卻至室溫，5% NaOH調pH值為6，靜置，抽濾，濾液旋蒸濃縮至原體積的1/15，再加入5倍體積的乙醇，充分混合，室溫靜置12小時，離心，棄去上清液，沉澱物用乙醇洗滌，抽濾，沉澱蒸餾水溶解，得溶液D。
[0044](5)將溶液D裝入截留量為5kD的透析袋中，流水透析24h，超純水透析72h，每6h換一次水。透析結束，透析袋內的液體旋蒸濃縮至原體積的1/10，濃縮液中加入5倍體積的乙醇進行沉澱，室溫靜置過夜，離心，抽濾，濾餅乙醇洗滌，在_40°C、5Pa條件下冷凍乾燥36h，得到灰樹花多糖硫酸酯，其中硫酸根的取代度為1.43。
[0045]實施例3
[0046](I)稱取12g三氧化硫-吡啶複合物於配有冷凝、攪拌、加熱裝置的反應器中，向其中加入60mL吡啶，室溫攪拌，使三氧化硫-吡啶複合物充分溶解，得酯化劑均相液A。
[0047](2)稱取經脫色、分級純化處理的灰樹花多糖3g，向其中加入45mLN，N- 二甲基甲醯胺(DMF)，於超聲反應器中，在頻率為60Hz條件下超聲溶脹60min，得到灰樹花多糖分散液B。
[0048](3)室溫下將1.0g DMAP溶解於灰樹花多糖分散液B中，得到含DMAP的灰樹花多糖分散液C。
[0049](4)酯化反應:將步驟(3)得到的灰樹花多糖分散液C緩慢加入A中，在70°C油浴中反應4h，反應結束，冰水冷卻至室溫，5% NaOH調pH值為6，靜置，抽濾，濾液旋蒸濃縮至原體積的1/15，再加入5倍體積的乙醇，充分混合，室溫靜置12小時，離心，棄去上清液，沉澱物用乙醇洗滌，抽濾，沉澱蒸餾水溶解，得溶液D。
[0050](5)將溶液D裝入截留量為5kD的透析袋中，流水透析24h，超純水透析72h，每6h換一次水。透析結束，透析袋內的液體旋蒸濃縮至原體積的1/15，濃縮液中加入6倍體積的乙醇進行沉澱，室溫靜置過夜，離心，抽濾，濾餅乙醇洗滌，在_30°C、5Pa條件下冷凍乾燥36h，得到灰樹花多糖硫酸酯，其中硫酸根的取代度為1.98。
[0051]實施例4
[0052](I)稱取12g三氧化硫-吡啶複合物於配有冷凝、攪拌、加熱裝置的反應器中，向其中加入60mL吡啶，室溫攪拌，使三氧化硫-吡啶複合物充分溶解，得酯化劑均相液A。
[0053](2)稱取經脫色、分級純化處理的灰樹花多糖3g，向其中加入45mL N，N_ 二甲基甲醯胺(DMF)，於超聲反應器中，在頻率為60Hz條件下超聲溶脹60min，得到灰樹花多糖分散液B。
[0054](3)室溫下將1.5g DMAP溶解於灰樹花多糖分散液B中，得到含DMAP的灰樹花多糖分散液C。
[0055](4)酯化反應:將步驟(3)得到的灰樹花多糖分散液C緩慢加入A中，在70°C油浴中反應4h，反應結束，冰水冷卻至室溫，5% NaOH調pH值為6，靜置，抽濾，濾液旋蒸濃縮至原體積的1/15，再加入5倍體積的乙醇，充分混合，室溫靜置12小時，離心，棄去上清液，沉澱物用乙醇洗滌，抽濾，沉澱蒸餾水溶解，得溶液D。
[0056](5)將溶液D裝入截留量為5kD的透析袋中，流水透析24h，超純水透析72h，每6h換一次水。透析結束，透析袋內的液體旋蒸濃縮至原體積的1/15，濃縮液中加入6倍體積的乙醇進行沉澱，室溫靜置過夜，離心，抽濾，濾餅乙醇洗滌，在_30°C、5Pa條件下冷凍乾燥36h，得到灰樹花多糖硫酸酯，其中硫酸根的取代度為2.13。
[0057]比較例I
[0058](I)稱取12g三氧化硫-吡啶複合物於配有冷凝、攪拌、加熱裝置的反應器中，向其中加入60mL吡啶，室溫攪拌，使三氧化硫-吡啶複合物充分溶解，得酯化劑均相液A。
[0059](2)稱取經脫色、分級純化處理的灰樹花多糖3g，向其中加入45mL N，N_ 二甲基甲醯胺(DMF)，於超聲反應器中，在頻率為60Hz條件下超聲溶脹60min，得到灰樹花多糖分散液B。
[0060](3)酯化反應:將灰樹花多糖分散液B緩慢加入A中，在70°C油浴中反應4h，反應結束，冰水冷卻至室溫，5% NaOH調pH值為6，靜置，抽濾，濾液旋蒸濃縮至原體積的1/15，再加入5倍體積的乙醇，充分混合，室溫靜置12小時，離心，棄去上清液，沉澱物用乙醇洗滌，抽濾，沉澱蒸餾水溶解，得溶液D。
[0061](4)將溶液D裝入截留量為5kD的透析袋中，流水透析24h，超純水透析72h，每6h換一次水。透析結束，透析袋內的液體旋蒸濃縮至原體積的1/15，濃縮液中加入6倍體積的乙醇進行沉澱，室溫靜置過夜，離心，抽濾，濾餅乙醇洗滌，在_30°C、5Pa條件下冷凍乾燥36h，得到灰樹花多糖硫酸酯，其中硫酸根的取代度為0.86。
[0062]比較例2`[0063](I)稱取12g三氧化硫-吡啶複合物於配有冷凝、攪拌、加熱裝置的反應器中，向其中加入60mL吡啶，室溫攪拌，使三氧化硫-吡啶複合物充分溶解，得酯化劑均相液A。
[0064](2)稱取經脫色、分級純化處理的灰樹花多糖3g，向其中加入45mL N，N_ 二甲基甲醯胺(DMF)，攪拌12h，使灰樹花多糖充分容散，得到灰樹花多糖分散液B。
[0065](3)酯化反應:將灰樹花多糖分散液B緩慢加入A中，在70°C油浴中反應4h，反應結束，冰水冷卻至室溫，5% NaOH調pH值為6，靜置，抽濾，濾液旋蒸濃縮至原體積的1/15，再加入5倍體積的乙醇，充分混合，室溫靜置12小時，離心，棄去上清液，沉澱物用乙醇洗滌，抽濾，沉澱蒸餾水溶解，得溶液D。
[0066](4)將溶液D裝入截留量為5kD的透析袋中，流水透析24h，超純水透析72h，每6h換一次水。透析結束，透析袋內的液體旋蒸濃縮至原體積的1/15，濃縮液中加入6倍體積的乙醇進行沉澱，室溫靜置過夜，離心，抽濾，濾餅乙醇洗滌，在_30°C、5Pa條件下冷凍乾燥36h，灰樹花多糖硫酸酯，其中硫酸根的取代度為0.69。
[0067]如表1所示，為以上實施例1~4及比較例1、2在相應工藝條件下合成灰樹花多糖硫酸酯的數據結果。
[0068]表1
[0069]
【權利要求】
1.一種超聲輔助-催化合成灰樹花多糖硫酸酯的方法，其特徵在於，以灰樹花多糖為原料，以三氧化硫-吡啶作為磺化劑，在4- 二甲氨基吡啶的催化作用下製備灰樹花多糖硫酸酯。
2.根據權利要求1所述的超聲輔助-催化合成灰樹花多糖硫酸酯的方法，其特徵在於，還包括將灰樹花多糖在N，N- 二甲基甲醯胺中的超聲溶脹的步驟。
3.根據權利要求2所述的超聲輔助-催化合成灰樹花多糖硫酸酯的方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟: (1)將三氧化硫-吡啶複合物溶解在有機溶劑吡啶中，得到酯化劑均相液A； (2)將灰樹花多糖置於1^二甲基甲醯胺中，在頻率為40-100取條件下超聲溶脹5~120min,得到灰樹花多糖的分散液B ;然後將催化劑4- 二甲氨基吡啶溶解在分散液B中，得到含4- 二甲氨基吡啶的灰樹花多糖的分散液C ； (3)將分散液C緩慢加入酯化劑均相液A中，在30~75°C油浴中反應I~6h，反應結束後冷卻至室溫,將酯化反應後的溶液中和至pH值為6~8,靜置,抽濾； (4)濾液濃縮後用乙醇進行沉澱，沉澱經乙醇洗滌後溶解在水中，溶液進行透析純化，純化後的溶液經濃縮後用乙醇進行沉澱，沉澱經洗滌、冷凍乾燥得到灰樹花多糖硫酸酯。
4.根據權利要求3所述的超聲輔助-催化合成灰樹花多糖硫酸酯的方法，其特徵在於，所述步驟⑴中有機溶劑 吡啶的用量相對於三氧化硫-吡啶複合物的用量為3~10mL/g。
5.根據權利要求3所述的超聲輔助-催化合成灰樹花多糖硫酸酯的方法，其特徵在於，所述步驟⑵中N，N-二甲基甲醯胺的用量相對於灰樹花多糖的用量為10~50mL/g ;4-二甲氨基吡啶與灰樹花多糖的質量比為1: 2~1: 20。
6.根據權利要求3所述的超聲輔助-催化合成灰樹花多糖硫酸酯的方法，其特徵在於，所述步驟(3)中灰樹花多糖與三氧化硫-吡啶複合物的質量比為1: 2~1: 10。
7.根據權利要求3所述的超聲輔助-催化合成灰樹花多糖硫酸酯的方法，其特徵在於，所述步驟(3)中酯化反應後的溶液用質量百分比濃度為2%~10%的NaOH溶液進行中和。
8.根據權利要求3所述的超聲輔助-催化合成灰樹花多糖硫酸酯的方法，其特徵在於，所述步驟(4)中濾液或溶液濃縮時均濃縮至原體積的1/8~1/30，濃縮液用乙醇沉澱時，加入相對於濃縮液2~6倍體積的乙醇。
9.根據權利要求3所述的超聲輔助-催化合成灰樹花多糖硫酸酯的方法，其特徵在於，所述步驟(4)中的透析純化過程為:將溶液裝入截留量為5kD~IOkD的透析袋中，流水透析12~36h ;然後用超純水透析48~96h,用超純水透析過程中每3~6h換一次水。
10.根據權利要求3所述的超聲輔助-催化合成灰樹花多糖硫酸酯的方法，其特徵在於，所述冷凍乾燥的條件為:在-50~-20°C、1~5Pa條件下冷凍乾燥24~36h。
【文檔編號】C08B37/00GK103819573SQ201410082155
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月7日 優先權日:2014年3月7日
【發明者】劉紅梅 申請人:北京聯合大學